腦靶向性功能性核酸及其利用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明以提供新型阿爾茨海默病治療藥及其用途為課題。本發(fā)明提供一種以腦靶向性和穩(wěn)定性得到提高的CpG寡聚脫氧核苷酸結(jié)構(gòu)體或其鹽為有效成分的阿爾茨海默病治療藥。
【專利說明】腦靶向性功能性核酸及其利用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及功能性核酸的對(duì)阿爾茨海默病治療中的應(yīng)用。更詳細(xì)而言，本發(fā)明涉及利用具有CpG模體的功能性核酸的阿爾茨海默病治療藥及其用途。本申請(qǐng)主張基于2011年4月28日提出申請(qǐng)的日本專利申請(qǐng)第2011-100278號(hào)的優(yōu)先權(quán)，通過參照而援引該專利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容。
【背景技術(shù)】
[0002]伴隨老齡化社會(huì)的發(fā)展，阿爾茨海默病的患者數(shù)量呈現(xiàn)增加，現(xiàn)在，日本國內(nèi)認(rèn)可的治療藥僅有乙酰膽堿分解酶抑制藥。雖然一直以被認(rèn)為是阿爾茨海默病的病因蛋白的Αβ為靶標(biāo)，在開發(fā)β以及Y分泌酶抑制劑、Αβ疫苗等著眼于Αβ產(chǎn)生抑制或Αβ分解促進(jìn)的新型治療藥，但是尚未確立有效的治療方法。雖然一直認(rèn)為Αβ的神經(jīng)毒性在于作為不溶性的淀粉樣蛋白纖維在腦內(nèi)沉淀的凝集Αβ ^么0)，但是近年發(fā)現(xiàn)可溶性的4 0低聚物(οΑβ)具有更強(qiáng)的神經(jīng)傷害作用。其神經(jīng)障礙作用被認(rèn)為是由樹突可塑性的障礙、活性氧引起的氧化應(yīng)激、海馬中胰島素受體功能障礙等引起的。因此，這提示了控制Αβ低聚物在阿爾茨海默病的治療策略中的重要性。
[0003]已知腦內(nèi)的免疫細(xì)胞小膠質(zhì)細(xì)胞與阿爾茨海默病的疾病狀態(tài)相關(guān)。小膠質(zhì)細(xì)胞聚集于老年斑，其不僅能夠處理凝集Αβ，也能夠處理Αβ低聚物，另一方面，其具有作為炎癥性細(xì)胞的側(cè)面，其過多的活化具有產(chǎn)生炎癥性細(xì)胞因子、活性氧、谷氨酸等神經(jīng)傷害因子等相反的作用。小膠質(zhì)細(xì)胞的Αβ處理與屬于自然免疫的活化相關(guān)受體的Toll樣受體(Tolllike receptor:TLR)的信號(hào)相關(guān)。
[0004]本發(fā)明人等的研究組著眼于與自然免疫的活化相關(guān)的Toll樣受體9 (TLR9)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)作為其配體的功能性核酸CpG寡聚脫氧核苷酸(CpG-ODN)能夠增強(qiáng)腦內(nèi)的免疫細(xì)胞小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)Αβ的處理能力，誘導(dǎo)抗氧化酶血紅素加氧酶I (Η0-1)，從而在神經(jīng)細(xì)胞.小膠質(zhì)細(xì)胞的共同培養(yǎng)中抑制低聚物A β的神經(jīng)毒性，進(jìn)一步通過CpG-ODN的腦室內(nèi)給藥，可改善阿爾茨海默病模型小鼠的認(rèn)知功能障礙以及其病理表現(xiàn)(非專利文獻(xiàn)I)。關(guān)于阿爾茨海默病中TLR信號(hào)的重要性，其他的研究組也進(jìn)行了研究，作為其成果之一，報(bào)告了由末梢?guī)讉€(gè)月給藥CpG-ODN時(shí)的有用性(非專利文獻(xiàn)2)。但是，存在由末梢給藥容易活化其他免疫細(xì)胞而產(chǎn)生副反應(yīng)，CpG-ODN變得容易分解，不易向腦內(nèi)轉(zhuǎn)移等各種各樣的問題。
[0005]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0006]非專利文獻(xiàn)
[0007]非專利文獻(xiàn)l:The American Journal of Pathology.175:2121-2131，2009
[0008]非專利文獻(xiàn)2: The Journal of Neuroscience.29:1846-1854, 2009

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]對(duì)于屬于TLR9配體的功能性核酸CpG-ODN，可期待其作為阿爾茨海默病治療藥的應(yīng)用.臨床應(yīng)用。但是，如前文所述，以往報(bào)告的CpG-ODN不具有腦靶向性，不能用于實(shí)際的治療。另外，考慮到向生體給藥時(shí)受核酸分解酶的攻擊等，特別是對(duì)穩(wěn)定性等進(jìn)行改善的余地大。
[0010]鑒于以上的課題，在以臨床應(yīng)用作為最終目標(biāo)的基礎(chǔ)上，嘗試將功能性核酸CpG-ODN最適化的同時(shí)，為了使由末梢給藥成為可能，嘗試了提高CpG-ODN的腦靶向性。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)后，對(duì)新設(shè)計(jì)的序列實(shí)施硫代磷酸化修飾的同時(shí)，通過與源自狂犬病病毒糖蛋白的RVG肽連結(jié)，成功合成了穩(wěn)定性高且顯示良好的腦靶向性的新型分子(稱為RVG-CpG)。確認(rèn)了該分子能夠保持Αβ處理能力、抗氧化酶HO-1誘導(dǎo)能力，在神經(jīng)細(xì)胞.小膠質(zhì)細(xì)胞的共同培養(yǎng)中抑制低聚物Αβ的神經(jīng)毒性。而且，阿爾茨海默病模型小鼠的認(rèn)知功能障礙顯著得到了改善。因此，證明該分子對(duì)阿爾茨海默病非常有效，同時(shí)，表示該分子的合成時(shí)采用的方法(為了穩(wěn)定化的硫代磷酸化修飾以及為了賦予腦靶向性的RVG肽的連結(jié))對(duì)功能性CpG-ODN的臨床應(yīng)用是有效的。
[0011]以下示出的本發(fā)明主要是基于以上的成果。
[0012][I], 一種阿爾茨海默病治療藥，其特征在于，含有:寡聚脫氧核苷酸與源自狂犬病病毒糖蛋白的RVG肽連結(jié)的結(jié)構(gòu)體或其藥理學(xué)上可接受的鹽，所述寡聚脫氧核苷酸包含CpG模體且被硫代磷酸化修飾。
[0013][2],根據(jù)[I]所述的阿爾茨海默病治療藥，其中，所述結(jié)構(gòu)體顯示增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用的作用。
[0014][3],根據(jù)[I]所述的阿爾茨海默病治療藥，其中，所述作用是小膠質(zhì)細(xì)胞特異性的。
[0015][4],根據(jù)[I]~[3]中任一項(xiàng)所述的阿爾茨海默病治療藥，其中，所述寡聚脫氧核苷酸是CpG B類。
[0016][5],根據(jù)[I]~[4]中任一項(xiàng)所述的阿爾茨海默病治療藥，其中，所述CpG模體由gacgtt 構(gòu)成。
[0017][6],根據(jù)[I]~[5]中任一項(xiàng)所述的阿爾茨海默病治療藥，其中，所述寡聚脫氧核苷酸具有在CpG模體的兩側(cè)分別連結(jié)有一個(gè)~多個(gè)的核苷酸的結(jié)構(gòu)。
[0018][7],根據(jù)[6]所述的阿爾茨海默病治療藥，其中，所述寡聚脫氧核苷酸是10~20核苷酸長(zhǎng)。
[0019][8],根據(jù)[6]所述的阿爾茨海默病治療藥，其中，所述寡聚脫氧核苷酸是10~14核苷酸長(zhǎng)。
[0020][9],根據(jù)[6]所述的阿爾茨海默病治療藥，其中，所述寡聚脫氧核苷酸由序列號(hào)I的序列構(gòu)成。
[0021][10].根據(jù)[I]~[9]中任一項(xiàng)所述的阿爾茨海默病治療藥，其中，所述寡聚核苷酸中，構(gòu)成其的全部核苷酸被 硫代磷酸化修飾。
[0022][11].根據(jù)[I]~[10]中任一項(xiàng)所述的阿爾茨海默病治療藥，其中，所述寡聚脫氧核苷酸與所述RVG肽在所述RVG肽中的半胱氨酸殘基位置介由二硫鍵連結(jié)。
[0023][12].根據(jù)[I]~[11]中任一項(xiàng)所述的阿爾茨海默病治療藥，其中，所述寡聚脫氧核苷酸的5,末端與所述RVG肽連結(jié)。
[0024][13].根據(jù)[I]~[12]中任一項(xiàng)所述的阿爾茨海默病治療藥，其中，在所述RVG肽的N末端或C末端加成有半胱氨酸，在該半胱氨酸位置也連結(jié)有所述寡聚脫氧核苷酸。[0025][14].根據(jù)[13]所述的阿爾茨海默病治療藥，其中，2分子的所述寡聚脫氧核苷酸與I分子的所述RVG肽相連結(jié)。
[0026][15].根據(jù)[I]~[14]中任一項(xiàng)所述的阿爾茨海默病治療藥，其中，所述RVG肽由序列號(hào)3的序列構(gòu)成。
[0027][16].權(quán)利要求[I]~[15]中任一項(xiàng)定義的結(jié)構(gòu)體的用于制造阿爾茨海默病治療藥的使用。
[0028][17].—種阿爾茨海默病的治療方法，其特征在于，含有如下工序:將[I]~[15]中任一項(xiàng)所述的阿爾茨海默病治療藥以治療上有效的量給藥阿爾茨海默病患者。
[0029][18].—種結(jié)構(gòu)體，是由序列號(hào)I的序列構(gòu)成的硫代磷酸化修飾的寡聚脫氧核苷酸與由序列號(hào)3的序列構(gòu)成的源自狂犬病病毒糖蛋白的RVG肽在該RVG肽中的半胱氨酸殘基的位置介由二硫鍵連結(jié)而成的。
[0030][19].根據(jù)[18]所述的結(jié)構(gòu)體，其中，在所述RVG肽的N末端或C末端加成有半胱氨酸，在該半胱氨酸位置也連結(jié)有所述寡聚脫氧核苷酸。
[0031][20].根據(jù)[18]或[19]所述的結(jié)構(gòu)體，其中，所述寡聚核苷酸中，構(gòu)成其的全部核苷酸被硫代磷酸化修飾。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1是說明硫代磷酸化修飾的模式圖。
[0033]圖2是CpG-ODN與 源自狂犬病病毒糖蛋白的RVG肽的連結(jié)狀態(tài)。該例子中，CpG-ODN和RVG肽介由直鏈狀碳鏈(C6 )和二硫鍵連結(jié)。
[0034]圖3是比較所制作的各種CpG-ODN的小膠質(zhì)細(xì)胞活化作用的坐標(biāo)圖(MTS測(cè)定的結(jié)果)。*表示與對(duì)照組(_:未添加)之間有顯著差異。
[0035]圖4是比較所制作的各種CpG-ODN的A β低聚物減少效果的坐標(biāo)圖。οΑ β:Αβ低聚物
[0036]圖5是比較所制作的各種CpG-ODN的神經(jīng)保護(hù)作用的坐標(biāo)圖。將添加各CpG-ODN時(shí)的神經(jīng)細(xì)胞的生存率與未添加的情形(左數(shù)第2個(gè))進(jìn)行了比較。*表示與對(duì)照組(未添加)之間有顯著差異。οΑβ:Αβ低聚物
[0037]圖6是CpG-ODN與RVG肽連結(jié)的結(jié)構(gòu)體的結(jié)構(gòu)。CpG-ODN與在C末端加成有半胱氨酸的RVG肽(RVG-Cys肽)連結(jié)。連結(jié)部位是RVG-Cys肽的中央部的半胱氨酸位置和在C末端加成有半胱氨酸的位置這兩處，成為2分子的CpG-ODN與I分子的RVG-Cys肽連結(jié)的結(jié)構(gòu)體(RVG-CpG)。關(guān)于CpG-ODN僅示出連結(jié)部(5'末端)，省略了其他部分。
[0038]圖7是使用阿爾茨海默病模型小鼠在條件性恐懼學(xué)習(xí)試驗(yàn)的結(jié)果。對(duì)阿爾茨海默病模型小鼠(APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠)腹腔內(nèi)給藥RVG-Cys-127-5，考察認(rèn)知功能障礙的改善程度。對(duì)照組給藥PBS。*表示與對(duì)照組(PBS)之間有顯著差異。WT:同系的野生型小鼠。APP/PS1:APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠。
[0039]圖8是表示RVG-Cys-127-5的Αβ低聚物減少效果的坐標(biāo)圖。*表示與對(duì)照組(οΑβ:RVG-Cys-127_5未添加)之間有顯著差異。οΑβ:Αβ低聚物
[0040]圖9是表示RVG-Cys-127-5的神經(jīng)保護(hù)作用的坐標(biāo)圖。比較了添加RVG-Cys-127-5時(shí)的神經(jīng)細(xì)胞的生存率(右)和未添加的情形(中央)。*表示與對(duì)照組(cont:RVG-Cys-127-5未添加)之間有顯著差異。cont:對(duì)照組、οΑβ:Αβ低聚物
[0041]圖10是表示RVG-Cys-127-5的抗氧化酶H0_1產(chǎn)生效果的坐標(biāo)圖。*表示與對(duì)照組(οΑβ:RVG-Cys-127-5未添加)之間有顯著差異。οΑβ:Αβ低聚物
【具體實(shí)施方式】
[0042]本發(fā)明的第I方面涉及阿爾茨海默病治療藥。本說明書中的用語“治療藥”是指，對(duì)作為目標(biāo)疾病或病態(tài)的阿爾茨海默病具有治療或預(yù)防的效果的醫(yī)藥。治療的效果包括緩解阿爾茨海默病的特征性癥狀或伴隨癥狀(輕癥化)，阻止或延遲癥狀的惡化等。關(guān)于后者，在預(yù)防重癥化這一點(diǎn)上，可以視為預(yù)防的效果之一。因此，由于治療的效果與預(yù)防的效果是部分重疊的概念，將其明確進(jìn)行區(qū)分是困難的，另外這樣做也沒有多大實(shí)際意義。此外，預(yù)防的效果的典型例子是阻止或延遲阿爾茨海默病的特征性癥狀的復(fù)發(fā)。此外，只要對(duì)阿爾茨海默病顯示任何治療的效果或預(yù)防效果或者這兩者，即屬于阿爾茨海默病治療藥。
[0043]本發(fā)明的有效成分是含有CpG模體且被硫代磷酸化修飾的寡聚脫氧核苷酸與源自狂犬病病毒糖蛋白的RVG肽連結(jié)的結(jié)構(gòu)體或其藥理學(xué)上可接受的鹽。即，本發(fā)明以特定的寡聚脫氧核苷酸與RVG肽連結(jié)的結(jié)構(gòu)的分子為有效成分。本發(fā)明的有效成分對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞顯示特征性的作用，即，增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用的作用。更具體而言，本發(fā)明的有效成分不誘導(dǎo)神經(jīng)傷害因子谷氨酸、一氧化氮以及TNF-α的產(chǎn)生就能夠提高小膠質(zhì)細(xì)胞的Αβ低聚物處理能力。該作用是典型的小膠質(zhì)細(xì)胞特異性的。此處的用語“小膠質(zhì)細(xì)胞特異性的”是指作用于小膠質(zhì)細(xì)胞，另一方面，對(duì)其他細(xì)胞(特別是存在于末梢的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞)實(shí)質(zhì)上沒有作用或者即使產(chǎn)生作用其作用程度也顯著低。
[0044]另一方面，本發(fā)明的有效成分能作用于小膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)抗氧化酶血紅素加氧酶I(Η0-1)的產(chǎn)生。該作用對(duì)于因Αβ低聚物引起的活性氧(ROS)的產(chǎn)生的抑制是有效的。
[0045](I)CpG寡聚脫氧核苷酸(CpG-ODN)
[0046]本發(fā)明的寡聚脫氧核苷酸含有CpG模體。此處的用語“模體”是指具有特定功能的特征性共有序列?！癈pG模體”是由特定的6堿基(5'-嘌呤-嘌呤-CG-嘧啶-嘧啶-3')構(gòu)成的低聚DNA。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中作為CpG模體部分的序列包含gacgtt。
[0047]含有CpG模體的寡聚脫氧核苷酸，依照其結(jié)構(gòu)上的特征分類為3個(gè)類、即，A類、B類以及C類。A類的CpG-ODN中，CpG模體部分使用磷酸二酯鍵。A類的CpG-ODN強(qiáng)烈誘導(dǎo)漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(PDC)的IFN-α分泌。另一方面，漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞的成熟化作用沒有這樣強(qiáng)，并且，對(duì)B細(xì)胞的作用低。B類的CpG-ODN是直線狀的，且具有硫代磷酸化骨格。典型的是全部被硫代磷酸化修飾。B類的CpG-ODN通常強(qiáng)烈誘導(dǎo)B細(xì)胞的增殖以及漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(PDC)的成熟化，另一方面，其基本不誘導(dǎo)漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞的IFN-α分泌。C類的3'末端側(cè)具有回文結(jié)構(gòu)，形成雙鏈。C類的CpG-ODN活化B細(xì)胞以及NK細(xì)胞，誘導(dǎo)IFN- Y。
[0048]優(yōu)選，出于顯示特別強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)作用的事實(shí)(參照后述的實(shí)施例以及TheAmerican Journal of Pathology.175:2121-2131，2009)，本發(fā)明中使用 B 類的 CpG-ODN。硫代磷酸化修飾的位置以及程度(即，硫代磷酯鍵的引入位置以及引入數(shù)量)沒有限制。由于硫代磷酸化修飾的部位穩(wěn)定化，對(duì)核酸酶的分解抵抗性提高，因此硫代磷酸化修飾的程度越大越好。特別優(yōu)選使用構(gòu)成其的全部核苷酸被硫代磷酸化修飾的B類的CpG-ODN。[0049]優(yōu)選，本發(fā)明中CpG-ODN具有在CpG模體的兩側(cè)分別連結(jié)有I~多個(gè)核苷酸的結(jié)構(gòu)。換而言之，CpG模體不位于末端。CpG模體的5'側(cè)或3'側(cè)連結(jié)的核苷酸數(shù)量無特別限制，但是考慮到腦靶向性，分子量最好不大。CpG模體的5'側(cè)連結(jié)的核苷酸的數(shù)量?jī)?yōu)選為I~8個(gè),更優(yōu)選為2~6個(gè),進(jìn)一步優(yōu)選為2~4個(gè)。CpG模體的3'側(cè)連結(jié)的寡聚核苷酸的數(shù)量也相同。
[0050]如上所述，考慮到腦靶向性，CpG-ODN的分子量最好不大。因此，CpG-ODN的整體長(zhǎng)度優(yōu)選為10~25核苷酸長(zhǎng),更優(yōu)選為10~20核苷酸長(zhǎng),進(jìn)一步優(yōu)選為10~14核苷酸長(zhǎng)。本發(fā)明中優(yōu)選的CpG-ODN的具體例子如下所示。此外,序列中的S表示硫代磷酯鍵(參照?qǐng)D1)。
[0051]csastsgsascsgststscscst (序歹I」可 I)
[0052]tcsgtcsgttttgtcsgttttgtcsgtt (序列號(hào) 2)
[0053]關(guān)于前者的CpG-ODN (序列號(hào)I )，不僅在使用培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，在使用阿爾茨海默病模型動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)中也確認(rèn)了其有效性，特別優(yōu)選CpG-ODN。
[0054]被硫代磷酸化修飾的CpG-ODN，可通過利用固相氰乙基亞磷酰胺法的方法等常規(guī)方法進(jìn)行合成(例如，參照 Journal of the American Chemical Societyll2:1253，1990)。合成的CpG-ODN的分離.精制，例如，可利用反相高效液相色譜進(jìn)行。
[0055](2)源自狂犬病病毒糖蛋白的RVG肽
[0056]向腦內(nèi)的移動(dòng)被血腦屏障嚴(yán)密地控制。本發(fā)明中為了賦予腦靶向性，使用源自狂犬病病毒糖蛋白的RVG肽。RVG肽的序列如下所示。本說明書中按照慣用的標(biāo)記方法，將左端成為氨基末端(N末端)、右端成為羧基末端(C末端)的方式對(duì)肽進(jìn)行標(biāo)記。此外，利用源自狂犬病病毒糖蛋白的肽的運(yùn)輸體系已有報(bào)告(例如，參照Nature448:39-43，2007 ；NatureBiotechnology29:341-345, 2011)。
[0057]YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG (序列號(hào) 3)
[0058]在不損害本發(fā)明中要求的特性(即、賦予腦靶向性)的范圍內(nèi)，允許RVG肽的構(gòu)成氨基酸的部分改變或修飾。此處的“部分改變”是指由I~多個(gè)(上限例如是3個(gè)、5個(gè)、7個(gè))的氨基酸的缺失、置換或者通過I~多個(gè)(上限例如是3個(gè)、5個(gè)、7個(gè))的氨基酸的添加、插入或這些的組合而在氨基酸序列中產(chǎn)生突變(變化)。另外，“修飾”是指，通過基本結(jié)構(gòu)(典型的是由序列號(hào)3的序列構(gòu)成的肽)的部分置換或其他分子的加成等而提高其穩(wěn)定化，賦予新的功能。作為本領(lǐng)域技術(shù)人員，能夠利用公知或慣用的手段設(shè)計(jì)置換體等修飾體。另外，基于該設(shè)計(jì)，利用公知或慣用的手段調(diào)制目的修飾體，考察其性質(zhì)、作用，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員也是容易的。
[0059]作為肽修飾體的例子，可例舉出構(gòu)成氨基酸殘基內(nèi)的官能團(tuán)由適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基(?；?、烷基、單糖、低聚糖、多糖等)保護(hù)的肽修飾體、添加糖鏈的肽修飾體、N末端或C末端通過由其他原子等置換而被分類為烷基胺、烷基酰胺、亞磺酰、砜酰胺、鹵化物、酰胺、氨基醇、酯、氨基醛等的各種肽衍生物、標(biāo)識(shí)化肽(例如，N末端由生物素標(biāo)識(shí)或FITC標(biāo)識(shí)的肽、由熒光色素標(biāo)識(shí)化的肽等)。此外，保護(hù)基可根據(jù)與保護(hù)基結(jié)合的肽的部位、使用的保護(hù)基的種類等，通過酰胺鍵、酯鍵、氨酯鍵、尿素鍵等進(jìn)行連結(jié)。
[0060]本發(fā)明中的肽(RVG肽或其改變體、修飾體)，可利用公知的肽合成法(例如固相合成法、液相合成法)進(jìn)行制造。此外，也可通過從生體材料提取.精制、調(diào)制本發(fā)明中的肽。[0061]本發(fā)明中肽也可通過基因工程學(xué)的方法進(jìn)行調(diào)制。即，將編碼本發(fā)明中的肽的核酸引入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，通過回收轉(zhuǎn)化體內(nèi)表達(dá)的肽，從而也能夠調(diào)制本發(fā)明中的肽。根據(jù)需要對(duì)回收的肽進(jìn)行精制。將回收的肽提供于適當(dāng)?shù)闹脫Q反應(yīng)，也能將其變換為所需的改變體。
[0062]本發(fā)明的有效成分結(jié)構(gòu)體中CpG-ODN與RVG肽連結(jié)。連結(jié)可利用適用于核酸和肽連結(jié)的各種方法。在一個(gè)方式中，RVG肽中的半胱氨酸位置介由二硫鍵與CpG-ODN連結(jié)。這樣的連結(jié)可利用John J.Turner等開發(fā)的方法(例如，參照Nucleic AcidsResearch, 33:27-42, 2005)。該方法中，例如使用巰基化修飾劑，其結(jié)果是通過介由碳鏈的二硫鍵，CpG-ODN的5'末端側(cè)與RVG肽進(jìn)行連結(jié)(參照?qǐng)D2)。通過使用的修飾劑可改變碳鏈的種類(直鏈或支鏈、長(zhǎng)度)。碳鏈的碳原子數(shù)例如是C3~C10。但是，考慮到腦靶向性，優(yōu)先將結(jié)構(gòu)體低分子化，因此，可將碳鏈的長(zhǎng)度設(shè)置為C3~C7的程度。
[0063]本發(fā)明的一個(gè)方式中，在RVG肽的N末端或C末端加成有半胱氨酸。將該半胱氨酸利用于CpG-ODN的連結(jié)。即，該方式中RVG肽中的半胱氨酸殘基位置之外，在末端半胱氨酸位置也連結(jié)CpG-ODN。即，將2分子的CpG-ODN與I分子的RVG肽連結(jié)的結(jié)構(gòu)體作為有效成分使用。這種情況下，2分子的CpG-ODN的結(jié)構(gòu)沒有必要相同。但是，典型的是由使用相同結(jié)構(gòu)的2分子CpG-ODN形成該結(jié)構(gòu)體。此外，在C末端加成有半胱氨酸的RVG肽的序列如下所示。[0064]YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNGC (序列號(hào) 4)
[0065]在N末端側(cè)或C末端側(cè)也可進(jìn)一步加成I~多個(gè)的半胱氨酸。通過這種追加而加成的半胱氨酸的數(shù)量無特別限制，例如是I~10個(gè)。加成的半胱氨酸的一部分或全部用于與CpG-ODN的結(jié)合。由此，可形成相對(duì)于RVG肽的分子數(shù)，CPG-ODN的分子數(shù)的比率增大的結(jié)構(gòu)體(例如I分子的RVG肽與3~10分子的CPG-ODN連結(jié)的結(jié)構(gòu)體)。此外，也可以在RVG肽的N末端側(cè)或C末端側(cè)不直接加成半胱氨酸，而是以隔著其他氨基酸的狀態(tài)加成半胱氨酸。通過追加二個(gè)以上的半胱氨酸而進(jìn)行加成的情形下也可以在各半胱氨酸殘基之間隔著其他氨基酸。
[0066]作為本發(fā)明的治療藥的有效成分也可使用所述結(jié)構(gòu)體的藥理學(xué)上接受的鹽?！八幚韺W(xué)上接受的鹽”是指，例如酸加成鹽、金屬鹽、銨鹽、有機(jī)胺加成鹽或氨基酸加成鹽。作為酸加成鹽的例子可例舉出三氟乙酸鹽鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、氫溴酸鹽等無機(jī)酸鹽，乙酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、檸檬酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、蘋果酸鹽、草酸鹽、甲磺酸鹽、酒石酸鹽等有機(jī)酸鹽。作為金屬鹽的例子可例舉出鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽等堿金屬鹽，鎂鹽、鈣鹽等堿土類金屬鹽，鋁鹽，鋅鹽等。作為銨鹽的例子可例舉出銨、四甲基銨等鹽。作為有機(jī)胺加成鹽的例子可例舉出嗎啉加成鹽、哌啶加成鹽。作為氨基酸加成鹽的例子可例舉出甘氨酸加成鹽、苯丙氨酸加成鹽、賴氨酸加成鹽、天冬氨酸加成鹽、谷氨酸加成鹽。這些鹽的調(diào)制可通過慣用手段進(jìn)行。
[0067]本發(fā)明的治療藥的制劑化可按照常規(guī)方法進(jìn)行。制劑化時(shí)，可含有制劑上接受的其他成分(例如，緩沖劑、賦形劑、崩解劑、乳化劑、混懸劑、舒緩劑、穩(wěn)定劑、保藏劑、防腐劑、生理食鹽水、載體等)。作為緩沖劑可使用磷酸緩沖液、檸檬酸緩沖液等。作為賦形劑可使用乳糖、淀粉、山梨醇、D-甘露醇、白糖等。作為崩解劑可使用淀粉、羧甲基纖維素、碳酸鈣等。作為緩沖劑可使用磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽等。作為乳化劑可使用阿拉伯膠、精氨酸鈉、黃蓍膠等。作為混懸劑可使用單硬脂酸甘油酯、單硬脂酸鋁、甲基纖維素、羧甲基纖維素、羥甲基纖維素、月桂基硫酸鈉等。作為舒緩劑可使用芐醇、氯丁醇、山梨醇等。作為穩(wěn)定劑可使用丙二醇、抗壞血酸等。作為保藏劑可使用苯酚、氯化苯扎、芐醇、氯丁醇、尼泊金甲酯等。作為防腐劑可使用氯化苯扎、對(duì)羥基苯甲酸、氯丁醇等。[0068]制劑化時(shí)的劑型也無特別限制。劑型的例子是注射劑、片劑、散劑、微粒劑、顆粒劑、膠囊劑以及糖漿劑。
[0069]本發(fā)明的治療藥中，為了達(dá)到期待的治療效果(或預(yù)防效果)含有必要量(即治療上有效的量)的有效成分。本發(fā)明的治療藥中的有效成分量通常因劑型不同而不同，為了達(dá)到期望的給藥量，例如將有效成分量設(shè)定在約0.001重量％~約95重量％的范圍內(nèi)。
[0070]本發(fā)明的治療藥根據(jù)其劑型通過口服給藥或非口服給藥(靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)或腹腔內(nèi)注射、經(jīng)皮、經(jīng)鼻、經(jīng)粘膜等)應(yīng)用于對(duì)象。這些給藥途徑相互間不是排斥的，也可任意選擇兩種以上聯(lián)合使用(例如，口服給藥的同時(shí)或經(jīng)過一定時(shí)間后進(jìn)行靜脈注射等)。此處的“對(duì)象”無特別限制，包括人以及人以外的哺乳動(dòng)物(包括寵物動(dòng)物、家畜、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。具體而言，例如小鼠、大樹、豚鼠、倉鼠、猴、牛、豬、山羊、羊、狗、貓、雞、鶴鵓等)。優(yōu)選的一個(gè)方式中本發(fā)明的治療藥應(yīng)用于人。
[0071]本發(fā)明的治療藥的給藥量，以達(dá)到期待的治療效果來進(jìn)行設(shè)定。在治療上有效的給藥量的設(shè)定中，通?？紤]患者的癥狀、年齡、性別以及體重等。此處，作為本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠考慮到這些事項(xiàng)而設(shè)定適當(dāng)?shù)慕o藥量。例如，將成人(體重約60kg)作為對(duì)象，以每日的有效成分量為約10 μ g~約100 μ g、優(yōu)選為約20 μ g~約50 μ g的方式來設(shè)定給藥量。作為給藥方案，例如可采用I日I次~數(shù)次、2日I次或3日I次等。制定給藥方案可考慮患者的癥狀、有效成分的效果持續(xù)時(shí)間等。
[0072]由于本發(fā)明的有效成分結(jié)構(gòu)體能增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用，隱含著應(yīng)用于阿爾茨海默病以外的神經(jīng)變性疾病(例如帕金森病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、亨廷頓病)的可能性，其自身具有有用的且高的價(jià)值。另外，將該結(jié)構(gòu)體作為對(duì)以阿爾茨海默病為首的神經(jīng)變性疾病的醫(yī)藥.藥劑的開發(fā)的種子化合物也是有用的。
[0073]實(shí)施例
[0074]本發(fā)明著眼于屬于Toll樣受體9 (TLR9)的配體的CpG-ODN的有用性，以開發(fā)新型阿爾茨海默病治療方法為目標(biāo)。
[0075]1.CpG-ODN 的最適化
[0076]以對(duì)阿爾茨海默病顯示有效性的CpG-ODN (CpG Subtype B:5’ -TCCATGACGTTCCTGATGCT-3’(序列號(hào)5))為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)具有直線結(jié)構(gòu)的0DN。另外，為了阻止因核酸分解酶導(dǎo)致的分解，實(shí)施了修飾。
[0077]2.制作的CpG-ODN的有效性的研究
[0078]關(guān)于制作的CpG-ODN，按照以下方法評(píng)價(jià)有效性。首先，通過MTS測(cè)定，選擇活化培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞的CpG-ODN。另一方面，在神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞共同培養(yǎng)下，給藥制作的CpG-0DN(l, 10，IOOnM)后，添加5 μ M的Αβ低聚物，檢測(cè).評(píng)價(jià)24小時(shí)后的神經(jīng)細(xì)胞的死亡。通過免疫染色選擇顯示70%以上的生存率的CpG-ODN。接下來，對(duì)培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞，添加選擇后的CpG-ODN后，加入5 μ M的A β低聚物，選擇24小時(shí)后在ELISA法的定量中Αβ低聚物減少40%以上的CpG-ODN。[0079]MTS測(cè)定考察的結(jié)果如圖3所示。比較了 6種CpG-ODN (127-1、127-2、127-3、127-4,127-5,2006)的結(jié)果。127-1、127-2、127-5顯示高的活化能力。特別是判斷為有效性高的127-5，其全部被硫代磷酸化修飾。127-2中，一部分也實(shí)施了硫代磷酸化修飾。這兩個(gè)CpG-ODN的序列如下所示。其中，序列中的S表示硫代磷酯鍵。
[0080]127-5:csastsgsascsgststscscst (序列號(hào) I)
[0081]127-2:tcsgtcsgttttgtcsgttttgtcsgtt (序列號(hào) 2)
[0082]各CpG-ODN的Αβ低聚物減少效果(ELISA法的結(jié)果)如圖4所示。另外，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞死亡的效果(通過免疫染色的生存率的評(píng)價(jià))如圖5所示。由此可知，127-1、127-2以及127-5能有效減少A β低聚物，顯示出神經(jīng)保護(hù)作用。
[0083]3.腦靶向性CpG-ODN的制成(腦靶向性肽的加成)
[0084]通過向確認(rèn)了有效性的CpG-ODN (127-1、127-2、127-4、127-5)加成源自狂犬病病毒糖蛋白的RVG肽(YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG (序列號(hào)3))賦予腦靶向性。首先，準(zhǔn)備在RVG肽的C末端加成有半胱氨酸(Cys)的腦靶向性RVG-Cys肽(YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNGC (序列號(hào)4))。然后，將RVG-Cys肽的半胱氨酸殘基吡啶化之后，在適當(dāng)?shù)臐舛葪l件下與5'巰基化CpG-ODN混合進(jìn)行置換反應(yīng)。將得到的反應(yīng)物由反向HPCL法進(jìn)行精制。
[0085]通過以上操作，得到在RVG-Cys肽中的2個(gè)半胱氨酸位置上，CpG-ODN介由碳鏈以及二硫鍵連結(jié)的結(jié)構(gòu)體(RVG-CpG)(圖6)。
[0086]4.腦靶向性CpG-ODN (RVG-CpG)`的有效性的驗(yàn)證(通過阿爾茨海默病模型小鼠的研究)
[0087]考察了使用通過2.的考察而判斷為有效性最高的127-5來制作的腦靶向性CpG-ODN (RVG-Cys-127-5)的治療效果?？疾觳捎檬褂冒柎暮Ｄ∧Ｐ托∈?APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠(Jackson Laboratory))的條件性恐懼學(xué)習(xí)試驗(yàn)(配對(duì)聯(lián)結(jié)式學(xué)習(xí))。簡(jiǎn)單說明試驗(yàn)方法則對(duì)阿爾茨海默病模型小鼠以每次I μ g的給藥量隔日、腹腔內(nèi)給藥RVG-Cys-127-5(總計(jì)3次)。全部給藥結(jié)束第2天將小鼠放入試驗(yàn)箱，僅實(shí)施電刺激或者實(shí)施電刺激和聲音刺激，進(jìn)行條件施加。次日，對(duì)僅放入箱中的情形和進(jìn)一步加入聲音刺激的情形的不動(dòng)狀態(tài)(Freezing),進(jìn)行評(píng)價(jià)并定量化。阿爾茨海默病模型小鼠不動(dòng)狀態(tài)減少，而RVG-Cys-127-5給藥組不動(dòng)狀態(tài)顯著增加，可知認(rèn)知功能得到改善。另一方面，還根據(jù)2.中的評(píng)價(jià)方法進(jìn)行了使用培養(yǎng)細(xì)胞的考察。另外，還按照以下方法考察了在Αβ低聚物存在下的氧化酶HO-1的產(chǎn)生的促進(jìn)作用。在Αβ低聚物存在下，對(duì)培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞給藥RVG-Cys-127-5，24小時(shí)后，破碎細(xì)胞，使用H0-1ELISA試劑盒對(duì)HO-1蛋白進(jìn)行了定量。
[0088]條件性恐懼學(xué)習(xí)試驗(yàn)的結(jié)果如圖7所示。通過RVG-Cys-127-5的給藥,認(rèn)知功能障礙得到顯著改善。使用培養(yǎng)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，RVG-Cys-127-5顯著減少A β低聚物的量(圖8)、神經(jīng)細(xì)胞的生存率顯著提高(圖9)，而且促進(jìn)作用于神經(jīng)保護(hù)的HO-1的產(chǎn)生(圖10)。以上結(jié)果顯示RVG-Cys-127-5對(duì)阿爾茨海默病是有效的。
[0089]5.結(jié)論
[0090]本申請(qǐng)成功合成了腦靶向性及穩(wěn)定性優(yōu)異的新型分子，即功能性核酸(RVG-CpG)。該分子顯示神經(jīng)保護(hù)作用，通過末梢給藥，顯著改善了阿爾茨海默病模型動(dòng)物的認(rèn)知能力。這一事實(shí)顯示該分子對(duì)阿爾茨海默病是有效的。另外，其強(qiáng)烈提示適用于其他神經(jīng)變性疾病的可能性?；谠摲肿樱赃M(jìn)一步提高藥效為目標(biāo)的新型藥劑的開發(fā)也受到期待。
[0091]另一方面，以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明在新型分子的合成時(shí)采用的方法(為了穩(wěn)定化的硫代磷酸化修飾以及為了賦予腦靶向性的RVG肽的連結(jié))的有效性。作為RVG肽的應(yīng)用，在RVG肽中加成9個(gè)賴氨酸，與siRNA進(jìn)行電結(jié)合而給藥的Kumar等的例子(Nature448:39-43, 2007)非常有名。與此對(duì)照，本次成功合成的新型分子中是利用S-S鍵將肽與核酸連結(jié)，其穩(wěn)定性高，合成成本低。在實(shí)用化方面這些特征也非常重要。
[0092]工業(yè)上的利用可能性
[0093]作為本發(fā)明的有效成分的新型RVG-CpG結(jié)構(gòu)體的腦靶向性及穩(wěn)定性優(yōu)異，通過增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用發(fā)揮藥效。不局限于阿爾茨海默病的應(yīng)用，可期待將其應(yīng)用于其他神經(jīng)變性疾病(例如帕金森病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、亨廷頓病)。作為對(duì)以阿爾茨海默病為首的神經(jīng)變性疾病的醫(yī)藥.藥劑的開發(fā)的種子化合物來利用該結(jié)構(gòu)體也是可預(yù)想的。
[0094]本發(fā)明不受前述本發(fā)明的實(shí)施方式以及實(shí)施例的說明的任何局限。在不脫離權(quán)利要求書的記載的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易想到的范圍內(nèi)的各種變形方式也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本說明書中明示的論文、公開專利公報(bào)以及專利公報(bào)等的內(nèi)容，將其全部?jī)?nèi)容通過援引而引用。
[0095]序列號(hào)1:人工序列的說明:CpG寡聚脫氧核苷酸
[0096]序列號(hào)2:人工序列的說明:CpG寡聚脫氧核苷酸
[0097]序列號(hào)5:人工序列 的說明:CpG寡聚脫氧核苷酸
【權(quán)利要求】
1.一種阿爾茨海默病治療藥，其特征在于，含有:寡聚脫氧核苷酸與源自狂犬病病毒糖蛋白的RVG肽連結(jié)的結(jié)構(gòu)體或其藥理學(xué)上可接受的鹽，所述寡聚脫氧核苷酸包含CpG模體且被硫代磷酸化修飾。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的阿爾茨海默病治療藥，其中，所述結(jié)構(gòu)體顯示增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用的作用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的阿爾茨海默病治療藥，其中，所述作用是小膠質(zhì)細(xì)胞特異性的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的阿爾茨海默病治療藥，其中，所述寡聚脫氧核苷酸是CpG B類。
5.根據(jù)權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的阿爾茨海默病治療藥，其中，所述CpG模體由gacgtt 構(gòu)成。
6.權(quán)利要求1~5中任一項(xiàng)所述的阿爾茨海默病治療藥，其中，所述寡聚脫氧核苷酸具有在CpG模體的兩側(cè)分別連結(jié)有一個(gè)~多個(gè)核苷酸的結(jié)構(gòu)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的阿爾茨海默病治療藥，其中，所述寡聚脫氧核苷酸是10~20核苷酸長(zhǎng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的阿爾茨海默病治療藥，其中，所述寡聚脫氧核苷酸是10~14核苷酸長(zhǎng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的阿爾茨海默病治療藥，其中，所述寡聚脫氧核苷酸由序列號(hào)I的序列構(gòu)成。`
10.根據(jù)權(quán)利要求1~9中任一項(xiàng)所述的阿爾茨海默病治療藥，其中，所述寡聚核苷酸中，構(gòu)成其的全部核苷酸被硫代磷酸化修飾。
11.根據(jù)權(quán)利要求1~10中任一項(xiàng)所述的阿爾茨海默病治療藥，其中，所述寡聚脫氧核苷酸與所述RVG肽在所述RVG肽中的半胱氨酸殘基位置介由二硫鍵連結(jié)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1~11中任一項(xiàng)所述的阿爾茨海默病治療藥，其中，所述寡聚脫氧核苷酸的5'末端與所述RVG肽連結(jié)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1~12中任一項(xiàng)所述的阿爾茨海默病治療藥，其中，在所述RVG肽的N末端或C末端加成有半胱氨酸，在該半胱氨酸位置也連結(jié)有所述寡聚脫氧核苷酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的阿爾茨海默病治療藥，其中，2分子的所述寡聚脫氧核苷酸與I分子的所述RVG肽相連結(jié)。
15.根據(jù)權(quán)利要求1~14中任一項(xiàng)所述的阿爾茨海默病治療藥，其中，所述RVG肽由序列號(hào)3的序列構(gòu)成。
16.權(quán)利要求1~15中任一項(xiàng)定義的結(jié)構(gòu)體的用于制造阿爾茨海默病治療藥的應(yīng)用。
17.—種阿爾茨海默病的治療方法，其特征在于，包括如下步驟:將權(quán)利要求1~15中任一項(xiàng)所述的阿爾茨海默病治療藥以治療上有效的量向阿爾茨海默病患者給藥。
18.—種結(jié)構(gòu)體，是由序列號(hào)I的序列構(gòu)成的被硫代磷酸化修飾的寡聚脫氧核苷酸與由序列號(hào)3的序列構(gòu)成的源自狂犬病病毒糖蛋白的RVG肽在該RVG肽中的半胱氨酸殘基的位置介由二硫鍵連結(jié)而成的。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的結(jié)構(gòu)體，其中，在所述RVG肽的N末端或C末端加成有半胱氨酸，在該半胱氨酸位置也連結(jié)有所述寡聚脫氧核苷酸。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的結(jié)構(gòu)體，其中，所述寡聚核苷酸中，構(gòu)成其的全部核苷酸被硫 代磷酸化修飾。
【文檔編號(hào)】C07K14/145GK103501794SQ201280019961
【公開日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2012年4月25日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月28日
【發(fā)明者】錫村明生, 水野哲也 申請(qǐng)人:國立大學(xué)法人名古屋大學(xué)