用于確定淀粉樣肽的抗體、試劑盒和方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及能夠使用抗Aβ17抗體檢測Aβ17肽的免疫測定領(lǐng)域，以及使用所述抗體的試劑盒和方法。本發(fā)明還涉及用于診斷或區(qū)分神經(jīng)退行性疾病的不同階段的方法。
【專利說明】用于確定淀粉樣肽的抗體、試劑盒和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫測定領(lǐng)域，其允許通過使用抗Αβ 17抗體來檢測Αβ 17肽以及使用所述抗體的試劑盒和方法。本發(fā)明還涉及用于診斷或區(qū)分神經(jīng)退行性疾病的不同階段的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]阿爾茨海默氏病(AD)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的進(jìn)行性退行性疾病，其特征為進(jìn)行性并且漸增的記憶力喪失，然后喪失對四肢和身體功能的控制，最終死亡。它是迄今為止造成癡呆病的最常見的原因，其影響了 I至6%的65歲以上的人群，和10至20%的80歲以上的人群。
[0003]AD通過幾種病理特征與其他類型的癡呆病區(qū)別開，包括在患者的腦中進(jìn)行性出現(xiàn)在神經(jīng)元之間的細(xì)胞外間隙中的老年斑。所述斑塊具有淀粉樣沉積物的中間核心，所述淀粉樣沉積物主要由被退行性軸突和膠質(zhì)細(xì)胞環(huán)繞的稱為β淀粉樣肽(Α β )的具有40-42個(gè)氨基酸肽的纖絲(fibril)形成。這種肽是由稱為β淀粉樣前體蛋白(β APP)的前體蛋白的蛋白水解處理產(chǎn)生的。
[0004]神經(jīng)病學(xué)、語言障礙和腦卒中國家研究所(NINCDS)和阿爾茨海默氏病及相關(guān)病癥協(xié)會(huì)(ADRDA)在1984年建立了最常用的NI NCDS-ADRDA阿爾茨海默氏病診斷標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)NINCDS/ADRDA。這些標(biāo)準(zhǔn)如下所示:
[0005].確定性阿爾茨海默氏病:患者滿足疑似阿爾茨海默氏病的標(biāo)準(zhǔn)并且通過尸體解剖或活檢表現(xiàn)出AD的組織病理學(xué)證據(jù)。
[0006].疑似或前驅(qū)性阿爾茨海默氏病:已通過臨床和神經(jīng)心理學(xué)檢查確立癡呆病。認(rèn)知障礙還必須是進(jìn)行性的并且在兩個(gè)或更多個(gè)認(rèn)知區(qū)域中存在。缺陷的發(fā)生是在40歲至90歲之間，并且最終必須不存在能夠產(chǎn)生癡呆病綜合征的其他疾病。
[0007].可能或非前驅(qū)性阿爾茨海默氏病:存在癡呆病綜合征，具有非典型性發(fā)病、出現(xiàn)或發(fā)展；并且無已知的病原學(xué)；但是認(rèn)為沒有能夠產(chǎn)生癡呆病的共病疾病是它的來源。
[0008].不可能的阿爾茨海默氏病:在病程早期，患者出現(xiàn)具有突然發(fā)病、局灶性神經(jīng)病征兆(focal neurologic sign)或癲癇發(fā)作或步態(tài)障礙的癡呆病綜合征。
[0009]輕度認(rèn)知障礙(MCI，也稱為早期癡呆病或孤立的記憶障礙(isolated memoryimpairment))是對患有超出對他們的年齡和教育情況的預(yù)期之外的認(rèn)知障礙，但并不顯著干擾他們的日常活動(dòng)的個(gè)體給予的診斷(Petersen RC等人，(1999)Arch.Neurol.56(3): 303-8)。它被認(rèn)為是自然衰老和癡呆病之間的界限或過渡階段。盡管MCI能夠以多種癥狀出現(xiàn)，但當(dāng)記憶力喪失是主要癥狀時(shí)，則將它稱作“記憶缺失性MCI”并通常將它看作阿爾茨海默氏病的風(fēng)險(xiǎn)因數(shù)(Grundman M等人，(2004).Arch.Neurol.61 (I):59-66)。研究表明這些個(gè)體傾向于以每年約10%至15%的速度發(fā)展成疑似或前驅(qū)性阿爾茨海默氏病(Grundman M等人，同上)。另外，當(dāng)個(gè)體在除記憶力之外的領(lǐng)域具有損傷時(shí)，則將其分類為非記憶缺失性單域或多域MCI并且認(rèn)為這些個(gè)體更可能轉(zhuǎn)化為其他癡呆病(Tabert MH 等人，(2006).Arch.Gen.Psychiatry 63 (8): 916-24)。[0010]MCI的診斷需要大量臨床判斷，并且照此包括臨床觀察、神經(jīng)影像、血液測試和神經(jīng)心理學(xué)測試的綜合臨床評價(jià)是最佳的以排除替代性診斷。類似的評價(jià)通常用于診斷阿爾茨海默氏病。當(dāng)存在以下情況時(shí)，診斷為MCI (Morris JC等人，(2001).Arch.Neurol.58(3):397-405):
[0011]-記憶缺陷的跡象
[0012]-一般認(rèn)知和功能性能力的維持
[0013]-無確診的癡呆病。
[0014]在過去十年里，已經(jīng)進(jìn)行了幾種嘗試以通過使用血漿、血清或循環(huán)細(xì)胞來識(shí)別外周標(biāo)志物。具體地，由于淀粉樣斑塊是阿爾茲海默氏病神經(jīng)病理學(xué)的確定特征并且可以在血漿中檢測到Aβ ，因此它的測量是阿爾茲海默氏病令人信服的候選生物標(biāo)志物。
[0015]在臨床實(shí)踐中，使用基于典型臨床標(biāo)志存在的臨床標(biāo)準(zhǔn)并且使用神經(jīng)影像技術(shù)和血液分析排除其他類型癡呆病來進(jìn)行AD診斷。使用這些標(biāo)準(zhǔn)，診斷可靠性是可接受的，盡管根據(jù)使用腦部尸檢進(jìn)行的研究，10-20%診斷為AD的患者患有不同的疾病。此外，當(dāng)前的診斷方法只可以在神經(jīng)退行性過程發(fā)展使得患者患有嚴(yán)重的癡呆病并且腦損傷擴(kuò)展使得治療措施的數(shù)量有限時(shí)進(jìn)行。確定性診斷需要死后腦組織的病理檢查。
[0016]鑒于A β在AD患者腦中積累并且是AD病理發(fā)生的中心元素的事實(shí)，該蛋白已被認(rèn)為是AD生物標(biāo)志物的最合適的候選物。然而，使用A β作為AD的血漿生物標(biāo)志物面臨以下問題:血清中Αβ肽(Αβ (1-40)和Αβ (1-42))的濃度極低從而沒有足夠靈敏的測定以允許可靠地檢測所述肽物質(zhì)。
[0017]多種不同的測定已用于確定生物樣品中淀粉樣β肽的水平(參見，例如，Scheuner等人(Nature Med.，1996，2:864-870);Tamaoka A 等人(J Neurol Sc1., 1996, 141, 65-68)；Suzuki, N.等人(Science, 1994，264:1336-1340) ；W0200722015 ；Vanderstichele H 等人(Amyloid, 2000, 7, 245-258) ；Fukomoto y col.(Arch.Neurol.2003, 60, 958-964) ；Mehta等人(Arch.Neurol.57, 2000, 100-105) ；Mayeux, R.等人(Ann Neurol.1999, 46, 412-416)；Lanz, T.A和 Schacthter, J.B.(J.Neuroscience Methods, 2006, 157:71-81)、W0200750359、W0016280U W00315617、W00246237、W00413172所述的方法)。然而，所有目前已知的基于ELISA的測定的檢測下限至多不在個(gè)位數(shù)pg/mL的范圍內(nèi)，該檢測下限足以檢測患有常見AD的患者的CSF中的Αβ 40和Αβ 42以及用于檢測血漿中的所述物質(zhì)，但是不適合檢測患有偶發(fā)AD的患者的血漿中的Aβ 42，其中所述Aβ 42的血漿濃度要低得多。
[0018]到目前為止，僅顯示檢測下限低于個(gè)位數(shù)pg/mL的Αβ肽測定對應(yīng)于W0200646644和TO2009015696中所述的測定。
[0019]W0200646644描述了電化學(xué)發(fā)光(ECL)夾心測定，其中mAb21F12 (其識(shí)別A β 42的氨基酸33-42)偶聯(lián)至磁珠，然后用于捕獲含有Aβ 42的樣品中的Aβ 42肽并進(jìn)一步與偶聯(lián)至釕復(fù)合物的3D6mAb接觸。然后當(dāng)施加電能時(shí)，通過釕復(fù)合物所發(fā)出的光來檢測所結(jié)合的3D6抗體的量。使用這種測定，發(fā)明人能夠檢測低至0.5pg/mL的Αβ42標(biāo)準(zhǔn)品。然而，當(dāng)使用相同測定來比較來自AD患者和健康對照的血漿樣品中的Αβ 42時(shí)，在兩組患者之間未觀察到顯著差異，這使得該發(fā)明人得出由于降解作用血清中完整Αβ 42的量非常低的結(jié)論并且轉(zhuǎn)向使用提供ng/mL范圍的更低靈敏度水平的21F12mAb的競爭性ELISA測定。
[0020]W02009015696描述了高靈敏度ELISA夾心測定，其中檢測抗體與對所述抗體顯示出特異性的生物素標(biāo)記的試劑接觸。所述試劑與偶聯(lián)至過氧化物酶的鏈霉親和素接觸。然后，通過使用TMB的比色法或使用QuantaBlue的熒光法檢測過氧化物酶活性。
[0021]W02006053251描述了用于確定樣品中淀粉樣β肽物質(zhì)的方法，包括將樣品與變性劑接觸，從樣品-變性劑混合物中提取肽集合(peptide pool)，將淀粉樣β肽物質(zhì)與所述集合分離并確定淀粉樣β肽物質(zhì)的量。該方法需要在所述確定之前分離肽的步驟，這導(dǎo)致處理時(shí)間增長和成本提高。
[0022]通過檢測患者腦或CSF中存在的生物標(biāo)志物的水平來診斷AD是現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法。已表征了不同的生物標(biāo)志物，它們的確定是在CSF中進(jìn)行的。CSF直接反映了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞外間隙的組成，并因此提供了更高濃度作為生物標(biāo)志物。然而，CSF只可以通過腰椎穿刺獲得，這不是患有癡呆病的患者容易接受的常規(guī)診斷方法，更不用說患有記憶力失調(diào)的患者。因此，需要可以在可以從身體中無創(chuàng)傷地取得的樣品中檢測的AD生物標(biāo)志物。
[0023]在現(xiàn)有技術(shù)中描述的并且可以在血漿中檢測的適合的AD生物標(biāo)志物包括(i)源自淀粉樣斑塊的標(biāo)志物、(ii)抗Αβ或βΑΡΡ的自身抗體、(iii)炎癥標(biāo)志物(如IL-6)、其受體或gpl30、C-反應(yīng)性蛋白或氧化性應(yīng)激(異前列腺烷)、(iv)脂類代謝標(biāo)志物(apoE、氧化固醇)和(V)血管病標(biāo)志物(高半胱氨酸、脂蛋白b Clq (Scheuner D等人，(1996)NatureMed 2,864-870)ο
[0024]然而，鑒于A β在AD患者腦中積累并且是AD發(fā)病的中心元素的事實(shí)，該蛋白已被認(rèn)為是AD生物標(biāo)志物的最合適的候選物。然而，使用A β作為AD的血漿生物標(biāo)志物面臨以下問題:血清中Αβ肽(Αβ (1-40)和Αβ (1-42))的濃度極低從而沒有足夠靈敏的測定以允許可靠地檢測所述肽物質(zhì)。
[0025]此外，已描述了用于檢測Αβ肽以及用于免疫測定的幾種抗體。例如，單克隆抗Αβ (1-17) (6Ε10)是針對Αβ肽的N端區(qū)域并且對抗肽Aβ (1-17)產(chǎn)生的抗體(Kim KS等人，Neurosc1.Res.Comm.7; 1988)并且識(shí)別包含所述區(qū)域的A β肽或者是對抗肽A β (1-28)產(chǎn)生的單克隆抗體(Pierce)。
[0026]然而，在本領(lǐng)域中需要改善的免疫學(xué)測定和試劑盒用來檢測源自Αβ的肽，其克服了本領(lǐng)域中已知的方法和試劑盒的問題，具體地，它們足夠靈敏以通過可靠的方式檢測患有偶發(fā)性AD的患者的血漿中的Αβ肽。還需要鑒別針對AD早期診斷的生物標(biāo)志物，它是靈敏并且特異性的，并且它能夠區(qū)分由于年齡所造成的認(rèn)知障礙和與該過程的早期癥狀有關(guān)的那些，以及區(qū)分由于AD和由于其他退行性病癥造成的改變。根據(jù)Growdon等人(Neurobiol.Aging, 1998，19:109-116)，AD的理想標(biāo)志物應(yīng)滿足以下要求:
[0027]-它應(yīng)檢測神經(jīng)病理學(xué)的基本特征
[0028]-它應(yīng)在神經(jīng)病理學(xué)確認(rèn)的病歷中有效
[0029]-它應(yīng)對AD檢測顯示出至少80%的靈敏度
[0030]-它應(yīng)對區(qū)分AD和其他類型的癡呆病顯示出至少80%的特異性，和
[0031]-它應(yīng)當(dāng)可靠地、可重復(fù)地、無創(chuàng)地，簡單地實(shí)施并且應(yīng)是廉價(jià)的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0032]在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及特異性結(jié)合至A β (1-17)肽的抗體。[0033]在第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于檢測A β (1-17)肽的試劑盒，包括:
[0034](i)第一抗體，它是如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所定義的抗體，和
[0035](ii)第二抗體，其識(shí)別不同于被所述第一抗體識(shí)別的區(qū)域的Αβ (1-17)肽的區(qū)域。
[0036]在第三個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于確定或檢測樣品中Αβ (1-17)肽的方法，包括以下步驟:
[0037](i)用與Αβ (1-17)肽特異性結(jié)合的第一抗體捕獲樣品中存在的所述肽，
[0038](ii)用第二抗體接觸步驟(i)中形成的免疫復(fù)合物，其中所述第二抗體如權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)所定義并且其中所述第二抗體識(shí)別不同于所述第一抗體的區(qū)域并且與結(jié)合對的第一兀件偶聯(lián)；
[0039](iii)用偶聯(lián)至可檢測標(biāo)記的結(jié)合對的第二元件接觸在步驟(ii)中形成的復(fù)合物，和
[0040](iv)檢測或確定所述可檢測標(biāo)記的活性或量。
[0041]在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于監(jiān)測受試者體內(nèi)神經(jīng)退行性疾病的方法，包括:
[0042](a)在第一時(shí)間點(diǎn)確定來自所述受試者的樣品中血漿樣品中游離Aβ 17肽的水平和結(jié)合至所述受試者的樣品中的血液樣品中的細(xì)胞的Αβ 17肽的水平；
[0043](b)在第二時(shí)間點(diǎn)確定來自所述受試者的樣品中血漿樣品中游離A β 17肽的水平和結(jié)合至所述受試者 的血液樣品中的細(xì)胞的Αβ 17肽的水平，以及
[0044](c)比較在所述第一和第二時(shí)間點(diǎn)血漿樣品中游離Αβ 17肽水平與結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的A β 17肽水平的比率；
[0045]其中如果相對于第一時(shí)間點(diǎn)，在第二時(shí)間點(diǎn)所述比率升高，則它指示在所述第一和所述第二時(shí)間點(diǎn)之間受試者體內(nèi)阿爾茨海默氏病的惡化。
[0046]在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于確定受試者是否患有輕度阿爾茨海默氏病的方法，包括確定選自由以下組成的組中的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的值:
[0047](a)結(jié)合至來自所述受試者樣品的血液樣品中的細(xì)胞的Αβ 17、Αβ40和Αβ42肽的加和值；
[0048](b)來自所述受試者的血漿樣品中Aβ 17、Αβ 40和Αβ 42總肽水平和結(jié)合至來自所述受試者的血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 17、Aβ 40和Αβ 42肽水平的加和值；
[0049](C)來自所述受試者的血漿樣品中總A β 42肽水平和結(jié)合至來自所述受試者的血液樣品中的細(xì)胞的A β 42肽水平的加和值；
[0050](d)來自所述受試者的血漿樣品中總Aβ 40和Αβ 42肽水平和結(jié)合至來自所述受試者的血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 40和Αβ 42肽水平的加和值；
[0051](e)來自所述受試者的血漿樣品中游離的Αβ 17水平與結(jié)合至來自所述受試者的血液樣品中的細(xì)胞的A β 17肽水平之間的比率值；
[0052]其中如果所述參數(shù)中一個(gè)或多個(gè)的值相對于健康受試者體內(nèi)參考樣品中所述參數(shù)的值增加，則所述受試者患有輕度阿爾茨海默氏病。
[0053]在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于確定受試者是否患有具有前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的MCI的方法，包括確定選自下組的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的值:
[0054](a)來自所述受試者的血漿樣品中總Aβ 42肽水平和結(jié)合至所述受試者的血液樣品中的細(xì)胞的A β 42肽水平的加和值；
[0055](b)來自所述受試者的血漿樣品中總Aβ 40和Αβ 42肽水平和結(jié)合至來自所述受試者的血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 40和Αβ 42肽水平的加和值；
[0056](C)來自所述受試者的血漿樣品中游離Aβ 17肽水平與結(jié)合至來自所述受試者的血液樣品中的細(xì)胞的A β 17肽水平之間的比率值；
[0057]Cd)結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Αβ 17水平與結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Αβ 42肽水平之間的比率值；
[0058](e)兩個(gè)參數(shù)之間的比率值，其中所述第一參數(shù)對應(yīng)于血漿樣品中總Αβ 17肽和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Αβ 17肽的加和水平，而所述第二參數(shù)對應(yīng)于血漿樣品中總Αβ 42肽和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的A β 42肽的加和水平；
[0059](f)兩個(gè)參數(shù)之間的比率值，其中所述第一參數(shù)對應(yīng)于結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Αβ 17肽的水平，而所述第二參數(shù)對應(yīng)于結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 40肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的A β 42肽水平的加和值；以及
[0060](g)兩個(gè)參數(shù)之間的比率值，其中所述第一參數(shù)對應(yīng)于來自所述受試者的血漿樣品中總Αβ 17肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 17肽水平的加和值，而所述第二參數(shù)對應(yīng)于血漿樣品中總Aβ 40和Αβ 42肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 40和A β 42肽水平的加和值；
[0061]其中如果相對于健 康受試者的參考樣品中的值，參數(shù)(a)、(b)或(C)中的一個(gè)或多個(gè)的值增加和/或參數(shù)(d)、(e)、(f)或(g)中的一個(gè)或多個(gè)的值降低，則所述受試者患有具有前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的MCI。
[0062]在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于確定受試者是否患有具有前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的MCI的方法，包括確定選自下組的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的值:
[0063](a)結(jié)合至來自所述受試者樣品的血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 17、Αβ 40和Αβ 42肽水平的加和值；
[0064](b)結(jié)合至所述受試者的血液樣品中的細(xì)胞的Αβ 17肽水平和結(jié)合至所述受試者的血液樣品中的細(xì)胞的A β 42肽水平之間的比率值；
[0065](C)兩個(gè)參數(shù)之間的比率值，其中所述第一參數(shù)對應(yīng)于來自所述受試者的血漿樣品中Αβ 17總肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 17肽水平的加和值，而所述第二參數(shù)對應(yīng)于來自所述受試者的血漿樣品中Αβ 42總肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的A β 42肽水平的加和值；
[0066](d)兩個(gè)參數(shù)之間的比率值，其中所述第一參數(shù)對應(yīng)于結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的A β 17肽水平，而所述第二參數(shù)對應(yīng)于結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的A β 40和A β 42肽水平的加和值；
[0067](e)兩個(gè)參數(shù)之間的比率值，其中所述第一參數(shù)對應(yīng)于來自所述受試者的血漿樣品中Αβ 17總肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 17肽水平的加和值，而所述第二參數(shù)對應(yīng)于血漿樣品中A β 40和A β 42總肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的A β 40和A β 42肽水平的加和值；
[0068]其中如果相對于患有具有非前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的MCI的受試者體內(nèi)參考樣品的值，(a)的值增加和/或所述參數(shù)(b)、(C)、(d)和(e)中的一個(gè)或多個(gè)的值降低，則所述受試者患有具有前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的MCI。
[0069]在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于確定受試者是否患有輕度阿爾茨海默氏病的方法，包括確定選自下組的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的值:
[0070](a)結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 17、Aβ 40和Αβ 42肽水平的加和值；
[0071](b)血漿樣品中Αβ 17、Aβ 40和Αβ 42總肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的A β 17、A β 40和A β 42肽水平的加和值；
[0072](c)血漿樣品中總Aβ 42肽和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 42肽水平的加和值；
[0073]Cd)血漿樣品中總Αβ 40和Αβ 42肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Αβ 40和A β 42肽水平的加和值；
[0074]Ce)血漿樣品中總Αβ 40肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Αβ 40肽水平的加和值；
[0075](f)兩個(gè)參數(shù)之間的比率值，其中所述第一參數(shù)對應(yīng)于結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的A β 17肽水平，而所述第二參數(shù)對應(yīng)于結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的A β 40和A β 42肽水平的加和值；以及
[0076](g)血漿樣品中游離Aβ 17肽水平與結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 17肽水平之間的比率值；
[0077]其中如果所述參數(shù)中一個(gè)或多個(gè)的值相對于患有具有非前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的MCI的受試者體內(nèi)參考樣品的值增加，則所述受試者患有輕度阿爾茨海默氏病。
[0078]在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于確定受試者是否患有輕度阿爾茨海默氏病的方法，包括確定選自下組的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的值:
[0079](a)血漿樣品中游離Αβ 17肽水平與血漿樣品中游離Αβ 40肽水平之間的比率值；和
[0080](b)兩個(gè)參數(shù)之間的比率，其中所述第一參數(shù)對應(yīng)于血漿樣品中游離A β 17肽水平，而所述第二參數(shù)對應(yīng)于血漿樣品中游離A β 40和A β 42肽的加和水平；
[0081]其中如果所述參數(shù)中一個(gè)或多個(gè)的值相對于前驅(qū)性輕度認(rèn)知障礙受試者體內(nèi)參考樣品的值增加，則所述受試者患有輕度阿爾茨海默氏病。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0082]圖1:使用多克隆抗Αβ (1-17)抗體和吸附至薄膜的不同的Αβ肽進(jìn)行的斑點(diǎn)印跡測定的結(jié)果。所述測定中使用的第二抗體是山羊抗兔抗體-HRP。通過SNAP技術(shù)在I分鐘和3分鐘曝光下用ECL顯影斑點(diǎn)印跡。
[0083]圖2顯示了 CSF樣品(2A)和血漿樣品(2B)的質(zhì)譜分析，其中用箭頭指示A β 17峰。
[0084]圖3顯示了在不同患者組中一些標(biāo)志物的平均值。FP:血漿中游離的Aβ ；ΤΡ:血漿中的總Aβ ;CB:結(jié)合至細(xì)胞的Αβ ;ΡΙΒ:血液中的集合(血漿中的總Αβ +結(jié)合至細(xì)胞的Αβ )。(A)針對不同組在夾心ELISA中獲得的A β標(biāo)志物的濃度(以pg/mL為單位):CS>65(大于65歲的健康受試者)、可能MCI (患有具有可能或非前驅(qū)性AD的輕度認(rèn)知障礙的受試者)、疑似MCI (患有具有疑似或前驅(qū)性AD的輕度認(rèn)知障礙的受試者)和輕度AD (患有輕度阿爾茨海默氏病的受試者)。(B)和(C):表示針對在不同組上幾種標(biāo)志物在ELISA中獲得的吸光值的圖。
[0085]圖4顯示了在不同患者組中一些標(biāo)志物的平均值。FP:血漿中游離的Aβ ；ΤΡ:血漿中的總Aβ ;CB:結(jié)合至細(xì)胞的Αβ ;ΡΙΒ:血液中的集合(血漿中的總Αβ +結(jié)合至細(xì)胞的Αβ)。(A)針對不同組在夾心ELISA中獲得的Αβ標(biāo)志物濃度(以pg/mL為單位)的比率:CS>65 (大于65歲的健康受試者)、可能MCI (可能或非前驅(qū)性輕度認(rèn)知障礙)、疑似MCI (疑似或前驅(qū)性輕度認(rèn)知障礙)和輕度AD (輕度阿爾茨海默氏病)。(B)表示針對在不同組上的幾種標(biāo)志物在ELISA中獲得的吸光值的圖。
[0086]圖5顯示了在不同患者組中一些標(biāo)志物的平均值。FP:血漿中游離的Aβ ；ΤΡ:血漿中的總Aβ ;CB:結(jié)合至細(xì)胞的Αβ ;ΡΙΒ:血液中的集合(血漿中的總Αβ +結(jié)合至細(xì)胞的Αβ )。(A)針對不同組在夾心ELISA中獲得的Αβ標(biāo)志物濃度(以pg/mL為單位)的比率:CS>65 (大于65歲的健康受試者)、可能MCI (可能或非前驅(qū)性輕度認(rèn)知障礙)、疑似MCI (疑似或前驅(qū)性輕度認(rèn)知障礙)和輕度AD (輕度阿爾茨海默氏病)。(B)表示針對在不同組上的幾種標(biāo)志物在ELISA中獲得的吸光值的圖。
[0087]圖6顯示了用于區(qū)分不同組的血漿中游離的Αβ 17 (FP)和結(jié)合至細(xì)胞的Αβ 17(CB)之間的比率。(A)針對不同組在夾心ELISA中獲得的Αβ標(biāo)志物的濃度(以pg/mL為單位):CS>65 (大于65歲的健康 受試者)、可能MCI (可能或非前驅(qū)性輕度認(rèn)知障礙)、疑似MCI (疑似或前驅(qū)性輕度認(rèn)知障礙)和輕度AD (輕度阿爾茨海默氏病)。(B)表示針對在不同組上的所述標(biāo)志物在ELISA中獲得的吸光值的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0088]本發(fā)明人已產(chǎn)生了對Αβ 17肽具有高度特異性的抗體，其并不識(shí)別其他Αβ種類。例如，圖1顯示所述抗體以特異性方式識(shí)別Aβ 17而對其他Aβ種類(如Αβ 15,Αβ 16、Αβ38、Αβ40或Αβ42)不顯示任何顯著的交叉反應(yīng)性。他們還設(shè)計(jì)了用于檢測Aβ 17肽的試劑盒，其允許對任何受試者的任何樣品中的所述分子種類進(jìn)行可靠的定量，具體地是懷疑患有AD的受試者的血漿中。同樣地，本發(fā)明人顯示有可能通過測量不同參數(shù)的水平區(qū)別不同組的受試者:健康受試者、前驅(qū)性AD受試者、非前驅(qū)性輕度認(rèn)知障礙受試者和輕度AD受試者。
_9] 本發(fā)明的抗體
[0090]在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及特異性結(jié)合至Aβ (1-17)肽(SEQ ID NO:1)的抗體，下文稱為本發(fā)明的抗體。
[0091]如本文所使用的術(shù)語“特異性結(jié)合”是指結(jié)合至A β 17肽而不與其他A β肽具有任何顯著交叉反應(yīng)的抗體。在具體的實(shí)施方式中，對Αβ 17肽的特異性高于50%，高于60%，高于70%，高于80%或高于90%。更優(yōu)選地，所述抗體對A β 17肽的特異性高于95%。如從圖1中可見的，本發(fā)明人已測定了抗Αβ 17抗體的特異性并且他們已顯示所述抗體對Αβ 17肽具有高度特異性并且對其他A β肽(Α β 15、A β 16、A β 38、A β 40和A β 42)不顯示出顯著的交叉反應(yīng)性。因此，在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的抗體對選自由以下組成的組中的Αβ肽不顯示出顯著的交叉反應(yīng)性:Αβ 15、Aβ 16、Aβ 38、Aβ 40、Aβ 42和它們一個(gè)或多個(gè)的組合。[0092]實(shí)際上，對根據(jù)本發(fā)明的抗體類型沒有限制，只要含有對A β 17具有特異性的至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。因此，適合的抗體分子包括:
[0093]-“完整的”抗體，其包含抗原結(jié)合可變區(qū)以及輕鏈恒定域(CL)和重鏈恒定域CH1、CH2 和 CH3，
[0094]- “Fab”片段，通過完整抗體的木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生，并且其包含單抗原結(jié)合位點(diǎn)以及CL和CHl區(qū)，
[0095]- “F(ab’)2”片段，通過完整抗體的胰蛋白酶消化產(chǎn)生，并且其含有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)， [0096]- “Fab’ ”片段，其含有輕鏈恒定域和重鏈第一恒定域(CHl)并且其僅具有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。Fab’片段通過在重鏈CHl域的羧基端添加一些殘基(包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸)而不同于Fab片段。
[0097]- “Fv”是含有完整抗原識(shí)別和抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。該區(qū)域由處于緊密、非共價(jià)結(jié)合的一個(gè)重鏈和一個(gè)輕鏈可變域的二聚體組成。它處于這種構(gòu)象:每個(gè)可變域的三個(gè)高變區(qū)(CDR)相互作用以限定VH-VL 二聚體的表面上的抗原結(jié)合位點(diǎn)。總體而言，六個(gè)高變區(qū)賦予抗體抗原結(jié)合特異性。然而，甚至單個(gè)可變域(或僅包含對抗原具有特異性的三個(gè)高變區(qū)的Fv的一半)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，盡管比整個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的親合力低。
[0098]-單鏈FV或“scFv”抗體片段包含抗體的結(jié)構(gòu)域VL和VH，其中這些結(jié)構(gòu)域以單多肽鏈形式存在。優(yōu)選地，VL和VH區(qū)通過多肽接頭連接，從而使得scFv形成用于抗原結(jié)合的所需結(jié)構(gòu)。
[0099]-“雙鏈抗體”包含連接到通過肽接頭連接的相同多肽鏈(VH-VL)上的輕鏈可變域(VL)的重鏈可變域(VH)，所述肽接頭太短從而不能在相同鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對。這迫使與另一條鏈的互補(bǔ)域配對并促進(jìn)二聚體分子與兩個(gè)功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)組裝。
[0100]-“雙特異性抗體”(BAb)為單個(gè)二價(jià)抗體(或其免疫治療有效片段)，其具有兩個(gè)不同特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)?？梢酝ㄟ^化學(xué)法或通過本領(lǐng)域中已知的基因工程方法將兩個(gè)抗原位點(diǎn)偶聯(lián)在一起。
[0101]還可以使用本領(lǐng)域中已知的常規(guī)方法來修飾所有這些抗體片段，例如，通過單獨(dú)或組合地使用氨基酸缺失、插入、取代、添加和/或重組(和/或本領(lǐng)域中已知的任何其他的修飾(例如，翻譯后修飾和化學(xué)修飾，如糖基化和磷酸化))。將這些修飾引入到免疫球蛋白鏈的氨基酸序列背后的D NA序列中的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的；參見，例如，Sambrook等人；“分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)”；Cold Spring Harbor Laboratory Press,第二版(1989)和第三版(2001 )。
[0102]適合于本發(fā)明的抗體包括多克隆抗體和單克隆抗體。為了生產(chǎn)多克隆抗體，可以通過用與具有免疫原性的Αβ 17片段對應(yīng)的肽注射使多種宿主(包括山羊、兔、大鼠、小鼠、綿羊、狗、駱駝、單峰駝、美洲駝、人、鳥類等)免疫。根據(jù)宿主種類，可以使用多種佐劑來提高免疫應(yīng)答。這些佐劑包括(但不限于)弗氏佐劑、礦物凝膠(如氫氧化鋁)和表面活性物質(zhì)，如溶血卵磷脂、聚陰離子、肽、油乳劑、KLH和二硝基酚。在人中使用的佐劑中，BCG (卡介苗)和小棒桿菌(Corynebacterium parvum)是特別優(yōu)選的。在優(yōu)選的實(shí)施方式中,用于產(chǎn)生本發(fā)明所述的抗體的佐劑是弗氏完全佐劑、弗氏不完全輔劑和Imject明礬。[0103]將抗原結(jié)合至在有待免疫的物種中具有免疫原性的蛋白質(zhì)可能是有用的。使用雙官能試劑或衍生試劑(例如，馬來酰亞胺基苯甲?；腔牾啺孵?通過半胱氨酸殘基結(jié)合)、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐或SOCl2),用于與所述肽結(jié)合的蛋白質(zhì)為，但不限于，鑰孔血藍(lán)素(KLH)、藍(lán)色載體(Blue Carrier，分離自似鮑巖螺(Concholepas concholepas)的血藍(lán)蛋白)、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，用于結(jié)合的蛋白質(zhì)為KLH。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述肽與KLH之間的結(jié)合是通過交聯(lián)劑NHS-PEG4-馬來酰亞胺進(jìn)行的，并且所述肽在N端具有半胱氨酸以進(jìn)行肽與KLH的結(jié)合。
[0104] 為了生產(chǎn)單克隆抗體，可以使用常規(guī)技術(shù)。例如，可以使用由Kohler等人，Nature, 256:495 (1975)首先描述的雜交瘤方法，使用Ausubel, F.Μ.等人(分子生物學(xué)現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)指南(Current Protocols in Molecular Biology), John ffiley&SonsInc;ring-bound edition, 2003)在單元11.4至11.11中詳細(xì)描述的程序制備單克隆抗體。可替代地，可以通過重組DNA程序從使用McCafferty等人，Nature, 348:552-554(1990)中所述的技術(shù)產(chǎn)生的抗體噬菌體文庫中分離單克隆抗體。Clacksoii等人,Nature, 352:624-628 (1991)和 Marks 等人，J.Mol.Biol.，222:581-597 (1991)分別描述了使用噬菌體文庫分離鼠和人抗體。隨后的出版物描述了通過鏈改組生產(chǎn)高親合力 CnM 范圍)人抗體(Marks 等人,Bio/Technology, 10:779-783(1992))以及組合感染和體內(nèi)重組作為用于構(gòu)建非常大的噬菌體文庫的策略(Waterhouse等人，Nucl.Acids.Res.,21:2265-2266 (1993))。因此，這些技術(shù)是用于分離單克隆抗體的常規(guī)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行的替代方案。
[0105]可以在出血并除去纖維蛋白凝塊后，將多克隆抗體直接用作由免疫的宿主獲得的抗血清。單克隆抗體可以直接用作雜交瘤培養(yǎng)物的上清液或用作在適合宿主的腹膜腔中植入雜交瘤后的腹水液?？商娲?，可以在使用前通過傳統(tǒng)方法(如使用源自Αβ 17的肽的親合純化、非變性凝膠純化、HPLC或RP-HPLC、尺寸排阻、在蛋白A柱上純化或這些技術(shù)的任意組合)來純化多克隆或單克隆免疫球蛋白分子。
[0106]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的抗體為多克隆抗體。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，用于產(chǎn)生本發(fā)明所述抗體的方法包括以下步驟:
[0107]-第一次給藥:使用弗氏完全佐劑作為佐劑,用100μ g肽使兔子免疫。
[0108]-第二次給藥:使用弗氏不完全佐劑作為佐劑,用100μ g肽使兔子免疫。
[0109]-第三次給藥:使用明礬作為佐劑,用100μ g肽使兔子免疫。
[0110]-3次之后的給藥，用200 μ g肽，交替地使用佐劑:弗氏不完全佐劑-明礬-弗氏不完全佐劑。
[0111]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，用于產(chǎn)生本發(fā)明所述的抗體的Αβ肽或免疫原的區(qū)域選自由以下組成的組中:對應(yīng)于序列VHHQKL (SEQ ID NO:2)的肽Αβ (12-17)和對應(yīng)于序列EVHHQKL (SEQ ID Ν0:3)的肽 Αβ (11-17)。
[0112]本發(fā)明的試劑盒
[0113]在第二方面，本發(fā)明涉及用于檢測或確定Αβ (1-17)肽的試劑盒(在下文中稱為本發(fā)明的試劑盒)，其包括:
[0114](i)第一抗體，它是對根據(jù)本發(fā)明的Αβ (1-17)具有特異性的抗體，和[0115](ii)第二抗體，其識(shí)別不同于被所述第一抗體識(shí)別的區(qū)域的Αβ (1-17)肽的區(qū)域。
[0116]術(shù)語“淀粉樣β肽”在本文中與Αβ、淀粉樣β蛋白質(zhì)、“Αβ ”、“βΑΡ”或“Αβ
肽”可互換使用，是指作為在阿爾茨海默氏病(AD)、唐氏綜合征和荷蘭型遺傳性腦出血伴淀粉樣變性(HCHWA-D)的患者腦中發(fā)現(xiàn)的老年斑和血管淀粉樣沉積物(淀粉樣血管病)的主要化學(xué)組分的肽家族。無論處于何種形式，淀粉樣β肽是β_淀粉樣前體蛋白(APP)的片段，其包含通過和Y-分泌酶或通過和α-分泌酶順序地蛋白水解切割淀粉樣前體蛋白所產(chǎn)生的不同數(shù)目的氨基酸。
[0117]淀粉樣β肽一般表示為“Α β (x-y)”，其中X代表淀粉樣β肽的氨基末端的氨基酸數(shù)，y代表羧基末端的氨基酸數(shù)。如本文所使用的“Αβ (1-17) ”或“Αβ 17”涉及對應(yīng)于淀粉樣前體蛋白的氨基酸672至688 (SEQ ID NO:1)的17個(gè)氨基酸肽，并且它是通過β-和α-分泌酶順序地蛋白水解切割淀粉樣前體蛋白(SEQ ID NO:4)產(chǎn)生的。
[0118]在本發(fā)明的背景中，“捕獲抗體”是用于從樣品中回收抗體特異性結(jié)合的所有分子種類的抗體。實(shí)際上，對于可以用作捕獲抗體的抗體類型沒有限制，只要它含有對Αβ 17具有特異性的至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。原則上，對Αβ 17肽具有特異性的任何抗體可以用作捕獲抗體。捕獲抗體結(jié)合至與第二抗體不同的區(qū)域。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，捕獲抗體針對Αβ 17肽的N端區(qū)域的表位。在又更優(yōu)選的實(shí)施方式中，捕獲抗體可以靶向的表位包括位于Αβ 17的氨基酸I至10內(nèi)的表位。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述捕獲抗體為單克隆抗體。在又更優(yōu)選的實(shí)施方式中，捕獲抗體識(shí)別與A β肽的氨基酸1-16對應(yīng)的區(qū)域。在又更優(yōu)選的實(shí)施方式中，用作捕獲抗體的單克隆抗體為6E10mAb,如在Kim, K.S.(NeuroscienceRes.Comm.1988，2:121-130)中所述的。
[0119]本發(fā)明的試劑盒的第二組分對應(yīng)于本發(fā)明所述的抗體，這先前已在本發(fā)明中進(jìn)行描述。在本發(fā)明的背景中，“檢測抗體”是將用于檢測已被捕獲抗體保留的抗原的量的抗體。第一抗體識(shí)別不同于第二抗體的區(qū)域，這是因?yàn)樗仨毥Y(jié)合至未被捕獲抗體覆蓋的抗原區(qū)域。
[0120]所述第一抗體和第二抗體可以在本發(fā)明的試劑盒中不區(qū)別地用作捕獲和檢測抗體。
[0121]兩種抗體之一(第一抗體或第二抗體)可以偶聯(lián)至結(jié)合對的第一元件，從而允許檢測結(jié)合至被捕獲抗體捕獲的抗原的抗體。將偶聯(lián)的抗體將用作檢測抗體并且可以是第一抗體或第二抗體。
[0122]在具體的實(shí)施方式中，所述試劑盒還包含特異性結(jié)合至Αβ 40和/或Αβ 42的抗體或抗體組合。因此，在具體的實(shí)施方式中，所述試劑盒將用于A β 17肽和A β 40和/或A β 42肽的檢測。
[0123]如本文所使用的“Αβ 42”涉及對應(yīng)于氨基酸672至713 (SEQ ID NO:5)的42個(gè)氨基酸的肽并且它是通過β_和Y-分泌酶順序地蛋白水解切割淀粉樣前體蛋白(SEQ IDNO:4)產(chǎn)生的。
[0124]如本文所使用的“Αβ 40”涉及對應(yīng)于氨基酸672至711 (SEQ ID NO:6)的40個(gè)氨基酸的肽并且它是通過β_和Y-分泌酶順序地蛋白水解切割淀粉樣前體蛋白(SEQ IDNO:7)產(chǎn)生的。[0125]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，視情況將所述第一或第二抗體偶聯(lián)至結(jié)合對的第一元件。如果情況是這樣，則試劑盒中還包含偶聯(lián)至可檢測標(biāo)記的結(jié)合對的第二元件。在具體的實(shí)施方式中，如果偶聯(lián)至結(jié)合對的第二元件的可檢測標(biāo)記是酶標(biāo)記，則所述試劑盒還包含可以通過所述酶轉(zhuǎn)化為可檢測產(chǎn)物的底物。
[0126]結(jié)合對適合的第一和第二元件包括，但不限于:
[0127].半抗原或抗原/抗體，例如，地高辛和抗地高辛抗體，
[0128].生物素或生物素類似物(例如，氨基生物素、亞氨基生物素或脫硫生物素)/抗生物素蛋白或鏈霉親和素，
[0129]?糖/卵磷脂，
[0130].酶和輔因子，
[0131]?葉酸/葉酸鹽，
[0132].選擇性結(jié)合至蛋白的雙鏈寡核苷酸/轉(zhuǎn)錄因子，
[0133].核酸或核酸類似物/互補(bǔ)核酸，和
[0134].受體/配體，例如，留類激素受體/留類激素。
[0135]將理解術(shù)語結(jié)合對的“第一”和“第二”元件是相對的并且可以將上述元件中的每一個(gè)看作所述結(jié)合對的第一或第二元件。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，結(jié)合對的第一元件是生物素或其功能等效變體并且結(jié)合對的第二元件是抗生物素蛋白、鏈霉親和素或其功能等效變體。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，結(jié)合對的第二元件為鏈霉親和素。
[0136]適合的可檢測標(biāo)記包括，但不限于，熒光部分(例如，熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、香豆素、噁嗪、試齒靈、花青及其衍生物)、發(fā)光部分(例如，由Quantum Dot Corporation, PaloAlto, CA提供的Qdot?納米顆粒)。如果所述可檢測標(biāo)記是酶，則該酶必須能夠產(chǎn)生可檢測信號(hào)，例如，當(dāng)加入活化劑、底物、放大試劑等時(shí)。適合作為本發(fā)明的可檢測標(biāo)記的酶及其相應(yīng)的底物包括:
[0137]?堿性磷酸酶:
[0138]ο發(fā)色底物:基于磷酸對硝基苯基酯(p-NPP)、5_溴-4-氯_3_吲哚基磷酸酯/四唑鎗氮藍(lán)(BCIP/NBT)、堅(jiān)牢紅(FastRed) /萘酚-AS-TA磷酸酯的底物
[0139]ο發(fā)突光底物:4_甲基傘形酮基憐酸酯(4-methylumbelliferyl phosphate)(4-MUP)、2- (5’ -氯-2’ -磷?；趸交?-6-氯-4- (3H)-喹唑啉酮(CPPCQ),3,6-熒光素二磷酸酯(3，6-FDP)、堅(jiān)牢藍(lán)BB，堅(jiān)牢紅TR或堅(jiān)牢紅紫LB重氮鎗鹽
[0140].過氧化物酶:
[0141]ο發(fā)色底物，基于2，2-連氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、鄰苯二胺(0PT)、3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺(ΤΜΒ)、鄰聯(lián)茴香胺、5-氨基水楊酸、3-二甲基氨基苯甲酸(DMAB)和3-甲基-2-苯并噻唑啉腙(ΜΒΤΗ)、3-氨-9-乙基咔唑(AEC)和3，3’- 二氨基聯(lián)苯胺四氯化氫(DAB)。
[0142]ο發(fā)熒光底物:4_羥基-3-甲氧基苯基乙酸、還原型吩噁嗪和還原型苯并噻嗪，其包括Amplex? Red試劑、Amplex UltraRed和還原型二羥基氧雜蒽。
[0143].糖苷酶:
[0144]ο發(fā)色底物:用于β-D-半乳糖苷酶的鄰硝基苯基-β-D-半乳糖苷(o-NPG)、對硝基苯基-β -D-半乳糖昔和4_甲基傘形苯基-β -D-半乳糖昔(4-methylumbelIiphenyl- β-D-galactoside, MUG)。
[0145]o發(fā)熒光底物:試鹵靈β-D-吡喃半乳糖苷、熒光素二半乳糖苷(FDG)、熒光素二葡萄糖苷酸、4-甲基傘形酮基β -D-批喃半乳糖苷、羧基傘形酮基β -D-批喃半乳糖苷和氟化香豆素β-D-吡喃半乳糖苷。
[0146].氧化還原酶(熒光素酶):
[0147]O發(fā)光底物:螢光素。
[0148]在具體的實(shí)施方式中，可檢測標(biāo)記是熒光分子、發(fā)光分子或酶。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，可檢測標(biāo)記是辣根過氧化酶并且檢測試劑是TMB。[0149]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，試劑盒還包含固體載體。如本文所使用的，術(shù)語“載體”或“表面”是指多孔或無孔的水不溶性材料的固相，所述水不溶性材料可以具有多種形狀中的任一種，如條帶、桿、顆粒，包括乳膠顆粒、磁性顆粒、微粒、珠粒、薄膜、微量滴定孔和塑料管。原則上，任何材料均適合作為固體載體，只要它能夠結(jié)合足夠量的捕獲抗體。因此，根據(jù)所需的測定形式性能特性來確定固相材料的選擇。適合用作固體載體的材料包括聚合物材料，具體地為纖維素材料和源于纖維素的材料，如含纖維紙，例如，濾紙、色譜紙、玻璃纖維紙等；合成的或修飾的天然發(fā)生的聚合物，如硝化纖維素、醋酸纖維素、聚(氯乙烯)、聚丙烯酰胺、交聯(lián)葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚(對苯二甲酸亞乙基酯)、尼龍、聚乙烯丁酸酯等；它們自己單獨(dú)使用或與其他材料結(jié)合使用；玻璃，像例如，作為生物玻璃、陶瓷、金屬等可供使用的玻璃。優(yōu)選苯乙烯和羧化苯乙烯的非交聯(lián)聚合物或用其他活性基團(tuán)(如氨基、羥基、鹵素等)官能化的苯乙烯。在一些情況下，將使用取代的苯乙烯與二烯(如丁二烯)的共聚物。
[0150]在具體的實(shí)施方式中，將未偶聯(lián)至結(jié)合對的第一元件的抗體預(yù)結(jié)合至固體載體，其可以是第一或第二抗體?？梢栽谠噭┖兄袉为?dú)提供所述固體載體和第一或第二抗體，或者可替代地，可以遞送已用所述抗體預(yù)涂覆的載體。在這種情況下，已在所述抗體結(jié)合后用封閉溶液處理所述載體。如果所述載體是預(yù)涂覆的，則優(yōu)選地用濃海藻糖溶液處理所述載體并使其干燥，在這種情況下干燥的海藻糖在所述載體上形成暈圈。含有干燥海藻糖的這些載體是特別穩(wěn)定的并且當(dāng)在4°C下保持在黑暗中時(shí)可以儲(chǔ)存多達(dá)兩年。
[0151]試劑盒的其他成分可以包括:
[0152].從患者回收待分析樣品的方法。
[0153].制備目標(biāo)肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線所需的緩沖液和溶液。
[0154].測定期間用于清洗和封閉所述固體載體的緩沖液和溶液
[0155].用于用涂覆抗體涂覆所述固體載體的緩沖液和溶液
[0156].用于由可檢測標(biāo)記發(fā)展帶顏色的或發(fā)熒光的信號(hào)的試劑。
[0157].用于終止由可檢測標(biāo)記形成帶顏色的或發(fā)熒光的產(chǎn)物的試劑(例如，IN H2SO4)
[0158].用于維持所述肽處于展開狀態(tài)的方法(例如，濃鹽酸胍)。
[0159].含有Αβ 17肽以及另外地Αβ40和/或Αβ42肽或其組合的母液的樣品。
[0160]可以在結(jié)合待檢測的靶多肽之前或一旦肽/蛋白質(zhì)結(jié)合至所述抗體時(shí)將抗體固定至固體載體中。在任何情況下，如果使用固體載體，則在加入含有待確定的靶多肽的樣品之前封閉所述載體上的過量的蛋白結(jié)合位點(diǎn)是方便的。優(yōu)選地，在每次結(jié)合反應(yīng)后使用用于清洗所述復(fù)合物的相同緩沖液(例如，50mM Tris-HCl, pH8, PBS或TBS，可選地包含吐溫20)來封閉或淬滅所述載體上的肽結(jié)合位點(diǎn)，所述相同緩沖液補(bǔ)充有濃度約0.05%至10%，優(yōu)選I至5%，更優(yōu)選地約3%的大分子化合物(例如，牛血清白蛋白、脫脂奶粉、蛋白質(zhì)印跡封閉試劑、酪蛋白、乳白蛋白、卵白蛋白)。如果包含固定的捕獲抗體的載體必須儲(chǔ)存一段時(shí)間，則優(yōu)選地用濃海藻糖溶液處理所述載體并使其干燥，在這種情況下干燥的海藻糖在所述載體上形成暈圈。含有干燥海藻糖的這些載體是特別穩(wěn)定的并且當(dāng)在4°C下保持在黑暗中時(shí)可以儲(chǔ)存多達(dá)兩年。
[0161]本發(fā)明的試劑盒允許以高靈敏度和特異性檢測或確定被所述試劑盒的第一和第二抗體成分特異性識(shí)別的一種或多種肽。因此，在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的試劑盒用于檢測樣品中Αβ 17肽的用途。在具體的實(shí)施方式中，所述試劑盒用于可選地檢測樣品中的A β 40和/或A β 42肽及其組合。
[0162]鑒于本發(fā)明的試劑盒提供高靈敏度和特異性確定任何樣品中Αβ 17肽的濃度的能力，它可以用于任何疾病的診斷，其中任何細(xì)胞液或組織中任何這種肽的濃度是不同的，具體地，退行性疾病，并且更具體地，神經(jīng)退行性疾病?？梢曰诔霈F(xiàn)Αβ 17的改變水平或者A β 40或A β 42的改變水平進(jìn)行診斷的退行性疾病的非限制性實(shí)例包括:
[0163].骨退行性病癥,如骨質(zhì)減少癥、骨軟化、骨質(zhì)疏松癥、骨髓瘤、骨營養(yǎng)不良、佩吉特病、成骨不全、骨硬化、骨發(fā)育不全癥、體液性高韓血癥骨髓瘤(humoral hypercalcemicmyeloma)、多發(fā)性骨髓瘤和轉(zhuǎn)移后骨質(zhì)疏松癥。
[0164].軟骨退行性病癥，如Gorham-Stout綜合征；關(guān)節(jié)炎疾??；骨關(guān)節(jié)炎；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；牛皮癬關(guān)節(jié)炎；類風(fēng)濕病；和脆骨病。
[0165].肌肉退行性疾病，如肌營養(yǎng)不良、肌肉萎縮、充血性阻塞性肺病、肌肉消耗綜合征、肌少癥、惡病質(zhì)。
[0166].心臟退行性疾病，包括由于缺血造成的心臟細(xì)胞死亡、由于移植排斥造成的組織和器官死亡、由于自毒作用造成的聽力喪失。
[0167].視網(wǎng)膜退行性病癥，如色素性視網(wǎng)膜炎
[0168].神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,如亞歷山大病、Alper病、阿爾茨海默氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化、共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張、Batten病、牛海綿狀腦病(BSE)、Canavan病、科凱恩綜合征、皮質(zhì)基底節(jié)退化癥、克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease)、亨廷頓病、HIV相關(guān)性癡呆病、肯尼迪氏病、克拉伯病、Lewy體癡呆癥、馬查多-約瑟夫病(3型脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào))、多發(fā)性硬化、多系統(tǒng)萎縮癥、神經(jīng)疏螺旋體病、帕金森病、佩-梅二氏病、皮克氏病、原生性脊髓側(cè)索硬化、朊病毒病、雷夫敘姆病病、SandhofT病、希爾德病、精神分裂癥、Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten病(也稱為Batten病)、脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)、脊髓性肌萎縮、Steele-Richardson-Olszewski病、脊髓癆。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用本發(fā)明的試劑盒診斷的神經(jīng)退行性病癥為阿爾茲海默氏病。
[0169]用于確定或檢測Ag 17肽的方法
[0170]本發(fā)明的試劑盒允許執(zhí)行用于確定或檢測樣品中Αβ 17肽的方法。因此，在另一方面，本發(fā)明涉及用于確定或檢測樣品中Αβ (1-17)肽的方法，在下文中稱為用于本發(fā)明檢測的方法，其包括以下步驟:
[0171](i)用第一抗體捕獲樣品中存在的Αβ (1-17)肽，所述第一抗體特異性地結(jié)合至所述肽，[0172](ii)用第二抗體接觸步驟(i)中形成的免疫復(fù)合物，其中所述第二抗體如權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)所定義的并且其中所述第二抗體識(shí)別不同于所述第一抗體的區(qū)域并且與結(jié)合對的第一兀件偶聯(lián)；
[0173](iii)用偶聯(lián)了可檢測標(biāo)記的結(jié)合對的第二元件接觸在步驟(ii)中形成的復(fù)合物，和
[0174](iv)檢測或確定所述可檢測標(biāo)記的活性或量。
[0175]如在本發(fā)明中所理解的，“樣品”包括組織培養(yǎng)物、血漿、血清、唾液、精液、痰液、腦脊液(CSF)、眼淚、粘液、汗液、乳汁、腦或外周組織提取液等中的任一種。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述樣品選自下組:血液、血清、血漿和CSF。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述樣品是血漿樣品。
[0176]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所檢測的肽對應(yīng)于所述肽的非低聚物形式，更優(yōu)選地，Αβ 17的單體形式。
[0177]已在上文中針對本發(fā)明的試劑盒詳細(xì)描述了所述方法的每個(gè)步驟中使用的試劑和抗體。
[0178]在根據(jù)本發(fā)明所述方法的第一步驟中，含有Αβ 17肽的樣品與第一抗體接觸從而形成第一免疫復(fù)合物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述第一抗體為單克隆抗體。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述單克隆抗體為6Ε10抗體。
[0179]在已執(zhí)行所述第 一結(jié)合步驟后，可以清洗所述復(fù)合物以除去在原始樣品中發(fā)現(xiàn)的并不結(jié)合至捕獲抗體的任何過量的蛋白質(zhì)/肽?？梢栽诒景l(fā)明背景中使用的優(yōu)選的清洗緩沖液包括PH接近于生理情況的任何緩沖液(例如，50mM Tris-HCl),可選地包含鹽(例如，150mM NaCl)并且可選地包含低濃度的清潔劑(例如，0.05%的吐溫-20)。
[0180]在第二步驟中，然后將在捕獲抗體和樣品中Αβ肽之間形成的復(fù)合物與第二抗體接觸以形成“夾心型”免疫復(fù)合物。所述第一抗體和第二抗體將結(jié)合至Aβ 17肽的不同區(qū)域，使得它們之間沒有干擾。
[0181]本發(fā)明方法的第一和第二步驟可以互換并且可以通過所述第二抗體(本發(fā)明所述的抗體)進(jìn)行Αβ 17肽的捕獲。然后，將所述復(fù)合物與所述第一抗體接觸，所述第一抗體將在與所述第二抗體不同的區(qū)域結(jié)合。兩個(gè)抗體之一將偶聯(lián)至結(jié)合對的第一元件，其將對應(yīng)于在捕獲步驟中不使用的抗體。
[0182]在進(jìn)行了第二步驟之后，可以使用如之前所描述的基本相同的緩沖液和程序清洗所述免疫復(fù)合物以消除非特異性結(jié)合的抗體。
[0183]在第三步驟中，本發(fā)明所述的方法涉及將在捕獲抗體-抗原和與結(jié)合對的第一元件偶聯(lián)的檢測抗體之間形成的復(fù)合物與偶聯(lián)至可檢測標(biāo)記的結(jié)合對的第二元件接觸。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，結(jié)合對的第一元件是生物素而結(jié)合對的第二元件是抗生物素蛋白、鏈霉親和素或其功能等效變體。
[0184]在根據(jù)本發(fā)明所述方法的第四步驟中，所述方法涉及檢測可檢測的標(biāo)記。將理解可檢測標(biāo)記的檢測和/或定量取決于標(biāo)記的性質(zhì)并且是本領(lǐng)域中已知的技術(shù)。當(dāng)完整的底物或可檢測標(biāo)記含有發(fā)光或染料成分時(shí)，可以通過在UV透照器上目視觀察或通過使用基于UV的電荷稱合裝置(CCD)相機(jī)檢測系統(tǒng)、基于激光的凝膠掃描儀、基于氣弧的CCD相機(jī)檢測系統(tǒng)、與UV透照器結(jié)合的Polaroid相機(jī)、以及用于檢測發(fā)光的多種其他裝置進(jìn)行檢測。當(dāng)所述可檢測標(biāo)記為酶時(shí)，根據(jù)本發(fā)明所述方法的第四步驟涉及將用所述標(biāo)記物(例如，用可檢測標(biāo)記標(biāo)記的捕獲肽、檢測抗體和試劑)標(biāo)記的免疫復(fù)合物暴露于用作可檢測標(biāo)記的酶的激活劑、底物或放大試劑。能夠產(chǎn)生可檢測信號(hào)的熟知的可檢測標(biāo)記包括酶標(biāo)記的抗體。針對這個(gè)目的熟知的示例性酶包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶和糖苷酶，包括β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和β-葡糖醛酸酶。舉例來說，可以用辣根過氧化物酶標(biāo)記特異性結(jié)合至檢測抗體的試劑。當(dāng)形成捕獲部分-檢測抗體-試劑復(fù)合物時(shí)，則可以使用用作可檢測標(biāo)記的酶的任何廣泛熟知的底物進(jìn)行檢測。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述可檢測標(biāo)記是突光分子、發(fā)光分子或酶。
[0185]在具體的實(shí)施方式中，用于本發(fā)明檢測的方法還包括A β 40和/或A β 42肽的檢測。
[0186]用于監(jiān)測神經(jīng)退行性疾病發(fā)展的方法
[0187]在另一方面，本發(fā)明涉及用于監(jiān)測受試者體內(nèi)神經(jīng)退行性疾病的方法，在下文中稱為用于本發(fā)明監(jiān)測的方法，其包括在第一時(shí)間點(diǎn)確定樣品中血漿中游離Αβ 17肽的水平和結(jié)合至所述受試者的樣品中的細(xì)胞的Αβ 17肽的水平并且將這些水平與第二時(shí)間點(diǎn)的所述水平進(jìn)行比較；其中如果相對于第一時(shí)間點(diǎn)，在第二時(shí)間點(diǎn)血漿中游離Αβ 17肽和結(jié)合至細(xì)胞的Αβ 17肽的比率增加，則它指示受試者體內(nèi)阿爾茨海默氏病的惡化。
[0188]如本文所使用的術(shù)語“神經(jīng)退行性疾病”是指其中由于細(xì)胞死亡所造成的神經(jīng)元細(xì)胞損失的病癥或失調(diào)，其導(dǎo)致認(rèn)知功能退化或?qū)е驴梢酝ㄟ^以下表征的損害、功能障礙或并發(fā)癥:神經(jīng)異常、神經(jīng)退行性異常、生理異常、心理異?；蛐袨楫惓?。可以用本發(fā)明所述方法診斷的適合的神經(jīng)退行性疾病包括，但不限于，老化相關(guān)的黃斑變性、克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease)、阿爾茨海默氏病、具有淀粉樣變性的腦血管病、血管性癡呆、放射治療引起的癡呆、軸突損傷、急性皮層擴(kuò)散性抑制、α -共核蛋白病、腦缺血、亨廷頓病、永久性局灶性腦缺血、周圍神經(jīng)再生、癲癇持續(xù)狀態(tài)后模型(post-statusepilepticus model)、脊髓損傷、散發(fā)性肌萎縮側(cè)索硬化癥和傳染性海綿狀腦病。
[0189]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明所述方法監(jiān)測的神經(jīng)退行性疾病為阿爾茨海默氏病或其前驅(qū)性形式，包括輕度認(rèn)知障礙、具有疑似阿爾茨海默氏病的輕度認(rèn)知障礙或具有可能阿爾茨海默氏病的輕度認(rèn)知障礙。
[0190]用于本發(fā)明監(jiān)測的方法對于評價(jià)受試者體內(nèi)阿爾茨海默氏病的發(fā)展。因此，本發(fā)明人顯示血漿中游離A β 17肽的水平/結(jié)合至細(xì)胞的A β 17肽的水平的比率增加指示AD惡化。
[0191]在具體的實(shí)施方式中，用于本發(fā)明監(jiān)測的方法包括以下步驟:
[0192](a)在第一時(shí)間點(diǎn)，確定血漿中游離Αβ 17肽的濃度和結(jié)合至受試者樣品中的細(xì)胞的 Αβ 17 肽的水平；(FP Αβ 17/CB Αβ 17)，
[0193](b)在第二時(shí)間點(diǎn)，確定血漿中游離Αβ 17肽的濃度和結(jié)合至相同受試者的樣品中的細(xì)胞的A β 17肽的水平；
[0194]根據(jù)受試者，由技術(shù)人員確定所選的時(shí)間點(diǎn)。
[0195](c)比較第一時(shí)間點(diǎn)和第二時(shí)間點(diǎn)之間血漿中游離的Αβ 17肽水平/結(jié)合至細(xì)胞的Αβ 17肽水平的比率，和
[0196](d)如果在第二時(shí)間點(diǎn)相對于第一時(shí)間點(diǎn)，所述參數(shù)的比率較高，則它指示受試者體內(nèi)阿爾茨海默氏病的惡化。
[0197]如本文所使用的術(shù)語“阿爾茲海默氏病的惡化”是指相對于所測量的第一時(shí)間點(diǎn)的階段，疾病向晚期發(fā)展。技術(shù)人員還將通過分析其他指示特征來識(shí)別并確認(rèn)疾病的發(fā)展是否惡化。在晚期出現(xiàn)并指示疾病發(fā)展的特征和癥候?yàn)?，但不限于，淀粉樣斑塊和神經(jīng)纖維纏結(jié)的出現(xiàn)以及認(rèn)知功能的較快速減退。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，如果相對于第一時(shí)間點(diǎn)，在第二時(shí)間點(diǎn)血漿中游離的Αβ 17肽水平/結(jié)合至細(xì)胞的Αβ 17肽水平的比率增加，則它指示了受試者認(rèn)知障礙的更高等級。因此，血漿中發(fā)現(xiàn)的游離Αβ 17肽的較高水平指示較高的認(rèn)知障礙。
[0198]可以在本發(fā)明中使用適合于確定肽的任何方法。舉例來說，可以使用選自以下的一種或多種技術(shù)來確定淀粉樣β肽的濃度:蛋白質(zhì)印跡、免測沉淀法、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、表面等離子共振、沉淀素反應(yīng)、凝膠擴(kuò)散免疫擴(kuò)散測定、放射免疫測定(RIA)、熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)、二維凝膠電泳、毛細(xì)管電泳、質(zhì)譜法(MS)、基質(zhì)輔助激光解析/離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD1-T0F)、表面增強(qiáng)激光解吸/離子化-飛行時(shí)間(SELD1-T0F)、高效液相色譜法(HPLC)、快速蛋白質(zhì)液相色譜(FPLC)、多維液相色譜(LC)緊接著串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)、薄層色譜法、蛋白質(zhì)芯片表達(dá)分析和激光密度法。在具體的實(shí)施方式中，通過ELISA確定所述參數(shù)的水平的確定。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在ELISA中使用的抗體之一是本發(fā)明所述的抗體，其針對A β 17肽的C端區(qū)域。
[0199]如本文所使用的術(shù)語“血漿中游離的A β 17肽”(在下文中稱為FPA β 17)是指不與生物樣品的任何成分相結(jié)合并且易于獲得用于結(jié)合至特異性抗體的淀粉樣β肽的水平?？梢酝ㄟ^常規(guī)免疫學(xué)技術(shù)，通過將生物樣品與對所述肽具有特異性的抗體接觸來確定這種肽。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，確定了血漿中游離的淀粉樣肽的水平。
[0200]如本文所使用的術(shù)語“結(jié)合至細(xì)胞的Αβ 17肽水平”(在下文中稱為CBAP 17)是指非共價(jià)結(jié)合至生物樣品中存在的細(xì)胞表面并且不可用于結(jié)合至加入到所述樣品中的抗體并因此是免疫學(xué)可檢測的淀粉樣β肽。通常，如果所述生物樣品是血液，則所述淀粉樣β肽結(jié)合至紅細(xì)胞、白血球(包括嗜中性白細(xì)胞、嗜酸性白細(xì)胞、嗜堿性白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞)和血小板。可以確定結(jié)合至給定樣品中細(xì)胞的淀粉樣β肽的量，并且在本發(fā)明所述的方法中可以單獨(dú)使用或與淀粉樣β肽相關(guān)的其他參數(shù)結(jié)合使用該值。為此目的，首先需要從生物樣品中分離細(xì)胞部分。這可以使用技術(shù)人員已知的任何技術(shù)來進(jìn)行，如離心、沉淀、過濾等。一旦分離了生物樣品的細(xì)胞部份，則將細(xì)胞與蛋白增溶劑接觸。
[0201]可以確定結(jié)合至給定樣品中細(xì)胞的淀粉樣β肽的量，并且在本發(fā)明所述的方法中可以單獨(dú)使用或與淀粉樣β肽相關(guān)的其他參數(shù)結(jié)合使用該值。為此目的，首先需要從生物樣品中分離細(xì)胞部分。這可以使用技術(shù)人員已知的任何技術(shù)來進(jìn)行，如離心、沉淀、過濾等。一旦分離了生物樣品的細(xì)胞部份，則將細(xì)胞與蛋白增溶劑接觸。
[0202]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，受試者的樣品選自下組:血液、血清、血漿和CSF。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述樣品是血漿樣品。
[0203]用于確定受試者是否患有阿爾茨海默氏病或患有早期阿爾茨海默氏病的方法
[0204]本發(fā)明人已確定直接地或通過在它們之間應(yīng)用某些計(jì)算來確定的某些集合的淀粉樣β肽的水平可以用于確定患者是否患有輕度阿爾茨海默氏病，用于確定受試者是否患有前驅(qū)性阿爾茨海默氏病，用于區(qū)分患有非前驅(qū)性輕度認(rèn)知障礙的受試者和患有前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的受試者，用于區(qū)分患有非前驅(qū)性輕度認(rèn)知障礙的受試者和患有輕度阿爾茨海默氏病的受試者，或者用于區(qū)分患有前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的受試者與患有輕度阿爾茨海默氏病的受試者。
[0205]因此，在另一方面，本發(fā)明涉及用于確定受試者是否患有輕度阿爾茨海默氏病的方法，包括確定選自由以下組成的組中的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的值:
[0206]Ca)結(jié)合至來自所述受試者樣品的血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 17、Αβ 40和Αβ 42肽水平的加和值；
[0207](b)來自所述受試者的血漿樣品中Aβ 17、Αβ 40和Αβ 42總肽水平和結(jié)合至來自所述受試者的血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 17、Aβ 40和Αβ 42肽水平的加和值；
[0208](C)來自所述受試者的血漿樣品中總A β 42肽水平和結(jié)合至來自所述受試者的血液樣品中的細(xì)胞的A β 42肽水平的加和值；
[0209](d)來自所述受試者的血漿樣品中總Aβ 40和Αβ 42肽水平和結(jié)合至來自所述受試者的血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 40和Αβ 42肽水平的加和值；和
[0210](e)來自所述受試者的血漿樣品中游離的Αβ 17水平和結(jié)合至來自所述受試者的血液樣品中的細(xì)胞的A β 17肽水平之間的比率值；
[0211]其中如果所述參數(shù)中一個(gè)或多個(gè)的值相對于健康受試者體內(nèi)參考樣品的值增加，則所述受試者患有輕度阿爾茨海默氏病。
[0212]因此，用于區(qū)分健康受試者和患有輕度阿爾茨海默氏病的受試者的待測參數(shù)如下所示:
[0213](a) CB Αβ 17+CB Αβ 40+CB Αβ 42
[0214](b) (CB Αβ 17+CB Aβ 40+CB Aβ 42)+ (TP Αβ 17+ΤΡ Aβ 40+ΤΡ Αβ 42)
[0215](c) TP Αβ 42+CB Αβ 42
[0216](d) (TP Αβ 40+ΤΡ Αβ 42) + (TP Aβ 40+ΤΡ Aβ 42)
[0217](e) FP Αβ 17/CB Αβ 17
[0218]用于確定受試者是否患有具有前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的MCI的方法，其包括確定選自下組的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的值:
[0219](a)來自所述受試者的血漿樣品中總Aβ 42肽水平和結(jié)合至所述受試者的血液樣品中的細(xì)胞的A β 42肽水平的加和值；
[0220](b)來自所述受試者的血漿樣品中總Aβ 40和Αβ 42肽水平和結(jié)合至來自所述受試者的血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 40和Αβ 42肽水平的加和值；
[0221](C)來自所述受試者的血漿樣品中游離的Αβ 17肽水平與結(jié)合至來自所述受試者的血液樣品中的細(xì)胞的A β 17肽水平之間的比率值；
[0222]Cd)結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Αβ 17水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Αβ 42肽水平之間的比率值；
[0223](e)兩個(gè)參數(shù)之間的比率值，其中所述第一參數(shù)對應(yīng)于血漿樣品中總Αβ 17肽和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Αβ 17肽的加和水平，而所述第二參數(shù)對應(yīng)于血漿樣品中總Αβ 42肽和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的A β 42肽的加和水平；
[0224](f)兩個(gè)參數(shù)之間的比率值，其中所述第一參數(shù)對應(yīng)于結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Αβ 17肽的水平，而所述第二參數(shù)對應(yīng)于結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 40肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的A β 42肽水平的加和值；和
[0225](g)兩個(gè)參數(shù)之間的比率值，其中所述第一參數(shù)對應(yīng)于來自所述受試者的血漿樣品中總Αβ 17肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 17肽水平的加和值，而所述第二參數(shù)對應(yīng)于血漿樣品中總Aβ 40和Αβ 42肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 40和A β 42肽水平的加和值；
[0226]其中如果相對于健康受試者的參考樣品中的值，參數(shù)(a)、(b)或(C)中的一個(gè)或多個(gè)的值增加和/或參數(shù)(d)、(e)、(f)或(g)中的一個(gè)或多個(gè)的值降低，則所述受試者患有輕度阿爾茨海默氏病。
[0227]因此，用于區(qū)分健康受試者和患有具有前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的MCI的受試者的待測參數(shù)如下所示:
[0228](a) TP Aβ 42+CB Αβ 42
[0229](b ) (TP A β 40+ΤΡ A β 42) + (CB A β 40+CB A β 42)
[0230](c)FP Aβ 17/CB Aβ 17
[0231](d) CB Aβ 17/CB Αβ 42
[0232](e) (TP Aβ 17+CB Αβ 17)/(TP Aβ 42+CB Αβ 42)
[0233](f) CB Aβ 17/(CB Aβ 40+CB Aβ 42)
[0234](g) (TP A β 17+CB A β 17) / (TP A β 40+TP A β 42) + (CB A β 40+CB A β 42)
[0235]在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于區(qū)分患有具有非前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的MCI的受試者和患有具有前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的MCI的受試者的方法，其包括確定選自下組的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的值:
[0236]Ca)結(jié)合至來自所述受試者樣品的血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 17、Αβ 40和Αβ 42肽水平的加和值；
[0237](b)結(jié)合至所述受試者的血液樣品中的細(xì)胞的Αβ 17肽水平和結(jié)合至所述受試者的血液樣品中的細(xì)胞的A β 42肽水平之間的比率值；
[0238](C)兩個(gè)參數(shù)之間的比率值，其中所述第一參數(shù)對應(yīng)于來自所述受試者的血漿樣品中Αβ 17總肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 17肽水平的加和值，而所述第二參數(shù)對應(yīng)于來自所述受試者的血漿樣品中Αβ 42總肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的A β 42肽水平的加和值；
[0239](d)兩個(gè)參數(shù)之間的比率值，其中所述第一參數(shù)對應(yīng)于結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的A β 17肽的水平，而所述第二參數(shù)對應(yīng)于結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的A β 40和A β 42肽水平的加和值；
[0240](e)兩個(gè)參數(shù)之間的比率值，其中所述第一參數(shù)對應(yīng)于來自所述受試者的血漿樣品中Αβ 17總肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 17肽水平的加和值，而所述第二參數(shù)對應(yīng)于血漿樣品中Aβ 40和Αβ 42總肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 40和A β 42肽水平的加和值；
[0241]其中如果相對于患有具有非前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的MCI的受試者體內(nèi)參考樣品的值，Ca)的值增加和/或所述參數(shù)(b)、(C)、(d)和(e)中的一個(gè)或多個(gè)的值降低，則所述受試者患有具有前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的MCI。
[0242]因此，允許區(qū)分患有具有非前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的MCI的受試者和患有具有前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的MCI的受試者的待測參數(shù)如下所示:[0243](a) CB Αβ 17+CB Aβ 40+CB Aβ 42
[0244](b) CB Aβ 17/CB Αβ 42
[0245](c) (TP Aβ 17+CB Αβ 17)/(TP Aβ 42+CB Αβ 42)
[0246](d) CB A β 17/ (CB A β 40+CB A β 42)
[0247](e) (TP Aβ 17+CB Αβ 17)/(TP Aβ 40+TP Aβ 42) + (CB Aβ 40+CB Αβ 42)
[0248]在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于區(qū)分患有具有非前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的MCI的受試者和患有輕度阿爾茨海默氏病的受試者的方法，包括確定選自下組的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的值:
[0249](a)結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Αβ 17、Αβ 40和Αβ 42肽水平的加和值；
[0250](b)血漿樣品中Αβ 17、Aβ 40和Αβ 42總肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Αβ 17、Αβ40和Αβ42肽的水平的加和值；
[0251](c)血漿樣品中總Aβ 42肽和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 42肽水平的加和值；
[0252]Cd)血漿樣品中總Αβ 40和Αβ 42肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Αβ 40和A β 42肽水平的加和值；
[0253]Ce)血漿樣品中總Αβ 40肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Αβ 40肽水平的加和值；
[0254](f)兩個(gè)參數(shù)之間的比率值，其中所述第一參數(shù)對應(yīng)于結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的A β 17肽的水平，而所述第二參數(shù)對應(yīng)于結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的A β 40和A β 42肽水平的加和值；和
[0255](g)血漿樣品中游離的Aβ 17肽水平與結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 17肽水平之間的比率值；
[0256]其中如果所述參數(shù)中一個(gè)或多個(gè)的值相對于具有非前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的MCI的受試者體內(nèi)參考樣品的值增加，則所述受試者患有輕度阿爾茨海默氏病。
[0257]因此，用于區(qū)分患有具有非前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的MCI的受試者與患有輕度阿爾茨海默氏病的受試者的待測參數(shù)如下所示:
[0258](a) CB Αβ 17+CB Aβ 40+CB Aβ 42
[0259](b) (TP Aβ 17+TP Aβ 40+TP Aβ 42) + (CB Aβ 17+CB Aβ 40+CB Aβ 42)
[0260](c) TP Aβ 42+CB Aβ 42
[0261 ] (d) (TP A β 40+TP A β 42) + (CB A β 40+CB A β 42)
[0262](e) TP Aβ 40+CB Αβ 40
[0263](f) CB Aβ 17/(CB Aβ 40+CB Aβ 42)
[0264](g) FP A β 17/CB A β 17
[0265]在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于區(qū)分患有具有前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的MCI的受試者和患有輕度阿爾茨海默氏病的受試者的方法，包括確定選自下組的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的值:
[0266](a)血漿樣品中游離的Αβ 17肽水平與血漿樣品中游離的Aβ 40肽水平之間的比率值；和[0267](b)兩個(gè)參數(shù)之間的比率值，其中所述第一參數(shù)對應(yīng)于血漿樣品中游離的Αβ 17肽的水平，而所述第二參數(shù)對應(yīng)于血漿樣品中游離的Aβ 40和Αβ 42肽的水平；
[0268]其中如果所述參數(shù)中一個(gè)或多個(gè)的值相對于具有前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的MCI的受試者體內(nèi)參考樣品的值增加，則所述受試者患有輕度阿爾茨海默氏病。
[0269]因此，用于區(qū)分患有具有前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的MCI的受試者與患有輕度阿爾茨海默氏病的受試者的待測參數(shù)如下所示:
[0270](a) FP Αβ 17/FP Αβ40
[0271](b)FP Αβ 17/FP A3 40+FP Αβ42[0272]如本文所使用的術(shù)語“診斷”包括評價(jià)受試者對疾病的敏感度，確定受試者目前是否患有疾病，以及患有疾病的受試者的預(yù)后。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的，這種評價(jià)通常不可能對于100%的待診斷的受試者都是正確的，盡管它優(yōu)選是正確的。然而，該術(shù)語要求可以將受試者的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著部分鑒別為患有疾病或易患該疾病。如果一個(gè)部分是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的，則本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用幾種熟知的統(tǒng)計(jì)評價(jià)工具來簡單地確定它，例如，置信區(qū)間的確定、P值的確定、student t_檢驗(yàn)、曼-惠特尼檢驗(yàn)等。在Dowdy和Wearden,《研究用統(tǒng)計(jì)學(xué)》(Statistics for Research) , John ffiley&Sons, New Yorkl983 中提供了詳細(xì)說明。優(yōu)選的置信區(qū)間為至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%。p值優(yōu)選地為0.2、0.1或0.05。
[0273]如本文所使用的，術(shù)語“受試者”涉及分類為哺乳動(dòng)物的所有動(dòng)物，并且包括(但不限于)家畜和農(nóng)場動(dòng)物、靈長類和人，例如，人類、非人靈長類、母牛、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓或嚙齒動(dòng)物。優(yōu)選地，所述受試者是任何年齡或種族的男性或女性人類。
[0274]術(shù)語“阿爾茨海默氏病”(或“老年性癡呆”)是指與特定退行性腦病有關(guān)的精神衰退，其特征在于老年斑、神經(jīng)炎纏結(jié)和進(jìn)行性神經(jīng)元損失，其臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶缺失、精神混亂、出現(xiàn)行為問題、生活不能自理、身體逐漸衰退并且最終死亡。
[0275]在本發(fā)明的背景中，表述“輕度阿爾茨海默氏病”是指阿爾茨海默氏病的早期，其中受試者經(jīng)歷:
[0276].針對近期事件的記憶力喪失。
[0277].問題解決、復(fù)雜任務(wù)和聲音判斷具有困難。
[0278].個(gè)性改變。
[0279].組織和表達(dá)想法困難。
[0280].迷路或?qū)⒇?cái)物放錯(cuò)地方。
[0281]使用NINCDS-ADRDA標(biāo)準(zhǔn)(CDR=I，MMSE在16至24分之間并且在Scheltens量表中內(nèi)側(cè)顳葉萎縮(Medial temporal atrophy)(通過MRI確定)>3分)來鑒別患有輕度阿爾茨海默氏病的患者。
[0282]術(shù)語“輕度認(rèn)知障礙”或MCI是指自然衰老和早期阿爾茨海默氏病之間的認(rèn)知障礙的過渡階段。如果患者滿足Mayo Clinic標(biāo)準(zhǔn)(O)R=0.5,它們顯示在Scheltens量表中大于3分的內(nèi)側(cè)顳葉萎縮(通過MRI確定)，它們在使用18-氟脫氧葡萄糖的正電子發(fā)射斷層成像術(shù)(PET-FDG)中顯示出頂骨和/或顳葉代謝減退模式(指示為AD))，則通常將患者鑒別為患有MCI。
[0283]表述“前驅(qū)性阿爾茨海默氏病”(也稱為“具有疑似阿爾茨海默氏病的MCI”)是指表現(xiàn)出MCI并且認(rèn)為表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化為阿爾茨海默氏病的高風(fēng)險(xiǎn)的患者。用于鑒別患者為疑似AD 的標(biāo)準(zhǔn)為通過 NINCDS-ADRDA 標(biāo)準(zhǔn)(McKhann G.等人，1984，Neurology, 34:939-44)所定義的那些，即通過臨床和神經(jīng)心理學(xué)檢查確定的癡呆病、在兩個(gè)或更多個(gè)認(rèn)知區(qū)域中存在的進(jìn)行性認(rèn)知障礙、在40至90歲之間缺陷發(fā)生以及沒有能夠產(chǎn)生癡呆綜合征的其他疾病。
[0284]表述“非前驅(qū)性阿爾茨海默氏病”(也稱為“具有可能阿爾茨海默氏病的MCI”)是指表現(xiàn)出MCI并且認(rèn)為表現(xiàn)出發(fā)展阿爾茨海默氏病的低風(fēng)險(xiǎn)的患者。用于鑒別患者為可能AD 的標(biāo)準(zhǔn)為通過 NINCDS-ADRDA 標(biāo)準(zhǔn)(McKhann G.等人，1984，Neurology, 34:939-44)所定義的那些，即具有非典型發(fā)病、表現(xiàn)或發(fā)展并且無已知病原學(xué)的癡呆綜合征，但是不能認(rèn)為能夠產(chǎn)生癡呆病的共病疾病是其來源。
[0285]如本發(fā)明中所使用的術(shù)語“健康受試者”是指健康狀況良好的受試者。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述受試者大于65歲。它相對于未患有神經(jīng)退行性疾病或沒有任何神經(jīng)退行性疾病病史的受試者。優(yōu)選地，健康受試者是表現(xiàn)出無記憶障礙、在神經(jīng)心理學(xué)測試中表現(xiàn)正常并且在MRI中無結(jié)構(gòu)變化的患者。健康受試者可以是健康的并且未患其他疾病，或者他們可以患有除了 MCI和AD以外的疾病。
[0286]術(shù)語“區(qū)分健康受試者和患有前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的受試者”是指區(qū)分不具有阿爾茨海默氏病(AD)癥狀的受試者和患有前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的受試者的能力。
[0287]術(shù)語“區(qū)分健康受試者和患有輕度阿爾茨海默氏病的受試者”是指區(qū)分不具有阿爾茨海默氏病(AD)癥狀的受試者和處于AD早期的受試者(輕度阿爾茨海默氏病)的能力。
[0288]術(shù)語“區(qū)分患有非前驅(qū)性MCI受試者和患有前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的受試者”是指區(qū)分具有非前驅(qū)性MCI癥狀的受試者和患有前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的受試者的能力。
[0289]術(shù)語“區(qū)分患有非前驅(qū)性MCI的受試者和患有輕度阿爾茨海默氏病的受試者”是指區(qū)分具有非前驅(qū)性M CI癥狀的受試者和處于AD早期的受試者(輕度阿爾茨海默氏病)的能力。
[0290]術(shù)語“區(qū)分患有前驅(qū)性AD的受試者和患有輕度阿爾茨海默氏病的受試者”是指區(qū)分具有前驅(qū)性AD癥狀的受試者和處于AD早期的受試者(輕度阿爾茨海默氏病)的能力。
[0291]術(shù)語“血漿”是指全血的液體成分。根據(jù)所使用的分離方法，血漿可以完全沒有細(xì)胞組分，或者可以含有不同量的血小板和/或少量的其他細(xì)胞組分。
[0292]如本文所使用的術(shù)語“結(jié)合至細(xì)胞的Aβ 17、Αβ40或Αβ42肽的水平”(在下文中分別稱為CB Αβ 17,CB Αβ40或CB Αβ 42)是指非共價(jià)連接至存在于生物樣品中的細(xì)胞表面并且不可用于結(jié)合至加入到所述樣品中的抗體并因此是免疫學(xué)可檢測的淀粉樣β肽。通常，如果所述生物樣品是血液，則所述淀粉樣β肽結(jié)合至紅細(xì)胞、白血球(包括嗜中性白細(xì)胞、嗜酸性白細(xì)胞、嗜堿性白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞)和血小板。可以確定結(jié)合至給定樣品中的細(xì)胞的淀粉樣β肽的量，并且在本發(fā)明所述的方法中可以單獨(dú)使用或與淀粉樣β肽相關(guān)的其他參數(shù)結(jié)合使用該值。出于此目的，首先需要從生物樣品中分離細(xì)胞部分。這可以使用技術(shù)人員已知的任何技術(shù)來進(jìn)行，如離心、沉淀、過濾等。一旦分離了生物樣品的細(xì)胞部份，則將細(xì)胞與蛋白增溶劑接觸。
[0293]可以確定結(jié)合至給定樣品中的細(xì)胞的淀粉樣β肽的量，并且在本發(fā)明所述的方法中可以單獨(dú)使用或與淀粉樣β肽相關(guān)的其他參數(shù)結(jié)合使用該值。出于此目的，首先需要從生物樣品中分離細(xì)胞部分。這可以使用技術(shù)人員已知的任何技術(shù)來進(jìn)行，如離心、沉淀、過濾等。一旦分離了生物樣品的細(xì)胞部份，則將細(xì)胞與蛋白增溶劑接觸。
[0294]適合的蛋白增溶劑包括如以下所定義的清潔劑、離液劑和還原劑，并且通常以足夠的濃度在緩沖溶液中提供。以下描述了適合的試劑、緩沖溶液和緩沖溶液中試劑的濃度?；救缫韵略谟糜卺尫胚B接至生物樣品成分(蛋白質(zhì)和脂質(zhì))的淀粉樣肽的方法中所說明的實(shí)施接觸步驟。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，蛋白增溶劑為清潔劑。在又更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述清潔劑是吐溫20。用作蛋白增溶劑的吐溫20的適合濃度如上定義，即0.004-0.02%之間，更優(yōu)選 0.005-0.01% (w/v)0
[0295]優(yōu)選地在低溫下進(jìn)行接觸步驟以抑制樣品中存在的蛋白水解活性。適合的溫度為約0-10°C，優(yōu)選約3-5°C，例如，約4°C。
[0296]通常，通過將生物樣品中的細(xì)胞部分用包含蛋白增溶劑的溶液再懸浮來進(jìn)行接觸步驟?？梢酝ㄟ^溫和地上下移液，通過攪拌，優(yōu)選地通過振蕩，更優(yōu)選地通過高速振蕩，最優(yōu)選地通過渦旋至少5秒，優(yōu)選地至少10秒，更優(yōu)選地至少15秒(例如，15-50秒)來進(jìn)行所述再懸浮。所述混合、攪拌、振蕩、高速振蕩或渦旋的有利速度包括至少250rpm的速度，優(yōu)選至少500rpm,更優(yōu)選至少1，OOOrpm,最優(yōu)選約2，000-2, 500rpm的速度。
[0297]接觸步驟是在足以實(shí)現(xiàn)淀粉樣β肽與存在于生物樣品中的細(xì)胞部分地或優(yōu)選地完全分離的條件下進(jìn)行的。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以通過監(jiān)測在接觸步驟之前并且在發(fā)生接觸步驟后在不同時(shí)間點(diǎn)逐步地可檢測的淀粉樣β肽的量來充分確定所述條件。
[0298]如本文所使用的術(shù)語“血漿中總A β肽”(在下文中稱為TP A β 17,TPA β 40或TPΑβ42)是指“在血漿中游離的Αβ肽”加上“結(jié)合至大分子組分的淀粉樣β肽〃。如本文所使用的術(shù)語“結(jié)合至大分子組分的淀粉樣β肽”是指非共價(jià)結(jié)合或連接至在所研究的生物樣品中發(fā)現(xiàn)的分子的淀粉 樣β肽。這種肽通常不易用于免疫學(xué)檢測，并因此需要對生物樣品進(jìn)行預(yù)處理以實(shí)現(xiàn)肽與所述組分的分離。在這些條件下，連接到大分子組分的淀粉樣β肽將從所述組分釋放并將可使 用特異性抗體進(jìn)行免疫學(xué)檢測。由于生物樣品已含有一定量的游離淀粉樣β肽，因此將樣品與蛋白增溶劑接觸后游離淀粉樣肽的總量將是初始存在的游離淀粉樣β肽水平和當(dāng)用蛋白增溶劑處理時(shí)釋放的淀粉樣β肽水平的總和。在需要確定連接到生物樣品中存在的大分子成分的淀粉樣β肽水平的情況下，這通?？梢酝ㄟ^確定在用蛋白增溶劑處理前游離淀粉樣β肽的水平和在用蛋白增溶劑處理后游離淀粉樣β肽的水平并用第二個(gè)值減去第一個(gè)值來完成。出于本發(fā)明的目的，它通常足以確定游離淀粉樣β肽的總水平，其包括初始的游離淀粉樣β肽水平和在用蛋白增溶劑處理后從大分子組分釋放的淀粉樣β肽的水平。因此，當(dāng)處理樣品以將淀粉樣肽從大分子組分分離時(shí)，通常所確定的參數(shù)對應(yīng)于樣品中存在的游離肽和連接到大分子組分的肽的總和。
[0299]可以結(jié)合淀粉樣β肽并且有助于連接至大分子組分的淀粉樣β肽集合的樣品的大分子組分包括蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。在所述方法在血液或血漿樣品中執(zhí)行的具體情況下，所述大分子組分包括，但不限于，血蛋白和血脂。示例性血蛋白包括白蛋白、免疫球蛋白G、免疫球蛋白Ε、免疫球蛋白Μ、免疫球蛋白Α、纖維蛋白原(纖維蛋白及其降解產(chǎn)物)、α -1抗胰蛋白酶、前白蛋白、α-1酸性糖蛋白、α-1胎蛋白、α-2親血球蛋白、巨球蛋白、血漿銅藍(lán)蛋白、轉(zhuǎn)移、C3/C4i3 2微球蛋白、β脂蛋白、α，β和Υ球蛋白、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、凝血酶原、甲狀腺素-結(jié)合蛋白、甲狀腺素運(yùn)載蛋白等。示例性的血脂包括游離脂肪酸、膽固醇、甘油三酯、磷脂、鞘脂等。[0300]可以通過在足以引起所述淀粉樣β肽從所述大分子組分中釋放的條件下將生物樣品的無細(xì)胞樣品與蛋白增溶劑接觸來確定連接至大分子組分的淀粉樣β肽的量。
[0301]在本文中接觸一詞是指將樣品加入到足夠量的包含蛋白增溶劑的溶液中使得混合物中所述蛋白增溶劑的濃度足以有效地溶解結(jié)合至樣品中的蛋白和細(xì)胞上的淀粉樣β肽。優(yōu)選地，在處于緩沖溶液中的溶液中發(fā)現(xiàn)所述蛋白增溶劑，使得所述蛋白增溶劑的加入不會(huì)導(dǎo)致樣品PH的顯著改變。
[0302]如本文所使用的術(shù)語“蛋白增溶劑”是指能夠改變多肽的二級、三級和/或四級結(jié)構(gòu)而保持一級結(jié)構(gòu)不變的組合物的任何化合物。借助于這些性質(zhì)，蛋白增溶劑能夠提高蛋白質(zhì)在樣品中的溶解度并防止蛋白質(zhì)的分子間和分子內(nèi)聚集。適合在本發(fā)明中使用的蛋白增溶劑包括，但不限于，清潔劑、離液劑、還原劑或其混合物。
[0303]如本文所使用的術(shù)語“清潔劑”一般是用作表面活性劑的同義詞，并且是指當(dāng)加入到液體中時(shí)與不存在所述清潔劑的相同液體相比降低所述液體表面張力的兩親性表面活性劑。清潔劑還能夠防止蛋白質(zhì)聚集并且防止非特異性相互作用或污染物與感興趣的蛋白質(zhì)的結(jié)合。適合在本發(fā)明中使用的清潔劑包括，但不限于，非離子型(中性)、陰離子型、陽離子型或兩性離子型清潔劑。 [0304]非離子或中性清潔劑的實(shí)例包括，但不限于，吐溫(Tween)系列的清潔劑，如Tween? 20、Tween? 21、Tween? 40、Tween? 60、Tween? 61、Tween? 65、
Tween? 80、Tween? 81、Tween? 85, Span?,系列的清潔劑，如 Span? 20 ；Tergitol系列的清潔劑，如Tergitol型15-S-12 ； Brij?系列的清潔劑，如Brij? 35、Brij? 56、Brij? 72、Brij? 76、Brij? 92V、Brij? 97、Brij? 58P ; Trjton? 系列的清潔劑，如Triton? X-100、Triton? X-114、Triton? CF-21、Triton? Ci'-32> Triton? DF-12、Triton? DF-16、Triton? GR-5M、Triton? X-102、Triton? X-15、Triton? X-151、Triton? X-207、Triton? X-165、Triton? X-305、Triton? X-405、Triton? X-45、
Triton? x-705-70，或所述清潔劑中至少一種的非離子型保守變體。
[0305]陰離子型清潔劑的實(shí)例包括，但不限于，膽酸及其衍生物、?；悄懰?、TritonX-200、Triton ff-30, Triton-30, Triton-770、磺基琥珀酸二辛酯、N5N- 二甲基十二烷胺N-氧化物、1-烷基磺酸鈉、N-月桂酰肌氨酸或脂肪酸鹽。
[0306]陽離子型清潔劑的實(shí)例包括，但不限于，單甲基脂肪胺和二甲基脂肪胺、烷基三甲基銨鹽、二烷基二甲基銨鹽、烷基胺乙酸鹽、三烷基銨乙酸鹽、烷基二甲基苯甲基銨鹽、二烷基甲基苯甲基按鹽、烷基吡淀鐵鹵化物和烷基(烷基取代的)吡淀鐵鹽、烷基硫基甲基吡啶鎗鹽、烷基酰胺甲基吡啶鎗鹽、烷基喹啉鎗鹽、烷基異喹啉鎗鹽、N, N-烷基甲基吡咯烷麗鐵鹽、1，1- 二烷基喊唳鐵鹽、4，4- 二烷基硫嗎琳鐵鹽、4，4- 二烷基硫嗎琳鐵_1-氧化物鹽、甲基雙(烷基乙基)-2_烷基咪唑啉鎗甲基硫酸鹽(和其他鹽)、甲基雙(烷基酰胺基乙基)-2-羥乙基銨甲基硫酸鹽(和其他鹽)、烷基酰胺基丙基-二甲基苯甲基銨鹽、羧基烷基-烷基二甲基銨鹽、烷基胺氧化物、烷基二甲基胺氧化物、聚(乙烯基甲基吡啶鎗)鹽、聚(乙烯基吡淀)鹽、聚乙烯亞胺、三烷基鱗碳酸氫鹽(和其他鹽)、三烴基甲基鱗鹽、烷基乙基甲基琉鹽和烷基二甲基氧化琉鹽。[0307]兩性離子型清潔劑的實(shí)例包括，但不限于，3-[(3_膽酰胺丙基)二甲基銨]-1_丙烷磺酸鹽(CHAPS) ;3-[(3-膽酰胺丙基)二甲基銨]-2-羥基-1-丙磺酸鹽(CHAPSO)；N-(烷基C10-C16)-N，N-二甲基甘氨酸甜菜堿(EMPIGENBB);辛酰硫代甜菜堿(SB3-10)；3-[N, N- 二甲基(3-肉豆蘧酰氨基丙基)銨]丙磺酸鹽(酰胺基硫代甜菜堿-14 ；ASB-14)；N-十四烷基-N，N- 二甲基-3-銨基-1-丙磺酸鹽(3-14清潔劑；ZWITTERGENT) ；N-十二烷基-N，N’ - 二甲基-3-銨基-1-丙磺酸鹽；N-十八烷基-N，N- 二甲基-3-銨基-1-丙磺酸鹽；N-癸基-N, N- 二甲基-3-銨-1-丙橫酸鹽；Mirataine CB ；Mirataine BB ；MirataineCBR ；Mirataine ACS ；Miracare2MHT 和 Miracare2MCA。
[0308]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，蛋白增溶劑為清潔劑。在又更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述清潔劑是吐溫20。在又更優(yōu)選的實(shí)施方式中，以0.5%的濃度使用吐溫20。
[0309]如本文所使用的“離液劑”涉及破壞蛋白質(zhì)之間和蛋白質(zhì)內(nèi)的氫鍵和疏水性相互作用的化合物或化合物的混合物。當(dāng)以高濃度使用時(shí)，離液劑破壞蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)并且使得在其他情況下不溶的蛋白質(zhì)成為溶液。適合的離液劑包括，但不限于，脲、異硫氰酸胍、硫氰酸鈉(NaSCN)、鹽酸胍、氯化胍、硫氰酸胍、四氯乙酸鋰、高氯酸鈉、四氯乙酸銣、碘化鉀或三氟乙酸銫。
[0310]如本文所使用的術(shù)語“還原劑”是指維持巰基處于還原狀態(tài)并且還原分子內(nèi)或分子間二硫鍵的任何化合物或材料。舉例來說，適合于本發(fā)明所述方法的還原劑包括巰基或膦還原劑兩者。巰基還原劑的實(shí)例包括二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚糖醇(DTE)和β-巰基乙醇。膦還原劑的實(shí)例包括三丁基膦(TBP)和三羧乙基膦(TCEP)。
[0311]通常，首先處理生物樣品以除去細(xì)胞部分。然后，將不含細(xì)胞的樣品與蛋白增溶劑接觸。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用包含蛋白增溶劑的緩沖液稀釋樣品。通常，在包含吐溫20的緩沖溶液中將樣品稀釋5倍。
[0312]如本文所使用的，“緩沖溶液”是在能夠中和酸和堿而不會(huì)顯著改變?nèi)芤涸妓岫然驂A度的溶液中的任何物質(zhì)或化合物的混合物。在本發(fā)明方法中使用的適合的緩沖溶液包括，但不限于，Tris緩沖溶液、磷酸鹽緩沖溶液、硼酸鹽緩沖溶液、碳酸鹽緩沖溶液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液等。優(yōu)選地，所述緩沖溶液是磷酸鹽緩沖液，如磷酸鹽緩沖鹽水或PBS。
[0313]包含加入到生物樣品中的蛋白增溶劑的溶液的量并不重要，只要能夠?qū)崿F(xiàn)淀粉樣β肽的充分分離。舉例來說，可以在包含蛋白增溶劑的溶液中以至少1/2 (v/v)U/3 (v/v)、l/4 (v/v)>1/5 (v/v)>1/6 (v/v)>1/7 (v/v)>1/8 (v/v)>1/9 (v/v)>1/10 (v/v)>1/20(v/v)> 1/50 (v/v)> 1/60 (v/v)> 1/80 (v/v)> 1/90 (v/v)> 1/100 (v/v)或以上的稀釋度稀釋生物流體。技術(shù)人員將理解可以使用所述稀釋率和所述蛋白增溶劑濃度的任何組合，只要蛋白增溶劑的最終濃度足以實(shí)現(xiàn)所需的效果。例如，含有蛋白增溶劑的溶液可以包含范圍0.001%至0.5% (w/v)的濃度的所述所選的蛋白增溶劑。在含有蛋白增溶劑的所述溶液中稀釋后，所述生物流體通常含有小于0.1% (w/v)，優(yōu)選地小于0.6% (w/v)，更優(yōu)選地不超過0.5% (w/v)，最優(yōu)選地不超過0.45% (w/v)并且甚至最優(yōu)選地0.5%的所述表面活性劑。
[0314]適合在本發(fā)明中使用的緩沖液系統(tǒng)包括Tris-HCl緩沖液，其包含鹽(如NaCl或KCl)和可選地BSA。具體的緩沖液系統(tǒng)包括，但不限于:
[0315]50mM Tris-HCl pH8，0.5M NaCl，0.05%BSA, 0.05% 吐溫 20 ；[0316]50mM Tris-HCl pH8,0.5M NaCl，0.05%BSA, 0.05% 吐溫 20，IMGuHCI ;
[0317]50mM Tris-HCl ρΗ8，0.5M KCl，0.05%BSA，0.05% 吐溫 20;
[0318]50mM Tris-HCl pH8,0.5M KCl，0.05%BSA, 0.05% 吐溫 20，IMGuHCI ;
[0319]50mM Tris-HCl pH8,0.5M NaCl，0.05%BSA, 0.05% 吐溫 80 ；
[0320]50mM Tris-HCl pH8,0.5M KCl，0.05%BSA, 0.05% 吐溫 80 ；
[0321]50mM Tris-HCl pH8，0.5M NaCl ；0.05%BSA,0.05%Triton X-100
[0322]50mM Tris-HCl pH8，0.5M KC1,0.05%BSA,0.05%Triton X-100;
[0323]50mM Tris-HCl pH8 ；0.05%BSA，0.05% 吐溫 20 ；
[0324]50mM Tris-HCl pH8,0.5M NaCl，0.1%BSA, 0.05% 吐溫 20;
[0325]50mM Tris-HCl pH8,0.5M NaCl，0.05%BSA, 0.1% 吐溫 20;
[0326]50mM Tris-HCl ρΗ8，0.5M NaCl，0.1%BSA，0.1% 吐溫 20;
[0327]50mM Tris-HCl pH8, IM NaCl，0.05%BSA, 0.05% 吐溫 20;
[0328]50mM Tris-HCl pH8,1.5M NaCl，0.05%BSA, 0.05% 吐溫 20 ；
[0329]50mM Tris-HC l pH8, 2M NaCl，0.05%BSA, 0.05% 吐溫 20;
[0330]50mM Tris-HCl pH8, 2.5M NaCl，0.05%BSA, 0.05% 吐溫 20 ；
[0331]50mM Tris-HCl pH8, 3M NaCl，0.05%BSA, 0.05% 吐溫 20 ；
[0332]50mM Tris-HCl pH8,0.5M NaCl，0.05%BSA, 0.05% 吐溫 20，10%DMS0;
[0333]50mM Tris-HCl pH8,0.5M NaCl，0.05%BSA, 0.05% 吐溫 20，0.5MGuHCl;
[0334]50mM Tris-HCl pH6,0.5M NaCl，0.05%BSA, 0.05% 吐溫 20;
[0335]50mM Tris-HCl pH7,0.5M NaCl，0.05%BSA, 0.05% 吐溫 20;
[0336]50mM Tris-HCl pH9,0.5M NaCl，0.05%BSA, 0.05% 吐溫 20;
[0337]50mM Tris-HCl pH8,0.5M NaCl,0.05%BSA。
[0338]例如，當(dāng)吐溫20用作蛋白增溶劑時(shí)，優(yōu)選的濃度為0.004-0.02%,更優(yōu)選地為0.005-0.01% (w/v)。
[0339]優(yōu)選地在低溫下進(jìn)行接觸步驟以抑制樣品中存在的蛋白水解活性。適合的溫度為約0-1 (TC，優(yōu)選地約3-5°C，例如，約4°C。
[0340]一旦生物流體已與包含蛋白增溶劑的溶液接觸，則可以將兩流體混合。可以通過攪拌，優(yōu)選地通過振蕩，更優(yōu)選地通過高速振蕩，最優(yōu)選地通過渦旋至少5秒，優(yōu)選地至少10秒，更優(yōu)選地至少15秒(例如，15-50秒)來進(jìn)行混合。所述混合、攪拌、振蕩、高速振蕩或潤旋的有利速度包括至少250rpm的速度,優(yōu)選至少500rpm,更優(yōu)選至少1，OOOrpm,最優(yōu)選約 2，000-2, 500rpm 的速度。
[0341]接觸步驟是在足以實(shí)現(xiàn)淀粉樣β肽與存在于生物樣品中的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)部分地或優(yōu)選地完全解離的條件下進(jìn)行的。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以通過監(jiān)測在接觸步驟之前以及在發(fā)生接觸步驟后逐步地在不同時(shí)間點(diǎn)可檢測的淀粉樣β肽的量來充分確定所述條件。可以如實(shí)驗(yàn)部分的實(shí)例中所述來確定時(shí)間過程實(shí)驗(yàn)。
[0342]技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是當(dāng)通過用含有蛋白增溶劑的緩沖液稀釋生物樣品來確定淀粉樣β肽的水平時(shí)，將需要修正通過免疫確定獲得的游離淀粉樣β肽的水平以考慮先前應(yīng)用于生物樣品的稀釋因子。
[0343]如本文所使用的術(shù)語“在血漿中游離的Aβ 17、Αβ 40或Αβ 42肽”(在下文中分別稱為FP Αβ 17,FP Αβ40或FP Αβ 42)是指未連接至生物樣品的任何組分并且易于得到以結(jié)合至特異性抗體的淀粉樣β肽的水平?？梢酝ㄟ^常規(guī)免疫學(xué)技術(shù)，通過將生物樣品與對所述肽具有特異性的抗體接觸來確定這種肽。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，確定了血漿中游離的淀粉樣肽的水平。
[0344]如本文所使用的術(shù)語“參考值”是指用于比較并且已在未患神經(jīng)退行性疾病或無任何神經(jīng)退行性疾病病史的受試者體內(nèi)確定的參數(shù)值。優(yōu)選地，從中獲得不同參數(shù)以及計(jì)算參數(shù)的參考值的受試者是表現(xiàn)出無記憶障礙、在神經(jīng)心理學(xué)測試中表現(xiàn)正常并且在MRI中無結(jié)構(gòu)變化的患者。
[0345]具體地，選擇允許高于85%的靈敏度和高于75%的特異性的參考值。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，選擇參考值以獲得高于70%的靈敏度和高于70%的特異性。優(yōu)選地，參考值允許獲得準(zhǔn)確度或精確度為至少80%的預(yù)測。
[0346]—旦確定了參數(shù)值，則當(dāng)相對于參考值，參數(shù)的值或計(jì)算參數(shù)的值存在變化時(shí)，進(jìn)行受試者是否患有輕度阿爾茨海默氏病的確定。
[0347]可以在本發(fā)明中使用適合于肽確定的任何方法。舉例來說，可以使用選自以下的一種或多種技術(shù)來確定淀粉樣β肽的濃度:蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀法、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、表面等離子體共振、沉淀素反應(yīng)、凝膠擴(kuò)散免疫擴(kuò)散測定、放射免疫測定(RIA)、熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)、二維凝膠電泳、毛細(xì)管電泳、質(zhì)譜法(MS)、基質(zhì)輔助激光解析/電離化-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD1-T0F)、表面增強(qiáng)激光解吸/離子化-飛行時(shí)間(SELD1-T0F)、高效液相色譜法(HPLC)、快速蛋白質(zhì)液相色譜(FPLC)、多維液相色譜(LC)緊接著串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS )、薄層色譜法、蛋白質(zhì)芯片表達(dá)分析和激光密度法。
[0348]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過免疫方法來進(jìn)行本發(fā)明方法的確定。當(dāng)用于確定時(shí)，如本文所使用的“免疫方法”是指任何方法，其包括使用對靶物質(zhì)具有特異性的一種或多種抗體以確定除樣品 中發(fā)現(xiàn)的其他物質(zhì)以外的所述靶物質(zhì)的量/濃度。適合的免疫學(xué)方法包括，單不限于，蛋白質(zhì)印跡、免測沉淀法、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、表面等離子共振、放射免疫測定(RIA)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過ELISA進(jìn)行淀粉樣β肽的確定或檢測。
[0349]技術(shù)人員將理解任何類型的抗體均適合進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的免疫學(xué)檢測方法，條件是所述抗體具有足夠特異性以有效地將樣品中淀粉樣β肽物質(zhì)與其他物質(zhì)區(qū)分開。
[0350]如本文所使用的術(shù)語“ELISA”代表酶聯(lián)免疫吸附測定并且涉及以下測定:通過其將未知量的靶物質(zhì)(淀粉樣β肽)固定至表面，然后特異性抗體清洗通過所述表面使得它可以結(jié)合至抗原。該抗體連接至酶，并且在最后的步驟中加入酶可以將其轉(zhuǎn)化為一些可檢測信號(hào)的物質(zhì)。不同類型的ELISA測定是已知的并且可以應(yīng)用于本發(fā)明的方法，其包括直接ELISA、夾心ELISA、競爭ELISA和反向ELISA方法和裝置(ELISA-R m&d)。
[0351]直接ELISA是通過將包含淀粉樣β肽的測試樣品與先前已用無相互作用的蛋白或試劑(牛血清白蛋白、酪蛋白)的濃溶液涂覆的固體載體接觸來進(jìn)行的。一旦測試樣品中存在的淀粉樣β肽吸附到載體上，則在足以結(jié)合至淀粉樣β肽的條件下加入對淀粉樣β肽具有特異性的抗體。然后，用偶聯(lián)至可檢測標(biāo)記或底物修飾酶的第二抗體來檢測結(jié)合的抗體。然后，由可檢測標(biāo)記或由底物產(chǎn)生的信號(hào)與結(jié)合至載體的抗體的量成正比，進(jìn)而直接地與樣品中淀粉樣β肽的量相關(guān)。
[0352]競爭ELISA測定包括第一步驟，其中包含未知量的淀粉樣β肽的測試樣品與如上定義的第一抗體接觸。將抗體-抗原復(fù)合物加入到抗原涂覆的孔中。一旦清洗載體以除去任何非特異性結(jié)合的復(fù)合物，則用偶聯(lián)至可檢測部分的第二抗體來檢測第一抗體的量。在這類測定中，初始抗原濃度越高，則最終信號(hào)越弱。可替代的競爭ELISA測定是包含酶聯(lián)抗原而不是酶聯(lián)抗體的測定。標(biāo)記的抗原與樣品抗原(未標(biāo)記)競爭第一抗體結(jié)合位點(diǎn)。使用這類測定，樣品中抗原濃度導(dǎo)致與孔中保留的標(biāo)記抗原的量逆相關(guān)，并因此導(dǎo)致信號(hào)更弱。
[0353]反向ELISA方法和裝置(ELISA-R m&d)使用了由具有4-12個(gè)突出尖頂部(ogive)的免疫吸附劑聚苯乙烯桿構(gòu)成的新型固相；整個(gè)裝置適合引入至含有所采集樣品的試管中，并且通過將所述尖頂部(ogive)浸沒在用試劑預(yù)填充、密封并儲(chǔ)存直至使用的標(biāo)準(zhǔn)微孔板的微孔中來容易地進(jìn)行隨后的步驟(清洗、在結(jié)合物中孵育和在發(fā)色物中孵育)。
[0354]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述ELISA測定是夾心ELISA測定。夾心ELISA測定包括用對淀粉樣β肽具有特異性的第一抗體涂覆載體，應(yīng)用含有將導(dǎo)致淀粉樣β肽與第一抗體結(jié)合的淀粉樣β肽的樣品并且應(yīng)用對淀粉樣β肽也具有特異性的第二抗體，其中所述第二抗體通常偶聯(lián)至可檢測標(biāo)記或偶聯(lián)至底物修飾酶。通過所述標(biāo)記或通過轉(zhuǎn)化的底物產(chǎn)生的信號(hào)與樣品中抗原的量成正比。
[0355]優(yōu)選地，平行地使用待確定的樣品和具有已知濃度的待確定化合物的多個(gè)參考樣品來執(zhí)行所述方法的不同步驟。必須使用用于確定上述參數(shù)的濃度的逐漸增加的濃度來制備Αβ 17肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線起到雙重目的:(i)建立濃度范圍，其中信號(hào)隨著目標(biāo)肽的濃度線性地提高，和(ii)通過在曲線中內(nèi)插用所述測試或標(biāo)準(zhǔn)樣品得到的信號(hào)來確定測試樣品中肽的濃度以獲得濃度值。鑒于本發(fā)明的測定的高靈敏度，測試樣品的優(yōu)選濃度為(例如)3.125 ；6.25 ；12.5 ；25 ；50 ；100和200pg/mL。應(yīng)當(dāng)理解的是用于獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品濃度對于每個(gè)測試底物將是不同的。然而，熟練的執(zhí)業(yè)者通過傳統(tǒng)方法可以容易地確定所述測定的線性范圍的確定。
[0356]術(shù)語“變化”是指相對于參考值所考慮的參數(shù)值的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的增加或減少。
[0357]如本文所使用的“統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的”是指兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)果、終點(diǎn)或結(jié)果之間存在非隨機(jī)關(guān)聯(lián)的可能性的統(tǒng)計(jì)分析，即相對于參考值，參數(shù)值與特定患者群體相關(guān)聯(lián)的一定程度的數(shù)學(xué)保證。
[0358]可以使用P值來確定所述值變化的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。例如，當(dāng)使用P值時(shí)，當(dāng)P值小于0.1，優(yōu)選小于0.05，更優(yōu)選小于0.01，甚至更優(yōu)選小于0.005，最優(yōu)選小于0.001時(shí)，參
數(shù)鑒別為顯示顯著變化。
[0359]通常，當(dāng)與參考值相比較時(shí)，所述值高于參考值至少1.1倍、1.5倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或甚至更多時(shí)，可以將所考慮的參數(shù)值指定為“升高”。另一方面，當(dāng)與參考值相比較它為至少0.9倍、0.75倍、0.2倍、0.1倍、
0.05倍、0.025倍、0.02倍、0.01倍、0.005倍或甚至更低時(shí)，可以認(rèn)為參數(shù)值為“降低”。在具體的實(shí)施方式中，相對于參考值，參數(shù)值或計(jì)算參數(shù)值的變化為升高。
[0360]本發(fā)明的其他實(shí)施方式如下所示:
[0361][1]特異性地結(jié)合至Αβ (1-17)肽的抗體。
[0362][2]如[I]中所定義的抗體，其對選自由以下組成的組中的Αβ肽并未顯示出顯著的交叉反應(yīng)性:Αβ (1-15),Αβ (1-16) ,Αβ (1-38), A β (1-40), A β (1-42)和它們的一個(gè)或多個(gè)的組合。[0363][3]如[I]或[2]所定義的抗體，其是多克隆抗體。
[0364][4]如[I]至[3]中任一項(xiàng)所定義的抗體，其中使用選自由SEQ IDNO:1或SEQ IDNO:2組成的組中的Aβ肽作為免疫原獲得了所述抗體。
[0365][5]用于檢測A β (1-17)肽的試劑盒，其包括:
[0366](i)第一抗體，其是如[I]至[3]中任一項(xiàng)所定義的抗體，和
[0367](ii)第二抗體，其識(shí)別不同于被所述第一抗體識(shí)別的區(qū)域的Αβ (1-17)肽的區(qū)域。
[0368][6]根據(jù)[5]的試劑盒，其中所述第一抗體或第二抗體偶聯(lián)至結(jié)合對的第一元件。
[0369][7]根據(jù)[6]的試劑盒，還包含所述結(jié)合對的第二元件，其中所述結(jié)合對的所述第二元件偶聯(lián)至可檢測標(biāo)記。
[0370][8]如[7]中所定義的試劑盒，其中如果偶聯(lián)至結(jié)合對的第二元件的可檢測標(biāo)記是酶標(biāo)記，則所述試劑盒還包含可以通過所述酶轉(zhuǎn)化為可檢測產(chǎn)物的底物。
[0371][9]如[5]至[8]中任一項(xiàng)所定義的試劑盒，還包含特異性結(jié)合至A β 40和/或Αβ 42的抗體或抗體組合。
[0372][10]如[5]至[9]中 任一項(xiàng)所定義的試劑盒，還包含固體載體。
[0373][11]如[10]中所定義的試劑盒，其中未偶聯(lián)至結(jié)合對的第一元件的所述抗體預(yù)結(jié)合至所述固體載體。
[0374][12]如[5]至[11]中任一項(xiàng)所定義的試劑盒，還包含含有A β 17、A β 40和/或A β 42肽的樣品。
[0375][13]用于確定或檢測樣品中Αβ (1-17)肽的方法，包括以下步驟:
[0376](i)用第一抗體捕獲樣品中存在的Αβ (1-17)肽，所述第一抗體特異性地結(jié)合至所述肽，
[0377](ii)用第二抗體接觸步驟(i)中形成的免疫復(fù)合物，其中所述第二抗體如[I至4中任一項(xiàng)所定義并且其中所述第二抗體識(shí)別不同于所述第一抗體的區(qū)域并且與結(jié)合對的第一元件偶聯(lián)；
[0378](iii)用偶聯(lián)至可檢測標(biāo)記的結(jié)合對的第二元件接觸在步驟(ii)中形成的復(fù)合物，和
[0379](iv)檢測或確定所述可檢測標(biāo)記的活性或量。
[0380][14]如[13]至[17]中任一項(xiàng)所定義的方法，其中所述生物樣品選自下組:血液、血清、血漿和CSF。
[0381][15]如[I]至[12]中任一項(xiàng)所定義的試劑盒或如[13]或[14]中所定義的方法，其中所述第一抗體是單克隆抗體。
[0382][16]如[15]中所定義的試劑盒或方法，其中所述單克隆抗體是6E10抗體。
[0383][17]如[I]至[16]中任一項(xiàng)所定義的試劑盒或方法，其中所述結(jié)合對的所述第一元件是生物素而所述結(jié)合對的所述第二元件是抗生物素蛋白、鏈霉親和素或其功能等效變體。
[0384][18]如[I]至[17]中任一項(xiàng)所定義的試劑盒或方法，其中所述可檢測標(biāo)記是熒光分子、發(fā)光分子或酶。
[0385][19]用于監(jiān)測受試者體內(nèi)神經(jīng)退行性疾病的方法，包括:[0386](a)在第一時(shí)間點(diǎn)確定來自所述受試者的樣品中血漿樣品中游離A β 17肽的水平和結(jié)合至所述受試者樣品中血液樣品中的細(xì)胞的Αβ 17肽的水平；
[0387](b)在第二時(shí)間點(diǎn)確定來自所述受試者的樣品中血漿樣品中游離A β 17肽的水平和結(jié)合至所述受試者的樣品中血液樣品中的細(xì)胞的Αβ 17肽的水平，以及
[0388](c)比較在所述第一和第二時(shí)間點(diǎn)在血漿樣品中游離A β 17肽水平與結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的A β 17肽水平的比率；
[0389]其中如果所述比率在第二時(shí)間點(diǎn)相對于第一時(shí)間點(diǎn)升高的話，則它指示在所述第一和所述第二時(shí)間點(diǎn)之間受試者體內(nèi)阿爾茨海默氏病的惡化。
[0390][20]根據(jù)[19]的方法，其中所述神經(jīng)退行性疾病是阿爾茨海默氏病。
[0391][21]根據(jù)[19]或[20]中任一項(xiàng)的方法，其中通過ELISA進(jìn)行A β 17肽水平的確定。
[0392][22]根據(jù)[21]的方法，其中使用如[13]至[18]中任一項(xiàng)所定義的方法進(jìn)行Αβ 17肽水平的水平確定。
[0393][23]用于確定受試者是否患有輕度阿爾茨海默氏病的方法，包括確定選自由以下組成的組中的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的值:
[0394]Ca)結(jié)合至來自所述受試者樣品的血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 17、Αβ 40和Αβ 42肽水平的加和值；
[0395](b)來自所述受試者的血漿樣品中Aβ 17、Αβ 40和Αβ 42總肽水平和結(jié)合至來自所述受試者的血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 17、Aβ 40和Αβ 42肽水平的加和值；
[0396](C)來自所述受試者的血漿樣品中總A β 42肽水平和結(jié)合至來自所述受試者的血液樣品中的細(xì)胞的A β 42肽水平的加和值；
[0397](d)來自所述受試者的血漿樣品中總Aβ 40和Αβ 42肽水平和結(jié)合至來自所述受試者的血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 40和Αβ 42肽水平的加和值；以及
[0398](e)來自所述受試者的血漿樣品中游離的A β 17水平和結(jié)合至來自所述受試者的血液樣品中的細(xì)胞的A β 17肽水平之間的比率；
[0399]其中如果所述參數(shù)中一個(gè)或多個(gè)的值相對于健康受試者體內(nèi)參考樣品中所述參數(shù)的值增加，則所述受試者患有輕度阿爾茨海默氏病。
[0400][24]用于確定受試者是否患有具有前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的MCI的方法，包括確定選自下組的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的值:
[0401](a)來自所述受試者的血漿樣品中總Aβ 42肽水平和結(jié)合至所述受試者的血液樣品中的細(xì)胞的A β 42肽水平的加和值；
[0402](b)來自所述受試者的血漿樣品中總Aβ 40和Αβ 42肽水平和結(jié)合至來自所述受試者的血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 40和Αβ 42肽水平的加和值；
[0403](C)來自所述受試者的血漿樣品中游離的A β 17肽水平與結(jié)合至來自所述受試者的血液樣品中的細(xì)胞的A β 17肽水平之間的比率值；
[0404]Cd)結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Αβ 17肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的A β 42肽水平之間的比率值；
[0405]Ce)兩個(gè)參數(shù)之間的比率值，其中所述第一參數(shù)對應(yīng)于血漿樣品中總Αβ 17肽和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Αβ 17肽的加和水平，而所述第二參數(shù)對應(yīng)于血漿樣品中總Αβ 42肽和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的A β 42肽的加和水平；
[0406](f)兩個(gè)參數(shù)之間的比率，其中所述第一參數(shù)對應(yīng)于結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Αβ 17肽的水平，而所述第二參數(shù)對應(yīng)于結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 40肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的A β 42肽水平的加和值；和 [0407](g)兩個(gè)參數(shù)之間的比率值，其中所述第一參數(shù)對應(yīng)于來自所述受試者的血漿樣品中總Αβ 17肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 17肽水平的加和值，而所述第二參數(shù)對應(yīng)于血漿樣品中總Aβ 40和Αβ 42肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 40和A β 42肽水平的加和值；
[0408]其中如果相對于健康受試者的參考樣品中的值,參數(shù)(a)、(b)或(C)中的一個(gè)或多個(gè)的值增加和/或參數(shù)(d)、(e)、(f)或(g)中的一個(gè)或多個(gè)的值降低，則所述受試者患有具有前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的MCI。
[0409][25]用于區(qū)分患有具有非前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的MCI的受試者和患有具有前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的MCI的受試者的方法，包括確定選自下組的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的值:
[0410]Ca)結(jié)合至來自所述受試者樣品的血液樣品中的細(xì)胞的Αβ 17、Αβ 40和Αβ 42肽水平的加和值；
[0411](b)結(jié)合至所述受試者的血液樣品中的細(xì)胞的Αβ 17肽水平和結(jié)合至所述受試者的血液樣品中的細(xì)胞的A β 42肽水平之間的比率值；
[0412](C)兩個(gè)參數(shù)之間的比率值，其中所述第一參數(shù)對應(yīng)于來自所述受試者的血漿樣品中Αβ 17總肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 17肽水平的加和值，而所述第二參數(shù)對應(yīng)于來自所述受試者的血漿樣品中Αβ 42總肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的A β 42肽水平的加和值；
[0413](d)兩個(gè)參數(shù)之間的比率值，其中所述第一參數(shù)對應(yīng)于結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的A β 17肽的水平，而所述第二參數(shù)對應(yīng)于結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的A β 40和A β 42肽水平的加和值；
[0414](e)兩個(gè)參數(shù)之間的比率值，其中所述第一參數(shù)對應(yīng)于來自所述受試者的血漿樣品中Αβ 17總肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 17肽水平的加和值，而所述第二參數(shù)對應(yīng)于血漿樣品中Aβ 40和Αβ 42總肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 40和A β 42肽水平的加和值；
[0415]其中如果相對于患有具有非前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的MCI的受試者體內(nèi)參考樣品的值，(a)的值增加和/或所述參數(shù)(b)、(C)、(d)和(e)中的一個(gè)或多個(gè)的值降低，則所述受試者患有具有前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的MCI。
[0416][26]用于區(qū)分患有具有非前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的MCI的受試者和患有輕度阿爾茨海默氏病的受試者的方法，包括確定選自下組的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的值:
[0417]Ca)結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 17、Aβ 40和Αβ 42肽水平的加和值；
[0418](b)血漿樣品中Αβ 17、Aβ 40和Αβ 42總肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的A β 17、A β 40和A β 42肽水平的加和值；
[0419](c)血漿樣品中總Aβ 42肽和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 42肽水平的加和值；
[0420]Cd)血漿樣品中總Αβ 40和Αβ 42肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Αβ 40和A β 42肽水平的加和值；
[0421](e)血漿樣品中總Αβ 40肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Αβ 40肽水平的加和值；
[0422](f)兩個(gè)參數(shù)之間的比率值，其中所述第一參數(shù)對應(yīng)于結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的A β 17肽的水平，而所述第二參數(shù)對應(yīng)于結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的A β 40和A β 42肽水平的加和值；和
[0423](g)血漿樣品中游離的Aβ 17肽水平與結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 17肽水平之間的比率值；
[0424]其中如果相對于患有具有非前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的MCI的受試者體內(nèi)參考樣品的值，所述參數(shù)中一個(gè)或多個(gè)的值增加，則所述受試者患有輕度阿爾茨海默氏病。
[0425][27]用于區(qū)分患有具有前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的MCI的受試者和患有輕度阿爾茨海默氏病的受試者的方法，包括確定選自下組的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的值:
[0426](a)血漿樣品中游離的Αβ 17肽水平與血漿樣品中游離的Aβ 40肽水平之間的比率值；和
[0427](b)兩個(gè)參數(shù)之間的比率，其中所述第一參數(shù)對應(yīng)于血漿樣品中游離的Αβ 17肽的水平，而所述第二參數(shù)對應(yīng) 于血漿樣品中游離的A β 40和A β 42肽的加和水平；
[0428]其中如果相對于前驅(qū)性輕度認(rèn)知障礙受試者體內(nèi)參考樣品的值，所述參數(shù)中一個(gè)或多個(gè)的值增加，則所述受試者患有輕度阿爾茨海默氏病。
[0429][28]根據(jù)[23]至[27]中任一項(xiàng)的方法，其中A β 17、Α β 40和A β 42肽中一種或多種水平的確定是通過ELISA確定的。
[0430]作為說明提供了以下實(shí)施例，并且不應(yīng)將這些實(shí)施例解釋為限制本發(fā)明的范圍。
[0431]實(shí)施例
[0432]實(shí)施例1
[0433]杭Αβ 17杭體的產(chǎn)牛
[0434]用以下對應(yīng)于A β (12-17) (SEQ ID NO:2)的肽 VHHQKL 和對應(yīng)于 A β (11-17) (SEQID NO:3)的肽EVHHQKL免疫四只兔子，用第一種肽免疫它們中的兩只，并且用第二種肽免疫它們中的另外兩只兔子。兩種肽在N末端包含額外的氨基酸，用于結(jié)合的半胱氨酸。
[0435]用于結(jié)合的載體是鑰孔血藍(lán)素(KLH) (Pierce，參考號(hào):77600)。通過交聯(lián)劑NHS-PEG4-馬來酰亞胺(Pierce，參考號(hào):22104)進(jìn)行結(jié)合。關(guān)于佐劑，使用三種類型:弗氏完全佐劑(Sigma，參考號(hào):F5881)、弗氏不完全佐劑(Sigma，參考號(hào):F5506)和Imject明礬(Pierce,參考號(hào):77161)。
[0436]免疫方案如下所示:
[0437]-每周用100μ g的肽免疫四只兔子。
[0438]-使用弗氏完全佐劑作為佐劑進(jìn)行第一次給藥，然后用弗氏不完全佐劑進(jìn)行另一次給藥，并且用明礬進(jìn)行第三次給藥。
[0439]-在前三次給藥后，獲得的抗體滴度太低以至于不能純化。因此，在另外三次給藥中(交替使用佐劑:弗氏不完全佐劑-明礬-弗氏不完全佐劑)劑量增加到200 μ g肽。
[0440]-四只兔子獲得的抗體滴度非常高，并通過親和色譜法(使用Aβ 17肽)進(jìn)行純化。
[0441]進(jìn)行斑點(diǎn)印跡以確定抗Αβ 17抗體的特異性，其中包括其他Αβ肽(圖1)。以兩個(gè)稀釋度(1:1000和1:2000)加入抗Αβ 17抗體并且所使用的第二抗體是山羊抗兔-HRP(1:2000)。在2.5μ I中每種肽加載500ng。使用SNAP技術(shù)以I分鐘和3分鐘曝光用ECL顯影斑點(diǎn)印跡。如所述圖中所示，抗體對Αβ 17肽具有高度特異性，并且它并不特異性地識(shí)別 Αβ 15、Aβ 16、Aβ 38、Aβ 40 和 Αβ42。
[0442]實(shí)施例2
[0443]樣品中Ag 17肽的確定
[0444](I)通過質(zhì)譜確定
[0445]試劑
[0446]甲酸、氯化鈉、α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-CHCA)、三氟乙酸(TFA)、DL-二硫蘇糖醇(DTT)、三乙醇胺、Tris和牛血清白蛋白(BSA)來自Sigma (Steimheim, Germany)。乙臆購自 Carlo-Erba (Rodano, MI, Italy)。庚二亞氨酸二甲酯.2HC1 (DMP)獲自 Pierce(Rockford, IL, USA)。三(輕甲基)甲基甘氨酸(Tricine)樣品緩沖液購自Bio-Rad(Hercules, CA, USA)。
[0447]免測沉淀法(IP)操作
[0448]如Portelius 等人，2007 (J.Proteome.Res.6(11), 4433-4439)所述并使用一些修改來執(zhí)行IP-MALDI操作從而使所述操作適合狗樣品的分析。首先，使用不同量的Αβ特異性抗體(6Ε10和 4G8-分別對氨基酸4-9和18-22中的Αβ表位具有特異性，SignetLaboratories, Inc., Dedham, MA, USA)和SAR2 (對抗Aβ 40羧基末端表位具有特異性，Araclon Biotech S.L., Zaragoza, Spain)以通過蛋白質(zhì)印跡法確定每種抗體的最佳量。優(yōu)化操作包括不同步驟。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，將每種抗體單獨(dú)地加入至50 μ LDynabeads蛋白G (Invitrogen Dynal AS, Oslo, Norway)。將珠粒與不同量的抗體一起孵育,清洗,然后通過將所述珠粒在具有DTT的三(羥甲基)甲基甘氨酸樣品緩沖液中煮沸來洗脫抗體。通過蛋白質(zhì)印跡法確定每種抗體的飽和量。此外，還優(yōu)化了所述珠粒與抗體以及珠粒-抗體復(fù)合物與樣品的孵育時(shí)間(I小時(shí)并且過夜)和溫度(4°C，室溫和37°C)。另一個(gè)優(yōu)化的參數(shù)是洗脫條件(0.5,2.5和5%的甲酸，以及有機(jī)溶劑(如乙腈)的幾種百分比)。
[0449]在本研究期間應(yīng)用了兩種不同的方案。第一種基本上是基于使用優(yōu)化參數(shù)的生產(chǎn)商的說明書JfAii特異性抗體(4μ86Ε10或8yg4G8或6ygSAR2)的等份部分與50yLDynabeads蛋白G —起在室溫下在旋轉(zhuǎn)震湯器中鮮育I小時(shí)。此后，用憐Ife鹽緩沖鹽水(PBS:1mM NaH2PO4H2O, 5mMNa2HP04.2Η20,138mM NaCl)進(jìn)行三次清洗。加入 ImL CSF 并在室溫下在旋轉(zhuǎn)震蕩器中孵育過夜。孵育后，利用磁鐵(DynaMag-2或DynaMag-15, InvitrogenDynal AS, Oslo, Norway)將CSF從所述珠粒中除去并棄去。用1mT,10OmM Tris(pH=6.8)清洗珠粒三次，并使用25 μ L5%的甲酸進(jìn)行最終洗脫。將洗脫液在室溫下在Thermomixer中孵育5 分鐘。用 ZipTip C18 吸頭(Millipore, Billerica, MA, USA)將洗脫的化合物脫鹽。ZipTipC18方案由幾個(gè)步驟組成:使用乙腈進(jìn)行吸頭溶劑化，用0.1%TFA調(diào)節(jié)(將該步驟重復(fù)幾次)，樣品加載(通過上下移液幾次)，使用0.1%TFA的清洗步驟和使用3 μ L a -CHCA (5mg/mL)的最終洗脫。
[0450]在第二方案中，將檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液，pH=5.0 (24.5mM檸檬酸，52mMNa2HPO4.2H20)用于清洗和結(jié)合步驟，代替PBS。在洗脫前，用PBS清洗珠粒，代替IOOmMTris pH=6.8。該第二方案導(dǎo)致具有較低背景噪聲的質(zhì)譜以及更強(qiáng)的峰，并將它用于實(shí)驗(yàn)的其余部分。
[0451]對于人樣品的免測沉淀法，使用50 μ I Dynabeads綿羊抗小鼠(Invitrogen DynalAS, Oslo, Norway)0用PBS清洗珠粒三次，并與最佳量的特異性抗體(8 μ g6E10或8 μ g4G8)在室溫下在旋轉(zhuǎn)震蕩器中孵育I小時(shí)。此后，除去上清液并用ImL0.2M的三乙醇胺(pH=8.2)清洗珠粒。加入處于0.2M三乙醇胺(pH=8.2)中的lmL20mM DMP (具有胺反應(yīng)基團(tuán)的同型雙功能交聯(lián)劑；(Greg T Hermanson, 2010))溶液之后發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。將珠粒和抗體在室溫下孵育30分鐘，然后棄去上清液并通過在旋轉(zhuǎn)震蕩器中加入lmL50mM Tris (pH=7.5)持續(xù)15分鐘來終止反應(yīng)。用Iml含有0.1%BSA的PBS清洗交聯(lián)的珠粒三次。加入ImL混合的人CSF并將其在室溫下孵育過夜。棄去上清液并用PBS清洗珠粒幾次。用25 μ L5%的甲酸洗脫Αβ物質(zhì)。使用如上所述的相同方案用ZipTip C18對洗脫的化合物脫鹽。
[0452]MALD1-T0F 和 MALD1-T0F/T0F 質(zhì)譜法(MS)。
[0453]將0.7μ I的洗脫樣品直接放置在MALDI靶板上直至完全蒸發(fā)。使用配備有在200Hz的重復(fù)頻率下運(yùn)行的二極管泵送固態(tài)Nd = YAG激光器(355nm)的ABI4800MALD1-T0F/TOF質(zhì)譜儀(AB/Sciex)采集所有光譜。為了獲得MS光譜，儀器在反射器模式下運(yùn)行并且所有實(shí)驗(yàn)均在陽離子模式下進(jìn)行。激光器點(diǎn)火后400納秒，應(yīng)用20kV的加速電壓。離子在兩級反射器中重新聚焦并最終在第二檢測器中檢測。鏡2與源I的電壓差保持恒定在1.105的比率值。對于MS/MS采集源1，電壓保持在8kV，激光值設(shè)置為比MS實(shí)驗(yàn)中高1000個(gè)單位。通過時(shí)間離子選擇器(Timed 1n Selector)在250的分辨率值下(半峰全寬)針對破碎選擇前體離子。所選的離子在到達(dá)碰撞室之前在減速堆疊(deceleration stack)中減速并且當(dāng)在IkeV動(dòng)能下與空氣碰撞時(shí)發(fā)生解離(高能碰撞誘導(dǎo)解離)。在短暫的延遲時(shí)間后，在15kV下在第二源中將碎片離子再加速。在所有MS/MS實(shí)驗(yàn)中激活亞穩(wěn)態(tài)抑制劑以避免檢測出剩余的前體離子和不希望的亞穩(wěn)態(tài)衰變碎片。使用Data Explorer軟件進(jìn)行光譜處理(平滑和/或噪聲過濾)。僅報(bào)告單同位素的m/z比率。用生產(chǎn)商所提供的肽混合物來外部校準(zhǔn)質(zhì)譜儀，覆蓋了 900-4000Da的分子量范圍。必要時(shí)，用胰島素(M+H+=5730.609Da)校準(zhǔn)儀器。
[0454]圖2中顯示了腦脊髓液(CSF)樣品和血漿樣品的質(zhì)譜結(jié)果，其中用箭頭指示對應(yīng)于Αβ 17的峰。
[0455](2)通過 ELISA 確定
[0456]試劑和溶液
[0457]- β -淀粉樣1-17標(biāo)準(zhǔn)品，人源。20ng/ml母液。
[0458]-優(yōu)化以將抗體吸附到其表面上的微孔板。
[0459]-對人Αβ肽的NH2末端具有特異性的捕獲單克隆抗體(6Ε10抗體)。
[0460]-檢測結(jié)合生物素的多克隆抗體，其特異性地識(shí)別末端在氨基酸17的人Αβ肽。
[0461]-鏈霉親和素-HRP結(jié)合物的放大劑溶液。
[0462]-穩(wěn)定的發(fā)色團(tuán)ΤΜΒ。
[0463]-涂覆緩沖液:IOOmMNa2C03/NaHC03pH9.6。
[0464]-清洗緩沖液:50mMTris, 0.05% 吐溫 20，150mM NaCl, ρΗ8.0。
[0465]-封閉緩沖液:50mMtris,0.2% 吐溫 20，0.5%BSA, ρΗ8.0。
[0466]-保存溶液:20mg/ml海藻糖，50mM tris, pH8.0。[0467]-抗體稀釋劑:50mMtris, 0.05%BSA，0.5M NaCl，0.05% 吐溫 20，ρΗ8.0。
[0468]-PBST:80mM Na2HP04, 20mM NaH2P04, IOOmM NaCl，0.5% 吐溫 20，pH7.5。
[0469]-標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋劑:在PBST中1:100稀釋度的合成封閉劑。
[0470]-終止溶液:INH2SO4。
[0471]方法
[0472]使用識(shí)別A β淀粉樣肽中氨基酸1-17的6Ε10單克隆捕獲抗體來涂覆孔板。根據(jù)抗體的飽和濃度確定所使用的濃度，使得它將不會(huì)是抗原-抗體反應(yīng)中的限制因素。為此目的，通過將抗小鼠IgG HRP結(jié)合的抗體在室溫下振蕩孵育I小時(shí)以及與發(fā)色底物進(jìn)行孵育的步驟并隨后終止反應(yīng)來監(jiān)測吸附至孔的抗體從而將450nm的吸光值與每孔中的抗體濃度相關(guān)聯(lián)。選擇信號(hào)不隨抗體濃度增加的濃度。
[0473]一旦選擇了飽和濃度，用處于涂覆緩沖液中的100μ I捕獲抗體涂覆微孔板并在4°C下在約20h的期間內(nèi)孵育過夜(ON)。
[0474]然后，用清洗緩沖液清洗孔板5次，并且每孔加入300 μ I封閉緩沖液。將孔板在室溫下孵育3小時(shí)。然后,將孔板用清洗緩沖液清洗5次，并加入100 μ I保存溶液。使孔板蒸發(fā)直至出現(xiàn)海藻糖的白色暈圈特征(在室溫下2-3天)。這樣處理的孔板可以在4°C下保持用鋁箔覆蓋并且在兩年內(nèi)是穩(wěn)定的。
[0475]樣品制備
[0476]可以使用未稀釋或在樣品/標(biāo)準(zhǔn)品稀釋劑中1:2至1:10稀釋的樣品。對于血漿樣品推薦1:3稀釋，對于血細(xì)胞樣品推薦1:5。為了確保準(zhǔn)確定量，必須在與樣品相同的稀釋劑或緩沖液中產(chǎn)生 標(biāo)準(zhǔn)曲線和空白。
[0477]用200pg/ml的肽Αβ 17母液在用6E10mAb涂覆并用海藻糖處理的孔板上制備人Αβ17 (hAM7)的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。從這些溶液，制備在樣品/標(biāo)準(zhǔn)品稀釋劑中1:2連續(xù)稀釋液從而獲得200、100、50、25、12.5,6.25和3.125pg/ml的濃度。加入100 μ I的每種樣品并在4°C下孵育過夜(或在37°C下孵育2h)。
[0478]檢測步驟
[0479]檢測抗體是抗末端在氨基酸17的人A β肽的多克隆生物素結(jié)合的抗體。在活化步驟和在室溫下在黑暗中孵育過夜后發(fā)生抗體與生物素的結(jié)合。在隨后的步驟中將過量的生物素失活。加入在抗體稀釋劑中稀釋的檢測抗體。每孔加入100 μ 1，然后在室溫下振蕩孵育lh。然后，將100ml在抗體稀釋劑中1/50稀釋的HRP偶聯(lián)的鏈霉親和素(得自SIGMA)加入至每個(gè)孔中并在室溫下振蕩孵育lh。為了使孔板顯色，使用100μ I發(fā)色底物TMB(ZEUInmunotec)。加入TMB并且在黑暗中孵育45分鐘。每孔加入50 μ I終止溶液。在酶標(biāo)儀Synergy HT (BioTek Instruments)中讀取 450nm 的吸光值。
[0480]A β 17 定量
[0481]可以使用任何免疫測定軟件包來計(jì)算結(jié)果。用于曲線擬合的方法是線性回歸法并且如下所示計(jì)算出Aβ 17的濃度:
[0482](i)如下所示，計(jì)算出每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液和樣品的平均凈OD:
[0483]平均凈OD (nm) =平均結(jié)合OD (nm)_平均零OD (nm)。
[0484](ii)在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的平均凈OD (nm)相對于標(biāo)準(zhǔn)品的Aβ濃度(pg/ml)。通過這些點(diǎn)繪制最佳曲線以構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。[0485](iii)可以通過由標(biāo)準(zhǔn)曲線的內(nèi)插法來確定未知樣品和對照中的Αβ濃度。
[0486](iv)將針對樣品獲得的值乘以每個(gè)樣品的稀釋因子。
[0487](V)將產(chǎn)生信號(hào)大于200pg/ml標(biāo)準(zhǔn)品的樣品進(jìn)一步稀釋并測定。
[0488]實(shí)施例3
[0489]可重復(fù)性以及檢測限和定暈限的確定
[0490]為了分析免疫測定的可重復(fù)性，測量了孔板內(nèi)的差異度、測定內(nèi)的差異度、血漿樣品中測定間的差異度和細(xì)胞樣品中測定間的差異度。
[0491]通過分析在相同孔板中樣品、標(biāo)準(zhǔn)樣品和參考樣品中三次重復(fù)的孔之間的差異來計(jì)算孔板內(nèi)的差異度。在測定內(nèi)的可重復(fù)性中，比較了在相同測定中11個(gè)不同的孔板中分析的4種參考血漿樣品所獲得的濃度。在血漿樣品的測定間的差異度中，當(dāng)分析兩個(gè)不同的并且獨(dú)立的測定中兩個(gè)血漿樣品時(shí)測量了從濃度中獲得的差異。細(xì)胞樣品中測定間的差異度是指8個(gè)細(xì)胞對照樣品的兩次不同的并且獨(dú)立的確定之間Αβ 17水平的比較。
[0492]表1中顯示了獲得的結(jié)果:
【權(quán)利要求】
1.一種特異性結(jié)合至Αβ (1-17)肽的多克隆抗體，其對選自由以下組成的組中的Αβ月太并不顯不顯著的交叉反應(yīng)性:A β (1-15) > A β (1-16) > A β (1-38) > A β (1-40) > A β (1-42)和它們的一種或多種的組合。
2.一種用于檢測A β (1-17)肽的試劑盒，包括: (i)第一抗體，其是如權(quán)利要求1中所定義的抗體，和 (ii)第二抗體，其識(shí)別不同于所述第一抗體所識(shí)別的區(qū)域的所述Αβ(1-17)肽的區(qū)域。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其中所述第一抗體或所述第二抗體偶聯(lián)至結(jié)合對的第一兀件。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，還包含所述結(jié)合對的第二元件，其中所述結(jié)合對的所述第二元件偶聯(lián)至可檢測標(biāo)記。
5.一種用于確定或檢測樣品中Αβ (1-17)肽的方法，包括以下步驟: (i)用第一抗體捕獲樣品中存在的所述Αβ(1-17)肽，所述第一抗體特異性地結(jié)合至所述肽， (ii)用第二抗體接觸步驟(i)中形成的免疫復(fù)合物，其中所述第二抗體如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所定義并且其中所述第二抗體識(shí)別不同于所述第一抗體的區(qū)域并且與結(jié)合對的第一元件偶聯(lián)； (iii)用偶聯(lián)至可檢測標(biāo)記的結(jié)合對的第二元件接觸在步驟(ii)中形成的復(fù)合物，和 (iV )檢測或確定所述可檢測標(biāo)記的活性或量。
6.如權(quán)利要求5中所定義的方法，其中所述樣品選自下組中:血液、血清、血漿和CSF。
7.一種用于監(jiān)測受試者體內(nèi)神經(jīng)退行性疾病的方法，包括: Ca)在第一時(shí)間點(diǎn)確定來自所述受試者的樣品中血漿樣品中游離Aβ 17肽的水平和所述受試者樣品中血液樣品中結(jié)合至細(xì)胞的Αβ 17肽的水平； (b)在第二時(shí)間點(diǎn)確定來自所述受試者的樣品中血漿樣品中游離Aβ17肽的水平和所述受試者的樣品中血液樣品中結(jié)合至細(xì)胞的Αβ 17肽的水平，以及 (c)比較在所述第一時(shí)間點(diǎn)和第二時(shí)間點(diǎn)血漿樣品中游離Αβ17肽的水平與血液樣品中結(jié)合至細(xì)胞的A β 17肽的水平的比率； 其中如果所述比率在第二時(shí)間點(diǎn)相對于第一時(shí)間點(diǎn)升高，則它指示在所述第一時(shí)間點(diǎn)和所述第二時(shí)間點(diǎn)之間所述受試者體內(nèi)阿爾茨海默氏病的惡化。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述神經(jīng)退行性疾病是阿爾茨海默氏病。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8中任一項(xiàng)所述的方法,其中使用如權(quán)利要求5或6中任一項(xiàng)所定義的方法進(jìn)行所述A β 17肽水平的水平確定。
10.一種用于確定受試者是否患有輕度阿爾茨海默氏病的方法，包括確定選自由以下組成的組中的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的值: Ca)結(jié)合至來自所述受試者樣品的血液樣品中的細(xì)胞的Αβ 17、Αβ 40和Αβ 42肽水平的加和值； (b)來自所述受試者的血漿樣品中Aβ 17、Α β 40和A β 42總肽水平和結(jié)合至來自所述受試者的血液樣品中的細(xì)胞的A β 17、A β 40和A β 42肽水平的加和值； (c)來自所述受試者的血漿樣品中總Aβ 42肽水平和結(jié)合至來自所述受試者的血液樣品中的細(xì)胞的A β 42肽水平的加和值； (d)來自所述受試者的血漿樣品中總Αβ40和Αβ 42肽水平和結(jié)合至來自所述受試者的血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 40和Αβ 42肽水平的加和值；和 (e)來自所述受試者的血漿樣品中游離Αβ17的水平和結(jié)合至來自所述受試者的血液樣品中的細(xì)胞的A β 17肽的水平之間的比率值； 其中如果所述參數(shù)中一個(gè)或多個(gè)的值相對于健康受試者體內(nèi)參考樣品中所述參數(shù)的值增加，則所述受試者患有輕度阿爾茨海默氏病。
11.一種用于確定受試者是否患有具有前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的MCI的方法，包括確定選自下組的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的值: (a)來自所述受試者的血漿樣品中總Aβ42肽水平和結(jié)合至所述受試者的血液樣品中的細(xì)胞的A β 42肽水平的加和值； (b)來自所述受試者的血漿樣品中總Aβ40和Αβ 42肽水平和結(jié)合至來自所述受試者的血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 40和Αβ 42肽水平的加和值； (c)來自所述受試者的血漿樣品中游離Aβ 17肽水平與結(jié)合至來自所述受試者的血液樣品中的細(xì)胞的A β 17肽水平之間的比率值； Cd)結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 17水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 42肽水平之間的比率值； (e)兩個(gè)參數(shù)之間的比率值，其中所述第一參數(shù)對應(yīng)于血漿樣品中總Αβ 17肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的A β 17肽水平的加和水平，而所述第二參數(shù)對應(yīng)于血漿樣品中總Αβ 42肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 42肽水平的加和水平； Cf)兩個(gè)參數(shù)之間的比率值，其中所述第一參數(shù)對應(yīng)于結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Αβ 17肽水平，而所述第二參數(shù)對應(yīng)于結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 40肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的A β 42肽水平的加和值；和 (g)兩個(gè)參數(shù)之間的比率值，其中所述第一參數(shù)對應(yīng)于來自所述受試者的血漿樣品中總Αβ 17肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Αβ 17肽水平的加和值，而所述第二參數(shù)對應(yīng)于血漿樣品中總A β 40和A β 42肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的A β 40和A β 42肽水平的加和值； 其中如果相對于健康受試者的參考樣品中的值，參數(shù)(a)、(b)或(c)中的一個(gè)或多個(gè)的值增加和/或參數(shù)(d)、(e)、(f)或(g)中的一個(gè)或多個(gè)的值降低，則所述受試者患有具有前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的MCI。
12.一種用于確定受試者是否患有具有前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的MCI的方法，包括確定選自下組的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的值: Ca)結(jié)合至來自所述受試者樣品的血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 17、Αβ 40和Αβ 42肽水平的加和值； (b)結(jié)合至所述受試者的血液樣品中的細(xì)胞的Αβ17肽水平和結(jié)合至所述受試者的血液樣品中的細(xì)胞的A β 42肽水平之間的比率值； (c)兩個(gè)參數(shù)之間的比率值，其中所述第一參數(shù)對應(yīng)于來自所述受試者的血漿樣品中Αβ 17總肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Αβ 17肽水平的加和值，而所述第二參數(shù)對應(yīng)于來自所述受試者的血漿樣品中A β 42總肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的A β 42肽水平的加和值； (d)兩個(gè)參數(shù)之間的比率值，其中所述第一參數(shù)對應(yīng)于結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的A β 17肽水平，而所述第二參數(shù)對應(yīng)于結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的A β 40和A β 42肽水平的加和值； (e)兩個(gè)參數(shù)之間的比率值，其中所述第一參數(shù)對應(yīng)于來自所述受試者的血漿樣品中A β 17總肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的A β 17肽水平的加和值，而所述第二參數(shù)對應(yīng)于血漿樣品中Aβ 40和Αβ 42總肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 40和Αβ 42肽水平的加和值； 其中如果相對于患有具有非前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的MCI的受試者體內(nèi)參考樣品的值，Ca)的值增加和/或所述參數(shù)(b)、(c)、(d)和(e)中的一個(gè)或多個(gè)的值降低，則所述受試者患有具有前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的MCI。
13.一種用于確定受試者是否患有輕度阿爾茨海默氏病的方法，包括確定選自下組的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的值: Ca)結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Αβ 17、Αβ40和Αβ 42肽水平的加和值； (b)血漿樣品中Αβ17、Αβ40和Αβ42總肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Αβ 17、A β 40和A β 42肽水平的加和值； (c)血漿樣品中總Αβ42肽和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Αβ 42肽水平的加和值； (d)血漿樣品中總Aβ 40和A β 42肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的A β 40和A β 42肽水平的加和值； Ce)血漿樣品中總Aβ ·40肽水平和結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 40肽水平的加和值； (f )兩個(gè)參數(shù)之間的比率，其中所述第一參數(shù)對應(yīng)于結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的A β 17肽水平，而所述第二參數(shù)對應(yīng)于結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 40和Αβ 42肽水平的加和值；以及 (g)血漿樣品中游離Aβ 17肽水平與結(jié)合至血液樣品中的細(xì)胞的Aβ 17肽水平之間的比率值； 其中如果所述參數(shù)中一個(gè)或多個(gè)的值相對于患有具有非前驅(qū)性阿爾茨海默氏病的MCI的受試者體內(nèi)參考樣品的值增加，則所述受試者患有輕度阿爾茨海默氏病。
14.一種用于確定受試者是否患有輕度阿爾茨海默氏病的方法，包括確定選自下組的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的值: (a)血漿樣品中游離的Αβ17肽水平與血漿樣品中游離的Αβ 40肽水平之間的比率值；和 (b)兩個(gè)參數(shù)之間的比率，其中所述第一參數(shù)對應(yīng)于血漿樣品中游離的Αβ17肽水平，而所述第二參數(shù)對應(yīng)于血漿樣品中游離的Aβ 40和Aβ 42肽的加和水平； 其中如果所述參數(shù)中一個(gè)或多個(gè)的值相對于前驅(qū)性輕度認(rèn)知障礙受試者體內(nèi)參考樣品的值增加，則所述受試者患有輕度阿爾茨海默氏病。
【文檔編號(hào)】C07K16/18GK103547593SQ201280018250
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2012年4月3日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月12日
【發(fā)明者】曼努埃爾·薩拉薩·巴里奧 申請人:艾拉科隆生物技術(shù)公司