Pcsk9拮抗劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了針對前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin9a型（“PCSK9”）的抗體拮抗劑，以及使用此類抗體的方法。
【專利說明】PCSK9拮抗劑
[0001]相關(guān)專利申請的交互引用
[0002]本申請要求2011年2月11日提交的美國臨時專利申請N0.61/442，126的優(yōu)先權(quán)，對于全部目的，將所述臨時申請并入本文作為參考。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明涉及針對PCSK9的抗體拮抗劑。
【背景技術(shù)】
[0004]低密度脂蛋白受體(LDL-R)通過清除血流中的低密度脂蛋白(LDL)來預(yù)防動脈粥樣硬化和高膽固醇血癥。LDL-R在翻譯后水平通過前蛋白轉(zhuǎn)化酶(proprotein convertase)枯草桿菌蛋白酶/kexin9a型(“PCSK9”)調(diào)控。最近，報道了小鼠中PCSK9的敲除。這些小鼠顯示血漿膽固醇水平降低了大約50%，并且在降低血漿膽固醇的過程中顯示出對抑制素的敏感性的提高(Rashid S，等人(2005)Proc Natl Acad Scil02:5374_5379)。人類遺傳學(xué)數(shù)據(jù)也支持PCSK9在LDL穩(wěn)態(tài)中的作用。最近，在PCSK9中鑒定了兩種突變，推測其是“功能缺失型”突變。具有這些突變的個體降低了大約40%LDL-C血漿水平，這相當(dāng)于減少了大約50-90%的冠心病。總之，這些研究表明，PCSK9的抑制劑對于降低LDL-C的血漿濃度和減少由PCSK9介導(dǎo)的其他疾病是有益的，并且可以例如與用于降低膽固醇的第二試劑共同施用，用于增加功效。
[0005]發(fā)明概述
[0006]本發(fā)明提供了與前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin9a型(PCSK9)(例如，SEQID N0:43)結(jié)合并對抗其功能的抗體，以及使用此類抗體的方法，例如治療由PCSK9介導(dǎo)的疾病。
[0007]在一個方面，本發(fā)明提供了與前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin9型(PCSK9)結(jié)合的抗體和抗原結(jié)合分子。在一些實施方案中，抗體阻斷PCSK9與低密度脂蛋白受體(LDLR)的相互作用，并抑制PCSK9-介導(dǎo)的LDLR的降解，其中所述抗體包含:
[0008]a)重鏈可變區(qū)，其包含人重鏈V-區(qū)段、重鏈互補決定區(qū)3 (⑶R3)和重鏈構(gòu)架區(qū)4(FR4);和
[0009]b)輕鏈可變區(qū)，其包含人輕鏈V-區(qū)段、輕鏈⑶R3和輕鏈FR4，其中
[0010]i)重鏈CDR3可變區(qū)包含氨基酸序列ITTEGGFAY (SEQ ID NO: 17);和
[0011]ii)輕鏈CDR3可變區(qū)包含氨基酸序列QQSNYWPLT (SEQ ID N0:24)。
[0012]在一些實施方案中，與人PCSK9結(jié)合的抗體或抗原結(jié)合分子具有約500pM或更小的平衡解離常數(shù)(KD)。例如，在一些實施方案中，與人PCSK9結(jié)合的抗體或抗原結(jié)合分子具有約 400pM、300pM、250pM、200pM、190pM、180pM、170pM、160pM、150pM、140pM 或更小的平衡解離常數(shù)(KD)。
[0013]在一些實施方案中，重鏈V-區(qū)段與SEQ ID NO:27具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列同一性，并且輕鏈 V 區(qū)段與 SEQID NO:28 具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%的序列同一性。
[0014]在一些實施方案中，重鏈V-區(qū)段與選自SEQ ID N0:25和SEQ ID N0:26的氨基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列同一性，并且輕鏈V-區(qū)段與SEQ ID NO: 28具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列同一性。
[0015]在一些實施方案中，重鏈FR4是人種系FR4。在一些實施方案中，重鏈FR4為SEQID N0:35。
[0016]在一些實施方案中，輕鏈FR4是人種系FR4。在一些實施方案中，輕鏈FR4為SEQID N0:39。
[0017]在一些實施方案中，重鏈V-區(qū)段和輕鏈V-區(qū)段均包含互補決定區(qū)I (⑶Rl)和互補決定區(qū)2 (CDR2)，其中:
[0018]i)重鏈V-區(qū)段的CDRl包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列；
[0019]ii)重鏈V-區(qū)段的CDR2包含SEQ ID NO: 16的氨基酸序列；
[0020]iii)輕鏈V-區(qū)段的CDRl包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列；且
[0021]iv)輕鏈V-區(qū)段的 CDR2包含SEQ ID NO: 23的氨基酸序列。
[0022]在一些實施方案中，
[0023]i)重鏈 V-區(qū)段的 CDRl 包含 SEQ ID NO: 14 ；
[0024]ii)重鏈 V-區(qū)段的 CDR2 包含 SEQ ID NO: 16 ；
[0025]iii)重鏈 CDR3 包含 SEQ ID NO: 17 ；
[0026]iv)輕鏈 V-區(qū)段的 CDRl 包含 SEQ ID NO: 19 ；
[0027]V)輕鏈 V-區(qū)段的 CDR2 包含 SEQ ID NO: 22 ;且
[0028]vi)輕鏈 CDR3 包含 SEQ ID NO:24。
[0029]在一些實施方案中，重鏈可變區(qū)與SEQ ID NO: 40的可變區(qū)具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的氨基酸序列同一性，并且輕鏈可變區(qū)與 SEQ ID NO: 41 的可變區(qū)具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%
的氨基酸序列同一性。
[0030]在一些實施方案中，抗體包含含有SEQ ID NO:40的重鏈和含有SEQ ID N0:41的輕鏈。
[0031]在一些實施方案中，重鏈可變區(qū)與選自SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:9的可變區(qū)具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的氨基酸序列同一性，并且輕鏈可變區(qū)與選自SEQ ID N0:7和SEQ ID NO: 11的可變區(qū)具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的氨基酸序列同一性。
[0032]在一些實施方案中，重鏈可變區(qū)包含選自SEQ ID N0:5和SEQ ID NO:9的氨基酸序列，并且輕鏈可變區(qū)包含選自SEQ ID N0:7和SEQ ID NOill的氨基酸序列。
[0033]在一些實施方案中，抗體是IgG。在一些實施方案中，抗體是IgGl。
[0034]在一些實施方案中，抗體是FAb’片段。在一些實施方案中，抗體是單鏈抗體(ScFv)0在一些實施方案中，抗體包含人恒定區(qū)。在一些實施方案中，抗體包含人IgGl恒定區(qū)。在一些實施方案中，人IgGl恒定區(qū)是突變的，以對細胞上的效應(yīng)子配體如Fe受體(FcR)Jf^nFcYRl或者補體的Cl組分具有降低的結(jié)合親和力。參見，例如美國專利N0.5，624，821。在一些實施方案中，將IgGl恒定區(qū)的氨基酸殘基L234和L235取代成Ala234和Ala235。重鏈恒定區(qū)中殘基的編號為EU索引的編號(參見，Kabat,等人，(1983)“Sequences of Proteins of Immunological Interest, ^U.S.Dept.Health and HumanServices)。
[0035]在一些實施方案中，抗體與載體蛋白，例如白蛋白連接。
[0036]在一些實施方案中，抗體是聚乙二醇化的。
[0037]在其他方面，本發(fā)明提供了組合物，其包含如本文中所述的抗體或抗原結(jié)合分子，以及生理上相容的賦形劑。 [0038]在一些實施方案中，組合物還包含降低個體中的低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的水平的第二試劑。
[0039]在一些實施方案中，第二試劑是抑制素。例如，抑制素可以選自托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。
[0040]在一些實施方案中，第二試劑選自貝特(fibrate)類、煙酸及其類似物、膽固醇吸收抑制劑、膽汁酸多價螯合劑、甲狀腺激素模擬物、微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白(MTP)抑制劑、二?；视王；D(zhuǎn)移酶(DGAT)抑制劑、靶向PCSK9的抑制性核酸，以及靶向apoBlOO的抑制性核酸。
[0041]在其他方面，本發(fā)明提供了在需要其的個體中降低LDL-C、非-HDL-C和/或總膽固醇的方法，該方法包括給個體施用治療有效量的如本文中所述的抗體或抗原結(jié)合分子。
[0042]在一些實施方案中，個體對抑制素治療是低應(yīng)答或者有抗性的。在一些實施方案中，個體是不耐受抑制素治療的。在一些實施方案中，個體具有至少約100mg/dL，例如至少約 110、120、130、140、150、160、170、180、190mg/dL 或者更高的基線 LDL-C 水平。在一些實施方案中，個體具有家族性高膽固醇血癥。在一些實施方案中，個體具有甘油三酯血癥(triglyceridemia)0在一些實施方案中，個體具有功能獲得型PCSK9基因突變。在一些實施方案中，個體具有藥物誘導(dǎo)的血脂異常。
[0043]在一些實施方案中，總膽固醇與LDL-C —起降低。
[0044]在一些實施方案中，方法還包括給個體施用治療有效量的有效降低LDL-C的第二試劑。
[0045]在一些實施方案中，第二藥劑是抑制素。例如，抑制素可以選自托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。
[0046]在一些實施方案中，第二藥劑選自貝特類、煙酸及其類似物、膽固醇吸收抑制劑、膽汁酸多價螯合劑、甲狀腺激素模擬物、微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白(MTP)抑制劑、二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)抑制劑、靶向PCSK9的抑制性核酸，以及靶向apoBlOO的抑制性核酸。
[0047]在一些實施方案中，將抗體或抗原結(jié)合分子和第二試劑以混合物的形式共同施用。
[0048]在一些實施方案中，將抗體或抗原結(jié)合分子和第二試劑分別共同施用。
[0049]在一些實施方案中，靜脈內(nèi)施用抗體。在一些實施方案中，皮下施用抗體。
[0050]定義
[0051]“抗體”指免疫球蛋白家族的多肽或包含能非共價地、可逆地，并且以特異的方式結(jié)合相應(yīng)抗原的免疫球蛋白的片段的多肽。示例性抗體結(jié)構(gòu)單元包含四聚體。每一四聚體由兩個相同的多肽鏈對組成，每一對具有通過二硫鍵連接的一個“輕”鏈(約25kD)和一個“重”鏈(約50_70kD)。公認的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、Υ、δ、ε和μ恒定區(qū)基因，以及無數(shù)的免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈分為K或λ。重鏈分為Y、μ、α、δ或ε，其依次分別定義了免疫球蛋白類別IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。每一鏈的N-端定義了主要負責(zé)抗原識別的約100-110或者更多的氨基酸的可變區(qū)。術(shù)語可變輕鏈(')和可變重鏈(Vh)分別指輕鏈和重鏈的那些區(qū)域。如在本申請中所用，“抗體”包括例如對PCSK9擁有特定結(jié)合特異性的抗體及其片段的全部變型。因此，在該概念的范圍內(nèi)，抗體是具有相同結(jié)合特異性的全長抗體、嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體(ScFv)、Fab、Fab’和這些片段的多聚形式(例如 F(ab，)2)。
[0052]“互補決定域”或“互補決定區(qū)(⑶R)”可互換地指\和Vh的超變區(qū)。⑶R是對該靶蛋白具有特異性的抗體鏈的靶蛋白質(zhì)結(jié)合位點。在每個人\或Vh中存在三個CDR(CDRl-3，從N-端順次編碼)，其構(gòu)成了約15-20%的可變域。CDR在結(jié)構(gòu)上與靶蛋白質(zhì)的表位互補，因此直接負責(zé)結(jié)合特異性。\和Vh的剩余鏈(所稱作的構(gòu)架區(qū))在氨基酸序列方面表現(xiàn)出較少的變化(Kuby, Immunology,第 4 版，第 4 章。W.H.Freeman&C0.，New York, 2000)。
[0053]使用本領(lǐng)域的多種熟知定義，例如，Kabat, Chothia, internationalImMunoGeneTics數(shù)據(jù)庫(IMGT)(在imgt.cines.fr/的全球網(wǎng)上)和AbM (參見，例如Johnson 等人，Nucleic Acids Res., 29:205-206 (2001) ;Chothia 和 Lesk, J.Mol.Biol.,196:901-917 (1987) ；Chothia 等人，Nature, 342:877-883 (1989) ；Chothia 等人，J.Mol.Biol.,227:799-817 (1992) ;Al_Lazikani 等人，J.Mol.Biol.，273:927-748 (1997))可以確定⑶R和構(gòu)架區(qū)的位置?？乖Y(jié)合部位的定義還描述于下文:Ruiz等人,Nucleic AcidsRes.,28:219 - 221 (2000);和 Lefranc，Μ.P.，NucleicAcids Res.，29:207-209 (2001)；MacCallum 等人，J.Mol.Biol.，262:732-745( 1996);和 Martin 等人,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 86:9268 - 9272( 1989);Martin等人，Methods Enzymo1.，203:121 - 153( 1991);和 Rees等人，In Sternberg M.J.E.(ed.), Protein Structure Prediction, Oxford UniversityPress, Oxford, 141 - 172 (1996)中。
[0054]術(shù)語“結(jié)合特異性決定簇”或“BSD”可互`換地指對于決定抗體的結(jié)合特異性所必需的互補決定區(qū)內(nèi)的最小連續(xù)或不連續(xù)氨基酸序列。最小結(jié)合特異性決定簇可以在一個或多個CDR序列內(nèi)。在一些實施方案中，最小結(jié)合特異性決定簇位于抗體重鏈和輕鏈的CDR3序列的一部分或者全長內(nèi)(即僅由抗體重鏈和輕鏈的CDR3序列的一部分或者全長決定)。
[0055]如本文中所用，“抗體輕鏈”或“抗體重鏈”指分別包含'或Vh的多肽。內(nèi)源' 由基因區(qū)段V (可變的)和J (接合的)編碼，而內(nèi)源Vh *V、D (多樣性)和J編碼。每一'或Vh包括CDR以及構(gòu)架區(qū)。在本申請中，有時將抗體輕鏈和/或抗體重鏈統(tǒng)稱為“抗體鏈”。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，這些術(shù)語包括含有不會破壞'或Vh的基本結(jié)構(gòu)的突變的抗體鏈。
[0056]抗體以完整的免疫球蛋白或者以通過多種肽酶消化產(chǎn)生的許多完全表征的片段存在。因此，例如胃蛋白酶在鉸鏈區(qū)中的二硫鍵消化抗體，產(chǎn)生F(ab)’2 (Fab’的二聚體)，其自身是通過二硫鍵與Vh-ChI結(jié)合的輕鏈。在溫和條件下可以還原F(ab)’2，以破壞鉸鏈區(qū)的二硫鍵，從而將F (ab)’2 二聚體轉(zhuǎn)變成Fab’單體。Fab’單體在本質(zhì)上是具有鉸鏈區(qū)的一部分的Fab。Paul,Fundamental Immunology第三版(1993)。盡管按照完整抗體的消化,定義了多種抗體片段，但技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以通過化學(xué)方法或者通過使用重組DNA方法從頭合成此類片段。因此，如本文中所用，術(shù)語“抗體”還包括通過全抗體的修飾產(chǎn)生的抗體片段、或者使用重組DNA方法從頭合成的那些抗體片段(例如，單鏈Fv)或者使用噬菌體展示文庫鑒定的那些抗體片段(參見，例如，McCafferty等人，Nature348:552-554 (1990))。
[0057]對于單克隆或多克隆抗體的制備，可以使用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)(參見，例如Kohler&Milstein, Nature256:495-497 (1975) ；Kozbor 等人，Immunology Today4:72(1983) ；Cole 等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,第 77-96 頁。AlanR.Liss, Inc.1985)。可以采用產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(美國專利N0.4，946，778)來產(chǎn)生針對本發(fā)明多肽的抗體。此外，可以將轉(zhuǎn)基因小鼠或者其他生物例如其他哺乳動物用于表達人源化抗體。備選地，可以將噬菌體展示技術(shù)用于鑒定抗體和與選定的抗原特異性結(jié)合的異聚 Fab 片段(參見，例如 McCafferty 等人，上述；Marks 等人，Biotechnology, 10:779-783,(1992))。
[0058]用于人源化或者靈源化(primatize)非人抗體的方法是本領(lǐng)域熟知的。通常，人源化抗體具有從非人來源引入的一個或多個氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基通常稱為輸入殘基，其一般取自輸入可變域(import variable domain)?；旧峡梢园凑誛inter 和同事的方法(參見，例如 Jones 等人，Nature321:522-525 (1986) ；Riechmann等人，Nature332:323-327 (1988) ;Verhoeyen 等人，Science239:1534-1536 (1988)和Presta, Curr.0p.Struct.Biol.2:593-596 (1992)),通過將嚙齒類動物 CDR 或 CDR 序列取代成相應(yīng)的人抗體的序列來進行人源化。因此，此類人源化抗體是嵌合抗體(美國專利N0.4，816，567)，其中已經(jīng)用來自非人物種的相應(yīng)序列取代了基本上少于一個完整的人可變域。實際上，人源化抗體一般是人抗體，其中用來自嚙齒類動物抗體中類似位點的殘基取代了一些互補決定區(qū)(“⑶R” )殘基，以及可能的一些構(gòu)架(“FR”)殘基。
[0059]本發(fā)明抗體或抗原結(jié)合分子還包括與其他蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)合或者與其他蛋白質(zhì)一起表達為融合蛋白的一個或多個免疫球蛋白鏈。本發(fā)明抗體或抗原結(jié)合分子還包括雙特異性抗體。雙特異性或雙功能抗體是人工的雜合抗體，其具有兩個不同的重鏈/輕鏈對和兩個不同的結(jié)合位點。本發(fā)明的其他抗原結(jié)合片段或抗體部分包括二價scFv (雙特異性抗體)、雙特異性scFv抗體(其中抗體分子識別兩個不同的表位)、單結(jié)合結(jié)構(gòu)域(dAb)和微抗體。
[0060]可以通過完整抗體的酶促修飾或者化學(xué)修飾產(chǎn)生或者使用重組DNA方法從頭合成(例如，單鏈Fv)或者使用卩遼菌體展示文庫鑒定(參見,例如McCafferty等人，Nature348:552-554,1990)本文中所述的多種抗體或抗原結(jié)合片段。例如，可以使用本領(lǐng)域所述的方法，例如 Vaughan 和 Sollazzo, Comb Chem High Throughput Screen。4:417-302001 產(chǎn)生微抗體?？梢酝ㄟ^多種方法包括雜交瘤的融合或者Fab’片段的連接來產(chǎn)生雙特異性抗體。參見，例如 Songsivilai&Lachmann, Clin.Exp.Tmmunol.79:315-321 (1990) ;Kostelny 等人，J.1mmunol.148，1547-1553 (1992)?？梢允褂檬删w展示文庫或者核糖體展示文庫、基因改組文庫鑒定單鏈抗體?？梢詮暮铣傻?、半合成的或者天然的且具有免疫能力的來源中構(gòu)建此類文庫。
[0061]“嵌合抗體”是這樣的抗體分子，其中(a)改變、替換或者交換了恒定區(qū)或其部分，以使抗原結(jié)合位點(可變區(qū))與不同或者改變種類、效應(yīng)子功能和/或物種的恒定區(qū)或者完全不同的分子例如酶、毒素、激素、生長因子、藥物等連接，所述完全不同的分子給嵌合抗體賦予了新的性質(zhì)；或(b)改變、替換或者交換了可變區(qū)或其部分，并且所述可變區(qū)具有不同的或者改變的抗原特異性。例如，如在下文實施例中所示，可以通過用來自人免疫球蛋白的恒定區(qū)替換小鼠抗PCSK9抗體的恒定區(qū)來修飾小鼠抗PCSK9抗體。由于用人恒定區(qū)進行了替換，所以嵌合抗體可以保留其識別人PCSK9的特異性，而與最初的小鼠抗體相比，在人類中還具有降低的抗原性。
[0062]術(shù)語“抗體結(jié)合分子”或“非抗體配體”指使用非免疫球蛋白的蛋白質(zhì)骨架的抗體模擬物，包括adnectin、avimer、單鏈多肽結(jié)合分子，以及抗體樣結(jié)合肽模擬物。
[0063]術(shù)語“可變區(qū)”或“V-區(qū)”可互換地指包含F(xiàn)R1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的重鏈或輕鏈。參見圖1。內(nèi)源可變區(qū)通過免疫球蛋白重鏈V-D-J基因或者輕鏈V-J基因編碼。V-區(qū)可以是天然存在的、重組的或者合成的。
[0064]如本文中所用，術(shù)語“可變區(qū)段”或“V-區(qū)段”可互換地指包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3的可變區(qū)的子序列。參見圖1。內(nèi)源V-區(qū)段由免疫球蛋白V-基因編碼。V-區(qū)段可以是天然存在的、重組的或者合成的。
[0065]如本文中所用，術(shù)語“ J-區(qū)段”指編碼的包含⑶R3和FR4的C-端部分的可變區(qū)的子序列。內(nèi)源J-區(qū)段由免疫球蛋白J-基因編碼。參見圖1。J-區(qū)段可以是天然存在的、重組的或者合成的。
[0066]“人源化抗體”指這樣的抗體，其保留了非人抗體的反應(yīng)性，但在人類中具有更低的免疫原性。這例如可以通過保留非人CDR區(qū)，而抗體的剩余部分用其人類的對應(yīng)物替換來實現(xiàn)。參見，例如 Morrison 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 81:6851-6855 (1984)；Morrison 和 0i, Adv.Tmmunol.,44:65-92( 1988);Verhoeyen 等人，Science, 239: 1534-1536(1988)；Padlan,Molec.T`mmun.,28:489-498 (1991)；Padlan,Molec.Tmmun.,31 (3):169-217(1994)。
[0067]術(shù)語“相應(yīng)的人種系序列”指編碼人可變區(qū)氨基酸序列或子序列的核酸序列，與由人種系免疫球蛋白可變區(qū)序列編碼的全部其他已知的可變區(qū)氨基酸序列相比，所述核酸序列與參照可變區(qū)氨基酸序列或子序列共有所確定的最高的氨基酸同一性。相應(yīng)的人種系序列還可以指與全部其他被評價的可變區(qū)氨基酸序列相比，與參照可變區(qū)氨基酸序列或子序列具有最高的氨基酸序列同一性的人可變區(qū)氨基酸序列或子序列。相應(yīng)的人種系序列可以是單獨的構(gòu)架區(qū)、單獨的互補決定區(qū)、構(gòu)架區(qū)和互補決定區(qū)、可變區(qū)段(如上所定義)或者包含可變區(qū)的序列或子序列的其他組合?？梢允褂帽疚闹兴龅姆椒ǎ?，使用本領(lǐng)域已知的BLAST、ALIGN或其他比對算法比對兩個序列，來確定序列同一性。相應(yīng)的人種系核酸或氨基酸序列可以與參照可變區(qū)核酸或氨基酸序列具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。可以例如通過公共可獲得的國際ImMunoGeneTics數(shù)據(jù)庫(IMGT)(在 imgt.cines.fr/ 的全球網(wǎng)上)和 V-base (在 vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk 的全球網(wǎng)上)確定相應(yīng)的人種系序列。
[0068]當(dāng)用于描述抗原，例如蛋白質(zhì)與抗體或抗體衍生的結(jié)合劑之間的相互作用時，短語“特異地(或者選擇地)結(jié)合”，指結(jié)合反應(yīng)，其確定抗原在蛋白質(zhì)的異源群體以及其他生物制品中，例如生物樣品，如血液、血清、血漿或組織樣品中的存在。因此，在設(shè)定的免疫測定條件下，抗體或結(jié)合劑與特定抗原結(jié)合的特定的結(jié)合特異性至少是背景的兩倍，并且基本上不以顯著量與樣品中存在的其他抗原結(jié)合。在此種條件下與抗體或結(jié)合劑的特異性結(jié)合可能需要已經(jīng)選擇了抗體或試劑對特定蛋白質(zhì)的特異性。根據(jù)需要或者根據(jù)情況，這種選擇可以通過去除與，例如來自其他物種(例如小鼠)的PCSK9分子或者其他PCSK亞型交叉反應(yīng)的抗體實現(xiàn)?？梢詫⒍喾N免疫測定形式用于選擇與特定蛋白質(zhì)特異地進行免疫反應(yīng)的抗體。例如，常規(guī)地將固相ELISA免疫測定用于選擇與蛋白質(zhì)特異地進行免疫反應(yīng)的抗體(對于可用于測定特異性免疫反應(yīng)的免疫測定形式和條件的描述，參見例如Harlow&Lane，Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998))。通常，特異性或選擇性結(jié)合反應(yīng)會產(chǎn)生至少兩倍于背景信號，并且更一般地至少10-100倍于背景的信號。
[0069]術(shù)語“平衡解離常數(shù)(KD，M)”指解離速率常數(shù)(kd，時間―1)除以結(jié)合速率常數(shù)(ka，時間Λμ—1)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域任何已知的方法測量平衡解離常數(shù)。本發(fā)明抗體通常具有低于約10〃或10-8Μ的平衡解離常數(shù)。
[0070]如本文中所用，術(shù)語“抗原結(jié)合區(qū)”指本發(fā)明PCSK9-結(jié)合分子的結(jié)構(gòu)域，其負責(zé)分子和PCSK9之間特異性結(jié)合?？乖Y(jié)合區(qū)包括至少一個抗體重鏈可變區(qū)和至少一個抗體輕鏈可變區(qū)。在本發(fā)明的每一個PCSK9-結(jié)合分子中至少存在一個這樣的抗原結(jié)合區(qū)，并且每一抗原結(jié)合區(qū)可以與其他抗原結(jié)合區(qū)相同或者不同。在一些實施方案中，本發(fā)明PCSK9-結(jié)合分子的至少一個抗原結(jié)合區(qū)起著PCSK9的拮抗劑的作用。
[0071]如本文中所用，術(shù)語“拮抗劑”指能特異地結(jié)合并抑制靶分子的活性的試劑。例如，PCSK9的拮抗劑與PCSK9特異地結(jié)合，并完全或者部分抑制PCSK9介導(dǎo)的LDLR的降解。如本文中所用，抑制PCSK9介導(dǎo)的LDLR的降解干擾了 PCSK9與LDLR的結(jié)合。在一些情況下，可以通過PCSK9拮抗劑與PCSK9結(jié)合并且抑制PCSK9與LDLR結(jié)合的能力來鑒定PCSK9拮抗劑。與對照存在的情況下或者拮抗劑不存在的情況下PCSK9介導(dǎo)的降解相比，當(dāng)暴露于本發(fā)明拮抗劑且抑制了 PCSK9介導(dǎo)LDLR降解時，發(fā)生的抑制為至少約10%、例如至少約25%、50%、75%或者完全抑制?？梢詫φ毡┞队跊]有抗體或抗原結(jié)合分子、特異地結(jié)合另一個抗原的抗體或抗原結(jié)合分子、抗PCSK9抗體或者已知不作為拮抗劑發(fā)揮作用的抗原結(jié)合分子。“抗體拮抗劑”指拮抗劑是抑制抗體的情況。
[0072]術(shù)語“PCSK9”或“前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin9a型”可互換地指屬于分泌性枯草桿菌蛋白酶家族的蛋白酶K亞家族的天然存在的人前蛋白轉(zhuǎn)化酶。PCSK9合成為可溶性酶原，其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中經(jīng)歷自身催化的分子內(nèi)加工，并認為PCSK9的功能為前蛋白轉(zhuǎn)化酶。PCSK9在膽固醇穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用，并在皮層神經(jīng)元的分化中起作用。PCSK9基因的突變與常染色體顯性家族性高膽固醇血癥的形成相關(guān)。參見，例如Burnett andHooper,Clin Biochem Rev (2008)29 (1):11_26。PCSK9的核酸和氨基酸序列是已知的，并且已經(jīng)分別在GenBank登錄號NM_174936.2和NP_777596.2中公開。如本文中所用，PCSK9多肽在功能上與LDLR結(jié)合，并促進LDLR的降解。在結(jié)構(gòu)上，PCSK9氨基酸序列與GenBank登錄號 NP_777596.2 的氨基酸序列具有至少約 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或100%的序列同一性。在結(jié)構(gòu)上，PCSK9氨基酸序列與GenBank登錄號NM_174936.2的氨基酸序列具有至少約 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。
[0073]短語“PCSK9功能獲得型突變”指在PCSK9基因中發(fā)生的天然突變，其與家族性高膽固醇血癥表型、加速的動脈粥樣硬化和早發(fā)冠心病相關(guān)和/或與上述病癥的成因相關(guān)，所述成因例如是由于增加的LDLR降解和LDLR水平的降低。PCSK9功能獲得型突變的等位基因頻率是罕見的。參見，Burnett 和 Hooper，Clin Biochem Rev.(2008) 29 (1):1_26。示例性PCSK9功能獲得型突變包括D129N、D374H、N425S和R496W。參見，F(xiàn)asano,等人，Atherosclerosis (2009) 203 (1):166_71。例如，在 Burnett 和 Hooper,上述；Fasano,等人，上述；Abifadel,等人，J Med Genet (2008) 45 (12):780-6 ;Abifadel,等人，HumMutat (2009) 30 (4):520_9 ;和 Li，等人，Recent Pat DNA Gene Seq (2009) 11 月 I 日(PMID19601924)中綜述了 PCSK9功能獲得型突變。
[0074]本發(fā)明多肽的“活性”指多肽在其天然細胞或組織中的結(jié)構(gòu)功能、調(diào)節(jié)功能或生物化學(xué)功能。多肽活性的實例包括直接活性和間接活性。PCSK9的示例性直接活性是與多肽直接相互作用的結(jié)果，包括與LDLR結(jié)合和PCSK9-介導(dǎo)的LDLR的降解。就PCSK9而言，示例性間接活性觀察為細胞、組織、器官或受試者的表型的改變或者對多肽的直接活性的應(yīng)答的改變，例如降低增加的肝LDLR、降低血漿HDL-C、減少血漿膽固醇、增加了對抑制素的敏感性。
[0075]當(dāng)應(yīng)用于核酸或蛋白質(zhì)時，術(shù)語“分離的”指核酸或蛋白質(zhì)基本上沒有其他細胞組分，所述細胞組分在天然狀態(tài)下是與所述核酸或蛋白質(zhì)相伴隨的。所述核酸或蛋白質(zhì)優(yōu)選地是均一狀態(tài)。它可以是干的或者是水溶液。通常使用分析化學(xué)技術(shù)，例如聚丙烯酰胺凝膠電泳或者高效液相層析測定純度和均一性。在制備物中以主要種類存在的蛋白質(zhì)是基本上純化的。特別地，分離的基因與基因側(cè)翼的可讀框分離，并且編碼不同于目的基因的蛋白質(zhì)。術(shù)語“純化的”指核酸或蛋白質(zhì)在電泳凝膠上基本上只產(chǎn)生一條帶。特別地，它指的是核酸和蛋白質(zhì)是至少85%的純度、更優(yōu)選地至少95%的純度，最優(yōu)選地至少99%的純度。
[0076]術(shù)語“核酸”或“多肽”指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特定限制，該術(shù)語包括含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有與參照核酸相似的結(jié)合性質(zhì)，并以與天然存在的核苷酸相似的方式代謝。除非另外指明，特定的核酸序列還隱含地包括經(jīng)保守修飾的變體(例如，簡并密碼子取代)、等位基因、直向同源物、SNP、互補序列，以及明確指出的序列。特別地，可以通過用混合的堿基和/或脫氧肌苷殘基取代一個或多個選定的(或者全部)密碼子的第三個位置而產(chǎn)生的序列，來實現(xiàn)簡并密碼子取代(Batzer 等人`，Nucleic Acid Res.19:5081 (1991) ;0htsuka 等人，J.Biol.Chem.260:2605-2608 (1985);和 Rossolini 等人，Mol.Cell.Probes8:91-98(1994))。
[0077]術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換地用于指氨基酸殘基的聚合物?？蓪⒃撔g(shù)語用于氨基酸聚合物(其中一個或多個氨基酸殘基是相應(yīng)天然存在的氨基酸的人工化學(xué)模擬物)，天然存在的氨基酸聚合物以及非天然存在的氨基酸聚合物。
[0078]術(shù)語“氨基酸”指天然存在的氨基酸和合成的氨基酸，以及以與天然存在的氨基酸相似的方式發(fā)揮作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼編碼的那些氨基酸，以及后來經(jīng)修飾的那些氨基酸，例如羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物指與天然存在的氨基酸具有相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，即與氫結(jié)合的α-碳、羧基、氨基和R基，例如高絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亞砜、蛋氨酸甲基锍(methionine methyl sulfonium)。此類類似物具有經(jīng)修飾的R基(例如正亮氨酸)或者經(jīng)修飾的肽主鏈，但保留了與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物指化學(xué)化合物，其具有與氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)，但以與天然存在的氨基酸相似的方式發(fā)揮作用。
[0079]“經(jīng)保守修飾的變體”應(yīng)用于氨基酸和核酸序列。對于特定的核酸序列，經(jīng)保守修飾的變體指編碼相同的或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或者其中該核酸并不編碼氨基酸序列或者指基本上相同的序列。由于遺傳密碼的簡并性，大量在功能上相同的核酸編碼任一給定的蛋白質(zhì)。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和G⑶都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在通過密碼子指定的丙氨酸的每一位置處，都可以在不改變所編碼的多肽的情況下，將密碼子改變成任一相應(yīng)的所述密碼子。此類核酸變異是“沉默變異”，其是經(jīng)保守修飾的變異的一種。本文中編碼多肽的每一核酸序列還描述了該核酸的每一種可能的沉默變異。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以修飾核酸中的每一密碼子(除通常作為甲硫氨酸的唯一密碼子的AUG和通常作為色氨酸的唯一密碼子的TGG外)，以產(chǎn)生在功能上相同的分子。因此，編碼多肽的核酸的每一沉默變異隱含在每一所述的序列中。
[0080]對于氨基酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，通過改變、添加或者缺失編碼序列中的單個氨基酸或者小部分的氨基酸而導(dǎo)致核酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列的單個取代、缺失或添加都是“經(jīng)保守修飾的變體”，其中改變導(dǎo)致氨基酸被取代為化學(xué)上相似的氨基酸。本領(lǐng)域熟知提供功能上相似的氨基酸的保守取代表。此類經(jīng)保守修飾的變體另外地并不排除本發(fā)明的多態(tài)變體、種間同源物和等位基因。
[0081]以下八組都含有相互保守取代的氨基酸:
[0082]I)丙氨酸(A)，甘氨酸(G);
[0083]2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；
[0084]3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；
[0085]4)精氨酸(R)，`賴氨酸(K)；
[0086]5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)；
[0087]6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；
[0088]7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T);和
[0089]8)半胱氨酸(C),甲硫氨酸(M)(參見,例如 Creighton, Proteins (1984))。
[0090]“序列的同一性百分比”通過在比較窗口上比較兩個最佳比對的序列確定，其中與用于兩個序列最佳比對的不包含添加或缺失的參照序列(例如，本發(fā)明多肽)相比，比較窗口中多核苷酸序列部分可以包含添加或缺失(即，空位)。通過以下計算百分比:通過確定兩個序列中存在的相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)目來產(chǎn)生匹配位置的數(shù)目，將匹配位置的數(shù)目除以比較窗口中位置的總數(shù)，將結(jié)果乘以100從而產(chǎn)生序列的同一性百分比。
[0091]就兩個或兩個以上核酸或多肽序列而言，術(shù)語“同一性”或“同一性百分比”指相同的兩個或兩個以上多個序列或子序列。當(dāng)使用以下序列比較算法之一或者通過人工比對和目視檢查在比較窗口上或者所測量的指定區(qū)域上比較并比對最大一致性時，如果兩個序列具有相同的氨基酸殘基或核苷酸的特定百分比(即，在特定區(qū)域上，或者當(dāng)沒有指定時，在參照序列的整個序列上具有 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性)，那么兩序列是“基本上同一的”。本發(fā)明提供了分別與本文中所示例的多肽或多核苷酸(例如，在SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll和40-41的任意之一中示例的可變區(qū)；在SEQ ID NO:25-29的任意之一中示例的可變區(qū)段；在SEQ ID NO: 13-24的任意之一中示例的CDR ;在SEQ ID NO: 30-39的任意之一中示例的FR ;和在SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12和46-49的任意之一中不例的核酸序列)基本上同一的多肽或多核苷酸。任選地，在至少約15、25或50個核苷酸長度的區(qū)域上或者更優(yōu)選地，在100-500或1000或者以上核苷酸長度的區(qū)域上或者在參照序列的全長上存在同一性。就氨基酸序列而言，可以在至少5、10、15或20個氨基酸長度，任選地至少約25、30、35、40、50、75或100個氨基酸長度，任選地至少約150、200或250個氨基酸長度的區(qū)域上或者在參照序列的全長上存在同一性或基本同一性。就更短的氨基酸序列，例如20個或者更少氨基酸的氨基酸序列而言，當(dāng)根據(jù)本文中所定義的保守取代，保守取代了一個或兩個氨基酸殘基時，存在基本同一性。
[0092]對于序列比較，通常將一個序列作為參照序列與測試序列比較。當(dāng)使用序列比較算法時，將測試和參考序列輸入到計算機中，指定子序列坐標(biāo)(subsequence coordinate),根據(jù)需要，并指定序列算法程序參數(shù)?？梢允褂媚J程序參數(shù)，或者指定備選的參數(shù)。然后，基于程序參數(shù)，序列比較算法計算測試序列相對于參照序列的序列百分比同一性。
[0093]如本文中所用，“比較窗口”包括提及選自20至600，通常約50至約200，更通常地約100至約150個連續(xù)位置數(shù)的任意之一的區(qū)段，其中在最佳地比對該序列與相同數(shù)目連續(xù)位置的參照序列后，可以比較這兩個序列。比對用于比較的序列的方法是本領(lǐng)域熟知的。例如通過Smith和Waterman (1970)Adv.App1.Math.2:482c的局部同源性算法、通過Needleman 和 Wunsch (1970) J.Mol.Biol.48:443 的同源性算法、通過 Pearson 和 Lipman,(1988) Proc.Nat’ 1.Acad.Sc1.USA85:2444的檢索相似性的方法、通過這些算法的計算機化實現(xiàn)(GAP、BESTFIT、FASTA 和 Wisconsin 遺傳軟件包中的 TFASTA，Genetics ComputerGroup, 575Science Dr.,Madison,WIO)或者通過人工比對和目視檢查(參見，例如，Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology) (1995 增刊))，可以進行用于比較的序列的最佳比對。
[0094]適合于測定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的兩個實例是BLAST和 BLAST2.0 算法，其分別描述于 Altschul 等人，(1977) Nuc.Acids Res.25:3389-3402 ；和Altschul等人，(1990) J.Mol .Biol.215:403-410中。用于進行BLAST分析的軟件是可從國家生物技術(shù)信息中心(National Centre for Biotechnology Information)公開得到的。該算法涉及通過在查詢序列中鑒定W長度的短字來首先鑒定高得分的序列對(HSP)，當(dāng)與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字比對時，所述序列對匹配或者滿足了一些正值閾值得分(positive-valued threshold score) T。T 稱為鄰近字得分閾值(Altschul 等人,上述)。將這些最初的鄰近字命中作為啟動檢索的種子以尋找含有它們的更長HSP。字命中沿著每一序列的兩個方向延伸，只要積累的比對得分可以增加。對于核苷酸序列，使用參數(shù)M (匹配殘基對的獎勵得分；總是大于0)和N (錯配殘基的罰分；總是小于0)計算積累得分。對于氨基酸序列，使用評分矩陣來計算積累得分。在以下情況下，中止在每一方向中字命中的延伸:積累比對得分從其最大達到值減少了 X值；由于一個或多個負得分殘基比對的積累，積累得分變成了 O或者更低；或者到達了任一序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定了比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(對于核苷酸序列)使用字長(W) 11、期望(E) 10、M=5、N=-4作為默認值，并比較兩條鏈。對于氨基酸序列，BLASTP程序使用3的字長、10的期望
(10)，以及 BL0SUM62 得分矩陣(參見 Henikoff 和 Henikoff，(1989) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:10915),50的比對(B)、10的期望(Ε)、M=5、N=_4作為默認值，并比較兩條鏈。[0095]BLAST算法還進行兩個序列之間相似性的統(tǒng)計學(xué)分析(參見，例如，Karlin和Altschul (1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:5873_5787)。BLAST 算法提供的相似性的一種測量方法是最小和概率(smallest sumprobability) (P(N)),其提供了兩個核苷酸序列或者氨基酸序列之間偶然發(fā)生匹配的概率的指示。例如，如果在測試核酸與參照核酸的比較中，最小和概率低于約0.2，更優(yōu)選地低于約0.01，以及最優(yōu)選地低于約0.001，那么認為核酸與參照序列相似。
[0096]兩個核酸序列或多肽是基本上相同的另一個指標(biāo)是由第一核酸編碼的多肽與針對由第二核酸編碼的多肽產(chǎn)生的抗體在免疫學(xué)上交叉反應(yīng)。因此，該多肽通常基本上與第二多肽相同，例如，其中兩種肽僅是保守性取代的不同。如下所述，兩個核酸序列是基本上相同的另一種指標(biāo)是，在嚴格條件下兩個分子或其互補核酸序列相互雜交。兩種核酸序列是基本上相同的又一個指標(biāo)是，可以將相同的引物用于擴增序列。
[0097]當(dāng)就描述本發(fā)明PCSK9結(jié)合分子內(nèi)抗原結(jié)合區(qū)如何連接而言使用時，術(shù)語“連接”包括物理連接該區(qū)域的全部可能方法。常常通過直接鍵合(即在兩個抗原結(jié)合區(qū)之間沒有接頭)或者間接鍵合(即在兩個或兩個以上抗原結(jié)合區(qū)之間借助于至少一個接頭分子)的化學(xué)鍵如共價鍵(例如，肽鍵或二硫鍵)或非共價鍵連接多個抗原結(jié)合區(qū)。
[0098]術(shù)語“受試者”、“患者”和“個體”可互換地指哺乳動物，例如人類或非人靈長類哺乳動物。哺乳動物還可以是實驗室哺乳動物，例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠。在一些實施方案中，哺乳動物可以是農(nóng)業(yè)哺乳動物(例如，馬、綿羊、牛、豬、駱駝(camelid))或者馴養(yǎng)哺乳動物(例如，犬、貓科動物)。
[0099]術(shù)語“可治療用的量”或“治療有效量”可互換地指足以實現(xiàn)期望結(jié)果(B卩，降低血漿中的非HDL-C、高膽固醇血癥、動脈粥樣硬化、冠心病)的量。在一些實施方案中，可治療用的量并不誘導(dǎo)或者導(dǎo)致不期望的副作用?？梢酝ㄟ^首先施用低劑量，然后逐漸地增加劑量，直到實現(xiàn)期望的作用來 確定可治療用的量。本發(fā)明“預(yù)防有效量”和“治療有效量”的PCSK9拮抗抗體可以分別預(yù)防與PCSK9的存在相關(guān)的疾病癥狀(例如，高膽固醇血癥)的發(fā)病或者導(dǎo)致所述疾病癥狀的嚴重程度的降低。所述術(shù)語還可以分別促進或增加無疾病癥狀的頻率和持續(xù)時間?！邦A(yù)防有效量”和“治療有效量”還可以分別預(yù)防或減輕由于PCSK9活性導(dǎo)致的病癥和疾病產(chǎn)生的損傷和殘疾。
[0100]術(shù)語“共同施用”指在個體的血液中同時存在兩種活性劑。可以同時或者順次地遞送共同施用的活性劑。
[0101]術(shù)語“抑制素”指一類藥劑，其是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A (HMG-CoA)還原酶的競爭性抑制劑。
[0102]附圖簡述
[0103]圖1顯示了親本小鼠單克隆抗體MABl的重鏈氨基酸序列(SEQ ID N0:1)和輕鏈氨基酸序列(SEQ ID N0:3)。CDR1、CDR2和CDR3的序列以下劃線和加粗表示。
[0104]圖2顯不了 Humaneered?抗體MAB2的重鏈氨基酸序列(SEQ ID NO: 5)和輕鏈氨基酸序列(SEQ ID N0:7)。CDR1、CDR2和CDR3的序列以下劃線和加粗表示。
[0105]圖3顯示了 Humaneered?抗體MAB3的重鏈氨基酸序列(SEQ ID NO:9)和輕鏈氨基酸序列(SEQ ID NO: 11)。CDR1、CDR2和CDR3的序列以下劃線和加粗表示。
[0106]圖4A-B顯示了與MABl相比，測試(A)MAB2和⑶MAB3與幾種不同的人和小鼠抗原結(jié)合的ELISA測定。
[0107]圖5A-C顯示了 MAB2和MAB3與⑷人Pcsk9和⑶食蟹猴Pcsk9的結(jié)合。(C)將數(shù)據(jù)擬合到Piehler,等人，(1997) J Immunol Methods201:189-206中所述的模型，并且從該擬合中計算Kd值。該圖代表至少2次獨立實驗。
[0108]圖6基于氘交換質(zhì)譜，顯示了有可能與氨基酸殘基159-182 (ERITPPRYRADEYQPPDGGSLVE ；SEQ ID N0:42)內(nèi)的表位結(jié)合的親本小鼠單克隆抗體，MAB1。使用與Chalmers等人，AnalChem2006,78,1005-1014中所述的相似設(shè)定和相似方式進行自動氫/氘交換質(zhì)譜。簡言之，將 LEAP Technologies Pal HTS 液體-處理器(LEAP Technologies, Carrboro,NC)用于全部液體的處理操作。通過LEAP Shell中記錄的自動化腳本控制液體-處理器，并放置于維持在2V的冷藏罩中。將6孔進樣閥和水洗工位安裝在液體-處理器軌道上，并協(xié)助將樣品注射到層析系統(tǒng)中以及洗滌注射器。對于在線消化，將酶柱(ABI固定化胃蛋白酶)放置在進樣閥和捕獲柱之間的線上。將由兩個另外的閥門(15kPSI Valeo, Houston, ΤΧ),4 μ L EXPHalo C18 反相捕獲筒(Optimize Technologies Inc., Oregon City, OR)和分析柱(300 μ mID, Halo2.7 μ m C18, MichromBioresources Inc.)組成的層析系統(tǒng)放置在單獨的冷卻罩中，所述冷卻罩安裝在LTQ-Orbitrap質(zhì)譜儀(ThermoElectron Corp.)的前面。通過安裝在罩頂部的peltier冷卻器將放置層析系統(tǒng)的罩的溫度維持在(TC。對于PCSK9的分析，在開始每一次實驗之前，將含有樣品、稀釋劑、還原劑和淬滅劑的4個96孔板裝載到液體-處理器中。每一次注射之前，將25 μ L的蛋白質(zhì)溶液(~2mg/mL)與25 μ L的50mM TEA緩沖液(pH7.4)或者含~21 μ gl3C10-FAB的25 μ L50mM TEA緩沖液(ρΗ7.4)混合，并允許混合30分鐘。為了起始交換反應(yīng)，加入150 μ L的D2O緩沖液(D20，150mMNaCl)或H2O緩沖液(150mMNaCl )，并允許交換I分鐘。然后加入200uL的redux緩沖液(IM TCEP，8M尿素，ρΗ4.0)，并允許混合物反應(yīng)~I分鐘。然后用300uL的淬滅緩沖液(5%TFA)淬滅混合物，以將混合物的PH值降低至pH2.5。然后注射500uL的樣品并且在線消化，通過如下所述的LC-MS捕獲并分析得到的肽。層析系統(tǒng)使用兩個單獨的HPLC泵，以進行線內(nèi)消化，將經(jīng)消化的肽捕獲到C18捕獲柱上，并通過分析柱洗脫捕獲的肽。以125 μ L/分鐘的流速(0.05%TFA)運行的“裝載”泵將樣品從PAL進樣閥試樣環(huán)管(500 μ L)經(jīng)胃蛋白酶柱轉(zhuǎn)移到反相捕獲筒中。在6分鐘的上樣步驟后，開啟第一 15kPSI閥，以允許液體從“梯度”泵流經(jīng)捕獲器(3分鐘脫鹽期(25 μ L/分鐘))。脫鹽步驟后，開啟第二 15kPSI閥，以協(xié)助肽從捕獲器中洗脫并進入分析柱和質(zhì)譜儀的離子源中。梯度泵(Waters Nano Acquity)以5 μ L/分鐘遞送0-40%梯度的移動相B，然后遞送40-75%第二梯度的移動相B。梯度的總時間為75分鐘。梯度泵緩沖液組合物為A:99.75:0.25%v/v (H2O:甲酸)和B:99.75:0.25%v/v (乙腈:甲酸)。對于質(zhì)譜，在LTQ-Orbitrap (ThermoElectron, San Jose, CA)上進行 LC-ES1-MS。進行數(shù)據(jù)-依賴性 MS/MS實驗，以收集串聯(lián)質(zhì)譜，其用于鑒定通過蛋白酶解產(chǎn)生的肽的序列。對于這些獲取，MS/MS在LTQ中獲取，并且MS掃描在Orbitrap中獲取。出于測定氘化水平的目的進行了獲取，在Orbitrap (m/z400-2000以上)中，以60，000的分辨率獲取。用于全部實驗的儀器參數(shù)包括3.5kV的噴霧電壓、1000ms的最大注射時間、靶向50，000離子的MS的LTQ AGC和靶向I, 000, 000離子的MS的FTMS AGC。使用內(nèi)部程序(RawXtract)，將Orbitrap.RAff文件轉(zhuǎn)變成.mzXML文件。隨后，將.mzXML文件轉(zhuǎn)變成.mzBIN文件，使用SEQUEST(ThermoElectron)檢索串聯(lián)MS獲取。使用妝序列鑒定，將內(nèi)部編與的程序(Deutoronomy)用于對每一鑒定序列自動地提取層析譜，并產(chǎn)生平均譜。然后平滑化并矩心化平均譜，以測定氘吸收的水平。最初的自動處理后，人工驗證或者使用Deutoronomy中構(gòu)建的交互數(shù)據(jù)指示器校準(zhǔn)每一平均譜的質(zhì)量和矩心化(quality and centroiding)。使用基于bio-layer干涉法的表位競爭測定，發(fā)現(xiàn)Humaneered?抗體MAB2和MAB3與MABl競爭相同的表位。
[0109]圖7顯示了如在時間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移(TR-FRET)生物化學(xué)測定法中所測定，MAB2和MAB3能阻斷PCSK9與LDL-R之間的相互作用。Pcsk9拮抗劑抗體與Pcsk9的結(jié)合可以破壞Pcsk9與LDLr形成復(fù)合體的能力，從而保護LDLr免于下調(diào)/降解，并增強LDL攝取。為了對Pcsk9拮抗劑抗體進行測試，將用熒光團標(biāo)記的人PCSK9(hPCSK9-AF)和測定緩沖液(20mM HEPES，pH7.2、150mM NaCl, ImM CaCl2,0.l%v/vTween20 和 0.l%w/v BSA沖的MAB2或MAB3 —起室溫溫育30分鐘。然后加入銪標(biāo)記的LDL_R(hLDL-R-Eu)，又在室溫溫育90分鐘，以使終濃度為hPcsk9-AF8nM和hLDL-R-EulnM。使用酶標(biāo)儀測量(EnVision2100，Perkin Elmer )TR-FRET信號(330nm激發(fā)光和665nm發(fā)射光)，并計算Pcsk9抗體存在下的％抑制。通過在Prism(GraphPad)中對抑制百分比值作圖來計算IC5tl值。每一數(shù)據(jù)點表示為平均值土SD (η=每個點4次重復(fù))。數(shù)據(jù)代表了至少兩次獨立的實驗。Humaneered?抗體MAB2和MAB3能分別以20nM和28nM的IC5tl值破壞復(fù)合體，這與發(fā)現(xiàn)的親本抗體MAB177nM的IC5tl是相當(dāng)?shù)?數(shù)據(jù)未顯示)。
[0110]圖8顯示，對于導(dǎo)致增加的LDL-R水平和H印G2細胞對LDL-的攝取，Humaneered?抗體MAB2和MAB3與小鼠抗體MABl是等同的。對于LDL-R測量，將細胞和結(jié)合PCSK9的抗體一起溫育，并用抗LDL-R抗體標(biāo)記所述細胞。對于LDL攝取，將細胞和結(jié)合PCSK9的抗體、PCSK9和Di1-LDL —起溫育。通過流式細胞術(shù)測量LDL-R抗體和Di1-LDL熒光。MAB2和MAB3的圖顯示了重復(fù)測量的平均值土SEM。結(jié)果代表了 2次獨立的實驗。
[0111]對于LDL-攝取測定，在含10%脂蛋白缺失的胎牛血清(Intracel)和200nM人PCSK9的DMEM中室溫溫育結(jié)合PCSK9的抗體30分鐘(Hampton等人PNAS (2007) 104:14604-14609)，將抗體/`PCSK9/培養(yǎng)基溶液加入到96-孔板中的細胞中，并培養(yǎng)過夜。第二天，加入I, I’-雙十八烷基_3，3，3’，3’-四甲基吲哚羰花青-高氯酸鹽(1，l'-dioctadecyl-3, 3, 3' , 3' -tetramethyl-1ndocarbocyanine perchlorate)標(biāo)記的 LDL (Dil-LDL,Biomedical Technologies)，另外溫育2小時。然后吸去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞三次，并用0.25%胰酶-EDTA分散細胞。然后將細胞轉(zhuǎn)移到FACS緩沖液(含5%胎牛血清、2mM EDTA和0.2%疊氮化鈉)中，1000 Xg離心10分鐘，吸干，并固定于1%的多聚甲醛中。使用流式細胞儀(Becton Dickinson LSR II )，通過細胞DiI熒光(488nm的激發(fā)光和575nm的發(fā)射光)測量LDL攝取。對于表面LDL-R測定，用含抗體的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，用PBS洗滌，并收獲于Versine (Biowhittaker, 17-771E)和FACS緩沖液中。將細胞轉(zhuǎn)移到新的平板中，在1200Xrpm離心5分鐘，并用正常的兔IgG (MP biomedicals)封閉。在FACS緩沖液中，用兔抗hLDL-R_Alexa647IgG (5 μ g/ml)標(biāo)記的抗體標(biāo)記細胞,離心、洗漆，并固定于1%的多聚甲醛中。通過流式細胞儀(488nm的激發(fā)光和633nm的發(fā)射光)測量表面LDL-R。使用Prism (GraphPad)計算 ECS0。
[0112]圖9提供了用于測定本發(fā)明抗體的降低膽固醇效應(yīng)的人PCSK9灌輸小鼠模型的研究設(shè)計示意圖。MAB2和MAB3是以高親和力結(jié)合hPCSK9的Humaneered?抗PCSK9抗體(檢測不到與鼠PCSK9的結(jié)合)。為了測試抗體是否能抑制hPCSK9介導(dǎo)的非HDL膽固醇的升高和防止PCSK9介導(dǎo)的肝LDL-R的降解，在含hPCSK9的滲透微型泵植入(用于連續(xù)輸注)前3小時，將每一個抗體都注射到小鼠中。hPCSK9注射后的第24小時進行血漿和肝組織獲取。
[0113]圖10顯示在灌輸小鼠模型中，用抗體MAB2和MAB3進行的治療導(dǎo)致了人PCSK9(“hPCSK9”)的積累。通過Meso Scale Discovery (MSD)測定法定量了血衆(zhòng)IgG和hPCSK9水平。對于IgG MSD測定法，使用MSD標(biāo)準(zhǔn)96板(LI 1XA-3)。簡言之，在4°C，用25-28 μ I在PBS中的I μ g/ml捕獲抗原PCSK9_Hi s過夜包被平板(25_28ng/孔)。棄去包被溶液，并用150 μ I/孔的MSD Blocker A (R93AA-2)在室溫振蕩封閉平板I小時。用PBS+0.059^?6611-2030(^1洗滌平板3次后，加入25 4 1的IgG校準(zhǔn)稀釋液(用MSD blockerA從10，000-0.0003ng/ml進行的10個連續(xù)稀釋)、未知血漿樣品稀釋液(用MSD blocker A稀釋10，000倍)或質(zhì)量控制樣品，室溫振蕩溫育I小時。洗滌后，加入25 μ I/孔的I μ g/ml檢測抗體(用l%BSA/PBS/0.05%Tween20稀釋的MSD山羊抗小鼠SULF0-TAG標(biāo)記的檢測抗體，R32AC-5) (MSD山羊抗人SULF0-TAG標(biāo)記的檢測抗體，R32AJ-5)并室溫振蕩溫育I小時。洗滌后，加入150μ I/孔的IX讀取緩沖液Τ，立即在MSD SECTOR Imager6000上讀取平板。使用MSD數(shù)據(jù)分析軟件計算標(biāo)準(zhǔn)曲線和未知樣品的圖。
[0114]通過Meso Scale Discovery(MSD)測定法定量血衆(zhòng)IgG水平。使用hPCSK9捕獲，測量游離的抗體。該測定法測量“游離的”抗體，并且有可能測量1:1的Ab:PCSK9復(fù)合體。對于IgG MSD測定法，使用MSD標(biāo)準(zhǔn)96板(LI 1XA-3)。簡言之，在4°C，用25-28 μ I在PBS中的lug/ml捕獲抗原PCSK9-His過夜包被平板(25-28ng/孔)。去除包被溶液，并用150μ I/孔的 MSD Blocker A(R93AA_2)在室溫振蕩封閉平板 I 小時。用 PBS+0.05%Tween-20300 μ I洗滌平板3次后，加入25 μ I的IgG校準(zhǔn)稀釋液(用MSD blocker A從10，000-0.0003ng/ml進行的10個連續(xù)稀釋)、未知血漿樣品稀釋液(用MSD blocker A稀釋10，000倍)或質(zhì)量控制樣品，室溫振蕩溫育I小時。洗滌后，加入25 μ I/孔的I μ g/ml檢測抗體(用l%BSA/PBS/0.05%Tween20稀釋的MSD山羊抗小鼠SULF0-TAG標(biāo)記的檢測抗體，R32AC-5)并室溫振蕩溫育I小時。洗滌后，加入150 μ I/孔的IX讀取緩沖液Τ，立即在MSD SECTORImagereOOO上讀取平板。使用MSD數(shù)據(jù)分析軟件計算標(biāo)準(zhǔn)曲線和未知樣品的圖。
[0115]MSD hPCSK9測定法與Ig`G測定法相似，但具有以下不同。用I μ g/ml的25-28 μ I捕獲抗體(7D16.C3:2.95mg/ml)包被平板。封閉平板后，室溫振蕩溫育25 μ I的hPCSK9校準(zhǔn)稀釋液(來自10，000-0.0003ng/ml的10個點)和血漿樣品稀釋液(用MSD blockerA2，000倍稀釋)I小時，之后用一級檢測抗體(兔抗PCSK9多克隆抗體，Ab4，內(nèi)部RabbitID#RB11835)溫育。加入第二檢測抗體(MSD山羊抗小鼠SULF0-TAG標(biāo)記的檢測抗體，R32AC-5)以進行額外的溫育步驟，之后用MSD SECT0RImager6000讀數(shù)。
[0116]圖11顯示在證051(9灌輸小鼠模型中，抗體獻82和獻83導(dǎo)致血漿非冊14旦固醇的降低。預(yù)注射MAB2抗體導(dǎo)致52%的非HDL膽固醇免于hPCSK9介導(dǎo)的非HDL膽固醇升高。預(yù)注射MAB3導(dǎo)致了等量的非HDL膽固醇免于hPCSK9介導(dǎo)的非HDL膽固醇升高的保護。用僅載體、僅 PCSK9、PCSK9+20mg/kg MAB2 或 PCSK9+20mg/kg MAB3 處理 C57BL/6 小鼠。用標(biāo)界為水平條的平均值顯示各個值。為了定量血漿總膽固醇水平，使用Olympus臨床用分析儀(Olympus America Inc.:01ympusAU400)。在 ddH20 中以 1:3 稀釋血衆(zhòng)樣品，并根據(jù)廠商說明定量40μ I經(jīng)稀釋的血漿樣品的總膽固醇水平。為了定量血漿HDL和非HDL，使用來自Helena Laboratories的Spife3000獲得脂蛋白膽固醇級分。按照操作手冊提供的說明進行全部步驟，其包括樣品制備、凝膠制備、點樣、凝膠電泳、染色、洗滌和干燥。然后使用Slit5在Quick Scan2000中掃描凝膠,并使用Helena光密度計計算脂蛋白膽固醇級分的相對百分比。最后，通過每一級分的百分比乘以總膽固醇水平，來計算HDL和非HDL的絕對值。
[0117]圖12顯示了與“典型的” IgGl (PK)譜相比，抗體MAB2和MAB3 (沉默人IgGl)的大鼠藥物代謝動力學(xué)(PK)譜。沒有祀向介導(dǎo)配置(target mediated disposition) (TMD)的證據(jù)，表明抗體不與嚙齒動物PCSK9交叉反應(yīng)。對于每一測試抗體，以lOmgs/kg注射3只雄性Lewis大鼠。在時間=0小時、I小時、6小時、24小時、2天、4天、8天和16天，取樣250 μ I的血液，稀釋澄清的血漿，并且在捕獲ELISA (山羊抗人IgG)中評價所述血漿，以測量回收的總的人抗體。也產(chǎn)生每一測試抗體的標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對于在大鼠中預(yù)期回收的典型人IgG，對回收的IgG的量作圖。 [0118]發(fā)明詳述
[0119]1.簡介
[0120]本發(fā)明抗體和抗原結(jié)合分子特異地結(jié)合前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin9a型(“PCSK9”)。本發(fā)明抗PCSK9抗體和抗原結(jié)合分子與PCSK9的催化結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并破壞PCSK9/低密度脂蛋白受體(LDL-R)復(fù)合體，從而防止PCSK9介導(dǎo)的細胞LDL-R的下調(diào)和LDL更新。特別地，抗PCSK9抗體和抗原結(jié)合分子與位于PCSK9的催化結(jié)構(gòu)域中的PCSK9的殘基159-182內(nèi)的表位，例如氨基酸序列ERITPPRYRADEYQPPDGGSLVE (SEQ ID N0:42)內(nèi)的表位結(jié)合。本發(fā)明抗PCSK9抗體和抗原結(jié)合分子是PCSK9的拮抗劑，這是因為它們防止、減弱和/或抑制PCSK9與低密度脂蛋白受體(LDLR)之間的相互作用，并防止、減少和/或抑制PCSK9介導(dǎo)的LDL-R的降解，從而協(xié)助增加低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的攝取。發(fā)現(xiàn)可將抗PCSK9抗體和抗原結(jié)合分子用于治療患例如血脂異常、高膽固醇血癥、甘油三酯血癥和其他PCSK9介導(dǎo)的疾病的受試者。
[0121]I1.一般改進的抗PCSK9抗體
[0122]抗PCSK9抗體片段可以通過本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生，所述方法包括但不限于重組表達、化學(xué)合成和抗體四聚體的酶消化產(chǎn)生，而全長單克隆抗體可以通過例如，雜交瘤或重組產(chǎn)生獲得。可以在本領(lǐng)域已知的任意合適的宿主細胞中重組表達，所述宿主細胞是例如，哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆蟲宿主細胞等。當(dāng)存在時，抗PCSK9抗體的恒定區(qū)可以是任意類型或者亞型，根據(jù)需要，并且可以選自待用本發(fā)明方法治療的受試者的物種(例如，人類、非人靈長類或其他哺乳動物，如農(nóng)業(yè)用哺乳動物(例如，馬、綿羊、牛、豬、駱騎)、馴養(yǎng)哺乳動物(例如，犬、貓科動物)或者嚙齒動物(例如，大鼠、小鼠、倉鼠、兔))的恒定區(qū)。
[0123]在一些實施方案中，抗PCSK9抗體是人源化的或者Humaneered?。在一些實施方案中，恒定區(qū)同種型是IgG，例如IgGl。在一些實施方案中，人IgGl恒定區(qū)是突變的，以具有對效應(yīng)子配體如Fe受體(FcR)，例如細胞上的Fe Y Rl或者補體的Cl組分降低的結(jié)合親和力。參見，例如美國專利N0.5，624，821。含有此類突變的抗體介導(dǎo)的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)或者補體依賴性細胞毒性(CDC)降低或者無上述效應(yīng)。在一些實施方案中，IgGl恒定區(qū)的氨基酸殘基L234和L235被取代成Ala234和Ala235。重鏈恒定區(qū)中殘基的編碼為EU索引的編碼(參見，Kabat,等人，(1983) “Sequences of Proteins ofImmunological Interest, ,fM.S.Dept.Health and Human Services)。還參見，例如Woodle,等人，Transplantation (1999) 68 (5):608-616 ;Xu,等人，Cell Tmmunol (2000) 200 (I):16-26 ;和 Hezareh，等人，J Virol75 (24):12161_8。
[0124]本發(fā)明抗PCSK9抗體或抗原結(jié)合分子還包括具有駱駝支架的單結(jié)構(gòu)域抗原結(jié)合單位。駱駝家族的動物包括駱駝、駱馬和羊駝。駱駝產(chǎn)生無輕鏈的功能性抗體。重鏈可變(VH)域自動折疊并獨立地作為抗原結(jié)合單位發(fā)揮作用。與經(jīng)典的抗原結(jié)合分子(Fab)或單鏈可變片段(scFv)中的六個CDR相比，駱駝抗體的結(jié)合表面僅包括三個CDR。駱駝抗體能保留與常規(guī)抗體的那些結(jié)合親和力相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合親和力。可以使用本領(lǐng)域熟知的方法，例如 Dumoulin 等人，Nature Struct.Biol.11:500 - 515,2002 ；Ghahroudi 等人，F(xiàn)EBSLetters414:521 - 526，1997 ;和 Bond 等人，J MolBioh 332:643-55, 2003，產(chǎn)生具有本文中所示例的抗PCSK9抗體的結(jié)合特異性的基于駱駝支架的抗PCSK9分子。
[0125]本發(fā)明改進的抗PCSK9抗體是經(jīng)改造的具有V-區(qū)序列的人抗體，同時保留了參照抗體的特異性和親和力，所述V-區(qū)序列與人種系V-區(qū)序列具有基本的氨基酸序列同一性。參見，美國專利公開N0.2005/0255552和美國專利公開N0.006/0134098，在此處將所述專利并入本文作為參考。改進方法包括，從參照抗體的可變區(qū)鑒定確定抗原結(jié)合特異性所需的最小序列信息，將該信息轉(zhuǎn)移到人部分V-區(qū)基因序列的文庫中，以產(chǎn)生人抗體V-區(qū)的表位-集中文庫。可以將基于微生物的分泌系統(tǒng)用于表達文庫的成員，因為例如使用菌落轉(zhuǎn)移結(jié)合測定法(colony lift binding assay)可以針對抗原結(jié)合Fab,篩選抗體Fab片段和文庫。參見，例如美國專利公開N0.2007/0020685。可以進一步表征陽性克隆，以鑒定具有最高親和力的那些克隆。得到的經(jīng)改造的人Fab保留了親本(參照抗PCSK9抗體)的結(jié)合特異性，通常與親本抗體相比，所述經(jīng)改造的人Fab具有相當(dāng)?shù)幕蛘吒叩目乖H和力，并且與人種系抗體V-區(qū)相比，所述經(jīng)改造的人Fab具有高度序列同一性的V-區(qū)。
[0126]通常通過重鏈CDR 3 (“CDRH3”)內(nèi)的序列和輕鏈的CDR3 (“CDRL3”)內(nèi)的序列表示產(chǎn)生表位-集中文庫所需要的最小結(jié)合特異性決定簇(BSD)。BSD可以包含⑶R3的一部分或者全長。BSD可以包含連續(xù)的或者非連續(xù)的氨基酸殘基。在一些情況下，從與來自參照抗體的獨特CDR3-FR4區(qū)連接的人V-區(qū)段序列構(gòu)建表位-集中文庫，所述參照抗體含有BSD和人種系J-區(qū)段序列(參見，美國專利公開N0.2005/0255552)。備選地，可以通過連續(xù)的盒替換產(chǎn)生人V-區(qū)段文庫，其中最初用人序列的文庫替換參照抗體V-區(qū)段的一部分。然后，在第二次文庫篩選中重組在剩余的參照抗體氨基酸序列中支持結(jié)合的經(jīng)鑒定的人類“盒”。(參見，美國專利公開N0.2006/0134098)。
[0127]在每一種情況下，將含有來自參照抗體的特異性決定簇的經(jīng)配對的重鏈和輕鏈CDR3區(qū)段、CDR3-FR4區(qū)段或J-區(qū)段用于限制結(jié)合特異性，以使從文庫中獲得的抗原結(jié)合子(binder)保留參照抗體的表位特異性。在文庫構(gòu)建期間，可以將其他成熟的改變引入到每一鏈的CDR3區(qū)中，以鑒定具有最佳結(jié)合動力學(xué)的抗體。得到的經(jīng)改造的人抗體具有來源于人種系文庫的V-區(qū)段序列，保留了來自CDR3區(qū)的短BSD序列，并具有人種系構(gòu)架4 (FR4)區(qū)。
[0128]因此，在一些實施方案中，抗PCSK9抗體含有來源于最初的或者參照單克隆抗體的重鏈和輕鏈的⑶R3內(nèi)的最小結(jié)合序列決定簇(BSD)。重鏈和輕鏈可變區(qū)(⑶R和FR)的剩余序列，例如V-區(qū)段和J-區(qū)段來自相應(yīng)的人種系和親和力成熟的氨基酸序列。V-區(qū)段可以選自人V-區(qū)段文庫。通過親和力成熟可以實現(xiàn)其他序列的精制。
[0129]在另一個實施方案中，抗PCSK9抗體的重鏈和輕鏈含有來自相應(yīng)的人種系序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3)，例如選自人V-區(qū)段文庫的人V-區(qū)段，以及來自最初的單克隆抗體的CDR3-FR4序列區(qū)段?？梢酝ㄟ^用相應(yīng)的人種系序列替換序列區(qū)段和/或通過親和力成熟來進一步精制CDR3-FR4序列區(qū)段。例如，可以用相應(yīng)的人種系序列替換BSD周圍的FR4和/或⑶R4序列，而保留來自最初的單克隆抗體的⑶R3的BSD。
[0130]在一些實施方案中，重鏈V-區(qū)段的相應(yīng)人種系序列是VH22-05。在一些實施方案中，重鏈J-區(qū)段的相應(yīng)人種系序列是JH1、JH4或JH5。根據(jù)免疫球蛋白可變區(qū)基因的標(biāo)準(zhǔn)命名法參考可變區(qū)基因。通過全球網(wǎng)，例如在ImMunoGeneTics( IMGT)>V-base和PubMed數(shù)據(jù)庫上可得到當(dāng)前的免疫球蛋白基因信息。還參見，Lefranc, Exp Clin Immunogenet.2001 ；18 (2):100-16 ；Lefranc, Exp Clin Immunogenet.2001 ;18 (3): 161-74 ;Exp Cl inImmunogenet.2001 ； 18 (4):242-54 ;和 Giudicelli,等人，NucleicAcids Res.2005 年 I 月I H ；33 (數(shù)據(jù)庫期號):D256-61.。
[0131]在一些實施方案中，輕鏈V-區(qū)段的相應(yīng)人種系序列是VK102或VK1012。在一些實施方案中，輕鏈J-區(qū)段的相應(yīng)人種系序列是JK2。
[0132]在一些實施方案中，重鏈V-區(qū)段與氨基酸序列Q (I/V) TLKESGPVLVKPT (E/Q)TLTLTCTVSGFSLSTSG(M/V)GVGffIRQPPGKALEffLADIffffDDNKYYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAR (SEQ ID NO:27)具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。在一些實施方案中，重鏈V-區(qū)段與氨基酸序列
[0133]QITLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTSGVGVGWIRQPPGKALEWLADIffffDDNKYYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAR (SEQ ID NO:25)具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。在一些實施方案中，重鏈V-區(qū)段與氨基酸序列 QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTVSGFSLSTSGVGVGWIRQSPGKALEWLADIffffDDNKYYNPSLKSRLTI SKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAR 序列(SEQ ID NO: 26)具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。
[0134]在一些實施方案中，輕鏈V-區(qū)段與氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRA(G/S)Q(R/S)I(N/S)(H/N)NLHWYQQKPDESPRLLINFASRLISGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO:29)具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、85%、89%、90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。在一些實施方案中，重鏈V-區(qū)段與氨基酸序列 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAGQRISHNLHWYQQKPDESPRLLINFASRLISGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO:28)具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、85%、89%、90%、93%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。
[0135]在一些實施方案中:
[0136]i)重鏈 CDR3 包含氨基酸序列 ITTEGGFAY (SEQ ID NO: 17);并且
[0137]ii)輕鏈CDR3可變區(qū)包含氨基酸序列QQSNYWPLT (SEQ ID N0:24)。
[0138]在一些實施方案中，本發(fā)明抗體包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含含有氨基酸序列 TSG(M/V)GVG (SEQ ID NO: 15)的 CDRl ;含有氨基酸序列 DIffffDDNKYYNPSLKS (SEQID NO: 16)的 CDR2 ;和含有氨基酸序列 ITTEGGFAY (SEQ ID NO: 17)的 CDR3。
[0139]在一些實施方案中，本發(fā)明抗體包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含含有氨基酸序列 RA(G/S)Q(R/S) I (N/S) (H/N)NLH (SEQ ID NO:20)的 CDRl ;含有氨基酸序列 FASR(L/S)IS (SEQ ID NO:23)的 CDR2 ;和含有氨基酸序列 QQSNYWPLT (SEQ ID NO:24)的 CDR3。
[0140]在一些實施方案中，重鏈可變區(qū)包含含有氨基酸序列SEQ ID N0:32的FRl;含有氨基酸序列SEQ ID N0:33的FR2 ;含有氨基酸序列SEQ IDNO: 34的FR3 ;和含有氨基酸序列SEQ ID N0:35的FR4。經(jīng)鑒定的氨基酸序列可以具有一個或多個取代的氨基酸(例如，來自親和力成熟)或者一個或兩個經(jīng)保守取代的氨基酸。
[0141]在一些實施方案中，輕鏈可變區(qū)包含含有氨基酸序列SEQ ID N0:36的FRl;含有氨基酸序列SEQ ID NO:37的FR2 ;含有氨基酸序列SEQ ID NO:38的FR3 ;和含有氨基酸序列SEQ ID N0:39的FR4。經(jīng)鑒定的氨基酸序列可以具有一個或多個經(jīng)取代的氨基酸(例如，來自親和力成熟)或者一個或兩個保守取代的氨基酸。
[0142]在其全長上，本發(fā)明抗PCSK9抗體的可變區(qū)通常與相應(yīng)的人種系可變區(qū)氨基酸序列具有至少約 85%，例如至少約 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%的整體可變區(qū)(例如，F(xiàn)R1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)氨基酸序列同一性。例如，抗PCSK9抗體的重鏈與人種系可變區(qū)Vh22-05可以具有至少約85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性?？筆CSK9抗體的輕鏈與人種系可變區(qū) Vkl02 可以具有至少約 85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%的氨基酸序列同一性。在一些實施方案中，僅添加、缺失或者取代構(gòu)架區(qū)內(nèi)的氨基酸。在一些實施方案中，序列同一'I"生不包括⑶3。
[0143]在一些實施方案中，本發(fā)明抗PCSK9抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)與SEQ ID NO:40的重鏈可變區(qū)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%氨基酸序列同一性，且所述輕鏈可變區(qū)與SEQ ID NO: 41的輕鏈可變區(qū)(即，共有序列)具有至少 85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或100%的氨基酸序列同一性。
[0144]在一些實施方案中，本發(fā)明抗PCSK9抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)與SEQ ID NO:1的重鏈`可變區(qū)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%氨基酸序列同一性，且所述輕鏈可變區(qū)與SEQ ID N0:3(g卩小鼠MAB1)的輕鏈可變區(qū)具有至少 85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 氨基酸序列同一'I"生。
[0145]在一些實施方案中，本發(fā)明抗PCSK9抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)與SEQ ID NO: 5的重鏈可變區(qū)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性，且所述輕鏈可變區(qū)與SEQ ID NO: 7 (B卩，MAB2)的輕鏈可變區(qū)具有至少 85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 氨基酸序列同一'I"生。
[0146]在一些實施方案中，本發(fā)明抗PCSK9抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)與SEQ ID N0:9的重鏈可變區(qū)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%氨基酸序列同一性，且所述輕鏈可變區(qū)與SEQ ID NO: 11卿，MAB3)的輕鏈可變區(qū)具有至少 85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的氨基酸序列同一'I"生。
[0147]對于經(jīng)鑒定的少于20個氨基酸長度的氨基酸序列，可以容許一個或兩個保守氨基酸殘基的取代，同時仍保留期望的特異性結(jié)合和/或拮抗劑活性。
[0148]本發(fā)明抗PCSK9抗體通常以低于約KT8M或ΙΟΙ，例如低于約KT10M或10-ηΜ，在一些實施方案中低于約10_12Μ或10_13Μ的平衡解離常數(shù)(Kd)結(jié)合PCSK9。
[0149]可以任選地多聚化抗PCSK9抗體，并根據(jù)本發(fā)明方法使用抗PCSK9抗體?？筆CSK9抗體可以是全長四聚體抗體(即，具有兩個輕鏈和兩個重鏈)、單鏈抗體(例如，scFv)或者包含抗體片段，例如重鏈和輕鏈可變區(qū)(如，F(xiàn)ab’或其他類似片段)的分子，所述抗體片段形成一個或多個抗原結(jié)合位點并賦予PCSK9結(jié)合特異性。
[0150]本發(fā)明還提供了編碼本文中所述抗體的多核苷酸，例如編碼重鏈和輕鏈可變區(qū)或者包含如本文中所述的互補決定區(qū)的區(qū)段的多核苷酸。在一些實施方案中，多核苷酸序列是表達優(yōu)化的，例如哺乳動物表達優(yōu)化的或者在特定細胞類型中表達優(yōu)化的。在一些實施方案中，編碼重鏈的多核苷酸與選自SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6、SEQ ID NO: 10, SEQ IDNO: 46 和 SEQ ID NO: 48 的多核苷酸具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的核酸序列同一性。在一些實施方案中，編碼輕鏈的多核苷酸與選自 SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO:47 和 SEQ ID NO:49的多核苷酸具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的核酸序列同一性。
[0151]在一些實施方案中，編碼重鏈的多核苷酸與SEQ ID N0:2的多核苷酸具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的核酸序列同一性。在一些實施方案中，編碼輕鏈的多核苷酸與SEQ ID NO:4 (即，MAB1)的多核苷酸具有至少 85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的核酸序列同一性。
[0152]在一些實施方案中， 編碼重鏈的多核苷酸與選自SEQ ID N0:6和SEQ ID NO:46的多核苷酸具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的核酸序列同一性。在一些實施方案中，編碼輕鏈的多核苷酸與選自SEQ ID NO:8和 SEQ ID N0:47(即，MAB2)的多核苷酸具有至少 85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的核酸序列同一性。
[0153]在一些實施方案中，編碼重鏈的多核苷酸與選自SEQ ID N0:10和SEQ ID NO:48的多核苷酸具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的核酸序列同一性。在一些實施方案中，編碼輕鏈的多核苷酸與選自SEQ ID NO: 12和 SEQ ID N0:49(即，MAB3)的多核苷酸具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的核酸序列同一性。
[0154]II1.鑒定抗PCSK9抗體的測定法
[0155]可以通過產(chǎn)生抗PCSK9抗體，然后測試每一抗體減弱或抑制PCSK9介導(dǎo)的事件，例如與LDLR結(jié)合、促進LDLR降解的能力，來鑒定拮抗劑抗體?？梢栽隗w外或者體內(nèi)實施測定。示例性抗體與PCSK9結(jié)合，破壞PCSK9與LDLR形成的復(fù)合體，并減少或抑制PCSK9介導(dǎo)的LDLR的降解。
[0156]可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法來測定抗體或抗原結(jié)合分子與PCSK9的結(jié)合，所述方法包括但不限于ELISA、Biacore和蛋白質(zhì)印跡。
[0157]還可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法測量PCSK9介導(dǎo)的LDLR降解。在一個實施方案中，使用灌輸小鼠模型測定抗PCSK9抗體或抗原結(jié)合分子抑制LDLR降解的能力。將抗PCSK9抗體或抗原結(jié)合分子由靜脈內(nèi)輸注(例如，3 μ g/小時)到小鼠中，測定肝臟膜制備物中LDLR的水平，并將其與接受了對照抗體(例如，與無關(guān)抗原結(jié)合的抗體)靜脈內(nèi)輸注的小鼠的肝臟膜制備物中LDLR的水平比較。與接受了對照抗體的小鼠相比，接受了拮抗劑抗PCSK9抗體的小鼠具有可檢測到的更高的LDLR水平，例如至少增加了 10%、20%、50%、80%、100%。
[0158]還可以測試抗PCSK9拮抗劑抗體在降低LCL-C、非HDL-C和/或總膽固醇的血漿水平中的治療功效。將抗PCSK9抗體或抗原結(jié)合分子由靜脈內(nèi)輸注(3 μ g/小時)到哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、非人靈長類動物、人類)中，測定LCL-C、非HDL-C和/或總膽固醇的血漿水平，并將其與來自治療前的相同哺乳動物或者接受了對照抗體(例如，結(jié)合無關(guān)抗原的抗體)的靜脈內(nèi)輸注的哺乳動物的LCL-C、非HDL-C和/或總膽固醇的血漿水平比較。與治療前的哺乳動物或者接受了對照抗體的哺乳動物相比，接受了拮抗劑抗PCSK9抗體的哺乳動物具有可檢測到的更低的LCL-C、非HDL-C和/或總膽固醇血漿水平，例如減少了 10%、20%、50%、80%、100%。
[0159]IV.包含抗PCSK9抗體的組合物
[0160]本發(fā)明提供了包含與可藥用載體配制在一起的本發(fā)明PCSK9抗體或抗原結(jié)合分子的藥物組合物。組合物可以另外地含有適合于治療或預(yù)防給定疾病的其他治療劑?？伤幱幂d體增強或者穩(wěn)定組合物，或者有助于組合物的制備?？伤幱幂d體包括在生理上相容的溶劑、分散介質(zhì)、涂層、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。
[0161]可以通過本領(lǐng)域已知的多種方法施用本發(fā)明藥物組合物。取決于期望的結(jié)果來改變施用的途徑和/或模式。優(yōu)選的施用是靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下或者鄰近靶位點的施用?？伤幱幂d體應(yīng)當(dāng)適合于由靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腸胃外、鼻內(nèi)、吸入、脊柱或者經(jīng)表皮施用(例如，通過注射或灌輸)。取決于施用的途徑，可以用材料涂布活性化合物，即抗體、雙特異性和多特異性分子，以保護化合物免于酸和可能使化合物失活的其他天然條件的作用。
`[0162]可以將抗體單獨地或者與其他合適的組分組合制備成待通過吸入施用的氣溶膠制劑(即它們是可“噴霧的“)?？梢詫馊苣z制劑放置于可加壓推進劑，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氣氣等中。
[0163]在一些實施方案中，組合物是無菌的并且是液體?？梢岳缤ㄟ^使用涂層如卵磷月旨、在分散的情況下通過維持所需的顆粒大小，以及通過使用表面活性劑來維持合適的流動性。在許多情況下，組合物中優(yōu)選地包括等滲劑，例如糖、多元醇如甘露醇或山梨糖醇，以及氯化鈉。通過在組合物中包含延遲吸收的試劑，例如單硬脂酸鋁或明膠，可以導(dǎo)致可注射組合物的長期吸收。
[0164]可以根據(jù)本領(lǐng)域熟知的和常規(guī)實踐的方法制備本發(fā)明的藥物組合物?？伤幱幂d體部分地由施用的特定組合物，以及施用組合物所使用的特定方法決定。因此，存在本發(fā)明藥物組合物的多種合適制劑。配制抗體和確定合適劑量和方案的適用方法可見于例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第 21 版，University ofthe Sciences in Philadelphia, Lippincott ffilliams&ffilkins(ed.) (2005)中；和Martindale:The Complete Drug Reference，Sweetman，2005，London:PharmaceuticalPress.中，以及 Martindale，Martindal:The Extra Pharmacopoeia，第 31 片反，1996，AmerPharmaceutical Assn，和 Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson (ed.) ,Marcel Dekker, Inc., New York, 1978 中，由此將所述每一文獻并入本文作為參考。藥物組合物優(yōu)選地在GMP條件下生產(chǎn)。通常，在本發(fā)明藥物組合物中使用抗PCSK9抗體的治療有效劑量。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法，將抗PCSK9抗體配制成可藥用劑量形式。調(diào)整劑量方案，以提供期望的應(yīng)答(例如，治療應(yīng)答)。在確定治療有效劑量或預(yù)防有效劑量中，可以施用低劑量，然后逐漸地增加，直到在最小或無不期望的副作用的情況下實現(xiàn)期望的應(yīng)答。例如，可以施用快速灌注劑、可以在一段時間施用幾次分開的劑量或者可以如治療情況的需求所指示，按比例降低或增加劑量。以劑量單位形式配制腸胃外的組合物的特別益處是容易施用和劑量的一致性。如本文中所用，劑量單位形式指在物理上分離的單位，其適合作為用于待治療受試者的單位劑量；每一單位含有計算的與所需藥物載體相關(guān)的活性化合物的預(yù)定量，以產(chǎn)生期望的治療作用。[0165]可以改變本發(fā)明藥物組合物中活性成分的實際劑量水平，以獲得有效實現(xiàn)對特定患者、組合物和施用方式所希望的治療反應(yīng)的活性成分的實際劑量水平，而不會對患者有毒性。選擇的劑量水平將取決于多種藥物動力學(xué)因素，包括本發(fā)明使用的特定組合物或者其酯、鹽或酰胺的活性、施用的途徑、施用的時間、所使用的特定化合物的排泄速率、治療持續(xù)時間、與所使用的特定組合物組合使用的其他藥物、化合物和/或物質(zhì)、所治療的患者的年齡、性別、體重、狀況、一般健康和既往病史，以及類似因素。
[0166]在一些實施方案中，藥物組合物包含抗PCSK9抗體或抗原結(jié)合分子和第二試劑的混合物。例如，組合物可以包含本發(fā)明抗PCSK9抗體或抗原結(jié)合分子和已知對于降低膽固醇，包括LDL-C、非HDL-C和總膽固醇和/或升高HDL-C有益的試劑。
[0167]在具有本發(fā)明抗PCSK9拮抗劑抗體或抗原結(jié)合分子的混合物中包含的示例性第二試劑包括但不限于，HMG-CoA還原酶抑制劑(即，抑制素)、貝特類(例如，氯貝丁酯、吉非貝齊、非諾貝特、環(huán)丙貝特、苯扎貝特)、煙酸及其類似物、膽固醇吸收抑制劑、膽汁酸多價螯合劑 (例如，考來烯胺、考來替泊、colesvelam)、回腸膽汁酸運輸(IBAT)抑制劑、甲狀腺激素模擬物(例如，化合物KB2115)、微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白(MTP)抑制劑、雙過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR) α和Y激動劑、乙酰輔酶Α: 二?；视王；D(zhuǎn)移酶(DGAT)抑制劑、乙酰輔酶A:膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(ACAT)抑制劑、Niemann Pick Cl-樣I (NPCl-Ll)抑制劑(例如，依澤替米貝)、ATP結(jié)合盒(ABC)蛋白G5或G8的激動劑、膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)抑制劑、靶向PCSK9的抑制性核酸，以及靶向apoBlOO的抑制性核酸。降脂劑是本領(lǐng)域已知的，并且描述于例如Goodman和Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,第 11 版，Brunton, Lazo 和 Parker(ed.), McGraw-Hi11 (2006) ；2009Physicians'DeskReference(PDR)JSl^PUin the63rd (2008) Eds., Thomson PDR 中。
[0168]在本發(fā)明組合物中使用的其他降脂劑描述和/或綜述于例如Chang,等人，CurrOpin Drug Disco Devel (2002) 5 (4):562-70 ；Sudhop,等人，Drugs (2002) 62 (16):2333-47 ;Bays 和 Stein, Expert Opin PharmacotherC2003)4( 11):1901-38 ；Kastelein, IntJ Clin Pract Suppl (2003) Mar (134):45-50 ;Tomoda 和 Omura,Pharmacol Ther (2007)115 (3):375-89 ;Tenenbaum,等人，Adv Cardiol (2008)45:127-53 ;Tomkin,Diabetes Care(2008) 31 (2):S241-S248 ;Lee，等人，J Microbiol Biotechnol (2008) 18 (11):1785-8;0h，等人，Arch Pharm Res (2009) 32 (I):43-7 ;Birch，等人，J Med Chem (2009) 52 (6):1558-68 ;和 Baxter 和 Webb, Nature Reviews Drug Discovery (2009) 8:308-320 中。[0169]在一些實施方案中，將本發(fā)明抗PCSK9抗體或抗原結(jié)合分子與抑制素一起提供為混合物。示例性抑制素包括但不限于，托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。
[0170]在一些實施方案中，將本發(fā)明抗PCSK9抗體或抗原結(jié)合分子與誘導(dǎo)高膽固醇血癥或甘油三酯血癥的試劑一起提供為混合物。例如，第二藥劑可以是蛋白酶抑制劑，如沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋、安普那韋、洛匹那韋、阿扎那韋、福沙那韋(Fosamprenavir)、替拉那韋、達蘆那韋、阿巴卡韋-齊多夫定-拉米夫定(三協(xié)唯)。在一些實施方案中，第二藥劑是他克莫司。
[0171]V.使用抗PCSK9抗體的方法
[0172]A.用抗PCSK9抗體進行治療的病癥
[0173]發(fā)現(xiàn)可將本發(fā)明抗PCSK9拮抗劑抗體和抗原結(jié)合分子用于治療由PCSK9的活性或者過量活性介導(dǎo)的任何疾病。
[0174]例如，出于任何原因或病因?qū)W，具有或者處于發(fā)展成血脂異常或高膽固醇血癥的個體可以受益于本發(fā)明抗PCSK9拮抗劑抗體和抗原結(jié)合分子。例如，個體可能具有家族性或者遺傳性傳遞的純合子型或雜合子型高膽固醇血癥，其中存在有功能的LDL-R。例如，在Burnett 和 Hooper, Clin Biochem Rev (2008) 29 (I):11-26 中總結(jié)了與家族性或者遺傳性遺傳的聞膽固醇血癥相關(guān)的和/或引起家族性或者遺傳性遺傳的聞膽固醇血癥的基因突變。個體可能還具有其他疾病或者涉及有助于或增加發(fā)展成為血脂異?；蚋吣懝檀佳Y風(fēng)險的行為。例如，個體可能肥胖或者患糖尿病或者代謝綜合征。個體可能是吸煙者，具有久坐的生活方式或者具有高膽 固醇飲食。
[0175]對于降低、逆轉(zhuǎn)、抑制或預(yù)防血脂異常、高膽固醇血癥和餐后甘油三酯血癥，靶向PCSK9 是有用的。參見，例如 Le May,等人，Arterioscler Thromb Vasc Biol (2009) 29
(5):684-90 ；Seidah, Expert Opin Ther Targets (2009) 13 (I):19-28 ;和 Poirier,等人，J Biol Chem (2009) PMID19635789。因此，發(fā)現(xiàn)可將本發(fā)明抗PCSK9拮抗劑抗體和抗原結(jié)合分子的施用用于需要其的個體中以降低、逆轉(zhuǎn)、抑制或預(yù)防血脂異常、高膽固醇血癥和餐后甘油三酯血癥。
[0176]發(fā)現(xiàn)可將本發(fā)明抗PCSK9拮抗劑抗體和抗原結(jié)合分子用于需要其的個體中以減少或降低低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。個體可以具有持續(xù)升高的LDL-C水平。在一些實施方案中，個體具有持續(xù)高于80mg/dL,例如高于約90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190mg/dL或者以上的LDL-C血漿水平。發(fā)現(xiàn)還可以將本發(fā)明抗PCSK9拮抗劑抗體和抗原結(jié)合分子用于需要其的個體中以減少或降低非-高密度脂蛋白膽固醇(非-HDL-C)或總膽固醇。
[0177]個體可能已經(jīng)服用了另一種降低膽固醇的藥劑，并對該藥劑具有抗性或者不耐受性。例如，個體可能已經(jīng)接受了抑制素的治療方案，已經(jīng)證實所述方案不能有效地將該個體中的LDL-C、非-HDL-C或總膽固醇降低到可接受水平。個體可能還不耐受抑制素的施用。將本發(fā)明抗PCSK9拮抗劑抗體和抗原結(jié)合分子與用于降低LDL-C或非-HDL-C和/或提高HDL-C的第二試劑組合施用，例如通過允許降低待施用的第二試劑的劑量，來改進第二試劑的有效性和耐受性。
[0178]在一些實施方案中，個體具有PCSK9基因中的功能獲得型突變，例如這導(dǎo)致了LDLR降解的異常增加。
[0179]在一些實施方案中，個體接受了誘導(dǎo)血脂異常或高膽固醇血癥的藥劑，即個體具有藥物誘導(dǎo)的血脂異常或高膽固醇血癥。例如，個體可能接受了蛋白酶抑制劑的治療方案，例如用于治療HIV感染。已知引起血漿甘油三酯升高的另一藥劑是他克莫司，其是給移植患者施用的免疫抑制藥物。已經(jīng)顯示，環(huán)孢菌素可以顯著增加LDL。參見，例如Ballantyne，等人(1996)78 (5):532-5。第二代抗精神病藥物(例如，阿立哌唑、氯氮平、奧氮平、喹硫平、利培酮和齊拉西酮)也與血脂異常相關(guān)。參見，例如Henderson, J Clin Psychiatry(2008)69 (2):e04 和 Brooks,等人，Curr Psychiatry Rep (2009) 11 (1):33_40。
[0180]B.抗PCSK9抗體的施用
[0181]醫(yī)師或獸醫(yī)可以以低于實現(xiàn)期望的治療效果所需的水平，并逐漸增加劑量直到實現(xiàn)期望效果而開始在藥物組合物中應(yīng)用本發(fā)明抗體的劑量?？傊?，取決于許多不同的因素來改變本發(fā)明組合物的有效劑量，所述因素包括待治療的特定疾病或病癥、施用方式、靶位點、患者的生理狀態(tài)、患者是人類還是動物、施用的其他藥物，以及治療是預(yù)防性的還是治療性的。需要滴定治療劑量，以優(yōu)化安全性和有效性。對于抗體的施用，劑量為宿主體重的約0.0001-100mg/kg和更通常地0.01_5mg/kg。例如，齊Li量可以是每kg體重Img或者每kg體重10mg，或者l-10mg/kg的范圍內(nèi)。根據(jù)需要或期望，可以每日、每周、每兩周、每月或者更頻繁或更不頻繁地施用劑量。示例性治療方案需要每周施用一次、每兩周施用一次或者每月施用一次或者每3-6月施用一次。
[0182]在一些實施方案中，施用編碼本發(fā)明抗PCSK9抗體和抗原結(jié)合分子的多核苷酸。在試劑是核酸的實施方案中，一般的劑量可以為每kg體重約0.1mg至(并包括)每kg體重約IOOmg,例如每kg體重約Img至每kg體重約50mg。在一些實施方案中，所述劑量為每kg體重約 1、2、3、4、5、10、15、20、30、40 或 50mg。
[0183]抗體可以以單個的或者分開的劑量施用。通常在多個時間施用抗體。根據(jù)需要或根據(jù)期望，單個劑量之間的間隔可以是每周、每兩周、每月或每年。如根據(jù)測量的患者中的抗PCSK9抗體的血液水平所指示，間隔還可以是無規(guī)律的。在一些方法中，可以調(diào)整劑量，以實現(xiàn)1- 1000μ g/ml，以及在一些方法中25-300 μ g/ml的血漿抗體濃度。備選地，可以將抗體施用為緩釋制劑，在這種情況下需要較低頻率的施用。取決于患者中抗體的半壽期，來改變劑量和頻率?？傊嗽椿贵w顯示的半壽期比嵌合抗體和非人抗體顯示的半壽期長。取決于治療是預(yù)防性的還是治療性的，可以改變施用的劑量和頻率。在預(yù)防性應(yīng)用中，以相對低頻率的間隔，長期施用相對低的劑量。一些患者終身繼續(xù)接受治療。在治療性應(yīng)用中，有時需要以相對短的間隔施用相對高的劑量，直到疾病的進程減緩或終止，并且優(yōu)選地直到患者表現(xiàn)出疾病癥狀的部分或完全改善。之后，可以給患者施用預(yù)防性方案。在一些實施方案中，當(dāng)患者中血漿LDL-C水平超出預(yù)定的閾值水平，例如至少約80mg/dL，如至少約 90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190mg/dL 或者更高時，施用抗 PCSK9 抗體或抗原結(jié)合劑。
[0184]C.與第二試劑共同施用
[0185]可以將PCSK9抗體拮抗劑與已知有益于降低膽固醇，包括LDL-C、非-HDL-C和總膽固醇和/或升高HDL-C的試劑組合使用。
[0186]可以將活性劑與抗PCSK9拮抗劑抗體混合一起施用，或者可以單獨地施用每一種試劑?？梢缘珶o需同時施用抗體劑和其他活性劑。
[0187]用于與本發(fā)明抗PCSK9拮抗劑抗體或抗原結(jié)合分子共同施用的示例性第二試劑包括但不限于，HMG-CoA還原酶抑制劑(B卩，抑制素)、貝特類(例如，氯貝丁酯、吉非貝齊、非諾貝特、環(huán)丙貝特、苯扎貝特)、煙酸及其類似物、膽固醇吸收抑制劑、膽汁酸多價螯合劑(例如，考來烯胺、考來替泊、colesvelam)、回腸膽汁酸運輸(IBAT)抑制劑、甲狀腺激素模擬物(例如，化合物KB2115)、微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白(MTP)抑制劑、雙過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR) α和 激動劑、乙酰輔酶Α: 二?；视王；D(zhuǎn)移酶(DGAT)抑制劑、乙酰輔酶A:膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(ACAT)抑制劑、Niemann Pick Cl-樣I (NPC1-L1)抑制劑(例如，依澤替米貝)、ATP結(jié)合盒(ABC)蛋白G5或G8的激動劑、膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)抑制劑、靶向PCSK9的抑制性核酸，以及靶向apoBlOO的抑制性核酸。
[0188]使用的其他降脂劑描述和/或綜述于例如Chang,等人，Curr Opin DrugDiscoDevel (2002)5 (4):562-70 ；Sudhop,等人，Drugs (2002)62 (16):2333-47 ;Bays 和 Stein,Expert Opin Pharmacother (2003)4 (11):1901-38 ；Kastelein,Int J Clin Pract Suppl(2003) Mar (134):45-50 ；Tomoda 和 Omura, Pharmacol Ther (2007) 115 (3):375-89 ；Tenenbaum,等人，Adv Cardiol (2008) 45:127-53 ；Tomkin, Diabetes Care (2008) 31
(2):S241-S248 ;Lee，等人，J Microbiol Biotechnol (2008) 18 (11):1785-8 ;0h，等人，Arch Pharm Res (2009) 32 (I):43-7 ;Birch，等人，J MedChem (2009) 52 (6):1558-68 ；和 Baxter 和 Webb, Nature Reviews DrugDiscovery (2009) 8:308-320 中。
[0189]在一些實施方案中，將本發(fā)明抗PCSK9抗體或抗原結(jié)合分子與抑制素共同施用。示例性抑制素包括但不限于，托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。
[0190]在一些實施方案中，將本發(fā)明抗PCSK9抗體或抗原結(jié)合分子與誘導(dǎo)高膽固醇血癥或甘油三酯血癥的藥劑共同施用。例如，第二藥劑可以是蛋白酶抑制劑，如沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋、安普那韋、洛匹那韋、阿扎那韋、福沙那韋、替拉那韋、達蘆那韋、阿巴卡韋-齊多夫定-拉米夫定(三協(xié)唯)。在一些實施方案中，第二藥劑是他克莫司。
[0191]在一些實施方案中，將本發(fā)明抗PCSK9抗體或抗原結(jié)合分子與特異地靶向PCSK9或apoBlOO的抑制性核酸(例如，siRNA、miRNA、反義序列、核酶)共同施用。
[0192]V1.試劑盒
[0193]可以在試劑盒中提供本發(fā)明藥物組合物。在某些實施方案中，本發(fā)明試劑盒包含如本文中所述的本發(fā)明抗PCSK9拮抗劑抗體或抗原結(jié)合分子?？梢砸砸恢碌幕虿煌膭┝刻峁┛筆CSK9抗體或抗原結(jié)合分子。
[0194]在一些實施方案中，試劑盒包含如本文中所述的一個或多種第二藥劑。可以在與抗PCSK9拮抗劑抗體或抗原結(jié)合分子相同的制劑或者分離的試劑中提供第二藥劑。第一和第二試劑的劑量可以是獨立統(tǒng)一的或者不同`的。
[0195]在一些實施方案中，試劑盒包含PCSK9抗體拮抗劑和已知有益于降低膽固醇，包括LDL-C、非-HDL-C和總膽固醇和/或升高HDL-C的一種或多種試劑。
[0196]與本發(fā)明抗PCSK9拮抗劑抗體或抗原結(jié)合分子一起包含于試劑盒中的示例性第二試劑包括但不限于，HMG-CoA還原酶抑制劑(即，抑制素)、貝特類(例如，氯貝丁酯、吉非貝齊、非諾貝特、環(huán)丙貝特、苯扎貝特)、煙酸及其類似物、膽固醇吸收抑制劑、膽汁酸多價螯合劑(例如，考來烯胺、考來替泊、colesvelam)、回腸膽汁酸運輸(IBAT)抑制劑、甲狀腺激素模擬物(例如，化合物KB2115)、微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白(MTP)抑制劑、雙過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR) α和Υ激動劑、乙酰輔酶Α: 二?；视王；D(zhuǎn)移酶(DGAT)抑制劑、乙酰輔酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(ACAT)抑制劑、Niemann Pick Cl-樣I (NPC1-L1)抑制劑(例如，依澤替米貝)、ATP結(jié)合盒(ABC)蛋白G5或G8的激動劑、膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)抑制劑、祀向PCSK9的抑制性核酸，以及靶向apoBlOO的抑制性核酸。
[0197]在試劑盒中使用的其他降脂劑描述和/或綜述于例如Chang,等人，CurrOpinDrug Disco Devel (2002) 5 (4):562-70 ；Sudhop,等人，Drugs (2002) 62 (16):2333-47;Bays 和 Stein, Expert Opin Pharmacother (2003)4 (11):1901-38 ;Kastelein, Int JClin Pract Suppl (2003)Mar (134):45-50 ;Tomoda 和 Omura,Pharmacol Ther (2007)115(3):375-89 ；Tenenbaum,等人，Adv Cardiol (2008) 45:127-53 ;Tomkin，Diabetes Care(2008) 31 (2):S241-S248 ;Lee，等人，J Microbiol Biotechnol (2008) 18 (11):1785-8;0h，等人，Arch Pharm Res (2009) 32 (1):43-7 ;Birch，等人，J Med Chem (2009) 52 (6):1558-68 ;和 Baxter 和 Webb, Nature Reviews Drug Discovery (2009) 8:308-320 中。
[0198]在一些實施方案中，在試劑盒中提供本發(fā)明抗PCSK9抗體或抗原結(jié)合分子與抑制素。示例性抑制素包括但不限于，托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。
[0199]在一些實施方案中，在試劑盒中提供本發(fā)明抗PCSK9抗體或抗原結(jié)合分子與誘導(dǎo)高膽固醇血癥或甘油三酯血癥的藥劑。例如，第二藥劑可以是蛋白酶抑制劑，如沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋、安普那韋、洛匹那韋、阿扎那韋、福沙那韋、替拉那韋、達蘆那韋、阿巴卡韋-齊多夫定-拉米夫定(三協(xié)唯)。在一些實施方案中，第二藥劑是他克莫司。
實施例
[0200]提供以下實施例以說明但并非限制要求專利保護的發(fā)明。
[0201]實施例1:PCSK9桔杭劑MABl的產(chǎn)牛和鑒定
[0202]概述
[0203]進行研究，以產(chǎn)生針對Pcsk9的功能性抗體拮抗劑。鑒定了多個雜交瘤，其分泌能與His-標(biāo)簽化形式的蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體。如通過測量抗體抑制Pcsk9介導(dǎo)的H印G2細胞上的LDL受體降解的能力(導(dǎo)致這些細胞攝取LDL膽固醇的能力增加)，評價了來自雜交瘤的抗體的功能性拮抗劑活性。鑒定了有效的功能性鼠抗人Pcsk9IgGl-K單克隆抗體，并稱作 MABl。
[0204]方法
[0205]抗原和其他蛋白質(zhì)
[0206]通過轉(zhuǎn)染HEK293Freestyle? 細胞(Invitrogen, Carlsbad, Ca)產(chǎn)生分泌人 Pcsk9蛋白的穩(wěn)定表達細胞系。簡言之，使用Lipofectamine2000?轉(zhuǎn)染試劑將以mel Iittin信號序列、成熟Pcsk9cDNA (aa31-692 )和序列C端處的his6標(biāo)簽為特征的重組質(zhì)粒(由E.Hampton, GNF, NPLO10051克隆)轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)于添加了 10%胎牛血清的培養(yǎng)基(Invitrogen)的細胞中，所述細胞以粘附模式存在于BioCoat燒瓶(Becton Dickinson)上。轉(zhuǎn)染后48小時，將100 μ g/mL Zeocin加入到培養(yǎng)基中，從而開始陽性轉(zhuǎn)染子的選擇。4周后，出現(xiàn)了產(chǎn)生Pcsk9的細胞的4個穩(wěn)定細胞庫。使庫4(最高的生產(chǎn)者)適應(yīng)Freestyle?培養(yǎng)基中的無血清懸浮條件，隨后使用Wave?生物反應(yīng)器，以10-20L生產(chǎn)體積的規(guī)模擴大，用于大規(guī)模生產(chǎn)。
[0207]在一段時間進行了幾輪試驗，得到了以12至30mg/L之間的比率產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)。收獲細胞上清液，并通過交叉流過濾濃縮。將得到的濃縮物以0.5mL/分鐘應(yīng)用于25mL NiNTA His-Bind Superflow 柱(用 50mM Tris/300mM NaCl/lmM CaCl2/2mM β -巰基乙醇，ρΗ7.4平衡)。用50mM Tris/300mM NaCl/20mM咪唑，pH7.4進行基線洗滌后，用50mMTris/300mM NaCl/250mM咪唑，pH7.4洗脫結(jié)合的物質(zhì)。將得到的洗脫物對PBS，pH7.3透析，無菌過濾并且等分。通過測定寡聚化的分析型大小排阻層析分析樣品。由HPLC層析獲得的純化蛋白質(zhì)顯示出兩個峰，主峰占85%。全長蛋白質(zhì)的HPLC-ESI MS分析顯示了 58176.0Da的質(zhì)量，其是來自具有全部半胱氨酸殘基均氧化的mellitinmellitin-hsPcsk9aa31-692-His的預(yù)期質(zhì)量。部分樣品是另外N-糖基化的。大約13kD質(zhì)量的污染蛋白質(zhì)類似于(最可能是)該蛋白質(zhì)的游離的前域結(jié)構(gòu)域(pro-domain)。再次使用在Freestyle培養(yǎng)基中以無血清懸浮培養(yǎng)的HEK293Freestyle細胞，以大規(guī)模瞬時表達方法產(chǎn)生來自小鼠、大鼠和食蟹猴的Pcsk9的相應(yīng)同源物。使用聚乙稀亞胺(作為質(zhì)粒DNA的載體)，以1:3的比例(μ g/mL: μ g/mL DNA:PEI),將重組質(zhì)粒小鼠/大鼠Pcsk9cDNA和食蟹猴Pcsk9轉(zhuǎn)染到Freestyle細胞中，所述小鼠/大鼠Pcsk9cDNA以天然前導(dǎo)序列和C端的his6-標(biāo)簽為特征，所述食蟹猴Pcsk9以⑶33前導(dǎo)序列和C端的his6_標(biāo)簽為特征。在Wave?生物反應(yīng)器中，以10升規(guī)模實施生產(chǎn)試驗；類似于上述用于人Pcsk9蛋白的方案進行蛋白質(zhì)純化和表征。
[0208]篩選分泌PCSK9的功能抗體的雜交瘤
[0209]產(chǎn)生雜交瘤，并在融合后第10天，針對Pcsk9特異性抗體的存在篩選雜交瘤平板。對于ELISA篩選，用50 μ L的Pcsk9 (在PBS中稀釋成15ng/孔)包被Maxisorp384_孔板(Nunc#464718)，并在4°C溫育過夜。吸出剩余的蛋白質(zhì)，并用PBS中的1%BSA封閉孔。室溫溫育30分鐘后，用PBS+0.05%Tween (PBST)洗滌孔四次。將15 μ L的雜交瘤上清液轉(zhuǎn)移到ELISA板中。在PBS中將在去`除PLN時取得的15 μ L小鼠血清1:1000稀釋，并作為陽性對照加入。將50 μ L的第二抗體(在PBS中1:5000稀釋的山羊抗鼠IgG-HRP( Jackson ImmunoResearch#115-035-071))加入到ELISA平板的全部孔中。室溫溫育I小時后，用PBST洗滌平板8次。加入25 μ L的TMB (KPL#50-76-05)，在室溫溫育30分鐘后，在605nm的吸光度讀取平板。在 HT 培養(yǎng)基(DMEM+20%FBS，Pen/Str印/Glu，I X NEAA, I X HT，0.5 X HFCS )中，將來自陽性孔的細胞擴大至24孔板。
[0210]抗體純化
[0211]使用G蛋白(Upstate#16_266 (Billerica, MA))純化含MABl的上清液。裝載上清液之前，用10個柱體積的PBS平衡樹脂。結(jié)合樣品后，用10個柱體積的PBS洗滌柱子，然后用5個柱體積的0.1M甘氨酸，pH2.0洗脫抗體。立即用1/10體積的Tris HCl，pH9.0中和柱級分。測量級分的0D280，匯集陽性級分并對PBS，pH7.2透析過夜。
[0212]通過溶液平衡滴定進行的親和力測定
[0213]制備連續(xù)稀釋的Pcsk9，并將抗體加入到每一抗原濃度中，以達到IOOpM的恒定抗體濃度。將100 μ L/孔的每一稀釋混合物一式兩份分配到96-孔聚丙烯微量滴定板(Greiner)中。密封平板，并室溫溫育過夜。用25 μ LPBS中稀釋的I μ g/mL Pcsk9包被96-孔標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合(Standard Bind)微量滴定板(Meso Scale Discovery)。密封該平板，并在4°C溫育過夜。溫育后，用每孔200 μ L的PBS/0.05% (w/v) Tween20洗滌經(jīng)抗原包被的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合微量滴定板3次。然后，用每孔150 μ L的PBS/5% (w/v) BSA封閉平板，室溫振蕩溫育I小時。重復(fù)洗滌步驟，并將25 μ L/孔抗體-抗原制備物從聚丙烯微量滴定板轉(zhuǎn)移到經(jīng)抗原包被的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合平板中。室溫振蕩溫育標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合平板60分鐘。3次額外的洗滌步驟后，將 25 μ L 在 PBS/1% (w/v) BSA/0.05% (w/v) Tween20 緩沖液中稀釋的 I μ g/mL 的經(jīng)Sulfo-Tag-標(biāo)記的山羊抗鼠檢測抗體(R32AC-5,Meso Scale Discovery)加入到每孔中，室溫振蕩溫育I小時。洗滌平板3次后，將150 μ L的2XRead BuffeKR92TC-1，Meso ScaleDiscovery)轉(zhuǎn)移到每孔中。產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光信號，并通過Sector Imager6000(Meso ScaleDiscovery)檢測該信號。輸出電化學(xué)發(fā)光數(shù)據(jù)，使用prism軟件和以下等式處理所述數(shù)據(jù):
【權(quán)利要求】
1.抗體，其與前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin9型(PCSK9)結(jié)合,其中所述抗體阻斷PCSK9與低密度脂蛋白受體(LDLR)的相互作用并抑制PCSK9介導(dǎo)的LDLR降解，其中所述抗體包含: a)重鏈可變區(qū)，其包含人重鏈V-區(qū)段、重鏈互補決定區(qū)3(⑶R3)和重鏈構(gòu)架區(qū)4(FR4);和 b)輕鏈可變區(qū)，其包含人輕鏈V-區(qū)段、輕鏈CDR3和輕鏈FR4，其中 i)所述重鏈⑶R3可變區(qū)包含氨基酸序列ITTEGGFAY(SEQ ID NO: 17);且 ii)所述輕鏈CDR3可變區(qū)包含氨基酸序列QQSNYWPLT(SEQ ID N0:24)。
2.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體以約500pM或更小的平衡解離常數(shù)(KD)與人PCSK9結(jié)合。
3.權(quán)利要求1的抗體，其中所述重鏈V-區(qū)段與SEQID NO: 27具有至少85%的序列同一性，并且其中所述輕鏈V-區(qū)段與SEQ ID NO: 28具有至少85%的序列同一性。
4.權(quán)利要求1的抗體，其中所述重鏈V-區(qū)段與選自SEQID N0:25和SEQ ID N0:26的氨基酸序列具有至少85%的序列同一性，并且其中所述輕鏈V-區(qū)段與SEQ ID NO: 28具有至少85%的序列同一性。
5.權(quán)利要求1的抗體,其中所述重鏈FR4是人種系FR4。
6.權(quán)利要求5的抗體，其中所述重鏈FR4是SEQID N0:35。
7.權(quán)利要求1的抗體，其中所述輕鏈FR4是人種系FR4。
8.權(quán)利要求7的抗體，其中所述輕鏈FR4是SEQID N0:39。
9.權(quán)利要求1的抗體，其中所述重鏈V-區(qū)段和所述輕鏈V-區(qū)段均包含互補決定區(qū)I(⑶Rl)和互補決定區(qū)2 (CDR2);其中: i)所述重鏈V-區(qū)段的⑶Rl包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列； ?)所述重鏈V-區(qū)段的⑶R2包含SEQ ID NO: 16的氨基酸序列； iii)所述輕鏈V-區(qū)段的⑶Rl包含SEQID NO: 20的氨基酸序列；且 iv)所述輕鏈V-區(qū)段的CDR2包含SEQID NO: 23的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求9的抗體，其中 i)所述重鏈V-區(qū)段的CDRl包含SEQ ID NO: 14 ； ?)所述重鏈V-區(qū)段的CDR2包含SEQ ID NO: 16 ； iii)所述重鏈⑶R3包含SEQID NO: 17的氨基酸序列； iv)所述輕鏈V-區(qū)段的CDRl包含SEQID NO: 19 ； V)所述輕鏈V-區(qū)段的CDR2包含SEQ ID NO: 22 ;且 vi)所述輕鏈CDR3包含SEQ ID NO: 24。
11.權(quán)利要求1的抗體，其中所述重鏈可變區(qū)與SEQID NO:40的可變區(qū)具有至少90%的氨基酸序列同一性，并且所述輕鏈可變區(qū)與SEQ ID N0:41的可變區(qū)具有至少90%的氨基酸序列同一性。
12.權(quán)利要求1的抗體，其中所述重鏈可變區(qū)與SEQID N0:40的可變區(qū)具有至少95%的氨基酸序列同一性，并且所述輕鏈可變區(qū)與SEQ ID N0:41的可變區(qū)具有至少95%的氨基酸序列同一性。
13.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體包含重鏈和輕鏈，所述重鏈包含SEQID N0:40,所述輕鏈包含SEQ ID N0:41o
14.權(quán)利要求1的抗體，其中所述重鏈可變區(qū)與選自SEQID N0:5和SEQ ID NO:9的可變區(qū)具有至少90%的氨基酸序列同一性，并且所述輕鏈可變區(qū)與選自SEQ ID NO:7和SEQID NO: 11的可變區(qū)具有至少90%的氨基酸序列同一性。
15.權(quán)利要求1的抗體，其中所述重鏈可變區(qū)與選自SEQID NO:5和SEQ ID NO:9的可變區(qū)具有至少95%的氨基酸序列同一性，并且所述輕鏈可變區(qū)與選自SEQ ID NO:7和SEQID NO: 11的可變區(qū)具有至少95%的氨基酸序列同一性。
16.權(quán)利要求1的抗體，其中所述重鏈可變區(qū)包含選自SEQID NO:5和SEQ ID NO:9的氨基酸序列，并且所述輕鏈可變區(qū)包含選自SEQ ID NO:7和SEQ ID NOill的氨基酸序列。
17.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是FAb’片段。
18.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是IgG。
19.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是單鏈抗體(scFv)。
20.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體包含人恒定區(qū)。
21.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體與載體蛋白連接。
22.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是聚乙二醇化的。
23.組合物，其包含權(quán)利要求1-22中任一項的抗體和生理上相容的賦形劑。
24.權(quán)利要求23的組合物，其中所述組合物還包含第二試劑，其降低個體中的低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平。`
25.權(quán)利要求24的組合物，其中所述第二試劑是抑制素。
26.權(quán)利要求25的組合物，其中所述抑制素選自托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。
27.權(quán)利要求24的組合物，其中所述第二試劑選自貝特類、煙酸及其類似物、膽固醇吸收抑制劑、膽汁酸多價螯合劑、甲狀腺激素模擬物、微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白(MTP)抑制劑、二?；视王；D(zhuǎn)移酶(DGAT)抑制劑、靶向PCSK9的抑制性核酸，以及靶向apoBlOO的抑制性核酸。
28.降低需要其的個體中的LDL-C的方法，所述方法包括將治療有效量的權(quán)利要求1的抗體施用于個體，從而降低個體中的LDL-C。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述個體是對抑制素治療低應(yīng)答或者有抗性的。
30.權(quán)利要求28的方法，其中所述個體是對抑制素治療不耐受的。
31.權(quán)利要求28的方法，其中所述個體具有至少約100mg/dL的基線LDL-C水平。
32.權(quán)利要求28的方法，其中所述個體具有家族性高膽固醇血癥。
33.權(quán)利要求28的方法，其中總膽固醇隨所述LDL-C—起降低。
34.權(quán)利要求28的方法，其中所述個體具有甘油三酯血癥。
35.權(quán)利要求28的方法，其中所述個體具有功能獲得型PCSK9基因突變。
36.權(quán)利要求28的方法，其中所述個體具有藥物誘導(dǎo)的血脂異常。
37.權(quán)利要求28的方法，其進一步包括對個體施用治療有效量的第二試劑，所述第二試劑有效降低LDL-C。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述第二試劑是抑制素。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述抑制素選自托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。
40.權(quán)利要求37的方法，其中所述第二試劑選自貝特類、煙酸及其類似物、膽固醇吸收抑制劑、膽汁酸多價螯合劑、甲狀腺激素模擬物、微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白(MTP)抑制劑、二?；视王；D(zhuǎn)移酶(DGAT)抑制劑、靶向PCSK9的抑制性核酸，以及靶向apoBlOO的抑制性核酸。
41.權(quán)利要求37的方法，其中所述抗體和所述第二試劑以混合物的形式共同施用。
42.權(quán)利要求37的方法，其中所述抗體和所述第二試劑分別共同施用。
43.權(quán)利要求28的方法，其中所述抗體靜脈內(nèi)施用。
44.權(quán)利要求28的方法，`其中所述抗體皮下施用。
【文檔編號】C07K16/40GK103562227SQ201280017658
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2012年2月10日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月11日
【發(fā)明者】J·戈爾德施泰因, S·B·科恩, A·舒馬赫, D·L·約韋 申請人:Irm責(zé)任有限公司, 諾瓦提斯公司