雙特異性結(jié)合劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及雙特異性抗硬化蛋白(anti-sclerostin)/抗DKK1結(jié)合劑，和抗硬化蛋白與抗DKK1結(jié)合劑的組合，以及相關(guān)治療方法。
【專利說明】雙特異性結(jié)合劑
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年3月I日提交的美國臨時申請?zhí)?1/448，089和2011年5月5日提交的美國臨時申請?zhí)?1/482，979的優(yōu)先權(quán)益。
[0003]本申請含有符合ASCII“txt”的序列表，其用作37C.F.R.第1.821 (C)和1.821 (e)節(jié)所要求的計算機可讀形式(CRF)與紙質(zhì)拷貝二者，且其全部內(nèi)容以引用方式并入本文。于 2012 年 2 月 29 日創(chuàng)建的“txt”文件的名稱是 A-1598-US-NP_SequenceListing_022912_ST25_AddedSeq485-496.txt 且大小為 471KB。
[0004]發(fā)明背景
發(fā)明領(lǐng)域
[0005]本發(fā)明涉及雙特異性抗硬化蛋白(ant1-sclerostin)/抗DKKl結(jié)合劑和抗硬化蛋白與抗DKKl結(jié)合劑的組合以及相關(guān)治療方法。
[0006]發(fā)明背景
[0007]個體的骨質(zhì)量在一生中發(fā)生兩個或三個不同階段的變化(參見Riggs, WestJ.Med.154:63 77(1991))。第一階段發(fā)生于男性與女性二者中且進展至達到峰值骨質(zhì)量。此第一階段是經(jīng)由軟骨內(nèi)生長板的線性生長和因一定速率的骨膜外積(periostealapposition)所致的徑向生長來達成。第二階段始于30歲左右(對于小梁骨(扁骨，例如椎骨和骨盆)來說)和約40歲(對于骨皮質(zhì)(例如，發(fā)現(xiàn)于四肢中的長骨)來說)且持續(xù)至老年。此階段的特征在于緩慢骨損失且發(fā)生于男性與女性二者中。在女性中，還發(fā)生第三階段的骨損失，這最有可能是因為絕經(jīng)后雌激素缺乏。僅在此階段期間，女性可自骨皮質(zhì)和自小梁隔室(trabecular compartment)損失另外的骨質(zhì)量(參見Riggs,見上文)。
[0008]骨礦物質(zhì)含量損失可因眾多種病狀引起且可能產(chǎn)生顯著醫(yī)學問題。舉例來說，骨質(zhì)疏松癥是人的衰竭性疾病且特征在于骨骼骨質(zhì)量和礦物質(zhì)密度顯著降低、骨結(jié)構(gòu)劣化(包括骨微結(jié)構(gòu)降級和對應(yīng)骨脆性增加(即，骨強度降低))和患病個體對骨折的敏感性。人的骨質(zhì)疏松癥之前通常為臨床骨量減少(骨礦物質(zhì)密度比年輕成人骨的平均值低I個標準偏差以上但小于2.5個標準偏差)，美國有約2千5百萬人發(fā)現(xiàn)這種病狀。在美國已診斷出另有7千8百萬患者患有臨床骨質(zhì)疏松癥(定義為骨礦物質(zhì)含量比成熟年輕成人骨低
2.5個標準偏差以上)。骨質(zhì)疏松癥在人群中的頻率隨年齡而增加。在高加索人中，骨質(zhì)疏松癥主要發(fā)生于女性，所述女性在美國占骨質(zhì)疏松癥患者庫的80%。老年人骨骼骨的增加的脆性和對骨折的敏感性會因此群體偶爾跌倒的風險較大而加重。髖關(guān)節(jié)骨折、腕骨骨折和椎骨骨折是最常見骨質(zhì)疏松癥相關(guān)性損傷。具體地說，髖關(guān)節(jié)骨折對于患者來說極不舒適且費用昂貴，且對于女性來說，與高死亡率和發(fā)病率相關(guān)聯(lián)。
[0009]盡管已認為骨質(zhì)疏松癥會因骨質(zhì)量降低而增加骨折風險，但當前用于骨骼病癥的可用治療很少可增加成人骨密度，且大多數(shù)當前可用治療主要通過抑制進一步骨再吸收而非刺激新骨形成來起作用。目前指定雌激素用于延緩骨損失。然而，關(guān)于患者是否獲得任何長期益處和雌激素是否對75歲以上患者具有任何作用存在一些爭議。然而，人們相信使用雌激素會增加乳癌和子宮內(nèi)膜癌的風險。也已建議將降鈣素、骨鈣素連同維生素K或高劑量膳食鈣連同或不連同維生素D用于絕經(jīng)后女性。然而，高劑量鈣經(jīng)常具有不期望的胃腸副作用，且必須連續(xù)監(jiān)測血清和尿韓水平(例如，Khosla和Riggs, Mayo Clin.Proc.70:978982, 1995)。
[0010]骨質(zhì)疏松癥的其它現(xiàn)行治療方法包括雙膦酸鹽(例如，F(xiàn)osamax?、Actonel?、Bonviva?、Zometa?、奧帕膦酸鹽(olpadronate)、奈立膦酸鹽(neridronate)、替魯膦酸鈉片(skelid)、骨復舒(bonefos))、甲狀旁腺激素、鈣受體拮抗劑(calcilytic)、擬鈣劑(calcimimetic)(例如,銳克|丐(cinacalcet))、他汀(statin)、合成代謝類固醇、鑭鹽和銀鹽以及氟化鈉。然而，這些治療劑經(jīng)常與不期望的副作用相關(guān)(參見Khosla和Riggs，見上文)。
[0011]硬化性狹窄(一種由骨過度生長和骨強而致密所闡釋的骨骼疾病)中不存在硬化蛋白(S0ST 基因產(chǎn)物)(Brunkow 等，Am.J.Hum.Genet., 68:577 589, 2001 ；Balemansφ, Hum.Mo 1.Genet., 10:537 543,2001)。已顯示硬化蛋白抑制劑增加骨礦化速率并因此增加骨礦物質(zhì)密度(Padhi等，J Bone Miner Res.2010年6月；在印刷之前以電子形式出版)。同樣，已顯示Dkk-1參`與尤其在骨折修復中骨形成的調(diào)控、和其在各種其它骨損失相關(guān)性疾病(例如，癌癥和糖尿病)中的作用(Komatsu等，J.0rthop.Res.2010年7 月；28(7):928-36 ;Gavriatolpoulou 等，Expert Opin.Ther.Targets.2009 年 7 月；13(7):839-48)。
[0012]Dickkopf-1 (Dkk-1)是參與胚胎頭誘導并拮抗Wnt的分泌蛋白(Glinka等,Nature391:357-362(1998))。前人已描述了人Dkk-1的氨基酸序列和編碼其的核苷酸(美國專利號 6，344，541、6844422、7，057，017 ;公布專利申請?zhí)?20050069915 ；Krupnick 等，Gene238:301-313 (1999))。人們認為Dkk-1在人中的表達局限于胎盤，從而表明Dkk-1在胚胎發(fā)育中具有作用(Krupnick等，見上文)。Alien和同事(美國公布專利申請?zhí)?0040038860)描述了與LRP5、HBM或LRP6與Dkk-1之間的相互作用有關(guān)的測定。結(jié)合Dkk-1的抗體已描述于上述專利和專利申請以及美國公布專利申請?zhí)?0050079173和20060127393中。
[0013]人Dkk-1是Dickkopf基因家族的成員，所述家族包括Dkk-1、Dkk_2、Dkk_3和Dkk4 (Krupnick等，見上文)。盡管已顯示Dkk-1和Dkk_4抑制非洲爪蟾(Xenopus)胚胎中由Wnt-誘導的二級軸誘導，但此二者皆不會阻斷由非洲爪蟾蓬亂蛋白(Dishevelled)或卷曲蛋白(Frizzled)觸發(fā)的軸誘導，從而表明其Wnt抑制活性在Wnt信號傳導途徑中是位于卷曲蛋白上游(Krupnick等，見上文)。已表明，Dkk-1可對骨形成具有抑制作用，從而使其成為預防或治療骨質(zhì)疏松癥的潛在祀標(Patel和Karensky, N.Eng.J.Med.346:1572-1573 (2002) ；Boyden 等，N.Eng.J.Med.346:1513-1521 (2002))。
[0014]發(fā)明概述
[0015]本文提供有效治療需要增加造骨的病狀(例如，骨折修復或與病理性病狀如多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)的骨損失)的新穎抑制劑。另外，本文提供增加骨合成代謝的多特異性藥劑，其包括DKK-1與硬化蛋白抑制劑的組合。所述組合可用于治療(例如)骨質(zhì)疏松癥，加速骨折愈合，和用于許多需要增加造骨速率的病狀。具體地說，DKK-1抑制劑和硬化蛋白抑制劑可以是兩種單獨抑制劑，例如，抗硬化蛋白抗體和抗DKK-1抗體?；蛘?，DKK-1抑制劑和硬化蛋白抑制劑可為單分子實體。非限制性實例包括雙特異性結(jié)合分子，如DVD-1g、雙特異性抗體和雙特異性連接體。
[0016]在這個實施方案的一個方面中，適于用本發(fā)明分子治療的患者是罹患轉(zhuǎn)移至骨的癌癥者，且在另一方面中，患者是罹患多發(fā)性骨髓瘤者。在又一方面中，患者是選自患有骨質(zhì)疏松癥、骨量減少、佩吉特氏病(Paget' s disease)、牙周炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎和因活動抑制(immobilization)所致的骨損失的患者。在其它實施方案中，患者是選自患有可能或可能不因潛在骨質(zhì)量損失引起的骨損害者，所述骨質(zhì)量損失如由與癌癥(例如，多發(fā)性骨髓瘤)相關(guān)的骨質(zhì)疏松癥或溶骨性病變所造成。此骨損害的實例包括(但不限于)矯形外科程序、牙科程序、植入手術(shù)、關(guān)節(jié)置換(例如，髖關(guān)節(jié)置換、膝關(guān)節(jié)置換等)、骨移植、骨整容手術(shù)和骨修復，如骨折愈合、不連接愈合(nonunion healing)、延遲性連接愈合(delayedunion healing)和面部重建?？稍谒龀绦?、置換、移植、手術(shù)或修復之前、期間和/或之后施用一種或多種組合物。 [0017]在一個實施方案中，提供包含多肽鏈的結(jié)合分子，其中所述多肽鏈包含VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n，其中:VH1是得自第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第一重鏈可變結(jié)構(gòu)域；VH2是得自第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第二重鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl) η是接頭，其中所述(Xl) η存在或不存在；且(Χ2)η是Fe區(qū)，其中所述(Χ2)η存在或不存在，其中所述結(jié)合分子特異性結(jié)合硬化蛋白與DKK-1 二者。
[0018]在另一實施方案中，提供包含多肽鏈的結(jié)合分子，其中所述多肽鏈包含VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n，其中:VL1是得自第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第一輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；VL2是得自第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第二輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl) η是接頭，其中所述(Xl) η存在或不存在；且(Χ2)η是Fe區(qū)，其中所述(Χ2)η存在或不存在，其中所述結(jié)合分子特異性結(jié)合硬化蛋白與DKK-1 二者。
[0019]在又一實施方案中，提供包含第一和第二多肽鏈的結(jié)合分子，其中所述第一多肽鏈包含VHl-(Xl) n-VH2-C-(X2)n，其中VHl是得自第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第一重鏈可變結(jié)構(gòu)域；VH2是得自第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第二重鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl)n是接頭，其中所述(Xl)n存在或不存在；且(X2)n是Fe區(qū)，其中所述(X2)η存在或不存在；且其中所述第二多肽鏈包含VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n，其中VLl是得自第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第一輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；VL2是得自第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第二輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl)η是接頭，其中所述(Xl)η存在或不存在；且(Χ2)η不包含F(xiàn)e區(qū)，其中所述(Χ2)η存在或不存在，其中所述結(jié)合分子特異性結(jié)合硬化蛋白與DKK-1。
[0020]在另一實施方案中，提供包含4條多肽鏈的結(jié)合硬化蛋白與DKK-1 二者的結(jié)合分子，其中第一和第三多肽鏈包含VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n，其中:VH1是第一重鏈可變結(jié)構(gòu)域；VH2是第二重鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl) η是接頭，其中所述(Xl) η存在或不存在；且(Χ2)η是Fe區(qū)，其中所述(Χ2)η存在或不存在；且其中第二和第四多肽鏈包含VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n，其中VLl是第一輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；VL2是第二輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl) η是接頭，其中所述(Xl) η存在或不存在；且(Χ2) η不包含F(xiàn)e區(qū)，其中所述(Χ2)η存在或不存在，其中VHl和VH2重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含選自由以下結(jié)合劑組成的組的氨基酸序列:硬化蛋白結(jié)合劑SEQ ID Ν0:95、96、104、112、120、128、136、144、152、160、168、176、184、192、200、208和 216，或DKK-1 結(jié)合劑 SEQ ID NO: 224、232、240、248、256、264、272、280、288、296、304、312、320、328、336、344、352、360、368、376、384、392、400 和408，且其中VLl和VL2輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含選自由以下結(jié)合劑組成的組的氨基酸序列:硬化蛋白結(jié)合劑 SEQ ID N0:94、103、lll、119、127、135、143、151、159、167、175、183、191、199、207 和 215，或DKK-1 結(jié)合劑 SEQ ID NO: 223、231、239、247、255、263、271、279、287、295、303、311、319、327、335、343、351、359、367、375、383、391、399 和 407。
[0021]在又一實施方案中，提供包含4條多肽鏈的結(jié)合硬化蛋白與DKK-1 二者的結(jié)合分子，其中第一和第三多肽鏈包含VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n，其中:VH1是第一重鏈可變結(jié)構(gòu)域；VH2是第二重鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl) η是接頭，其中所述(Xl) η存在或不存在；且(Χ2)η是Fe區(qū)，其中所述(Χ2)η存在或不存在；且其中第二和第四多肽鏈包含VLl-(Xl) n-VL2-C-(X2)n，其中VLl是第一輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；VL2是第二輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(XDn是接頭，其中所述(Xl)n存在或不存在；且(X2)n不包含F(xiàn)e區(qū)，其中所述(X2)n存在或不存在，其中所述結(jié)合分子包含選自由以下組成的組的VHl-(Xl)n-VH2-C- (X2) η 與 VLl-(Xl) n-VL2_C-(Χ2) η 的配對:`[0022]SEQ ID NO: 18 與 20 ；22 與 24 ；26 與 28 ；30 與 32 ；34 與 36 ；38 與 40 ；42 與 44 ；46與 48 ；50 與 52 ；54 與 76 ；56 與 72 ；58 與 60 ；62 與 64 ；66 與 68 ；70 與 72 ；74 與 76 ；78 與80 ；82 與 84 ；86 與 88 ;和 90 與 92。
[0023]在另一實施方案中，提供包含4條多肽鏈的結(jié)合分子，其中第一和第三多肽鏈包含VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n，其中:VH1是第一重鏈可變結(jié)構(gòu)域；VH2是第二重鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl)n是接頭，其中所述(Xl)n存在或不存在；且(X2)n是Fe區(qū)，其中所述(X2) η存在或不存在；且其中第二和第四多肽鏈包含VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n，其中VLl是第一輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；VL2是第二輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl) η是接頭，其中所述(Χ1)η存在或不存在；且(Χ2)η不包含F(xiàn)e區(qū)，其中所述(Χ2)η存在或不存在，其中所述結(jié)合分子包含3個VHl⑶R、3個VH2⑶R、3個VLl⑶R和3個VL2⑶R，其中配對的VHl和VLl⑶R以及配對的VH2和VL2⑶R是選自由以下組成的組:SEQ ID NO:
[0024]97-102 ;105_110 ;113_118 ;121_126 ;129_134 ;137_142 ;145_150 ;153_158 ；161-166 ；169-174 ;177_182 ;185_190 ;193_198 ;201_206 ；209-214 ;217_222，
[0025]或SEQ ID NO:
[0026]225-230 ;233_238 ;241_246 ;249_254 ;257_262 ;265_270 ;273_278 ;281_286 ；289-294 ；297-302 ;305_310 ;313_318 ;321_326 ;329_334 ;337_342 ;345_350 ;353_358 ；361-366 ；369-374 ；377-382 ；385-390 ；393-398 ；401-406 ;409_414。
[0027]在另一實施方案中，提供產(chǎn)生結(jié)合硬化蛋白和DKK-1的結(jié)合分子的方法，其包括以下步驟:(a)獲得可結(jié)合硬化蛋白或DKK-1的第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分；(b)獲得可結(jié)合硬化蛋白或DKK-1的第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分；(c)構(gòu)建包含VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n的第一和第三多肽鏈，其中:VH1是得自所述第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第一重鏈可變結(jié)構(gòu)域；VH2是得自所述第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第二重鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl)n是接頭，限制條件為其不為CH1，其中所述(Xl)n存在或不存在；且(X2)n是Fe區(qū)，其中所述(X2)n存在或不存在；(d)構(gòu)建包含VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n的第二和第四多肽鏈，其中:VL1是得自所述第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第一輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；VL2是得自所述第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第二輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl) η是接頭，其中所述(Xl) η存在或不存在；且(Χ2)η不包含F(xiàn)e區(qū)，其中所述(Χ2)η存在或不存在；和(e)表達所述第一、第二、第三和第四多肽鏈，以產(chǎn)生結(jié)合硬化蛋白與DKK-1的結(jié)合分子。
[0028]在另一實施方案中，提供包含本發(fā)明結(jié)合分子的藥物組合物。在又一實施方案中，提供本發(fā)明結(jié)合分子與一種或多種藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載劑的組合。
[0029]在一個實施方案中，提供治療骨病癥的方法，其包括向有需要的患者施用本發(fā)明的結(jié)合分子。在另一實施方案中，提供加速骨折修復的方法，其包括向有需要的患者施用本發(fā)明的結(jié)合分子。在另一實施方案中，提供增加骨密度的方法，其包括向有需要的患者施用本發(fā)明的結(jié)合分子。在又一實施方案中，提供增加骨強度的方法，其包括向有需要的患者施用本發(fā)明的結(jié)合分子。
[0030]在參照以下詳細描述和附圖后，本發(fā)明的這些和其它方面將變得顯而易見。
[0031]附圖簡述
[0032]圖1匯總對結(jié)合huDKKl或huScl的雙特異性huAb的ELISA分析。
[0033]圖2匯總對結(jié)合huDKKl或huScl的雙特異性大鼠-Ab的ELISA分析。
[0034]圖3匯總對同時結(jié)合huDKKl和huScl的雙特異性Ab的ELISA分析。
[0035]圖4匯總體外生物測定結(jié)果，其顯示當使用相同摩爾比時，rAB-4-ΙΙΗΙΟ與對照Mab具有類似的中和活性。
[0036]圖5匯總來自體內(nèi)研究的腰椎和全腿的骨質(zhì)量密度(BMD)和骨礦物質(zhì)含量(BMC)的變化百分比數(shù)據(jù)，其中所述 體內(nèi)研究使用用媒介物、抗硬化蛋白mAb、抗DKKl mAb、抗硬化蛋白mAb與DKKl mAb的組合和13C7-11H10雙特異性試劑治療的小鼠。
[0037]圖6匯總對在用抗硬化蛋白/抗DKK-1組合療法治療后基因表達數(shù)據(jù)的分析。
[0038]圖7和8匯總用媒介物、抗硬化蛋白mAb、抗DKKl mAb、抗硬化蛋白mAb與DKKl mAb的組合和13C7-11H10雙特異性試劑治療的小鼠的腰椎和股骨-脛骨的BMD變化百分比。
[0039]圖9和10匯總來自用媒介物、抗硬化蛋白mAb、抗DKKl mAb、抗硬化蛋白mAb與DKKl mAb的組合和13C7-11H10雙特異性試劑治療的小鼠的骨強度的變化百分比。
[0040]圖11含有來自用媒介物、抗硬化蛋白mAb、抗DKKl mAb、抗硬化蛋白mAb與DKKlmAb的組合和13C7-11H10雙特異性試劑治療的小鼠的小鼠股骨的剖面影像。
[0041]圖12匯總扭轉(zhuǎn)模型中來自用媒介物、抗硬化蛋白mAb、抗DKKl mAb和DKKl mAb以及13C7-11H10雙特異性試劑治療的大鼠的骨強度的變化百分比。
[0042]圖13至14匯總來自用媒介物、6.147_2x_Ab5雙特異性試劑、6.37_AbL_Ab23雙特異性試劑、Ab5K-AbS-6.147雙特異性試劑、6.147_AbL_27H6雙特異性試劑和8G2-AbL-6.37.5雙特異性試劑治療的大鼠的腰椎和股骨-脛骨的BMD的變化百分比。
[0043]圖15至16匯總來自用媒介物、抗硬化蛋白mAb、抗DKKl mAb和13C7-11H10雙特異性試劑治療的小鼠的骨強度的變化百分比。
[0044]圖17匯總成骨細胞supertopflash競爭測定的結(jié)果，其顯示大鼠13C7-11H10在用fct蛋白處理的成骨細胞MC3T3E1細胞中保持親本抗體的中和活性。
[0045]圖18匯總成骨細胞supertopflash競爭測定的結(jié)果,其顯示大鼠和人DVD-1g在用Wntl蛋白處理的成骨細胞MC3T3E1STF細胞中具有針對硬化蛋白與Dkkl 二者的有效中和活性。[0046]圖19匯總AlphaScreen競爭測定的結(jié)果,其顯不DVD-1g抑制Lrp6與硬化蛋白或Dkkl的結(jié)合。
[0047]圖20是稱為DVD-1g的代表性雙特異性結(jié)合分子的示意圖。
[0048]發(fā)明詳述
[0049]本文的各部分標題僅用于組織目的，且不應(yīng)解釋為限制本文所述的標的物。本申請中所引用的所有參考文獻皆明確地以引用方式并入本文。除非本文另外定義，否則結(jié)合本發(fā)明所用的科學和技術(shù)術(shù)語應(yīng)具有本領(lǐng)域的技術(shù)人員通常所理解的含義。此外，除非上下文另有要求，否則單數(shù)術(shù)語應(yīng)包括復數(shù)含義且復數(shù)術(shù)語應(yīng)包括單數(shù)含義。
[0050]本文提供有效治療需要增加造骨的病狀(例如，骨折修復或與病理性病狀如多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)的骨損失)的新穎雙特異性分子。另外，本文提供增加骨合成代謝的藥劑的組合，其包括DKK-1與硬化蛋白抑制劑的組合。所述組合可用于治療(例如)骨質(zhì)疏松癥，增加骨折愈合速率，和用于許多需要增加造骨速率的病狀。組合治療劑可呈兩種單獨抑制劑的形式，例如抗硬化蛋白抗體和雙特異性分子，或可以是單分子實體，例如雙特異性結(jié)合分子。
`[0051]報導指示Dkk-1表達在不連接骨折模型中有所升高(Bajada,等,2009Bone; 45 (4):726-35.)。同樣，健康骨表達較低水平的Dkk-1，此有助于解釋單獨Dkk-1抗體對完好骨的BMD的作用有限。因此，倘若愈合反應(yīng)強得令人驚奇，包括峰值載荷在相對較短的時期內(nèi)顯著增加，則硬化蛋白與Dkk-1抑制劑的組合用于治療骨折尤其有用。已意外地發(fā)現(xiàn)包含硬化蛋白與DKK-1 二者的抑制劑的雙特異性分子產(chǎn)生的生物反應(yīng)比任一單獨單一療法都強。
[0052]如本文所用，雙特異性分子在其兩個結(jié)合區(qū)中的一者上結(jié)合一種抗原且在其第二結(jié)合區(qū)上結(jié)合不同抗原。因此，舉例來說，雙特異性抗體可具有兩個不同抗原結(jié)合區(qū)且對于其所結(jié)合的每一抗原來說都是單價的。雙特異性分子的又一非限制性實例是DVD-1g，其在其兩個臂的每一者上可具有兩個不同抗原結(jié)合區(qū)，因此對于兩種不同抗原來說都是二價的。本文所提供的雙特異性和雙功能性硬化蛋白和DKK-1結(jié)合分子可包括如本文所述的一個或多個CDR或一個或多個可變區(qū)。在一些情形下，雙特異性或雙功能性抗體是具有兩個不同重鏈/輕鏈對和兩個不同結(jié)合位點的人工雜交抗體。所述雙特異性抗體可通過多種方法(包括(但不限于)雜交瘤融合或連接Fab'片段)產(chǎn)生。例如，參見Songsivilai 和 Lachmann, 1990, Clin.Exp.1mmunol.79:315-321 ；Kostelny 等，1992，J.Tmmunol.148:1547-1553。
[0053]雙特異性分子也可根據(jù)本發(fā)明通過融合產(chǎn)生。在一個實例中，可將其連接(例如，通過表達融合蛋白、化學連接、高親和力非共價締合等)至一種或多種其它結(jié)合分子。這些結(jié)合分子的實例包括(但不限于)另一抗體、抗體片段、肽或結(jié)合模擬物，以產(chǎn)生雙特異性分子。
[0054]雙特異性分子也可通過選擇和/或工程改造特異性結(jié)合兩種不同抗原(如DKK-1和硬化蛋白)的抗體來產(chǎn)生。例如，參見Bostrom等，2009，Science323:1610-1614。
[0055]雙特異性分子也可包含對硬化蛋白的第一結(jié)合特異性和對第二靶標的第二結(jié)合特異性。舉例來說，第二靶標可以是硬化蛋白的不同于第一表位的另一表位。另一實例是包含至少一種對硬化蛋白的第一結(jié)合特異性和對Dkk-1內(nèi)的表位的第二結(jié)合特異性的雙特異性分子。另一實例是包含至少一種對硬化蛋白的第一結(jié)合特異性和對LRP4內(nèi)的表位的第二結(jié)合特異性的雙特異性分子。另外，對于雙特異性分子具有多特異性的本發(fā)明來說，所述分子除包括第一和第二靶表位外，還可進一步包括第三結(jié)合特異性。
[0056]雙特異性結(jié)合劑的形式
[0057]在一個方面中，本發(fā)明的特征在于包含抗硬化蛋白結(jié)合劑和抗DKKl結(jié)合劑或其片段的雙特異性或多特異性分子。可將本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合區(qū)衍生至或連接至另一功能分子，例如，另一肽或蛋白(例如，受體的另一抗體或配體)，以產(chǎn)生結(jié)合至少兩個不同結(jié)合位點或靶分子的雙特異性分子。實際上，可將本發(fā)明抗體衍生至或連接至超過一種的其它功能分子以產(chǎn)生結(jié)合超過兩個不同結(jié)合位點和/或靶分子的多特異性分子；這些多特異性分子也意欲由本文所用的術(shù)語“雙特異性分子”或“雙特異性結(jié)合分子”或“雙特異性結(jié)合蛋白”所涵蓋。
[0058]為產(chǎn)生本發(fā)明的雙特異性分子，可將本發(fā)明抗體功能性連接(例如，通過化合偶合、基因融合、非共價締合或其它方式)至一種或多種其它結(jié)合分子，如另一抗體、抗體片段、肽或結(jié)合模擬物，以產(chǎn)生雙特異性分子。
[0059]因此，本發(fā)明包括包含至少一種對硬化蛋白的第一結(jié)合特異性和對第二靶表位的第二結(jié)合特異性的雙特異性分子。舉例來說，第二靶表位是硬化蛋白的不同于第一靶表位的另一表位。另一實例是包含至少一種對硬化蛋白的第一結(jié)合特異性和對Dkk-1內(nèi)的表位的第二結(jié)合特異性的雙特異性分子。另一實例是包含至少一種對硬化蛋白的第一結(jié)合特異性和對LRP4內(nèi)的表位的第二結(jié)合特異性的雙特異性分子。另外，對于雙特異性分子具有多特異性的本發(fā)明來說，所述分子除包括第一和第二靶表位外，還可進一步包括第三結(jié)合特異性。
[0060]在某些實施方案中，雙特異性形式是雙可變結(jié)構(gòu)域(DVD) Ig。在某些實施方案中，DVD-1g形式在免疫球蛋白上的每一臂上包含兩個可變結(jié)構(gòu)域，從而獲得每分子總共4個可變結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，本發(fā)明結(jié)合蛋白是包含4條多肽鏈的能夠結(jié)合兩個抗原的DVD-1g，其中第一和第三多肽鏈包含VHl- (Xl) n-VH2-C- (X2)n,其中VHl是得自第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第一重鏈可變結(jié)構(gòu)域；VH2是得自第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第二重鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl)n是接頭，其中所述(Xl)n存在或不存在；且(X2) η是Fe區(qū)，其中所述(Χ2) η存在或不存在；且其中第二和第四多肽鏈包含VLl-(Xl) n-VL2-C-(X2)n，其中VLl是得自第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第一輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；VL2是得自第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第二輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域。所涵蓋組合的非限制性實例在本文中提供于表1的SEQ ID NO: 17-92中，其描述了 DVD-1g重鏈和輕鏈的核酸和氨基酸序列。然而，涵蓋本文所提供的抗體或其片段(包括⑶R)的任何組合。
[0061 ] DVD-1g的非限制性實例可參見美國專利號7，612，181、美國專利申請公布號 US 20110008766A1、 US 20090311253A1、 US 20100047239A1、 US 20090215992A1、US 20070081996AU US 20070071675A1, US 20070041905AU US 20100260668A1, US20100076178A1、US 20090304693A1、US 20090311253A1 和 US 20100233079A1。DVD-1g 的其它非限制性實例可參見國際專利申請公布號WO 2007024715A2、WO 2008024188A2、WO2009134776A2、WO 2009149185A2、WO 2009149189A2、WO 2010065882AU WO 2010127284A2和 TO 2010127294A2。
[0062]術(shù)語“接頭”用于表示包含兩個或更多個通過肽鍵接合的氨基酸殘基的多肽且任選地用于連接一個或多個抗原結(jié)合部分。這些接頭多肽為本領(lǐng)域中所熟知(例如，參見Holliger, P.,等(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90:6444-6448 ；Poljak, R.J.等(1994)Structure 2:1121-1123)。舉例來說，DVD-1g的Xl可以是選自本文表1中所述接頭序列中的任一者的接頭。
[0063]在具體實施方案中，接頭可經(jīng)過突變以進行氨基酸取代，從而改變其性質(zhì)。舉例來說，對于包含AbL接頭的DVD-1g來說，可觀察到O-糖基化。為解決此問題，可將一個或多個Ser或Thr殘基(下文帶下劃線者)改變?yōu)楦拾彼?Gly ；G)或谷氨酰胺(Gin ；Q)，這取決于每一 DVD-1g中發(fā)生O-糖基化的具體位點，如通過肽作圖所確定。
[0064]ASTKGPSVFPLAP HC [0065]TVAAPSVFIFPP LC
[0066]QPKAAPSVTLFPP LC
[0067]可在重鏈接頭和輕鏈接頭的任一者或二者中取代位點。
[0068]在一個實施方案中，結(jié)合蛋白不包含X2。在另一實施方案中，Xl是接頭，限制條件為其不為CHl。
[0069]在一個實施方案中，可變重鏈與可變輕鏈二者皆包含相同接頭。在另一實施方案中，可變重鏈與可變輕鏈包含不同接頭。在另一實施方案中，可變重鏈與可變輕鏈二者皆包含短(約6個氨基酸或更短)接頭。在另一實施方案中，可變重鏈與可變輕鏈二者皆包含長(多于6個氨基酸)接頭。在另一實施方案中，可變重鏈包含短接頭且可變輕鏈包含長接頭。在另一實施方案中，可變重鏈包含長接頭且可變輕鏈包含短接頭。
[0070]在某些實施方案中，雙特異性形式是進一步包含結(jié)合硬化蛋白或DKK-1的單體結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白。例如，參見美國專利號7，503，907和7，820，790和美國專利公布號20040175756、20050048512、20050053973 和 20060223114。在一個實施方案中，雙特異性分子包含多個單體結(jié)構(gòu)域，或者稱為高親和性聚合體(avimer)。高親和性聚合體包含兩個或更多個各自為30個至35個氨基酸的通過接頭肽連結(jié)的肽序列。在某些實施方案中，個別序列是衍生自各種膜受體的A結(jié)構(gòu)域且具有通過二硫鍵和鈣穩(wěn)定的剛性結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，每一 A結(jié)構(gòu)域可結(jié)合靶蛋白的某一表位。結(jié)合相同蛋白的不同表位的結(jié)構(gòu)域的組合會增加與此蛋白的親和力，即稱為親合力的作用。在一個實施方案中，單體結(jié)構(gòu)域或高親和性聚合體是位于免疫球蛋白的Fe區(qū)內(nèi)。
[0071]在某些實施方案中,雙特異性形式是連接體(Iinkerbody)?！斑B接體”是二價、雙特異性抗體。連接體是通過使用接頭接合抗體的VL與其各別重鏈來構(gòu)建的?？赏ㄟ^在每一重鏈的Fe中引入相反電荷對突變使分別代表對DKK和硬化蛋白的特異性的兩半結(jié)合在一起。舉例來說，第一 Fe含有392D和409D，而第二 Fe含有356K和359K (例如，參見KannanGunasekhran 等，J.Biol Chem, 2010 年 6 月)。
[0072]在某些實施方案中，雙特異性形式包含肽結(jié)合區(qū)(例如肽模擬物)。也提供基于本文所述的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域和CDR的模擬物(例如，“肽模擬物”或“擬肽”)。這些類似物可為肽、非肽或肽與非肽區(qū)的組合。Fauchere, 1986, Adv.Drug Res.15:29 ;Veber和Freidinger, 1985，TINS 第 392 頁；和 Evans 等，1987，J.Med.Chem.30:1229，所述文獻出于任何目的以引用方式并入本文?？墒褂迷诮Y(jié)構(gòu)上與在治療上有用的多肽相類似的肽模擬物來產(chǎn)生類似治療性或預防性作用。這些化合物經(jīng)常是借助計算機化分子建模來開發(fā)的。通常，本發(fā)明的擬肽是在結(jié)構(gòu)上與顯示期望的生物學活性(如此處能夠特異性結(jié)合Dkk-1或硬化蛋白)的抗體類似，但一個或多個肽鍵聯(lián)任選地通過本領(lǐng)域中熟知的方法置換為選自以下的鍵聯(lián)的蛋白:一CH2NH—、一CH2S—、一CH2—CH.2—、一CH—CH-(順和反)、一C0CH2—、-CH(OH) CH2—和一CH2S0—。用相同類型的D-氨基酸系統(tǒng)性取代共有序列的一個或多個氨基酸(例如，D-賴氨酸置換L-賴氨酸)可在本發(fā)明的某些實施方案中用于產(chǎn)生更穩(wěn)定的蛋白。另外，包含共有序列或?qū)嵸|(zhì)上一致的共有序列變化的限制性肽可通過本領(lǐng)域中已知的方法來產(chǎn)生(Rizo和Gierasch, 1992, Ann.Rev.Biochem.61:387,以引用方式并入本文)；舉例來說，通過添加能夠形成可使肽環(huán)化的分子內(nèi)二硫橋鍵的內(nèi)部半胱氨酸殘基。
[0073]在某些實施方案中，雙特異性結(jié)合分子是雙特異性雙功能抗體。雙特異性雙功能抗體(Db)利用雙功能抗體形式進行表達。雙功能抗體是通過將連結(jié)VH和VL結(jié)構(gòu)域的接頭的長度減至約5個殘基自scFv片段產(chǎn)生的(參見Peipp，M.和T.Valerius (2002)`Biochem.Soc.Trans.30 (4): 507-11)。接頭大小的這種減小有助于通過VH和VL結(jié)構(gòu)域的交叉配對使兩條多肽鏈二聚化。雙特異性雙功能抗體是通過在相同細胞內(nèi)表達兩條具有結(jié)構(gòu)VHA-VLB和VHB-VLA (VH-VL構(gòu)型)或VLA-VHB和VLB-VHA (VL-VH構(gòu)型)的多肽鏈來產(chǎn)生。過去已產(chǎn)生眾多種不同的雙特異性雙功能抗體，且其中的大多數(shù)是在細菌中以可溶形式表達。然而，最近的比較研究證明，可變結(jié)構(gòu)域的取向可影響活性結(jié)合位點的表達和形成(參見 Mack, M.等(1995) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 92 (15): 7021-5)。然而，相對于串聯(lián)scFv分子，細菌中的可溶表達代表重要優(yōu)點。然而，由于在單一細胞中表達兩條不同多肽鏈，因此無活性同源二聚體可連同活性異源二聚體一起產(chǎn)生。這使得需要實施另外的純化步驟來獲得雙特異性雙功能抗體的同源制劑。一種促使雙特異性雙功能抗體產(chǎn)生的方法是產(chǎn)生隆凸與孔洞(knob-1nto-hole)雙功能抗體(參見Holliger, P.，T.Prospero和
G.Winter (1993) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90 (14): 6444-8.18)。證明此方法可用于針對HER2和⑶3的雙特異性雙功能抗體。通過用Phe交換Val37和用Trp交換Leu45在VH結(jié)構(gòu)域中引入大隆凸，且通過在抗HER2或抗⑶3可變結(jié)構(gòu)域中使Phe98突變成Met和使Tyr87突變成Ala在VL結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生互補孔洞。通過使用此方法，可使雙特異性雙功能抗體的產(chǎn)生自72%(以親本雙功能抗體計)增加至超過90%(以隆凸與孔洞雙功能抗體計)。也已將雙功能抗體融合至Fe以產(chǎn)生更多稱為二-雙功能抗體的Ig樣分子(參見Lu，D.，等(2004)J.Biol.Chem.279(4):2856-65)。另外，前人已描述在IgG的重鏈中包含兩個Fab重復且能夠結(jié)合4個抗原分子的多價抗體構(gòu)建體(參見WO 0177342六1和組1161*，1(.，等(2003)J.1mmunol.170(9):4854-61)。
[0074]在某些實施方案中，雙特異性結(jié)合分子可屬于多特異性結(jié)合分子。此形式的非限制性實例可參見國際專利申請公布號WO 2009018386A1和美國專利申請公布號US20090155275。
[0075]在某些實施方案中，雙特異性形式是結(jié)構(gòu)域抗體?！敖Y(jié)構(gòu)域抗體”是僅含有重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的免疫學功能性免疫球蛋白片段。在一些情形下，兩個或更多個VH區(qū)與肽接頭共價接合以產(chǎn)生二價結(jié)構(gòu)域抗體。二價結(jié)構(gòu)域抗體的兩個VH區(qū)可靶向相同或不同抗原。例如，參見美國專利公布號20100234570和20040219643A1。
[0076]在一個實施方案中，本發(fā)明的雙特異性分子包含至少一種抗體或其抗體片段作為結(jié)合特異性，抗體片段包括(例如)來自本文所提供的新穎雙特異性分子序列的Fab、Fab'、F(ab' )2, Fv或單鏈Fv。其也可為輕鏈或重鏈二聚體或任何最小片段，如Fv或單鏈構(gòu)建體，如Ladner等,美國專利號4，946, 778中所述。
[0077]雙特異性分子可通過使用本領(lǐng)域中已知的方法使結(jié)合部分化學偶聯(lián)來制備。當結(jié)合部分是蛋白或肽時，可使用多種偶合劑或交聯(lián)劑進行共價偶聯(lián)。實例包括蛋白A、碳化二亞胺、N-琥珀酰亞氨基-S-乙?；?硫代乙酸酯(SATA)、5，5 ' - 二硫基雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、鄰亞苯基二馬來酰亞胺(oPDM) ,3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀酰亞氨基酯(STOP)和4-(N-馬來酰亞氨基甲基)環(huán)己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亞氨基酯(磺基-SMCC)(例如，參見 Karpovsky 等，1984J.Exp.Med.160:1686 ；Liu, MA 等，1985 Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 82:8648)。其它方法包括以下文獻中所述者:Paulus, 1985 BehringIns.Mitt.第 78 期，118-132 ;Brennan 等，1985 Science 229:81-83 和 Glennie 等，1987J.1mmunol.139:2367-2375。偶聯(lián)劑包括 SATA 和磺基-SMCC，二者皆購自 Pierce Chemical公司(Rockford，IL)。當結(jié)合部分是抗體時，其可通過兩條重鏈的鉸鏈區(qū)的巰基鍵結(jié)來偶聯(lián)。在一個實施方案中，鉸鏈區(qū)經(jīng)過修飾以含有奇數(shù)個巰基殘基，以使得存在未與對應(yīng)重鏈或輕鏈對等部分形成二硫鍵聯(lián)的游離巰基。
[0078]雙特異性分子可包含至少兩種單鏈分子。制備雙特異性分子的方法的非限制性實例描述于各種專利公布中，包括美國專利號5，260，203 ;美國專利號5，455，030 ;美國專利號4，881，175 ;美國專利號5，132，405 ;美國專利號5，091，513 ;美國專利號5，476，786 ；美國專利號5，013，653 ;美國專利號5，258，498 ;美國專利號5，482，858和美國專利申請?zhí)?010/0076178。
[0079]或者，兩個結(jié)合部分皆可在同一載體中編碼且在同一宿主細胞中表達并組裝。當雙特異性分子是mAbXmAb、mAbXFab、FabXF(abl): !或配體XFab融合蛋白時,此方法尤其有用。本發(fā)明的雙特異性分子可以是包含一種單鏈抗體和一種結(jié)合決定簇的單鏈分子或包含兩種結(jié)合決定簇的單鏈雙特異性分子。
[0080]本文公開結(jié)合硬化蛋白和DKK-1的抗體的非限制性實例。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，本文所述的抗體可用于本發(fā)明的雙特異性分子的背景下。
[0081]雙特異性分子與其特異性靶標的結(jié)合可通過(例如)以下測定來證實:酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(REA)、FACS分析、生物測定(例如，生長抑制)或蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)測定。所述測定中的每一者通常通過采用對相關(guān)復合物具有特異性的標記試劑(例如，抗體)來檢測特別關(guān)注的蛋白-抗體復合物的存在。
[0082]硬化蛋白結(jié)合分子
[0083]本發(fā)明提供可用于本發(fā)明的雙特異性分子中的硬化蛋白結(jié)合分子。在某些實施方案中，硬化蛋白結(jié)合分子是抗體或其片段。在某些實施方案中，雙特異性分子包含本文所述免疫球蛋白的VH和/或VL結(jié)構(gòu)域。在其它實施方案中，雙特異性分子包含輕鏈CDR1、CDR2、⑶R3中的至少一者和至少一個重鏈⑶R1、⑶R2或⑶R3。硬化蛋白結(jié)合分子的⑶R序列的非限制性實例提供于本文表1中。
[0084]所提供雙特異性分子的硬化蛋白結(jié)合組分可包括表1中所列⑶R中的一者、二者、三者、四者、五者或六者。預期雙特異性分子可包括來自上文所列單一抗體的兩個或更多個CDR、或來自上文所列抗體的任何組合的兩個或更多個CDR。一些硬化蛋白結(jié)合組分包括輕鏈⑶R3與重鏈⑶R3 二者。某些硬化蛋白結(jié)合組分具有表1中所列⑶R的變異體形式，其中一個或多個(即，2個、3個、4個、5個或6個)⑶R各自與表1中所列的⑶R序列具有至少80%、85%、90%或95%的序列一致性。舉例來說，硬化蛋白結(jié)合組分可包括輕鏈⑶R3與重鏈⑶R3 二者，其各自分別與表1中所列的輕鏈⑶R3序列和重鏈⑶R3具有至少80%、85%、90%或95%的序列一致性。一些所提供硬化蛋白結(jié)合組分的⑶R序列也可與表1中所列的⑶R序列不同，以使得任何給定CDR的氨基酸序列與表1中所列的序列相差不超過I個、2個、3個、4個或5個氨基酸殘基。與所列序列的差異通常是(但不限于)保守取代。
[0085]進一步預期本文所述輕鏈中的每一者可與本文所述重鏈中的任一者組合以形成雙特異性分子的硬化蛋白結(jié)合組分。本文所提供的某些硬化蛋白結(jié)合組分包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域包含與本文所提供輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列相差僅I個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個氨基酸殘基的氨基酸序列，`其中每一此序列差異皆獨立地`是一個氨基酸的缺失、插入或取代、或其組合。某些硬化蛋白結(jié)合組分中的輕鏈可變區(qū)包含與本文所提供輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%的序列一致性的氨基酸序列。
[0086]本文所提供的某些硬化蛋白結(jié)合組分包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域包含與本文所提供重鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列相差僅I個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個氨基酸殘基的氨基酸序列，其中每一此序列差異皆獨立地是一個氨基酸的缺失、插入或取代、或其組合。某些硬化蛋白結(jié)合組分中的重鏈可變區(qū)包含與本文所提供重鏈可變區(qū)的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%序列一致性的氨基酸序列。
[0087]在其它實施方案中，雙特異性分子的結(jié)合硬化蛋白的部分是選自公開于美國專利號7，744，874、美國專利號7，592，429和美國專利申請公布號2009/0130113中的那些硬化蛋白結(jié)合分子。在一個具體實施方案中，涵蓋包含來自上文專利和專利申請中所公開的抗體的結(jié)合硬化蛋白的VH和VL的DVD-1g。
[0088]DKK-1 結(jié)合劑
[0089]本發(fā)明提供可用于本發(fā)明的雙特異性分子中的DKK-1結(jié)合分子。在某些實施方案中，DKK-1結(jié)合分子是抗體或其片段。在某些實施方案中，雙特異性分子包含本文所述免疫球蛋白的VH和/或VL結(jié)構(gòu)域。在其它實施方案中，雙特異性分子包含輕鏈CDR1、CDR2、⑶R3和重鏈⑶R1、⑶R2或⑶R3中的至少一者。DKK-1結(jié)合分子的⑶R序列的非限制性實例提供于表1中。
[0090]所提供雙特異性分子的DKK-1結(jié)合組分可包括表1中所列⑶R中的一者、二者、三者、四者、五者或六者。預期雙特異性分子可包括來自表1中所列單一抗體的兩個或更多個⑶R、或來自表1中所列抗體的任何組合的兩個或更多個⑶R。一些DKK-1結(jié)合組分包括輕鏈⑶R3與重鏈⑶R3 二者。某些DKK-1結(jié)合組分具有表1中所列⑶R的變異體形式，其中一個或多個(即，2個、3個、4個、5個或6個)⑶R各自與表1中所列的⑶R序列具有至少80%、85%、90%或95%的序列一致性。舉例來說，DKK-1結(jié)合組分可包括輕鏈⑶R3與重鏈⑶R3 二者，其各自分別與表1中所列的輕鏈⑶R3序列和重鏈⑶R3具有至少80%、85%、90%或95%的序列一致性。一些所提供DKK-1結(jié)合組分的⑶R序列也可與表1中所列的⑶R序列不同，以使得任何給定CDR的氨基酸序列與表1中所列的序列相差不超過I個、2個、3個、4個或5個氨基酸殘基。與所列序列的差異通常是(但不限于)保守取代。
[0091]進一步涵蓋本文所述輕鏈中的每一者可與本文所述重鏈中的任一者組合以形成雙特異性分子的DKK-1結(jié)合組分。本文所提供的某些DKK-1結(jié)合組分包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域包含與本文所提供輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列相差僅I個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個氨基酸殘基的氨基酸序列，其中每一此序列差異皆獨立地是一個氨基酸的缺失、插入或取代、或其組合。某些DKK-1結(jié)合組分中的輕鏈可變區(qū)包含與本文所提供輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%序列一致性的氨基酸序列。
[0092]本文所提供的某些DKK-1結(jié)合組分包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域包含與本文所提供重鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列相差僅I個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個氨基酸殘基的氨基酸序列，其中每一此序列差異皆獨立地是一個氨基酸的缺失、插入或取代、或其組合。某些DKK-1結(jié)合組分中的重鏈可變區(qū)包含與本文所提供重鏈可變區(qū)的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%序列一致性的氨基酸序列。
[0093]在其它實施方案中，雙特異性分子的結(jié)合DKK-1的部分是選自公開于美國專利號7，709，611、美國專利公布號2008/0193449、美國專利號7，642，238、美國專利號7，700，101和WO 2007/084344中的那些DKK-1結(jié)合分子。在一個具體實施方案中，涵蓋包含來自上述專利和專利申請中所公開的抗體的結(jié)合硬化蛋白的VH和VL的DVD-1g。
[0094]抗體和結(jié)合表位
[0095]本發(fā)明的雙特異性結(jié)合分子可包含本文所提供的抗硬化蛋白和抗DKK-1抗體和其片段。術(shù)語“抗體”是指可與完好抗體競爭與靶抗原特異性結(jié)合的任何同種型的完好免疫球蛋白或其片段，且包括(例如)嵌合抗體、人源化抗體、完全人抗體和雙特異性抗體?！翱贵w”是一種抗原結(jié)合蛋白。完好抗體通常將包含至少兩條全長重鏈和兩條全長輕鏈，但在一些情形下，可包括較少鏈，如駱§它科動物(camelid)中可僅包含重鏈的天然抗體?？贵w可僅源自單一來源，或可以是“嵌合的”，即，抗體的不同部分可源自兩種不同抗體，如下文所進一步闡述。抗原結(jié)合蛋白、抗體或結(jié)合片段可通過重組DNA技術(shù)或通過完好抗體的酶促或化學裂解在雜交瘤中產(chǎn)生。除非另有說明，否則術(shù)語“抗體”除包含兩條全長重鏈和兩條全長輕鏈的抗體外也包括其衍生物、變異體、片段和突變蛋白。此外，除非明確排除，否則抗體分別包括單克隆抗體、雙特異性抗體、微小抗體、結(jié)構(gòu)域抗體、合成抗體(本文中有時稱為“抗體模擬物”)、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、抗體融合物(本文中有時稱為“抗體偶聯(lián)物”)和其片段。
[0096]天然存在的抗體結(jié)構(gòu)單元通常包含四聚體。每一此四聚體通常是由兩個相同的多肽鏈對構(gòu)成，每一對具有一條全長“輕”鏈(在某些實施方案中，約25kDa)和一個全長“重”鏈(在某些實施方案中，約50-70kDa)。每一鏈的氨基端部分通常包括通常負責抗原識別的具有約100個至10個或更多個氨基酸的可變區(qū)。每一鏈的羧基端部分通常界定可負責作用功能的恒定區(qū)。通常將人輕鏈歸類為K輕鏈和λ輕鏈。通常將重鏈歸類為μ、δ、、α或ε，且分別將抗體的同種型定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有若干亞類，包括(但不限于)IgGU IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有亞類，包括(但不限于)IgMl和IgM2。同樣可將IgA細分成亞類，包括(但不限于)IgAl和IgA2。在全長輕鏈和重鏈內(nèi)，通?？勺儏^(qū)和恒定區(qū)是由約12個或更多個氨基酸的“J”區(qū)接合，其中重鏈也包括約10個或更多個氨基酸的 “D” 區(qū)。例如，參見 Fundamental Immunology Ch.7 (Paul, ff.編著,第二版 RavenPress，N.Y.(1989))(出于所有目的，其全部內(nèi)容以引用方式并入本文)。每一輕鏈/重鏈對的可變區(qū)通常形成抗體結(jié)合位點 。
[0097]可變區(qū)通常展現(xiàn)具有由三個超變區(qū)(也稱為互補決定區(qū)或⑶R)接合的相對保守的框架區(qū)(FR)的相同的一般結(jié)構(gòu)。來自每一對的兩條鏈的⑶R是通過框架區(qū)對齊，這可使其能夠與特定表位結(jié)合。自N端至C端，輕鏈可變區(qū)與重鏈可變區(qū)二者皆通常包含結(jié)構(gòu)域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。氨基酸在每一結(jié)構(gòu)域中的分配通常是依照 Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (NationalInstitutes of Health, Bethesda, Md.(1987 和 1991))或 Chothia 和 Lesk, J.Mol.Biol.，196:901-917(1987) ；Chothia 等，Nature, 342:878-883(1989)的定義。
[0098]在某些實施方案中，在不存在抗體輕鏈下，抗體重鏈結(jié)合抗原。在某些實施方案中，在不存在抗體重鏈下，抗體輕鏈結(jié)合抗原。在某些實施方案中，在不存在抗體輕鏈下，抗體結(jié)合區(qū)結(jié)合抗原。在某些實施方案中，在不存在抗體重鏈下，抗體結(jié)合區(qū)結(jié)合抗原。在某些實施方案中，在不存在其它可變區(qū)下，個別可變區(qū)特異性結(jié)合抗原。
[0099]在某些實施方案中，對CDR的定義性描述和對包含抗體的結(jié)合位點的殘基的鑒別是通過解析抗體的結(jié)構(gòu)和/或解析抗體-配體復合物的結(jié)構(gòu)來達成。在某些實施方案中，這可通過那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的多種技術(shù)中的任一者(例如X射線結(jié)晶學)達成。在某些實施方案中，可采用各種分析方法來鑒別或接近CDR區(qū)。這些方法的實例包括(但不限于)Kabat定義、Chothia定義、AbM定義和接觸定義。
[0100]Kabat定義是對抗體中的殘基編號的標準且通常用于鑒別⑶R區(qū)。例如，參見 Johnson 和 ffu, Nucleic Acids Res.，28:214-8 (2000)。Chothia 定義與 Kabat 定義類似，但Chothia定義考慮某些結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)的位置。例如，參見Chothia等，J.Mol.Biol., 196:901-17(1986) ;Chothia 等，Nature, 342:877-83 (1989)。AbM 定義使用模擬抗體結(jié)構(gòu)的計算機程序整合套件(由Oxford Molecular Group制造)。例如，參見Martin等，Proc Natl Acad Sci(USA)，86:9268-9272 (1989) ;“AbM?，A Computer Program forModeling Variable Regions of Antibodies”,Oxford, UK;Oxford Moleculare 有限公司。AbM定義使用知識數(shù)據(jù)庫與從頭算(ab initio)方法的組合自一級序列模擬抗體的三級結(jié)構(gòu)，從頭算方法如那些由 Samudrala等,“Ab Initio Protein Structure Prediction Usinga Combined Hierarchical Approach，，，PROTEINS, Structure, Function and Genetics 增刊，3:194-198(1999)所述者。接觸定義是基于對可獲得復雜晶體結(jié)構(gòu)的分析。例如，參見MacCallum 等，J.Mol.Biol.，5:732-45 (1996)。
[0101]按照慣例，通常將重鏈中的⑶R區(qū)稱為H1、H2和H3且沿自氨基端至羧基端的方向依序編號。通常將輕鏈中的CDR區(qū)稱為L1、L2和L3且沿自氨基端至羧基端的方向依序編號。
[0102]術(shù)語“輕鏈”包括全長輕鏈和其具有足量可變區(qū)序列以賦予結(jié)合特異性的片段。全長輕鏈包括可變區(qū)結(jié)構(gòu)域VL和恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域CL。輕鏈的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域是位于多肽的氨基端處。輕鏈包括K鏈和λ鏈。
[0103]術(shù)語“重鏈”包括全長重鏈和其具有足量可變區(qū)序列以賦予結(jié)合特異性的片段。全長重鏈包括可變區(qū)結(jié)構(gòu)域VH和三個恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域(CH1、CH2和CH3)。VH結(jié)構(gòu)域是位于多肽的氨基端處，且CH結(jié)構(gòu)域是位于羧基端處，其中CH3最靠近多肽的羧基端。重鏈可具有任何同種型，包括IgG (包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4亞型)、IgA (包括IgAl和IgA2亞型)、IgM 和 IgE0 [0104]當認為抗體結(jié)合指定殘基內(nèi)(例如Dkk-1內(nèi))的表位時,舉例來說,這意指所述抗體特異性結(jié)合由指定殘基(例如，Dkk-1的指定區(qū)段)組成的多肽。這一抗體不一定接觸Dkk-1內(nèi)的每一殘基。Dkk-1內(nèi)的每一單一氨基酸取代或缺失也不一定顯著影響結(jié)合親和力?？贵w的表位特異性可以多種方式來確定。舉例來說，一種方法涉及測試一批約15個氨基酸的重疊肽，其涵蓋Dkk-1的序列且相差小數(shù)目的氨基酸的增量(例如，3個氨基酸)。將所述肽固定于微量滴定盤的孔內(nèi)。固定可通過將肽的一端生物素化來實現(xiàn)。任選地，相同肽的不同試樣可于N端和C端處進行生物素化且出于比較目的固定于單獨孔中。此可用于鑒別末端特異性抗體。任選地，可包括端接所關(guān)注特定氨基酸處的其它肽。此方法可用于鑒別針對Dkk-1的內(nèi)部片段的末端特異性抗體。針對與各種肽中的每一者的特異性結(jié)合來篩選抗體或免疫學功能片段。表位定義為帶有抗體顯示特異性結(jié)合的所有肽所共有的氨基酸區(qū)段。
[0105]也提供結(jié)合位于Dkk-1的羧基端部分中的構(gòu)象表位的抗體和其功能片段以用于本發(fā)明的雙特異性分子。Dkk-1的羧基端含有幾個半胱氨酸殘基，所述殘基形成產(chǎn)生幾個環(huán)的二硫鍵簇。本發(fā)明提供用于本發(fā)明的雙特異性分子中的抗體，其結(jié)合所述環(huán)中的二者，由此中和Dkk-1抑制Wnt活性的能力。用于本發(fā)明的雙特異性分子中能夠結(jié)合上述構(gòu)象表位的示例性抗體是單克隆抗體11H10和1F11，各包含輕鏈和重鏈。用于本發(fā)明的雙特異性分子中的其它實例可見于2010年10月27日申請的美國專利申請?zhí)?1/407，128和2011年10月27日申請的國際專利申請?zhí)朠CT/US 2011/058025。包含所述兩個環(huán)的表位是由SEQID NO: 190的半胱氨酸殘基220與237之間和SEQ ID NO: 190的半胱氨酸殘基245與263之間的二硫鍵形成。因此，形成所述表位的兩個環(huán)體包括SEQ ID NO: 190的氨基酸221-236和246-262。所述環(huán)內(nèi)參與結(jié)合的區(qū)段包括SEQ ID NO: 190的氨基酸221-229和SEQ IDNO: 190的氨基酸246-253。因此，本文所提供用于本發(fā)明的雙特異性分子中的某些抗體和片段特異性結(jié)合上述區(qū)。舉例來說，一些所述抗體和片段結(jié)合包含SEQ ID N0:190的氨基酸221至262或由其組成的肽。
[0106]競每杭體
[0107]也提供可用于本發(fā)明雙特異性結(jié)合分子中的抗體和其免疫功能片段，其與所例示抗體或功能片段中的一者競爭與Dkk-1或硬化蛋白的特異性結(jié)合。這些抗體和片段也可與所例示抗體中的一者結(jié)合相同表位。預期與所例示抗體或片段競爭或結(jié)合相同表位的抗體和片段顯示類似功能性質(zhì)。例示所抗體和片段包括本文所述者，包括本文列出的具有重鏈和輕鏈、可變區(qū)結(jié)構(gòu)域和CDR者。在具體實施方案中，本發(fā)明涵蓋雙特異性結(jié)合分子，例如所提供的DVD-1g(例如本發(fā)明的SEQ ID NO 17-92)，其包含所提供抗體的VH和VL，和與所述雙特異性結(jié)合分子競爭結(jié)合的結(jié)合分子。結(jié)合競爭可以是針對DKK-1和/或硬化蛋白。競爭測定(例如Biacore測定)為本領(lǐng)域中所熟知。[0108]每一個別免疫球蛋白鏈通常是由若干“免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域”構(gòu)成，每一者由90個至110個左右氨基酸組成且具有特有折疊模式。所述結(jié)構(gòu)域是構(gòu)成抗體多肽的基本單元。在人中，IgA和IgD同種型含有4條重鏈和4條輕鏈；IgG和IgE同種型含有兩條重鏈和兩條輕鏈；且IgM同種型含有5條重鏈和5條輕鏈。重鏈C區(qū)通常包含一個或多個可負責作用功能的結(jié)構(gòu)域。重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的數(shù)目將取決于同種型。舉例來說，IgG重鏈含有稱為CH1、CH2和CH3的3個C區(qū)結(jié)構(gòu)域。提供用于本發(fā)明的雙特異性分子中的抗體可具有所述同種型和亞型中的任一者。
[0109]術(shù)語“可變區(qū)”或“可變結(jié)構(gòu)域”是指抗體的輕鏈和/或重鏈的一部分，通常包括重鏈中的約120個至130個氨基端氨基酸和輕鏈中的約100個至110個氨基端氨基酸。在某些實施方案中，不同抗體的可變區(qū)的氨基酸序列即使在相同物種的抗體之間也有廣泛不同?？贵w的可變區(qū)通常決定特定抗體對其靶標的特異性。
[0110]術(shù)語“中和抗原結(jié)合蛋白”或“中和抗體”分別是指結(jié)合配體且防止或降低所述配體的生物學作用的用于本發(fā)明的雙特異性分子中的抗原結(jié)合蛋白或抗體。這可通過(例如)直接阻斷配體上的結(jié)合位點或通過結(jié)合配體且經(jīng)由間接手段(例如配體中的結(jié)構(gòu)或能量改變)改變配體的結(jié)合能力來達成。在一些實施方案中，所述術(shù)語也可表示防止所結(jié)合的蛋白實施生物學功能的抗原結(jié)合蛋白。在評估抗原結(jié)合蛋白(例如，抗體或其免疫學功能片段)的結(jié)合和/或特異性中，當過量抗體將結(jié)合配體的結(jié)合伴侶的量減少至少約1-20、20-30%、30-40%、40-50%、50-60%、60-70%、70-80%、80-85%、85-90%、90-95%、95-97%、97-98%、98-99%或更多(如體外競爭性結(jié)合分析中所測量)時，抗體或片段可實質(zhì)上抑制配體與其結(jié)合伴侶的結(jié)合。在一些實施方案中，中和能力是經(jīng)由競爭測定來表征和/或描述。在一些實施方案中，中和能力是按照IC5tl或EC5tl值來描述。
[0111]在某些實施方案中， 提供用于本發(fā)明的雙特異性分子中的抗體與硬化蛋白或Dkk-1的結(jié)合親和力(Ka)是至少IO4或105/M x秒，如通過本領(lǐng)域中所熟知的技術(shù)(例如Biacore或KinExA)所測量。其它抗體的Ka是至少106/M x秒、107/M x秒、108/M x秒或109/M X秒。所提供的某些抗體具有低解離速率。舉例來說，一些抗體的Koff是Ixl0_4s-1、IxKT5S-1或更低。
[0112]單克隆抗體可使用本領(lǐng)域中已知的任何技術(shù)來產(chǎn)生，例如通過在免疫方案完成后自轉(zhuǎn)基因動物收獲的脾細胞永生化來產(chǎn)生。可使用本領(lǐng)域中已知的任何技術(shù)使脾細胞永生化,例如通過將其與骨髓瘤細胞融合來產(chǎn)生雜交瘤。用于產(chǎn)生雜交瘤的融合程序中的骨髓瘤細胞優(yōu)選地不產(chǎn)生抗體，其具有高融合效率，且具有使其不能在某些僅支持期望融合細胞(雜交瘤)生長的選擇性培養(yǎng)基中生長的酶缺陷。用于小鼠融合中的適宜細胞系的實例包括 Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63_Ag8.653、NS1/1.Ag41、Sp210_Agl4、F0、NSO/U、MPC-1U MPC11-X45-GTG1.7和S194/5XX0 Bul ;用于大鼠融合的細胞系的實例包括R210.RCY3、Y3-Agl.2.3、IR983F 和 4B210。可用于細胞融合的其它細胞系是 U-266、GM1500_GRG2、LICR-L0N-HMy2 和 UC729-6。
[0113]在一些情形下，雜交瘤細胞系是通過以下方式來產(chǎn)生:用Dkk-1免疫原對動物(例如具有人免疫球蛋白序列的轉(zhuǎn)基因動物)進行免疫；自免疫動物收獲脾細胞；將所收獲脾細胞與骨髓瘤細胞系融合，由此產(chǎn)生雜交瘤細胞；自雜交瘤細胞建立雜交瘤細胞系，且鑒別產(chǎn)生可結(jié)合Dkk-1多肽的抗體的雜交瘤細胞系。這些雜交瘤細胞系和通過其產(chǎn)生的抗Dkk-1單克隆抗體涵蓋于本發(fā)明中。
[0114]由雜交瘤細胞系分泌的單克隆抗體可使用抗體技術(shù)內(nèi)已知的任何有用技術(shù)來純化。雜交瘤或mAb可進行進一步篩選以鑒別具有特定性質(zhì)(例如阻斷Wnt誘導的活性的能力)的mAb。這些篩選的實例提供于下文實例中。
[0115]也提供基于上述序列的嵌合和人源化抗體。用作治療劑的單克隆抗體在使用前可以各種方式來修飾。一個實例是“嵌合”抗體，其是由來自不同抗體的蛋白區(qū)段構(gòu)成的抗體，所述區(qū)段經(jīng)過共價接合以產(chǎn)生功能性免疫球蛋白輕鏈或重鏈或其免疫學功能部分。通常，重鏈和/或輕鏈的一部分與源自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的對應(yīng)序列一致或同源，而所述鏈的其余部分與源自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的對應(yīng)序列一致或同源。關(guān)于與嵌合抗體有關(guān)的方法，例如，參見美國專利號4，816, 567 ；和 Morrison 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 81:6851-6855(1985)。CDR 移植描述于(例如)美國專利號 6，180，370,5, 693，762,5, 693，761,5, 585，089 和 5，530，101 中。
[0116]通常，制備嵌合抗體的目標是產(chǎn)生使來自預期患者物種的氨基酸的數(shù)目最大化的嵌合體。一個實例是“CDR-移植”抗體，其中所述抗體包含來自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的一個或多個互補決定區(qū)(CDR)，而所述抗體鏈的其余部分與源自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體的對應(yīng)序列一致或同源。對于在人中的應(yīng)用來說，經(jīng)常將來自嚙齒類動物抗體的V區(qū)或所選CDR移植至人抗體中，以置換人抗體的天然V區(qū)或CDR。
[0117]一種有用類型的嵌合抗體是“人源化”抗體。通常，人源化抗體是自初始在非人動物中培育的單克隆抗體產(chǎn)生。此單克隆抗體中的通常來自抗體的非抗原識別部分的某些氨基酸殘基經(jīng)過修飾以與對應(yīng)同種型的人抗體中的對應(yīng)殘基同源。人源化可(例如)使用各種方法通過用嚙齒類動物可變區(qū)的至少一部分取代人抗體的對應(yīng)區(qū)來實施(例如，參見美國專利號 5，585，089 和 5，693，762 Jones 等，1986, Nature 321:522-25 ；Riechmann 等，1988, Nature 332:323-27 ;Verhoeyen 等，1988，Science 239:1534-36)。在某些實施方案中，來自除人以外的物種的恒定區(qū)可連同人可變區(qū)使用以產(chǎn)生雜交抗體。
[0118]也提供完全人抗體。多種方法可用于制備對給定抗原具有特異性的完全人抗體，而不使人暴露至所述抗原(“完全人抗體”)。實施完全人抗體的產(chǎn)生的一種手段是小鼠體液免疫系統(tǒng)的“人源化”。將人免疫球蛋白(Ig)基因座引入內(nèi)源性Ig基因已去活的小鼠中是在小鼠(即可用任何期望抗原進行免疫的動物)中產(chǎn)生完全人單克隆抗體(MAb)的一種手段。使用完全人抗體可使有時可通過將小鼠Mab或小鼠衍生Mab作為治療劑施用給人而引起的免疫原性和過敏反應(yīng)最小化。
[0119]完全人抗體可通過對能夠在內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生不存在下產(chǎn)生人抗體譜系的轉(zhuǎn)基因動物(通常為小鼠)進行免疫來產(chǎn)生。用于此目的的抗原通常具有6個或更多個鄰接氨基酸且任選地偶聯(lián)至載體，例如半抗原。例如，參見Jakobovits等，1993, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90:2551-2555 ;Jakobovits 等，1993, Nature 362:255-258 ;和 Bruggermann等，1993，Year in Immunol.7:33。在這一方法的一個實例中，轉(zhuǎn)基因動物是通過以下方式來產(chǎn)生:使其中編碼小鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈的內(nèi)源性小鼠免疫球蛋白基因座失能且向小鼠基因組中插入含有編碼人重鏈和輕鏈蛋白的基因座的人基因組DNA的大片段。然后將具有人免疫球蛋白基因座的不完全補體的部分修飾動物雜交以獲得具有所有期望免疫系統(tǒng)修飾的動物。當施用免疫原時，所述轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)生對免疫原具有免疫特異性但具有人而非鼠類氨基酸序列的抗體(包括可變區(qū))。關(guān)于此方法的其它詳情參見(例如)WO 96/33735和WO 94/02602。與制備人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠有關(guān)的其它方法描述于美國專利號 5，545，807,6, 713，610,6, 673，986,6, 162，963,5, 545，807,6, 300，129,6, 255，458、5，877，397,5, 874，299 和 5，545，806 ；PCT 公布 WO 91/1074UW0 90/04036 和 EP 546073B1和 EP 546073A1 中 。
[0120]上述轉(zhuǎn)基因小鼠(本文中稱為“HuMab”小鼠)含有編碼未重排人重鏈(μ和Y)和K輕鏈免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因微小基因座以及使內(nèi)源性μ和.K.鏈基因座去活的靶向突變(Lonberg等，1994，Nature 368:856-859)。因此，小鼠展現(xiàn)降低的小鼠IgM或.κ.的表達和對免疫的反應(yīng)，且引入的人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換和體細胞突變以產(chǎn)生高親和力人IgG.κ.單克隆抗體(Lonberg等，見上文；Lonberg和Huszar, 1995, Intern.Rev.Tmmunol., 13:65-93;Harding 和 Lonberg, 1995, Ann.N.Y Acad.Sci764:536-546)。HuMab小鼠的制備詳細地描述于以下文獻中=Taylor等，1992，NucleicAcids Research, 20:6287-6295 ;Chen 等，1993，International Immunology5:647-656 ；Tuaillon 等，1994，J.1mmunol.152: 2912-2920 ;Lonberg 等，1994，Nature 368:856-859 ；Lonberg, 1994,Handbook of Exp.Pharmacology 113:49-101 ;Taylor 等，1994,International Immunology 6:579-591 ;Lonberg 和 Huszar, 1995，Intern.Rev.Tmmunol.13:65-93 ;Harding和 Lonberg, 1995, Ann.N.Y Acad.Sc1.764:536-546 ；Fishwild等，1996，Nature Biotechnology 14:845-851。進一步參見美國專利號 5，545，806、5，569，825、5，625，126、5，633，425、5，789，650、5，877，397、5，661，016、5，814，318、5，874，299 和 5，770, 429 以及美國專利號 5，545，807 ;國際公布號 WO 93/1227、WO92/22646和WO 92/03918。用于在所述轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生人抗體的技術(shù)也公開于WO98/24893 和 Mendez 等，1997，Nature Genetics 15:146-156 中。舉例來說，可使用 HC07 和HC012轉(zhuǎn)基因小鼠品系來產(chǎn)生適用于本文的結(jié)合劑。
[0121]使用雜交瘤技術(shù)，可自轉(zhuǎn)基因小鼠(例如那些上文所述者)產(chǎn)生并選擇具有期望特異性的抗原特異性人MAb?？墒褂眠m宜載體和宿主細胞來克隆和表達這些抗體，或可自培養(yǎng)的雜交瘤細胞收獲抗體。
[0122]完全人抗體也可衍生自曬菌體展不文庫(如Hoogenboom等，1991, J.Mol.Biol.227:381 ;和Marks等，1991，J.Mol.Biol.222:581中所公開)。噬菌體展示技術(shù)經(jīng)由以下方式來模擬免疫選擇:在絲狀噬菌體的表面上展示抗體譜系且隨后通過其與所選抗原的結(jié)合來選擇噬菌體。一種此類技術(shù)描述于PCT公布號WO 99/10494中，其描述使用這一方法來分離MPL-受體和msk-受體的高親和力和功能性拮抗抗體。
[0123]本文提供的雙特異性分子也可阻斷或減少硬化蛋白和/或Dkk-1與LRP5和/或LRP6之間的結(jié)合，由此刺激至少一種與Wnt信號傳導相關(guān)的活性。
[0124]也提供用于產(chǎn)生抗體和選擇性結(jié)合劑的核酸分子、載體和宿主細胞。某些雙特異性分子或片段包括表1中列出的I個、2個、3個、4個、5個或所有6個抗硬化蛋白或抗DKK-1抗體⑶R，且在某些實施方案中，雙特異性結(jié)合分子將包含總共12個⑶R (6個來自VH且6個來自VL)。
[0125]也提供包括上述雙特異性分子和片段中的任一者的藥物組合物。這些組合物通常也包括緩沖劑、藥學上可接受的稀釋劑、載劑、增溶劑、乳化劑或防腐劑。也提供上述抗體和片段在藥物組合物或藥劑的制備中的用途。
[0126]變異體
[0127]允許用于本發(fā)明的雙特異性分子中的抗體或片段中的一些是上文所公開抗體和片段的變異體形式(例如，那些具有表1中列出的序列者)。舉例來說，抗體或片段中的一些是在表1中列出的一個或多個重鏈或輕鏈可變區(qū)或CDR中具有一個或多個保守氨基酸取代者。
[0128]可基于共同側(cè)鏈性質(zhì)將天然氨基酸分成以下類別:1)疏水性:正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、He ；2)中性親水性:Cys、Ser> Thr> Asn、Gln ；3)酸性:Asp、Glu ；4)堿性:His、Lys> Arg ；5)影響鏈取向的殘基:Gly、Pro ;和6)芳香性:Trp、Tyr> Phe。保守氨基酸取代可涉及用相同類別的另一成員交換所述類別中一者的一個成員。保守氨基酸取代可涵蓋非天然氨基酸殘基，其通常是通過化學肽合成而非在生物系統(tǒng)中合成來納入。所述殘基包括擬肽和氨基酸部分的其它反轉(zhuǎn)或倒置形式。
[0129]非保守取代可涉及用上述類別中一者的一個成員交換另一類別的一個成員?？蓪⑦@些取代殘基引入與人對應(yīng)序列同源的區(qū)中，或引入所述分子的非同源區(qū)中。
[0130]在進行這些改變時，根據(jù)某些實施方案，可考慮氨基酸的親水性指數(shù)(hydropathic index)。蛋白的親水性曲線是通過對每一氨基酸指配一數(shù)值(“親水性指數(shù)”)且隨后沿肽鏈重復地對所述值取平均值來計算。每一氨基酸已基于其疏水性和電荷特性指配親水性指數(shù)。其是:異亮氨酸(+4.5);纈氨酸(+4.2);亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/胱氨酸(+2.5);甲硫氨酸(+1.9);丙氨酸(+1.8);甘氨酸(-0.4);蘇氨酸(-0.7);絲氨酸(-0.8);色氨酸(-0.9);酪氨酸(-1.3);脯氨酸(-1.6);組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5);谷氨酰胺(-3.5);天冬氨酸(-3.5);天冬酰胺(-3.5);賴氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。
[0131]本領(lǐng)域中理解親水性曲線在對蛋白賦予交互生物學功能上的重要性(例如，參見Kyte等，1982，J.Mol.Biol.157:105-131)。已知可將某些氨基酸取代為具有類似親水性指數(shù)或分數(shù)的其它氨基酸且其仍保持類似生物學活性。在基于親水性指數(shù)進行改變時，在某些實施方案中，包括親水性指數(shù)在+/-2內(nèi)的氨基酸的取代。在本發(fā)明的一些方面中，包括那些在+/-1內(nèi)者，且在本發(fā)明的其它方面中，包括那些在+/-0.5內(nèi)者。
[0132]本領(lǐng)域中也理解，同樣氨基酸的取代可基于親水性有效地進行，尤其在由此產(chǎn)生的生物學功能蛋白或肽意欲用于免疫學實施方案中時，如在本情形下。在某些實施方案中，蛋白的最大局部平均親水性(如通過其毗鄰氨基酸的親水性所控制)與其免疫原性和抗原結(jié)合或免疫原性(即與蛋白的生物學性質(zhì))相關(guān)聯(lián)。
[0133]已將以下親水性值指配給所述氨基酸殘基:精氨酸(+3.0);賴氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0+/-1);谷氨酸(+3.0+/-1);絲氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(O);蘇氨酸(-0.4);脯氨酸(-0.5+/-1);丙氨酸(-0.5);組氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);纈氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);異亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在基于類似親水性值進行改變時，在某些實施方案中，包括親水性值在+/-2內(nèi)的氨基酸的取代，在其它實施方案中，包括那些在+/-1內(nèi)者，且在其它實施方案中，包括那些在+/-0.5內(nèi)者。在一些情形下，也可基于親水性鑒別來自一級氨基酸序列的表位。所述區(qū)也稱為“表位核心區(qū)”。[0134]本領(lǐng)域的技術(shù)人員將能使用常規(guī)技術(shù)來確定本文所述多肽的適宜變異體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可通過靶向據(jù)信對活性不重要的區(qū)域來鑒別分子中可進行改變而不破壞活性的適宜區(qū)域。本領(lǐng)域的技術(shù)人員也應(yīng)能夠鑒別分子中在類似多肽之間保守的殘基和部分。在其它實施方案中，甚至可使可能對生物活性或結(jié)構(gòu)重要的區(qū)域經(jīng)受保守的氨基酸取代，而不會破壞生物學活性或不會不利地影響多肽結(jié)構(gòu)。
[0135]另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可回顧鑒別類似多肽中對活性或結(jié)構(gòu)重要的殘基的結(jié)構(gòu)-功能研究。根據(jù)這一比較，可預測蛋白中與相似蛋白中對活性或結(jié)構(gòu)重要的氨基酸殘基對應(yīng)的氨基酸殘基的重要性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可選擇化學上類似的氨基酸取代用于這些預測的重要氨基酸殘基。
[0136]已有多個科學出版物致力于對二級結(jié)構(gòu)的預測。參見Moult, 1996，Curr.0p.， Biotech.7:422-427 ；Chou 等，1974，Biochemistryl3:222_245 ；Chou 等，1974,Biochemistryl13:211-222 ；Chou 等，1978，Adv.Enzymo1.ReIat.Areas Mol.Biol.47:45-148 ;Chou 等，1979，Ann.Rev.Biochem.47:251-276 ;和 Chou 等，1979，Biophys.J.26:367-384。然而，當前可使用計算機程序來輔助預測二級結(jié)構(gòu)。預測二級結(jié)構(gòu)的一種方法是基于同源性建模。舉例來說，序列一致性大于30%或相似度大于40%的兩個多肽或蛋白質(zhì)經(jīng)常具有相似的結(jié)構(gòu)`形態(tài)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(TOB)最新進展已增強對二級結(jié)構(gòu)的可預測性，包括多肽或蛋白結(jié)構(gòu)中的潛在折疊數(shù)目。參見Holm等，1999，Nucl.Acid.Res.27:244-247ο 有人提出(Brenner 等，1997，Curr.0p.Struct.Biol.7:369-376)，給定多肽或蛋白中的折疊數(shù)目有限，且一旦解析出結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵數(shù)目，即可更顯著地提高結(jié)構(gòu)預測的準確性。
[0137]預測二級結(jié)構(gòu)的其它方法包括“線串(threading)” (Jones, 1997, Curr.0pin.Struct.Biol.7:377-87 ；Sippl 等，1996，Structured:: 15-19)、“ 曲線分析”(Bowie 等，1991，Science253:164-170 ；Gribskov 等，1990，Meth.Enzym.183:146-159 ；Gribskov 等，1987, Proc.Nat.Acad.Sc1.84:4355-4358)以及“進化連接(evolutionary linkage)”(參見 Holm, 1999，見上文；和 Brenner, 1997，見上文)。
[0138]在本發(fā)明的一些實施方案中，進行如下氨基酸取代:其⑴降低對蛋白水解的敏感性，(2)降低對氧化的敏感性，(3)改變形成蛋白復合物的結(jié)合親和力，(4)改變配體或抗原結(jié)合親和力，和/或(4)賦予或改進這些多肽的其它物理化學或功能性質(zhì)。舉例來說，可在天然序列中進行單一或多個氨基酸取代(在某些實施方案中，保守氨基酸取代)?？稍诳贵w中位于形成分子間接觸的結(jié)構(gòu)域外側(cè)的所述部分中進行取代。在這些實施方案中，可使用不會實質(zhì)上改變親本序列的結(jié)構(gòu)特性的保守氨基酸取代(例如，不會擾亂表征親本或天然抗體的二級結(jié)構(gòu)的一個或多個置換氨基酸)。本領(lǐng)域中公認的多肽二級和三級結(jié)構(gòu)的實例描述于 Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton 編著)，I984，W.H.New York:Freeman and Company ；Introduction to Protein Structure(Branden 和Tooze 編著)，1991, New York:Garland Publishing ;和 Thornton 等，1991, Nature354:105中，所述文獻各自以引用方式并入本文。
[0139]本發(fā)明也涵蓋與親本多肽的氨基酸序列相比糖基化位點的數(shù)目和/或類型已經(jīng)改變的本發(fā)明的雙特異性分子的糖基化變異體。在某些實施方案中，抗體蛋白變異體包含數(shù)目大于或小于天然抗體的N-連接糖基化位點。N-連接糖基化位點的特征在于以下序列:Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中指定為X的氨基酸殘基可以是除脯氨酸以外的任何氨基酸殘基。產(chǎn)生此序列的氨基酸殘基的取代為N-連接碳水化合物鏈的添加提供潛在新位點。或者，消除或改變此序列的取代將防止存在于天然多肽中的N-連接碳水化合物鏈的添加。舉例來說，可通過Asn的缺失或通過用不同氨基酸取代Asn來減少糖基化。在其它實施方案中，產(chǎn)生一個或多個新N-連接位點。抗體通常在Fe區(qū)中具有N-連接糖基化位點。
[0140]其它變異體包括半胱氨酸變異體，其中親本或天然氨基酸序列中的一個或多個半胱氨酸殘基自另一氨基酸(例如，絲氨酸)缺失或被其取代。半胱氨酸變異體尤其在抗體必須再折疊成生物學活性構(gòu)形時有用。半胱氨酸變異體中的半胱氨酸殘基可少于天然抗體，且通常具有偶數(shù)數(shù)目以使非成對半胱氨酸所致的相互作用最小化。
[0141]也提供基于本文所述可變區(qū)結(jié)構(gòu)域和⑶R的模擬物(例如，“肽模擬物”或“擬肽”)。所述類似物可為肽、非肽或肽與非肽區(qū)的組合。Fauchere，1986，Adv.DrugRes.15:29 ；Veber 和 Freidinger, 1985，TINS 第 392 頁；和 Evans 等，1987，J.Med.Chem.30:1229，所述文獻出于任何目的以引用方式并入本文?？墒褂迷诮Y(jié)構(gòu)上與在治療上有用的多肽相類似的肽模擬物來產(chǎn)生類似治療性或預防性作用。經(jīng)常借助計算機化分子建模來研發(fā)這些化合物。通常，`本發(fā)明擬肽是在結(jié)構(gòu)上與展示期望的生物學活性(例如此處能夠特異性結(jié)合Dkk-1)的抗體類似，但具有一個或多個任選地通過本領(lǐng)域中熟知方法由選自以下的連接置換的肽連接的蛋白:一CH2NH—、一CH2S—、一CH2—CH.2—、—CH-CH-(順和反)、一C0CH2—、-CH(OH) CH2—和一CH2S0—。用相同類型的D-氨基酸系統(tǒng)性取代共有序列的一個或多個氨基酸(例如，D-賴氨酸置換L-賴氨酸)可在本發(fā)明的某些實施方案中用于產(chǎn)生更穩(wěn)定的蛋白。另外，包含共有序列或?qū)嵸|(zhì)上一致的共有序列的限制性肽變化可通過本領(lǐng)域中已知的方法來產(chǎn)生(Rizo和Gierasch, 1992, Ann.Rev.Biochem.61:387,以引用方式并入本文)；舉例來說，通過添加能夠形成可使肽環(huán)化的分子內(nèi)二硫橋鍵的內(nèi)部半胱氨酸殘基。
[0142]也提供用于本文所述本發(fā)明的雙特異性分子中的抗體和片段的衍生物。衍生抗體或片段可包含賦予抗體或片段期望性質(zhì)(例如在特定應(yīng)用中延長半衰期)的任何分子或物質(zhì)。衍生抗體可包含(例如)可檢測(或標記)部分(例如，放射性、比色、抗原或酶促分子、可檢測珠粒(例如磁性或電子致密(例如,金)珠粒)或結(jié)合另一分子(例如,生物素或抗生蛋白鏈菌素(streptavidin)的分子))、治療性或診斷性部分(例如，放射性、細胞毒性或藥用活性部分)或增加抗體對于特定應(yīng)用(例如，施用給個體，例如人個體，或其它體內(nèi)或體外應(yīng)用)的適宜性的分子。可用于衍生抗體的分子的實例包括白蛋白(例如，人血清白蛋白)和聚乙二醇(PEG)。連接白蛋白且聚乙二醇化的抗體衍生物可使用本領(lǐng)域中的熟知技術(shù)來制備。在一個實施方案中，抗體是偶聯(lián)或以其它方式連接至轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(transthyretin) (TTR)或TTR變異體。TTR或TTR變異體可經(jīng)過(例如)選自由以下組成的組的化學品化學修飾:葡聚糖、聚(η-乙烯基吡咯烷酮)、聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇和聚乙烯醇。
[0143]其它衍生物包括雙特異性分子或其片段與其它蛋白或多肽的共價或聚集偶聯(lián)物，例如通過表達包含融合至雙特異性分子多肽的N端或C端的異源多肽的重組融合蛋白。舉例來說，偶聯(lián)肽可為異源信號(或前導序列)多肽(例如，酵母α因子前導序列)或如表位標簽等肽。含有雙特異性分子的融合蛋白可包含被添加以促進分子的純化或鑒別的肽(例如聚His)。也可將雙特異性分子多肽連接至FLAG肽，如Hopp等，Bio/Technology6:1204, 1988和美國專利號5,011,912中所述。FLAG肽具有高抗原性且提供由特異性單克隆抗體(mAb)可逆結(jié)合的表位，從而使得能夠快速分析和便捷地純化所表達的重組蛋白?？捎糜谥苽涫笷LAG肽融合至給定多肽的融合蛋白的試劑可自市面購得(Sigma, St.Louis, M0.)。
[0144]本文所用術(shù)語“Fe多肽”包括衍生自抗體Fe區(qū)的多肽的天然和突變蛋白形式。也包括這些多肽的含有可促進二聚化的鉸鏈區(qū)的截短形式。包含F(xiàn)e部分(和自其形成的寡聚體)的融合蛋白提供可在蛋白A或蛋白G管柱上通過親和色譜便捷地純化的優(yōu)點。
[0145]描述于PCT申請WO 93/10151和美國專利號5，426，048和5，262,522(其中每一者以引用方式并入本文)中的一種適宜Fe多肽是自人IgGl抗體Fe區(qū)的N端鉸鏈區(qū)延伸至天然C端的單鏈多肽。另一有用Fe多肽是美國專利號5，457，035和Baum等，1994，EMBOJ.13:3992-4001中所述的Fe突變蛋白。此突變蛋白的氨基酸序列與WO 93/10151中所呈現(xiàn)的天然Fe序列一致，只是氨基酸19已自Leu變?yōu)锳la，氨基酸20已自Leu變?yōu)镚lu，且氨基酸22已自Gly變?yōu)锳la。突變蛋白所展現(xiàn)針對Fe受體的親和力降低。
[0146]在其它實施方案中，可用如本文所公開的雙特異性分子的重鏈和/或輕鏈的可變部分取代抗體重鏈和/或輕鏈的可變部分。
[0147]或者，寡聚體是包含多個雙特異性分子多肽且具有或不具有肽接頭(間隔肽)的融合蛋白。適宜的肽接頭包括那些描述于美國專利號4，751，180和4，935，233中者。
[0148]制備寡聚雙特異性分子衍生物的另一方法涉及使用亮氨酸拉鏈。亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域是促進發(fā)現(xiàn)所述結(jié)構(gòu)域的蛋白寡聚化的肽。亮氨酸拉鏈最初是在若干種DNA-結(jié)合蛋白中鑒別出來的(Landsch ulz等，1988, Science240:1759),且此后發(fā)現(xiàn)其存于多種不同蛋白中。已知亮氨酸拉鏈包括二聚化或三聚化的天然肽和其衍生物。適于產(chǎn)生可溶性寡聚蛋白的亮氨酸拉鏈接構(gòu)域的實例描述于PCT申請WO 94/10308中，且衍生自肺表面活性蛋白D(SPD)的亮氨酸拉鏈描述于Hoppe等，1994，F(xiàn)EBS Letters344:191中，其以引用方式并入本文。修飾亮氨酸拉鏈的使用允許與其融合的異源蛋白進行穩(wěn)定三聚化，此描述于Fanslow等，1994，Semin.1mmunol.6:267-78中。在一種方法中，在適宜宿主細胞中表達包含融合至亮氨酸拉鏈肽的雙特異性分子片段或衍生物的重組融合蛋白，且自培養(yǎng)物上清液回收形成的可溶性寡聚雙特異性分子片段或衍生物。
[0149]在另一方面中，本發(fā)明提供具有至少I天的體外或體內(nèi)(例如，當施用給人個體時)半衰期的雙特異性分子。在一個實施方案中，抗體具有至少3天的半衰期。在另一實施方案中，抗體或其一部分具有4天或更長的半衰期。在另一實施方案中，抗體或其一部分具有8天或更長的半衰期。在另一實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部分經(jīng)過衍生或修飾以使其與未衍生或未修飾的抗體相比具有更長的半衰期。在另一實施方案中，抗體可含有點突變以延長血清半衰期，如WO 00/09560中所述。
[0150]也提供編碼本發(fā)明雙特異性分子的多肽鏈或其片段、衍生物、突變蛋白或變異體的核酸、足以用作鑒別、分析、突變或擴增編碼多肽的多核苷酸的雜交探針、PCR引物或測序引物的多核苷酸、抑制多核苷酸表達的反義核酸和上述的互補序列。核酸可具有任何長度。其長度可為(例如)5個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、75個、100 個、125 個、150 個、175 個、200 個、250 個、300 個、350 個、400 個、450 個、500 個、750 個、1，OOO個、I, 500個、3，000個、5，000個或更多個核苷酸，和/或可包含一個或多個另外的序
列(例如調(diào)控序列)，和/或為較大核酸(例如載體)的一部分。核酸可為單鏈或雙鏈核酸且可包含RNA和/或DNA核苷酸以及其人工變異體(例如肽核酸)。
[0151]可自已用Dkk-1或硬化蛋白或其免疫原性片段免疫的小鼠B細胞分離編碼抗體多肽(例如重鏈或輕鏈、僅可變結(jié)構(gòu)域、或全長)的DNA。可通過如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)等常用程序來分離DNA。噬菌體展示是可制備抗體的衍生物的已知技術(shù)的另一實例。在一種方法中，為所關(guān)注抗體的組分的多肽是在任何適宜重組表達系統(tǒng)中表達，且使所表達多肽組裝以形成抗體分子 。
[0152]本發(fā)明進一步提供在特定雜交條件下與其它核酸雜交的核酸。雜交核酸的方法為本領(lǐng)域中所熟知。例如，參見 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。如本文所定義，中等嚴謹雜交條件使用含有5X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)、0.5%SDS、1.0mM EDTA (pH8.0)的預洗溶液、含有約50%甲酰胺、6 X SSC的雜交緩沖液和55°C的雜交溫度(或其它類似雜交溶液，例如含有約50%甲酰胺者，且雜交溫度為42°C )，且洗滌條件為60°C、0.5XSSC、0.1%SDS。嚴謹雜交條件在6 X SSC中于45°C下雜交，隨后在0.1XSSC、0.2%SDS中于68°C下洗滌一或多次。此外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可操作雜交和/或洗滌條件以提高或降低雜交嚴謹性，從而使得包含核苷酸序列彼此至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99% —致的核酸通常仍可相互雜交。
[0153]影響雜交條件選擇的基本參數(shù)和設(shè)計適宜條件的指導描述于(例如)以下文獻中:Sambrook、Fritsch和Maniatis(1989，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,第 9 章和第 11 章；和Current Protocols in Molecular Biology, 1995，Ausubel 等編著，John Wiley&Sons 公司，第2.10節(jié)和第6.3-6.4節(jié))，且可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)(例如)DNA的長度和/或堿基組成來容易地確定。
[0154]可通過突變向核酸中引入改變，由此在其所編碼多肽的氨基酸序列中產(chǎn)生改變。可使用任何本領(lǐng)域中已知的技術(shù)來引入突變。在一個實施方案中，使用(例如)定點誘變方案來改變一個或多個特定氨基酸殘基。在另一實施方案中，使用(例如)隨機誘變方案來改變一個或多個隨機選擇的殘基。無論采用何種制備方式，皆可表達突變體多肽并針對期望性質(zhì)來篩選。
[0155]可將突變引入核酸中而不顯著改變其所編碼多肽的生物學活性。舉例來說，可實施核苷酸取代，以在非必需氨基酸殘基處導致氨基酸取代?；蛘?，可向核酸中引入一個或多個突變以選擇性改變其所編碼多肽的生物學活性。舉例來說，突變可定量或定性地改變生物學活性。定量改變的實例包括增加、降低或消除活性。定性改變的實例包括改變抗體的抗原特異性。
[0156]可對本文所述重鏈和輕鏈進行保守修飾(和對編碼核酸進行對應(yīng)修飾)以產(chǎn)生具有功能和生物化學特性的雙特異性分子。達成這些修飾的方法描述于上文中。
[0157]涵蓋與本發(fā)明的雙特異性分子一起使用的單鏈抗體可通過經(jīng)由氨基酸橋鍵(短肽接頭)連接本文提供的重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(Fv區(qū))片段從而產(chǎn)生單多肽鏈來形成。這些單鏈Fv(ScFv)可通過將編碼肽接頭的DNA融合在編碼兩個可變結(jié)構(gòu)域多肽(VL和VH)的DNA之間來制備?？墒顾枚嚯淖陨碚郫B以形成抗原結(jié)合單體，或其可形成多聚體(例如二聚體、三聚體、或四聚體)，此視兩個可變結(jié)構(gòu)域之間柔性接頭的長度而定(Kortt 等，1997，Prot.Eng.10:423 ;Kortt 等，2001，Biomol.Eng.18:95-108)。通過組合包含不同VL和VH的多肽，可形成結(jié)合不同表位的多聚體scFv(Kriangkum等，2001, Biomol.Eng.18:31-40)。所研發(fā)用于產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)包括那些描述于以下文獻中者:美國專利號 4，946，778 ；Bird, 1988，Science242:423 ；Huston 等，1988，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 85:5879 ;Ward 等，1989，Nature 334:544, de Graaf 等 2002，Methods MolBiol.178:379-87。
[0158]本發(fā)明的蛋白和其功能片段可以各種方式進一步修飾。舉例來說，若欲將其用于治療目的，則將其與聚乙二醇偶聯(lián)(聚乙二醇化)以延長血清半衰期或增強蛋白遞送。或者，可將標的抗體或其片段的V區(qū)與不同抗體分子的Fe區(qū)融合。用于此目的的Fe區(qū)可進行修飾以使其不結(jié)合補體，由此降低當使用融合蛋白作為治療劑時誘導患者細胞溶解的可能性。另外，可將標的抗體或其功能片段與人血清白蛋白偶聯(lián)以延長抗體或其片段的血清半衰期。本發(fā)明抗體或其片段的另一有用融合伴侶是轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(TTR)。TTR具有形成四聚體的能力，因此抗體-TTR融合蛋白可形成可增加其結(jié)合親合力的多價抗體。`
[0159]或者，本文所述抗體和片段的功能和/或生物化學特性的實質(zhì)性修飾可通過在重鏈和輕鏈的氨基酸序列中產(chǎn)生取代來達成，所述取代在其對維持以下方面的作用上顯著不同:(a)取代區(qū)域中分子骨架的結(jié)構(gòu)，例如，呈折疊片或螺旋構(gòu)形，(b)靶位點處分子的電荷或疏水性，或(C)側(cè)鏈的體積。“保守氨基酸取代”可涉及用非天然殘基取代天然氨基酸殘基，從而使得對所述位置處的氨基酸殘基的極性或電荷具有很少影響或沒有影響。此外，多肽中的任何天然殘基也可進行丙氨酸取代，如先前已針對丙氨酸掃描誘變所述。
[0160]標的抗體的氨基酸取代(無論保守抑或非保守)可由那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過施加常規(guī)技術(shù)來實施?？墒褂冒被崛〈鷣龛b別本文所提供本發(fā)明的抗體或雙特異性分子的重要殘基，或增加或降低本發(fā)明的所述抗體或雙特異性分子與人Dkk-1或硬化蛋白的親和力或改進本文所述其它雙特異性分子的結(jié)合親和力。
[0161]表汰
[0162]雙特異性分子和功能片段可通過多種常用技術(shù)中的任一者來制備以表達表1中提供的核酸序列，或表達編碼表1中提供的氨基酸序列中的任一者的核酸序列。
[0163]舉例來說，雙特異性分子可使用本領(lǐng)域中已知的任何技術(shù)通過重組表達系統(tǒng)產(chǎn)生° 例如，參見 Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in BiologicalAnalyses, Kennet 等(編著)Plenum Press, New York(1980): and Antibodies:ALaboratory Manual, Harlow和 Lane (編著)，Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, N.Y.(1988)。
[0164]本發(fā)明的雙特異性分子可在雜交瘤細胞系中或在除雜交瘤以外的細胞系中表達?？墒褂镁幋a抗體的表達構(gòu)建體來轉(zhuǎn)化哺乳動物、昆蟲或微生物宿主細胞。轉(zhuǎn)化可使用將多核苷酸引入宿主細胞中的任何已知方法來實施，包括(例如)在病毒或噬菌體中包裝多核苷酸和通過本領(lǐng)域中已知的轉(zhuǎn)染程序用構(gòu)建體轉(zhuǎn)導宿主細胞，如由美國專利號4，399，216、4，912，040,4, 740，461和4，959，455所例示。所用最佳轉(zhuǎn)化程序?qū)⒁曀D(zhuǎn)化宿主細胞的類型而定。用于將異源多核苷酸引入哺乳動物細胞中的方法為本領(lǐng)域中所熟知且包括(但不限于)葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、聚凝胺介導的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、脂質(zhì)體中多核苷酸的囊封、混合核酸與帶正電脂質(zhì)和直接向細胞核中微注射DNA。
[0165]本發(fā)明的重組表達構(gòu)建體通常包含編碼包含以下中的一者或多者的多肽的核酸分子:重鏈恒定區(qū)(例如，CH1、CH2和/或CH3);重鏈可變區(qū)和任選地至少一個或多個重鏈可變區(qū)；輕鏈恒定區(qū)；輕鏈可變區(qū)和任選地至少兩個或更多個輕鏈可變區(qū)；雙特異性分子的輕鏈或重鏈的一個或多個CDR ;和任選地多個可變區(qū)之間的接頭序列。使用標準連接技術(shù)將所述核酸序列插入合適表達載體中。在一些實施方案中，所用載體采用使用蛋白報告物(例如二氫葉酸還原酶)的蛋白-片段互補測定(例如，參見美國專利號6，270, 964)。適宜表達載體可購自(例如)Invitrogen Life Technologies或BD Biosciences (先前為“Clontech”)。用于克隆和表達本發(fā)明的抗體和片段的其它有用載體包括那些描述于 Bianchi 和 McGrew, Biotech Biotechnol Bioeng84(4):439-44(2003)中者。其它適宜表達載體論述于(MfI^n)Methods Enzymol,第 185 卷(D.V.Goeddel 編著)，1990，NewYork:Academic Press中，其以引用方式并入本文。
[0166]通常，任何宿主細胞中所用表達載體會含有用于質(zhì)粒維持和外源核苷酸序列克隆和表達的序列。這些序列(統(tǒng)稱為“側(cè)接序列”)通常包括以下可操作連接的核苷酸序列中的一者或多者:啟動子、一個或多個增強子序列、復制起點、轉(zhuǎn)錄終止序列、含有供體和受體剪接位點的完整內(nèi)含子序列、編碼用于多肽分泌的前導序列的序列、核糖體結(jié)合位點、多腺苷酸化序列、用于插入編碼多肽的核酸以進行表達的多接頭區(qū)和可選標記物組件。
[0167]任選地，所述載體可含有“標簽”編碼序列，即，位于編碼序列的5'或3'端的寡核苷酸分子，所述寡核苷酸序列編碼聚His (例如，六His);或另一“標簽”，例如FLAG?、HA(來自流感病毒的血凝集素)或myc，存在用于所述標簽的市售抗體。標簽通常在抗體蛋白表達后與其融合，且可用作自宿主細胞親和純化抗體的手段。舉例來說，可通過管柱色譜使用針對作為親和力基質(zhì)的標簽的抗體來達成親和純化。任選地，隨后可通過各種手段(例如使用某些裂解用肽酶 )自純化抗體多肽去除標簽。
[0168]表達載體中的側(cè)接序列可以是同源(即，來自與宿主細胞相同的物種和/或品系)、異源(即，來自除宿主細胞物種或品系以外的物種)、雜交(即，來自一種以上來源的側(cè)接序列的組合)、合成或天然的。因此，側(cè)接序列的來源可為任何原核或真核有機體、任何脊椎動物或無脊椎動物有機體、或任何植物，限制條件為所述側(cè)接序列在所述宿主細胞體系中起作用且可通過所述宿主細胞體系活化。
[0169]用于本發(fā)明的載體中的側(cè)接序列可通過本領(lǐng)域中所熟知若干方法中的任一者來獲得。通常，本文中所用的側(cè)接序列已預先通過作圖和/或通過限制性內(nèi)切酶消化來確定且因此其可使用合適限制性內(nèi)切酶自適當組織來源分離。在一些情況下，可知側(cè)接序列的全核苷酸序列。在本文中，可使用用于核酸合成或克隆的本文所述方法來合成側(cè)接序列。
[0170]倘若已知所有或僅一部分側(cè)接序列時，則其可使用PCR和/或通過使用來自相同或另一物種的適宜寡核苷酸和/或側(cè)接序列片段篩選基因組文庫來獲得。倘若未知側(cè)接序列，則含有側(cè)接序列的DNA片段可自可含有(例如)編碼序列或甚至另一種或多種基因的較大片DNA分離。可通過限制性內(nèi)切酶消化達成分離以產(chǎn)生適當?shù)腄NA片段，繼而使用瓊脂糖凝膠純化、Qiagen?管柱色譜(Chatsworth, Calif.)或本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其它方法實施分離。那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)易于明了用以完成此目的的適宜酶的選擇。
[0171]復制起點通常為原核表達載體、尤其那些可購得者的一部分，并且所述起點有助于載體在宿主細胞中的擴增。若所選載體不含復制起點，則其可根據(jù)已知序列以化學方式合成并連接至所述載體中。舉例來說，質(zhì)粒pBR322 (New England Biolabs, Beverly, Mass.)的復制起點適于大多數(shù)革蘭氏陰性細菌(gram-negative bacteria)且多種起點(例如，SV40、多瘤病毒、腺病毒、水泡性口炎病毒(VSV)或乳頭瘤病毒(例如HPV或BPV))可用于哺乳動物細胞中的克隆載體。一般來說，哺乳動物表達載體不需要哺乳動物復制起點(舉例來說，經(jīng)常使用SV40起點，此僅是由于其含有早期啟動子)。
[0172]本發(fā)明的表達和克隆載體通常將含有由宿主有機體識別且可操作地連接至編碼雙特異性分子或其免疫學功能片段的核酸的啟動子。啟動子是控制結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的位于結(jié)構(gòu)基因的起始密碼子上游(即，5')的非轉(zhuǎn)錄序列(通常在約IOObp至1000bp內(nèi))。習慣上，將啟動子歸為如下兩類中的一類:誘導型啟動子和組成型啟動子。誘導型啟動子可因應(yīng)培養(yǎng)條件的一些變化(例如，存在或不存在營養(yǎng)素和溫度變化)而起始來自在其控制下的DNA的轉(zhuǎn)錄水平升高。另一方面，組成型啟動子可起始連續(xù)基因產(chǎn)物產(chǎn)生；即，對基因表達有極小或沒有實驗控制。由多種潛在宿主細胞識別的大量啟動子為本領(lǐng)域中所熟知。通過限制酶消化自來源DNA去除啟動子或通過聚合酶鏈反應(yīng)擴增啟動子并將期望啟動子序列插入載體中，將適宜啟動子可操作地連接至DNA編碼雙特異性分子。
[0173]與酵母菌宿主一起使用的適宜啟動子也為本領(lǐng)域中所熟知。酵母菌增強子有利地與酵母菌啟動子一起使用。與哺乳動物宿主細胞一起使用的適宜啟動子為本領(lǐng)域中所熟知且包括(但不限于)那些自如以下等病毒的基因組獲得者:多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如，腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、鳥類肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、B型肝炎病毒和最佳猿病毒40 (SV40)。其它適宜哺乳動物啟動子包括異源哺乳動物啟動子，例如，熱激啟動子和肌動蛋白啟動子。
[0174]用于本發(fā)明的重組表達載體實踐中的特定啟動子包括(但不限于):SV40早期啟動子區(qū)(Bemoist 和 Chambon, 1981, Nature 290:304-10)、CMV 啟動子、勞斯肉瘤病毒(Roussarcoma virus)的 3'長端重復序列中所含啟動子(Yamamoto 等，1980，Cell 22:787-97)、皰疫胸苷激酶啟動子(Wagner 等，1981, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.78:1444-45)、金屬硫蛋白基因的調(diào)控序列(Brinster等，1982，Nature 296:39-42)、如β-內(nèi)酰胺酶啟動子等原核表達載體(Villa-Kamaroff 等，1978, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.Α., 75:3727-31)或tac 啟動子(DeBoer 等，1983, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.80:21-25)。也可使用展現(xiàn)組織特異性且已用于轉(zhuǎn)基因動物中的以下動物轉(zhuǎn)錄控制區(qū):胰腺腺泡細胞中活躍的彈性蛋白酶 I 基因控制區(qū)(Swift 等，1984，Cell 38:63946 ;0rnitz 等，1986，Cold Spring HarborSymp.Quant.Biol.50:399409 ；MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515)、膜腺 β 細胞中活躍的胰島素基因控制區(qū)(Hanahan，1985, Nature 315:115-22)、睪丸、乳腺、淋巴和肥大細胞中活躍的小鼠哺乳動物腫瘤病毒控制區(qū)(Leder等，1986，Cell 45:485-95)、肝中活躍的白蛋白基因控制區(qū)(Pinkert等，1987，Genes and Devel.1:268-76)、肝中活躍的α -胎蛋白基因控制區(qū)(Krumlauf 等，1985, Mol.Cell.Biol.5:1639-48 ；Hammer 等，1987, Science235:53-58)、肝中活躍的α 1-抗胰蛋白酶基因控制區(qū)(Kelsey等，1987，Genes andDevel.1:161-71)、骨髓細胞中活躍的β-球蛋白基因控制區(qū)(Mogram等，1985，Nature315:338-40 ；Kollias等，1986，Cell 46:89-94)、腦中寡樹突細胞中活躍的髓磷脂堿性蛋白基因控制區(qū)(Readhead等，1987，CelI 48:703-12)、骨骼肌中活躍的肌凝蛋白輕鏈_2基因控制區(qū)(Sani，1985, Nature 314:283-86)、下丘腦中活躍的促性腺釋放激素基因控制區(qū)(Mason等，1986，Science 234:1372-78)和最具體來說淋巴樣細胞中活躍的免疫球蛋白基因控制區(qū)(Grosschedl 等，1984，Cell 38:647-58 ;Adames 等，1985，Nature 318:533-38 ；Alexander 等，1987, Mol.Cell Biol.7:1436-44)。
[0175]可將增強子序列插入載體中以增加編碼本發(fā)明的雙特異性分子或其免疫學功能片段的核酸在更高等真核生物中的轉(zhuǎn)錄。增強子是作用于啟動子以增加轉(zhuǎn)錄的DNA的順式作用組件，其長度通常為約10_300bp。增強子是以相對獨立的方式定向并定位。其已發(fā)現(xiàn)于轉(zhuǎn)錄單元的5'和3'。已知若干增強子序列可自哺乳動物基因(例如，珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰島素)獲得。也可使用來自病毒的增強子序列。SV40增強子、巨細胞病毒早期啟動子增強子、多瘤增強子和腺病毒增強子是用于活化真核啟動子的示例性增強組件。盡管可將增強子在核酸分子的5'位或3'位剪接至載體中，但通常將其置于啟動子的5'位點處。
[0176]在表達載體中，轉(zhuǎn)錄終止序列通常位于多肽編碼區(qū)末端的3'處且可用于終止轉(zhuǎn)錄。用于在原核細胞中表達的轉(zhuǎn)錄終止序列依序為富含G-C的片段和聚-T序列。盡管所述序列可自文庫容易地克隆或甚至作為載體的一部分購得，但其也可使用用于核酸合成的方法(例如，那些本文所述者)來容易地合成。
[0177]可選標記基因組件編碼在選擇性培養(yǎng)基中生長的宿主細胞存活和生長所需蛋白。用于表達載體中的典型選擇標記基因編碼以下蛋白:(a)賦予原核宿主細胞以抗生素或其它毒素(例如，安比西林(ampicillin)、四環(huán)素(tetracycline)、卡那霉素(kanamycin))抗性；(b)補足細胞的營養(yǎng)缺陷型不足；或(C)供給自復合培養(yǎng)基中無法獲得的關(guān)鍵營養(yǎng)素。可選標記物的實例包括卡那霉素抗性基因、安比西林抗性基因和四環(huán)素抗性基因。細菌性新霉素(neomycin)抗性基因也可用于在原核宿主細胞與真核宿主細胞二者中選擇。
[0178]可使用其它選擇基 因來擴增將表達的基因。擴增是不能以單一拷貝和高足夠水平表達以允許細胞在某些選擇條件下存活和生長的基因在連續(xù)世代重組細胞的染色體內(nèi)串聯(lián)重復的過程。哺乳動物的適宜可擴增可選標記物的實例包括二氫葉酸還原酶(DHFR)和無啟動子胸苷激酶。在所述標記物的應(yīng)用中，在選擇壓力下放置哺乳動物細胞轉(zhuǎn)化體，其中僅有所述轉(zhuǎn)化體借助存于載體中的選擇基因獨特地適于存活。通過在連接增加培養(yǎng)基中選擇劑的濃度的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細胞來施加選擇壓力，由此僅允許那些選擇基因已經(jīng)擴增的細胞存活。在所述情況下，毗鄰于選擇基因的DNA (例如編碼本發(fā)明的雙特異性分子的DNA)是與選擇基因共擴增的。
[0179]核糖體結(jié)合位點通常為mRNA的翻譯起始所需且其特征在于Shine-Dalgarno序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)。所述組件通常位于啟動子的3'處和欲表達多肽編碼序列的5'處。
[0180]在一些情形下，舉例來說，倘若期望在真核宿主細胞表達系統(tǒng)中進行糖基化，則各種前序列可進行操作以提高糖基化或產(chǎn)率。舉例來說，可改變特定信號肽的肽酶裂解位點或添加前序列，這也可影響糖基化。最終蛋白產(chǎn)物可在-1位(相對于成熟蛋白的第一氨基酸)中具有隨表達產(chǎn)生的一個或多個可能未完全去除的另外的氨基酸。舉例來說，最終蛋白產(chǎn)物可具有在肽酶裂解位點中所發(fā)現(xiàn)附接至氨基端的一或兩個氨基酸殘基?；蛘撸裘冈诔墒於嚯膬?nèi)的此區(qū)域處進行切割，則使用一些酶裂解位點可產(chǎn)生期望多肽的略截短但仍具有活性的形式。
[0181]倘若市售表達載體缺乏如上文所述期望側(cè)接序列中的一些，則可通過將所述序列個別地連接至載體中來修飾所述載體。在已視需要對載體進行選擇和修飾后，將編碼雙特異性分子或其免疫學功能片段的核酸分子插入載體的適當位點中。
[0182]將含有編碼本發(fā)明抗體或其免疫學功能片段的序列的完整載體插入適宜宿主細胞中以供擴增和/或多肽表達?？赏ㄟ^常規(guī)方法來達成雙特異性分子或其免疫學功能片段的表達載體至所選宿主細胞的轉(zhuǎn)化，所述方法包括(例如)轉(zhuǎn)染、感染、氯化鈣、電穿孔、顯微注射、脂轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖方法或其它已知技術(shù)。所選方法在一定程度上隨欲用宿主細胞的類型而變化。所述方法和其它適宜方法為那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。
[0183]當在合適條件下培養(yǎng)時，轉(zhuǎn)化的宿主細胞合成雙特異性分子或其功能片段，隨后可自培養(yǎng)基(若宿主細胞將所述雙特異性分子或其功能片段分泌至培養(yǎng)基中)或直接自產(chǎn)生其的宿主細胞(若不分泌所述雙特異性分子或其功能片段)收集所述雙特異性分子或其功能片段。合適宿主細胞的選擇應(yīng)視各種因素而定，例如期望表達程度、活性(例如糖基化或磷酸化)所期望或所需的多肽修飾和折疊成生物活性分子的容易性。
[0184]可用作表達用宿主的哺`乳動物細胞系為本領(lǐng)域中所熟知且包括(但不限于)許多可自美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC))獲得的永生化細胞系，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞、幼小倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人肝細胞癌細胞(例如H印G2)和諸多其它細胞系。在某些實施方案中，用于表達特定DNA構(gòu)建體的最好的細胞系可通過以下方式來選擇:測試各種細胞系以確定具有最高表達水平并產(chǎn)生具有組成型Dkk-1結(jié)合性質(zhì)的抗體者。
[0185]MM
[0186]在某些實施方案中，本發(fā)明也提供包含標的雙特異性分子或其片段連同以下中的一者或多者的組合物:藥學上可接受的稀釋劑、載劑、增溶劑、乳化劑、防腐劑和/或佐劑。這些組合物可含有有效量的雙特異性分子或其免疫學功能片段。因此，也包括本文所提供的抗體和片段在藥物組合物或藥劑的制備中的用途。這些組合物可用于治療多種疾病，如下文有關(guān)示例性應(yīng)用的部分中所列者。
[0187]用于醫(yī)藥制劑的可接受的制劑組分在所用劑量和濃度下對接受者無毒。除所提供的雙特異性分子、抗體和片段外，本發(fā)明組合物也可含有改進、維持或保持(例如)組合物的以下性質(zhì)的組分:PH、滲透性、粘性、澄清度、色彩、等滲性、氣味、無菌性、穩(wěn)定性、溶解或釋放速率、吸附或滲透。用于配制藥物組合物的適宜材料包括(但不限于)氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸)；抗微生物劑；抗氧化劑(例如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)；緩沖劑(例如乙酰鹽、硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其它有機酸)；增積劑(例如甘露醇或甘氨酸)；螯合劑(例如乙二胺四乙酸(EDTA));絡(luò)合劑(例如咖啡因、聚乙烯基吡咯烷酮、β_環(huán)糊精或羥丙基-β_環(huán)糊精)；填充劑；單糖；二糖；和其它碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白(例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；著色劑、矯味劑和稀釋劑；乳化劑；親水聚合物(例如聚乙烯基吡咯烷酮)；低分子量多肽；成鹽抗衡離子(例如鈉)；防腐劑(例如苯扎氯銨(benzalkonium chloride)、苯甲酸、水楊酸、硫柳萊(thimerosal)、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯(methylparaben)、對輕基苯甲酸丙酯(propylparaben)、氯己定(chlorhexidine)、山梨酸或過氧化氫)；溶劑(例如丙三醇、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(例如甘露醇或山梨糖醇)；懸浮劑；表面活性劑或潤濕劑(例如普流尼克(Pluronic)、PEG、山梨糖醇酐酯、聚山梨糖醇酯(例如聚山梨糖醇酯
20、聚山梨糖醇酯80)、曲拉通(triton)、胺丁三醇(tromethamine)、卵磷脂、膽固醇、泰洛沙泊(tyloxapol));穩(wěn)定性增強劑(例如蔗糖或山梨糖醇)；張力增強劑(例如堿金屬鹵化物(優(yōu)選地為氯化鈉或氯化鉀)、甘露醇、山梨糖醇)；遞送媒介物；稀釋劑；賦形劑和/或藥用佐劑。(參見 Remington' s Pharmaceutical Sciences,第 18 版，(A.R.Gennaro 編著)，1990, Mack Publishing Company),其以引用方式并入本文。
[0188]藥物組合物中的主要媒介物或載劑本質(zhì)上可為水性或非水性。用于這些組合物的適宜媒介物或載劑包括注射用水、生理鹽水溶液或人工腦脊髓液，可能補充一般用于腸胃外施用的組合物中的其它材料。中性緩沖鹽水或與血清白蛋白混合的鹽水是其它示例性媒介物。包含雙特異性分子或其片段的組合物可由具有期望純度的所選組合物與可選配制劑混合制備呈凍干餅或水溶液形式以供儲存。此外，可使用適合賦形劑(例如蔗糖)將雙特異性分子或其片段配制成凍干物。
[0189]制劑組分是以施用位點可接受的濃度存在。有利地使用緩沖液來將組合物維持在生理pH或略低pH，通常在約4.0至約8.5，或介于約5.0至8.0之間的pH范圍內(nèi)。藥物組合物可包含pH約6.5-8.5的TRIS緩沖液，或pH約4.0-5.5的乙酸鹽緩沖液，且可進一步包括山梨糖醇或其適宜取代物。
[0190]藥物組合物可涉及有效量的雙特異性分子或其片段與適于制造片劑的無毒賦形劑的混合物。可由片劑溶于滅菌水中或另一合適媒介物中來制備呈單位劑型的溶液。適宜賦形劑包括(但不限于)惰性材料，例如碳酸鈣、碳酸鈉或碳酸氫鈉、乳糖或磷酸鈣；或結(jié)合劑，例如淀粉、明膠或阿拉伯膠(acacia);或潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉。
[0191]其它藥物組合物是 呈持續(xù)或控制遞送制劑形式。可使用配制多種其它持續(xù)或控制遞送手段(例如脂質(zhì)體載劑、生物可蝕性微?；蚨嗫字榱：蛢Ψe注射)的技術(shù)(參見例如PCT/US93/00829，其闡述用于遞送藥物組合物的多孔聚合物微粒的控制釋放)。持續(xù)釋放制劑可包括半透性聚合物基質(zhì)的成形物品形式(例如薄膜或微膠囊)、聚酯、水凝膠、聚乳酸(美國專利號3，773，919和EP 058，481)、L-谷氨酸與L-谷氨酸Y乙基酯的共聚物(Sidman 等，1983, Biopolymers 22:547-556)、聚(2-輕乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等，1981，J Biomed Mater Res 15:167-277 和 Langer, 1982，Chem Tech 12:98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等,文獻同上)或聚-D(-)-3-羥基丁酸(EP 133,988)。持續(xù)釋放組合物也可包括脂質(zhì)體，其可通過本領(lǐng)域中已知的幾種方法中的任一者制備。參見例如Eppstein 等，1985，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 82:3688-3692 ；EP 036, 676 ；EP 088，046 和EP 143,949。
[0192]欲用于體內(nèi)施用的藥物組合物通常是無菌的。可通過無菌濾膜過濾來達成滅菌。若組合物凍干，則可在凍干和復原之前或之后實施滅菌。用于腸胃外施用的組合物可以凍干形式或溶液形式儲存。在某些實施方案中，將腸胃外組合物置于具有無菌進入埠的容器中，所述容器是(例如)具有可通過皮下注射針刺穿的塞子的靜脈內(nèi)溶液袋或小瓶、或注射用即用型無菌預填充注射器。
[0193]在本發(fā)明的藥物組合物已配制后，其可作為溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體或作為脫水或凍干粉末儲存于無菌小瓶中。這些制劑可以即用形式或以在施用前復原的形式(例如，凍干)儲存。
[0194]用于配制藥物組合物的組分優(yōu)選地具有高純度且實質(zhì)上不含潛在有害的污染物(例如，至少National Food(NF)級、通常至少分析級且更通常至少醫(yī)藥級)。此外，意欲體內(nèi)使用的組合物通常是無菌的。就必須在使用前合成給定化合物的程度來說，所得產(chǎn)物通常實質(zhì)上不含可在合成或純化過程期間存在的任何潛在毒劑、尤其任何內(nèi)毒素。用于腸胃外施用的組合物也是無菌的，實質(zhì)上等滲的且是在GMP條件下制得。
[0195]本發(fā)明提供產(chǎn)生多劑量或單劑量施用單位的試劑盒。舉例來說，本發(fā)明試劑盒各自可含有具有干燥蛋白的第一容器與具有水性稀釋劑的第二容器二者，包括(例如)單和多室預填充注射器(例如，液體注射器、溶解注射器(lyosyringe)或無針注射器)。
[0196]本發(fā)明的藥物組合物可腸胃外(通常通過注射)遞送?？稍谝韵虏课贿M行注射:眼內(nèi)、腹膜內(nèi)、門靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、鞘內(nèi)、大腦內(nèi)(實質(zhì)內(nèi))、腦室內(nèi)、動脈內(nèi)、病灶內(nèi)、病灶周圍或皮下。滴眼劑可用于眼內(nèi)施用。在一些情形下，注射可局限于治療所欲靶向的一塊或多塊特定骨附近。對于腸胃外施用來說，抗體可以無熱原腸胃外可接受的水溶液形式`施用，所述溶液包含存于藥學上可接受的媒介物中的所期望雙特異性分子或其片段。尤其適宜的腸胃外注射用媒介物是無菌蒸餾水，其中將雙特異性分子或其片段配制成無菌等滲溶液并以適宜方式保存。
[0197]可通過濃注或連接地通過輸注、通過植入器件、持續(xù)釋放系統(tǒng)或達成延長釋放的其它構(gòu)件來施用包含標的雙特異性分子和其功能片段的藥物組合物。也可經(jīng)由植入上面已吸收或囊封有期望分子的膜、海綿或另一合適材料來局部施用藥物組合物。倘若使用植入器件，則可將所述器件植入任一適宜組織或器官中，且可經(jīng)由擴散、定時釋放濃注或連續(xù)釋放來遞送期望分子。可用諸如以下等試劑來配制制劑:可注射微球、生物可蝕性粒子、聚合化合物(例如聚氨酸；聚乙醇酸；或共聚(乳酸/乙醇酸)(PLGA))、珠?；蛑|(zhì)體，所述試劑可提供隨后可經(jīng)由儲積注射遞送的產(chǎn)物的受控或持續(xù)釋放。具有玻尿酸的制劑具有延長在循環(huán)中的持續(xù)時間的作用。
[0198]包含雙特異性分子或其功能片段的標的組合物可配制成用于吸入。在所述實施方案中，將雙特異性分子配制成吸入用干燥粉末，或也可用推進劑將雙特異性分子吸入溶液配制用于氣溶膠遞送，例如通過霧化。肺施用進一步描述于PCT/US94/001875中，其描述化學修飾蛋白的肺遞送且其是以引用方式并入本文。
[0199]本發(fā)明的某些藥物組合物可經(jīng)由消化道(如口服)遞送?？稍诖嬖诨虿淮嬖谀切┩ǔＳ糜趶秃先缙瑒┖湍z囊等固體劑型的載劑的情況下配制以此方式施用的標的雙特異性分子或其片段。膠囊可設(shè)計成在胃腸道中某時釋放制劑的活性部分，此時可使生物利用度最大化且使全身前降解最小化?？砂ㄆ渌噭┮源龠M雙特異性分子或其功能片段的吸收。對于口服施用來說，可使用修飾氨基酸來賦予消化酶抗性。也可使用稀釋劑、矯味劑、低熔點蠟、植物油、潤滑劑、懸浮劑、片劑崩解劑和結(jié)合劑。
[0200]也可離體使用包含雙特異性分子或其片段的標的組合物。在這些情形下，使自患者移出的細胞、組織或器官暴露于特異性分子或與其一起培養(yǎng)。然后可將培養(yǎng)細胞植回所述患者或不同患者中或用于其它目的。
[0201]在某些實施方案中，可使用如那些本文所述的方法等方法通過植入某些已遺傳工程改造的細胞中來遞送雙特異性分子或其片段，以表達和分泌多肽。這些細胞可以是動物或人細胞，且可以是自體、異源或異種細胞，或可永生化。為降低免疫反應(yīng)的機會，可將細胞囊封以避免周圍組織的浸潤。囊封材料通常是允許蛋白產(chǎn)物釋放但防止患者的免疫系統(tǒng)或來自周圍組織的其它有害因素破壞細胞的生物兼容性、半透性聚合外套或膜。
[0202]艦量
[0203]可施用所提供的藥物組合物用于預防性和/或治療性治療。“有效量”通常是指活性成分(即，雙特異性分子或其免疫學功能片段)達成期望作用的足夠但無毒的量的量，所述期望作用是癥狀的嚴重程度和/或頻率的降低或消除和/或損害的改良或治療?！爸委熡行Я俊笔侵缸阋灾委熂膊顟B(tài)或癥狀或以其它方式防止、阻礙、延緩或逆轉(zhuǎn)疾病或任何其它不期望的癥狀的進展的量?！邦A防有效量”是指有效防止、阻礙或延緩疾病狀態(tài)或癥狀發(fā)作的量。
[0204]一般來說，抗體或片段的毒性和治療效能可根據(jù)標準醫(yī)藥程序在細胞培養(yǎng)物和/或?qū)嶒瀯游镏袦y定，包括(例如)測定LD50 (群體中的50%死亡的劑量)和ED50 (群體中的50%治療有效的劑量)。毒性作用與治療作用間的劑量比是治療指數(shù)且其可表示為比率LD50/ED50。展現(xiàn)大治療指`數(shù)的組合物優(yōu)選。
`[0205]可使用自細胞培養(yǎng)和動物研究獲得的數(shù)據(jù)來配制用于人的劑量范圍?；钚猿煞值膭┝客ǔＴ诰哂袠O低毒性或無毒性的循環(huán)濃度(包括ED50)的范圍內(nèi)。視所用劑型和所用施用途徑而定，劑量可在此范圍內(nèi)變化。
[0206]欲在治療上或預防上采用的包含雙特異性分子或其片段的藥物組合物的有效量應(yīng)視(例如)治療治療背景和目標而定。因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，根據(jù)某些實施方案，用于治療的合適劑量量可部分地視以下因素而定:所遞送分子、使用雙特異性分子的適應(yīng)癥、施用途徑和患者的體型(體重、身體表面尺寸或器官大小)和/或狀況(年齡和一般健康情況)。臨床醫(yī)師可滴定劑量并改進施用途徑以獲得最好的治療作用。典型劑量在約0.1 μ g/kg至最高約100mg/kg或更多的范圍內(nèi)，視上述因素而定。在某些實施方案中，齊Li量可在0.1 μ g/kg直至約150mg/kg或I μ g/kg直至約100mg/kg或5 μ g/kg直至約50mg/kg的范圍內(nèi)。在某些實施方案中，劑量是至少0.1 μ g/kg。在某些實施方案中，劑量是至少I μ g/kg。在某些實施方案中，劑量是至少5 μ g/kg。在某些實施方案中，劑量是至少5mg/kg。在某些實施方案中，劑量是至少10mg/kg。在某些實施方案中，劑量是至少50mg/kg。在某些實施方案中，劑量是至少100mg/kg。
[0207]施用頻率應(yīng)視制劑中雙特異性分子或其免疫學功能片段的藥物動力學參數(shù)而定。舉例來說，臨床醫(yī)師應(yīng)施用組合物直至達到達成期望作用的劑量。因此可以單次劑量施用組合物，或隨時間以兩次或更多次劑量施用(每次劑量可含有或可不含有相同量的期望分子)，或經(jīng)由植入器件或?qū)Ч芤赃B續(xù)輸注方式施用?？呻S時間連續(xù)或間歇地進行治療。合適劑量的進一步細分是由那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員以常規(guī)方式來實施且在其所實施的常規(guī)任務(wù)的范圍內(nèi)?？山柚褂煤线m劑量反應(yīng)數(shù)據(jù)來確定合適劑量。
[0208]為通過靶向硬化蛋白和/或Dkk-1治療醫(yī)學病癥，可向患者施用一定量的包含標的雙特異性分子或其片段的組合物且維持時間足以誘導至少一個反映病癥嚴重程度的指標的持續(xù)改良。若患者展現(xiàn)對至少兩個相隔至少I周至7周或在一些情形下I周至6周的時刻的改良，則將所述改良視為“持續(xù)”。合適間隔在某種程度上應(yīng)視所治療疾病狀況而定；確定用于確定改良是否持續(xù)的合適間隔在熟練醫(yī)師的范圍內(nèi)。改良程度是基于體征或癥狀來確定，且也可采用施用患者的調(diào)查問卷，例如生活質(zhì)量調(diào)查問卷。
[0209]可評估反應(yīng)患者疾患程度的各種指標以確定治療的量和時間是否足夠。通過在施用第一劑量的抗體之前檢測患者來確定所選一個或多個指標的基線值。優(yōu)選地，在施用第一劑量的約60天內(nèi)實施基線檢測。若抗體是施用來治療急性癥狀，例如治療骨折，則在已發(fā)生損傷后實際上盡可能快地施用第一劑量。
[0210]改良是通過施用標的雙特異性分子或其片段直至患者對于所選一個或多個指標表達相對于基線的改良來誘導。在治療慢性病狀時，此改良程度是通過在至少一個月或更長時間的時段(例如，I個月、2個月或3個月或更長時間或無限期)內(nèi)重復施用此藥劑來獲得。I周至6周時段或甚至單次劑量經(jīng)常足以治療急性病狀。對于損傷或急性病狀來說，單一劑量可能足夠。
[0211]盡管患者在治療后的疾患程度可根據(jù)一個或多個指標出現(xiàn)改良，但治療可在相同量下或在減少劑量或頻率下持續(xù)無限期。在治療已減少或中斷后，若癥狀會再次出現(xiàn)，則隨后可以原始量重新開始治療。
[0212]可使用標的雙特異性分子和其片段來檢測生物試樣中的硬化蛋白和/或Dkk-1。這些用途允許鑒別產(chǎn)生蛋白的細胞或組織或用作檢測硬化蛋白和/或Dkk-1過度產(chǎn)生或產(chǎn)生不足的病理性病狀的診斷法。所提供的抗體和片段也可用于篩選結(jié)合硬化蛋白和/或Dkk-1的分子的方法。舉例來說，可使用多種競爭性篩選方法。在一些方法中，使雙特異性分子所結(jié)合的硬化蛋白和/或Dkk-1分子或其片段與本文所公開的抗體或片段以及另一分子(即，候選分子)接觸。雙特異性分子或片段與硬化蛋白和/或Dkk-1之間結(jié)合的減少是分子結(jié)合靶標的指標。雙特異性分子或片段的結(jié)合可使用多種方法(例如，ELISA)來檢測。雙特異性分子或片段與靶標之間的結(jié)合的檢測可通過以檢測方式標記抗體來簡化。在一些方法中，進一步分析在初始篩選展現(xiàn)結(jié)合的分子以確定其是否抑制硬化蛋白和/或Dkk-1活性(例如，所述分子 是否活化Wnt信號傳導)。
[0213]治療方法和用途
[0214]在另一方面中，公開上述抗體或片段在治療多種疾病中的用途。舉例來說，某些方法涉及向有需要的患者施用有效量的本文所述的本發(fā)明雙特異性分子或片段以治療關(guān)節(jié)炎、因應(yīng)干細胞更新的疾病、發(fā)炎性疾病、神經(jīng)疾病、眼部疾病、腎臟疾病、肺部疾病和皮膚疾病。一些治療方法涉及治療類風濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎。使用某些抗體和片段來治療以下疾病:(a)因應(yīng)干細胞更新且是選自由以下組成的組的疾病:糖尿病、慢性心臟衰竭和肌肉疾?。?b)選自由以下組成的組的發(fā)炎性疾病:克隆氏病(Crohn; s disease)、結(jié)腸炎和發(fā)炎性腸??；(C)選自由以下組成的組的神經(jīng)疾病:阿茲海默氏病(Alzheimer, s disease)、帕金森氏病(Parkinson, s disease)和亨庭頓氏病(Huntington' s disease) ; (d)選自由以下組成的組的眼部疾病:黃斑變性和視網(wǎng)膜病變；(e)選自由以下組成的組的腎臟疾病:末期腎臟疾病、慢性腎臟疾病、腎小球腎炎、腎小管間質(zhì)性腎炎和IgA腎病變；(f)選自由以下組成的組的肺部疾病:慢性阻塞性肺部疾病、特發(fā)性肺部纖維化和囊性纖維化；或(g)因化學療法誘導的對腸上皮的損害所致的皮膚疾病。
[0215]本文進一步提供治療或防止骨質(zhì)量損失的方法，其包含向有需要的患者施用治療有效量的本發(fā)明的雙特異性分子。在一個實施方案中，本發(fā)明的雙特異性分子包含選自US 7，744，874、US 2009/0130113、US 7，592，429、US 2008/0193449、US 7，642，238 和 US7，700，101中任一者中所述抗體的可變區(qū)或本文所述其免疫學功能片段。在所述實施方案的一個實施方案中，患者是罹患轉(zhuǎn)移至骨的癌癥者，且在另一方面中，患者是罹患多發(fā)性骨髓瘤者 。
[0216]可通過本發(fā)明組合物治療的特定病狀包括發(fā)育不良，其中骨的生長或發(fā)育異常。這些病狀的代表性實例包括軟骨發(fā)育不全、鎖骨顱骨發(fā)育不全、內(nèi)生軟骨瘤病、纖維性發(fā)育不良、高歇氏病(Gaucher, s Disease)、低血磷性拘僂癥、馬爾方氏綜合癥(Marfan' ssyndrome)、多發(fā)性遺傳性外生骨撫、神經(jīng)纖維瘤病、成骨不全、骨硬化癥、脆弱性骨硬化癥、硬化性病灶、假關(guān)節(jié)和化膿性骨髓炎。
[0217]可治療或預防的其它病狀包括眾多種原因的骨量減少、骨質(zhì)疏松癥和骨損失。這些病狀的代表性實例包括牙周疾病、抗癲癇藥物誘導的骨損失、原發(fā)性和繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進、家族性甲狀旁腺功能亢進綜合癥、失重誘導的骨損失、男性的骨質(zhì)疏松癥、絕經(jīng)后骨損失、骨關(guān)節(jié)炎、腎性骨營養(yǎng)不良、浸潤性骨病、口骨損失、頜骨壞死、幼年型佩吉特氏病、肢骨紋狀肥大、代謝性骨病、肥大細胞增多癥、鐮狀細胞疾病、缺血性骨病(例如雷格-卡爾夫-柏斯氏病(Legg-Calve-Perthes disease)、局限性游走性骨質(zhì)疏松癥)、貧血狀態(tài)、由類固醇引起的病狀、糖皮質(zhì)激素誘導的骨損失、肝素誘導的骨損失、骨髓病癥、壞血病、營養(yǎng)不良、鈣缺乏、特發(fā)性骨量減少或骨質(zhì)疏松癥、先天性骨量減少或骨質(zhì)疏松癥、酒精中毒、慢性肝病、絕經(jīng)后狀態(tài)、慢性發(fā)炎性病狀、類風濕性關(guān)節(jié)炎、發(fā)炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、發(fā)炎性結(jié)腸炎、克隆氏病、月經(jīng)過少、閉經(jīng)、妊娠病狀、糖尿病、甲狀腺機能亢進、甲狀腺病、甲狀旁腺病、庫欣氏病(Cushing' s disease)、肢端肥大癥、性腺功能減退癥、活動抑制或廢用(disuse)、反射性交感神經(jīng)營養(yǎng)不良綜合癥、局限性骨質(zhì)疏松癥、骨軟化癥、關(guān)節(jié)置換相關(guān)性骨損失、HIV相關(guān)性骨損失、生長激素損失相關(guān)性骨損失、囊性纖維化相關(guān)性骨損失、纖維性發(fā)育不良、化學療法相關(guān)性骨損失、腫瘤誘導的骨損失、癌癥相關(guān)性骨損失、激素消融性骨損失、多發(fā)性骨髓瘤、藥物誘導的骨損失、神經(jīng)性厭食、疾病相關(guān)性面骨損失、疾病相關(guān)性顱骨損失、疾病相關(guān)性頜骨損失、疾病相關(guān)性頭蓋骨損失和太空旅行相關(guān)性骨損失。其它病狀涉及衰老相關(guān)性骨損失，包括衰老相關(guān)性面骨損失、衰老相關(guān)性顱骨損失、衰老相關(guān)性頜骨損失和衰老相關(guān)性頭蓋骨損失。
[0218]本發(fā)明組合物也可用于改良以下的結(jié)果:矯形外科程序、牙科程序、植入手術(shù)、關(guān)節(jié)置換(例如，髖關(guān)節(jié)或膝關(guān)節(jié))、骨移植、骨整容手術(shù)和骨修復(例如骨折愈合、不連接愈合、延遲性連接愈合和面部重建)。可在所述程序、置換、移植、手術(shù)或修復之前、期間和/或之后施用一種或多種組合物。
[0219]在某些實施方案中，設(shè)想本發(fā)明結(jié)合分子的局部遞送，例如(但不限于)骨折位點、脊柱融合或牙科相關(guān)性適應(yīng)癥。在一個實施方案中，經(jīng)由局部注射將結(jié)合分子遞送至治療位點。在另一實施方案中，將另外的結(jié)合序列添加至本發(fā)明結(jié)合分子以引導結(jié)合分子抵抗局限于骨細胞外基質(zhì)的蛋白，此可改良于治療位點的保留時間和結(jié)合分子的PK，由此改良效能。所述蛋白的非限制性實例包括(但不限于)I型膠原、骨唾液蛋白和牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白。在某些實施方案中，另外的結(jié)合序列是結(jié)合局限于骨細胞基質(zhì)的蛋白的結(jié)合肽或高親和性聚合體序列。
[0220]以下是由本發(fā)明所涵蓋具體實施方案的非限制性列表:[0221]預期當VHl或來自VHl的⑶R是選自硬化蛋白結(jié)合劑時，VH2或來自VH2的⑶R是選自DKK-1結(jié)合劑。反之，當VHl或來自VHl的⑶R是選自DKK-1結(jié)合劑時，VH2或來自VH2的CDR是選自硬化蛋白結(jié)合劑。進一步預期，當VLl或來自VLl的CDR是選自硬化蛋白結(jié)合劑時，VL2或來自VL2的⑶R是選自DKK-1結(jié)合劑。反之，當VLl或來自VLl的⑶R是選自DKK-1結(jié)合劑時，VL2或來自VL2的⑶R是選自硬化蛋白結(jié)合劑。
[0222]1.一種包含多肽鏈的結(jié)合分子，其中所述多肽鏈包含VHl-(Xl)n-VH2-C_(X2)n，其中:VH1是得自第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第一重鏈可變結(jié)構(gòu)域；VH2是得自第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第二重鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl)η是接頭，其中所述(Xl) η存在或不存在；且(Χ2) η是Fe區(qū)，其中所述(Χ2) η存在或不存在，其中所述結(jié)合分子特異性結(jié)合硬化蛋白與DKK-1 二者。
[0223]2.如實施方案I所述的結(jié)合分子，其中VHl和VH2包含選自由以下組成的組的氨基酸序列:硬化蛋白結(jié)合劑 SEQ ID Ν0:95、96、104、112、120、128、136、144、152、160、168、176、184、192、200、208 和 216 或 DKK-1 結(jié)合劑 SEQ ID NO: 224、232、240、248、256、264、272、280、288、296、304、312、320、328、336、344、352、360、368、376、384、392、400 和 408。
[0224]3.一種包含多肽鏈的結(jié)合分子，其中所述多肽鏈包含VLl-(Xl)n-VL2-C_(X2)n，其中:VL1是得自第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第一輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；VL2是得自第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第二輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl)η是接頭，其中所述(Xl) η存在或不存在；且(Χ2) η是Fe區(qū)，其中所述(Χ2) η存在或不存在，其中所述結(jié)合分子特異性結(jié)合硬化蛋白與DKK-1 二者。
[0225]4.如實施方案3所述的結(jié)合分子，其中VLl和VL2包含選自由以下組成的組的氨基酸序列:硬化蛋白結(jié)合劑 SEQ ID N0:94、103、lll、119、127、135、143、151、159、167、175、183、191、199、207 和 215 或 DKK-1 結(jié)合劑 SEQ ID NO: 223、231、239、247、255、263、271、279、287、295、303、311、319、327、335、343、351、359、367、375、383、391、399 和 407。
[0226]5.如實施方案I或3所述的結(jié)合分子，其中(Χ2)η不存在。
[0227]6.一種包含第一和第二多肽鏈的結(jié)合分子，其中所述第一多肽鏈包含VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n，其中VHl是得自第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第一重鏈可變結(jié)構(gòu)域；VH2是得自第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第二重鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl) η是接頭，其中所述(Xl) η存在或不存在；且(Χ2) η是Fe區(qū)，其中所述(Χ2)η存在或不存在；且其中所述第二多肽鏈包含VLl-(Xl) n-VL2-C-(X2)n，其中VLl是得自第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第一輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；VL2是得自第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第二輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl) η是接頭，其中所述(Xl) η存在或不存在；且(Χ2)η不包含F(xiàn)e區(qū)，其中所述(Χ2)η存在或不存在，其中所述結(jié)合分子特異性結(jié)合硬化蛋白與DKK-1 二者。
[0228]7.如實施方案6所述的結(jié)合分子，其中所述VHl和VH2重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含選自由以下組成的組的氨基酸序列:硬化蛋白結(jié)合劑SEQ ID Ν0:95、96、104、112、120、128、136、144、152、160、168、176、184、192、200、208 和 216 或 DKK-1 結(jié)合劑 SEQ ID Ν0:224、232、240、248、256、264、272、280、288、296、304、312、320、328、336、344、352、360、368、376、384、392,400和408，且其中所述VLl和VL2輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含選自由以下組成的組的氨基酸序列:硬化蛋白結(jié)合劑 SEQ ID N0:94、103、lll、119、127、135、143、151、159、167、175、183、191、199、207 和 215 或 DKK-1 結(jié)合劑 SEQ ID NO: 223、231、239、247、255、263、271、279、287、295、303、311、319、327、335、343、351、359、367、375、383、391、399 和 407。
[0229]8.如實施方案1、3或6所述的結(jié)合分子，其中(Xl)n是選自由SEQ ID NO: 415-482組成的組的氨基酸序列。
[0230]9.如實施方案6所述的結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子包含兩條第一多肽鏈和兩條
第二多肽鏈。
[0231]10.如實施方案1、3或6所述的結(jié)合分子,其中所述Fe區(qū)是選自由天然序列Fe區(qū)和變異型序列Fe區(qū)組成的組。
[0232]11.如實施方案10所述的結(jié)合分子，其中所述Fe區(qū)是選自由來自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE 和 IgD 的 Fe 區(qū)組成的組。
[0233]12.如實施方案1、3或6所述的結(jié)合分子，其中所述第一多肽鏈的所述VHl和所述第二多肽鏈的所述VLl是得自相同親本抗體或其抗原結(jié)合部分。
[0234]13.如實施方案1、3或6所述的結(jié)合分子，其中所述第一多肽鏈的所述VHl和所述第二多肽鏈的所述VLl是得自不同親本抗體或其抗原結(jié)合部分。
[0235]14.如實施方案1、3或6所述的結(jié)合分子，其中所述第一多肽鏈的所述VH2和所述第二多肽鏈的所述VL2是得自相同親本抗體或其抗原結(jié)合部分。
[0236]15.如實施方案1、3或6所述的結(jié)合分子，其中所述第一多肽鏈的所述VH2和所述第二多肽鏈的所述VL2是得自 不同親本抗體或其抗原結(jié)合部分。
[0237]16.如實施方案1、3或6所述的結(jié)合分子，限制條件為所述接頭(Xl)n不為CH1。
[0238]17.如實施方案1、3或6所述的結(jié)合分子，其中所述第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分以不同于所述第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合所述第二抗原的效能結(jié)合所述第一抗原。
[0239]18.如實施方案1、3或6所述的結(jié)合分子，其中所述第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分以不同于所述第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合所述第二抗原的親和力結(jié)合所述第
一抗原。
[0240]19.如實施方案1、3或6所述的結(jié)合分子，其中所述第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分和所述第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分是選自由人抗體、CDR移植抗體和人源化抗體組成的組。
[0241]20.如實施方案1、3或6所述的結(jié)合分子，其中所述第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分和所述第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分是選自由以下組成的組=Fab片段；F(ab' )2片段；二價片段，其包含于鉸鏈區(qū)由二硫橋鍵連接的兩個Fab片段；Fd片段，其由VH和CHl結(jié)構(gòu)域組成；Fv片段，其由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成；dAb片段；經(jīng)分離互補決定區(qū)(CDR);單鏈抗體；和雙功能抗體。
[0242]21.如實施方案1、3或6所述的結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子具有由所述第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分或所述第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分展現(xiàn)的至少一種期望性質(zhì)。
[0243]22.如實施方案21所述的結(jié)合分子，其中所述期望性質(zhì)是選自一個或多個抗體參數(shù)。
[0244]23.如實施方案21所述的結(jié)合分子，其中所述抗體參數(shù)是選自由以下組成的組:抗原特異性、與抗原的親和力、效能、生物學功能、表位識別、穩(wěn)定性、溶解性、產(chǎn)生效率、免疫原性、藥物動力學、生物利用度、組織交叉反應(yīng)性和直系同源抗原結(jié)合。
[0245]24.一種包含4條多肽鏈的結(jié)合硬化蛋白與DKK-1 二者的結(jié)合分子，其中第一和第三多肽鏈包含VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n，其中:VH1是第一重鏈可變結(jié)構(gòu)域；VH2是第二重鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl)n是接頭，其中所述(Xl)n存在或不存在；且(X2)n是Fe區(qū)，其中所述(X2)n存在或不存在；且其中第二和第四多肽鏈包含VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n，其中VLl是第一輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；VL2是第二輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl)n是接頭，其中所述(Xl)n存在或不存在；且(X2)n不包含F(xiàn)e區(qū)，其中所述(X2) η存在或不存在，其中所述VHl和VH2重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含選自由以下組成的組的氨基酸序列:硬化蛋白結(jié)合劑SEQ ID Ν0:95、96、104、112、120、128、136、144、152、160、168、176、184、192、200、208 和 216 或 DKK-1 結(jié)合劑 SEQ ID NO: 224、232、240、248、256、264、272、280、288、296、304、312、320、328、336、344、352、360、368、376、384、392、400 和 408，且其中所述VLl和VL2輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含選自由以下組成的組的氨基酸序列:硬化蛋白結(jié)合劑SEQID NO:94、103、111、119、127、135、143、151、159、167、175、183、191、199、207和215或DKK-1結(jié)合劑 SEQ ID Ν0:223、231、`239、247、255、263、271、279、287、295、303、311、319、327、335、343、351、359、367、375、383、391、399 和 407。
[0246]25.如實施方案24所述的結(jié)合分子，限制條件為所述接頭(Xl) η不為CHl。
[0247]26.一種包含4條多肽鏈的結(jié)合硬化蛋白與DKK-1 二者的結(jié)合分子，其中第一和第三多肽鏈包含VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n，其中:VH1是第一重鏈可變結(jié)構(gòu)域；VH2是第二重鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl)n是接頭，其中所述(Xl)n存在或不存在；且(X2)n是Fe區(qū)，其中所述(X2)n存在或不存在；且其中第二和第四多肽鏈包含VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n，其中VLl是第一輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；VL2是第二輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl)n是接頭，其中所述(Xl)n存在或不存在；且(X2)n不包含F(xiàn)e區(qū)，其中所述(X2)n存在或不存在，其中所述結(jié)合分子包含選自由以下組成的組的VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2) η 與 VLl-(Xl) n-VL2-C- (X2)n 的配對:
[0248]SEQ ID NO: 18 與 20 ；22 與 24 ；26 與 28 ；30 與 32 ；34 與 36 ；38 與 40 ；42 與 44 ；46與 48 ；50 與 52 ；54 與 76 ；56 與 72 ；58 與 60 ；62 與 64 ；66 與 68 ；70 與 72 ；74 與 76 ；78 與80 ；82 與 84 ；86 與 88 ；90 與 92 ；486 與 488 ；490 與 492 ;和 494 與 496。
[0249]27.如實施方案26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl- (Xl) n-VH2_C- (X2) η與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID N0:18 與 20。
[0250]28.如實施方案26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl- (Xl) n-VH2_C- (X2) η與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID N0:22 與 24。
[0251]29.如實施方案26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID NO:26 與 28。
[0252]30.如實施方案26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl- (Xl) n-VH2_C- (X2) η與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID NO:30 與 32。
[0253]31.如實施方案26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl- (Xl) n-VH2_C- (X2) η與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID NO:34 與 36。
[0254]32.如實施方案26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl- (Xl) n-VH2_C- (X2) η與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID NO:38 與 40。[0255]33.如實施方案26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl- (Xl) n-VH2_C- (X2) η與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID N0:42 與 44。
[0256]34.如實施方案26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl- (Xl) n-VH2_C- (X2) η與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID NO:46 與 48。
[0257]35.如實施方案26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl- (Xl) n-VH2_C- (X2) η與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID NO:50 與 52。
[0258]36.如實施方案26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl- (Xl) n-VH2_C- (X2) η與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID NO:54 與 76。
[0259]37.如實施方案26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl- (Xl) n-VH2_C- (X2) η與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID NO:56 與 72。
[0260]38.如實施方案26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl- (Xl) n-VH2_C- (X2) η與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID NO:58 與 60。
[0261]39.如實施方案26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID N0:62 與 64。
[0262]40.如實施方案26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl- (Xl) n-VH2_C- (X2) η與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID NO:66 與 68。
[0263]41.如實施方案26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl- (Xl) n-VH2_C- (X2) η與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2) n 的配對是 SEQ ID NO:70 與 72。
[0264]42.如實施方案26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl- (Xl) n-VH2_C- (X2) η與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID NO:74 與 76。
[0265]43.如實施方案26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl- (Xl) n-VH2_C- (X2) η與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID NO:78 與 80。
[0266]44.如實施方案26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl- (Xl) n-VH2_C- (X2) η與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID N0:82 與 84。
[0267]45.如實施方案26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl- (Xl) n-VH2_C- (X2) η與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID NO:86 與 88。
[0268]46.如實施方案26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl- (Xl) n-VH2_C- (X2) η與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID NO:90 與 92。
[0269]47.如實施方案1、3和6所述的結(jié)合分子，其中所述硬化蛋白結(jié)合劑的VH包含3個選自由以下SEQ ID NO組成的組的⑶R，其中每一組成員皆具有3個⑶R(⑶R1、⑶R2、CDR3):
[0270]100、101、102 ;108、109、110 ;116、117、118 ;124、125、126 ;132、133、134 ;140、141、142 ;148、149、150 ;156、157、158 ;164、165、166 ;172、173、174 ;180、181、182 ;188、189、190 ;196、197、198 ;204、205、206 ;212、213、214 ;和 220、221、222，
[0271]且其中所述DKKl結(jié)合劑的VH包含3個選自由以下SEQ ID NO組成的組的⑶R，其中每一組成成員具有3個⑶R (⑶R1、⑶R2、⑶R3):
[0272]228、229、230 ;236、237、238 ;244、245、246 ;252、253、254 ;260、261、262 ;268、269、270 ;276、277、278 ;284、285、286 ;292、293、294 ;300、301、302 ;308、309、310 ;316、317、318 ;324、325、326;332、333、334;340、341、342 ;348、349、350 ;356、357、358 ;364、365、366 ;372、373、374 ;380、381、382 ;388、389、390 ;396、397、398 ;404、405、406 ；和 412、413、
414。
[0273]48.如實施方案1、3和6所述的結(jié)合分子，其中所述硬化蛋白結(jié)合劑的VL包含3個選自由以下SEQ ID NO組成的組的⑶R，其中每一組成員皆具有3個⑶R(⑶R1、⑶R2、CDR3):
[0274]97、98、99 ;105、106、107 ;113、114、115 ;121、122、123 ;129、130、131 ;137、138、139 ;145、146、147 ;153、154、155 ;161、162、163 ;169、170、171 ;177、178、179 ;185、186、187 ;193、194、195 ;201、202、203;209、210、211;和 217、218、219，
[0275]且其中所述DKKl結(jié)合劑的VL包含3個選自由以下SEQ ID NO組成的組的⑶R，其中每一組成成員具有3個⑶R (⑶R1、⑶R2、⑶R3):
[0276]a)225、226、227 ;233、234、235 ;241、242、243 ;249、250、251 ;257、258、259 ;265、266,267 ;273、274、275 ;281、282、283 ;289、290、291 ;297、298、299 ;305、306、307 ;313、314,315 ;321、322、323 ;329、330、331 ;337、338、339 ;345、346、347 ;353、354、355 ;361、362,363 ;369、370、371 ;377、378、379 ;385、386、387 ;393、394、395 ；401,402,403 ；和 409、410、411。
[0277]49.如實施方案1、3和6所述的結(jié)合分子，其中所述硬化蛋白結(jié)合劑的VH包含3個選自由以下SEQ ID NO組成的組的⑶R，其中每一組成員皆具有3個⑶R(⑶R1、⑶R2、CDR3): [0278]100、101、102 ;108、109、110 ;116、117、118 ;124、125、126 ;132、133、134 ;140、141、142 ;148、149、150 ;156、157、158 ;164、165、166 ;172、173、174 ;180、181、182 ;188、189、190 ;196、197、198 ;204、205、206 ;212、213、214 ;和 220、221、222，
[0279]且其中所述DKKl結(jié)合劑的VH包含3個選自由以下SEQ ID NO組成的組的⑶R，其中每一組成成員具有3個⑶R (⑶R1、⑶R2、⑶R3):
[0280]228、229、230 ;236、237、238 ;244、245、246 ;252、253、254 ;260、261、262 ;268、269、270 ;276、277、278 ;284、285、286 ;292、293、294 ;300、301、302 ;308、309、310 ;316、317、318 ;324、325、326 ;332、333、334 ;340、341、342 ;348、349、350 ;356、357、358 ;364、365、366 ;372、373、374 ;380、381、382 ;388、389、390 ;396、397、398 ;404、405、406 ；和 412、413、
414。
[0281]且其中所述硬化蛋白結(jié)合劑的VL包含3個選自由以下SEQ ID NO組成的組的⑶R，其中每一組成成員具有3個⑶R (⑶R1、⑶R2、⑶R3):
[0282]97、98、99 ;105、106、107 ;113、114、115 ;121、122、123 ;129、130、131 ;137、138、139 ;145、146、147 ;153、154、155 ;161、162、163 ;169、170、171 ;177、178、179 ;185、186、187 ;193、194、195 ;201、202、203 ;209、210、211;和 217、218、219，
[0283]且其中所述DKKl結(jié)合劑的VL包含3個選自由以下SEQ ID NO組成的組的⑶R，其中每一組成成員具有3個⑶R (⑶R1、⑶R2、⑶R3):
[0284]225、226、227 ;233、234、235 ;241、242、243 ;249、250、251 ;257、258、259 ;265、266、267 ;273、274、275 ;281、282、283 ;289、290、291 ;297、298、299 ;305、306、307 ;313、314、315 ;321、322、323 ;329、330、331 ;337、338、339 ;345、346、347 ;353、354、355 ;361、362、363 ;369、370、371 ;377、378、379 ;385、386、387 ;393、394、395 ;401、402、403 ；和 409、410、411。
[0285]50.一種包含4條多肽鏈的結(jié)合分子，其中第一和第三多肽鏈包含VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n，其中:VH1是第一重鏈可變結(jié)構(gòu)域；VH2是第二重鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl)n是接頭，其中所述(Xl)n存在或不存在；且(X2)n是Fe區(qū)，其中所述(X2) η存在或不存在；且其中第二和第四多肽鏈包含VLl-(Xl) n-VL2-C-(X2)n，其中VLl是第一輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；VL2是第二輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl) η是接頭，其中所述(Xl) η存在或不存在；且(Χ2) η不包含F(xiàn)e區(qū)，其中所述(Χ2) η存在或不存在，其中所述結(jié)合分子包含3個VHl⑶R、3個VH2⑶R、3個VLl⑶R和3個VL2⑶R，其中所述配對的VHl和VLl CDR和配對的VH2和VL2 CDR是選自由以下組成的組:SEQ ID NO :
[0286]97-102 ;105_110 ;113_118 ;121_126 ;129_134 ;137_142 ;145_150 ;153_158 ；161-166 ；169-174 ;177_182 ;185_190 ;193_198 ;201_206 ；209-214 ;217_222，
[0287]或SEQ ID NO:
[0288]a) 225-230 ;233_238 ;241_246 ;249_254 ;257_262 ;265_270 ;273_278 ；281-286 ；289-294 ；297-302 ;305_310 ;313_318 ;321_326 ;329_334 ;337_342 ;345_350 ;353_358 ；361-366 ；369-374 ；377-382 ；385-390 ；393-398 ；401-406 ;409_414。
[0289]51.如實施方案50所述的結(jié)合分子，其中所述VLl CDR是SEQ ID NO: 161-163，所述 VHlCDR 是 SEQ ID NO: 164-166，所述 VL2 CDR 是 SEQ ID NO: 385-387，并且所述 VH2 CDR是 SEQ ID NO:388-390。
[0290]52.如實施方案50所述的結(jié)合分子，其中所述VLl CDR是SEQ ID NO: 385-387，所述 VHl CDR 是 SEQ ID NO: 388-390，所述 VL2 CDR是 SEQ ID NO: 161-163，并且所述 VH2 CDR是 SEQ ID NO:164-166。
[0291]53.如實施方案50所述的結(jié)合分子，其中所述VLl CDR是SEQ ID NO: 153-155，所述 VHl CDR 是 SEQ ID NO: 156-158，所述 VL2 CDR是 SEQ ID NO: 385-387，并且所述 VH2 CDR是 SEQ ID NO:388-390。
[0292]54.如實施方案50所述的結(jié)合分子，其中所述VLl CDR是SEQ ID NO: 385-387，所述 VHl CDR 是 SEQ ID NO: 388-390，所述 VL2 CDR 是 SEQ ID NO: 153-155，并且所述 VH2 CDR是 SEQ ID NO:156-158。
[0293]55.如實施方案50所述的結(jié)合分子，其中所述VLl CDR是SEQ ID N0:409_411，所述 VHl CDR是 SEQ ID N0:412_414，所述 VL2 CDR是 SEQ ID NO: 121-123，并且所述 VH2 CDR是 SEQ ID NO:124-126。
[0294]56.如實施方案50所述的結(jié)合分子，其中所述VLl CDR是SEQ ID N0:409_411，所述 VHl CDR是 SEQ ID N0:412_414，所述 VL2 CDR是 SEQ ID NO: 177-179，并且所述 VH2 CDR是 SEQ ID NO:180-182。
[0295]57.如實施方案50所述的結(jié)合分子，其中所述VLl CDR是SEQ ID N0:409_411，所述 VHl CDR 是 SEQ ID NO:412-414，所述 VL2 CDR 是 SEQ ID NO:97-99，并且所述 VH2 CDR是 SEQ ID NO:100-102。
[0296]58.如實施方案50所述的結(jié)合分子，其中所述VLl CDR是SEQ ID NO: 385-387，所述 VHl CDR 是 SEQ ID NO: 388-390，所述 VL2 CDR是 SEQ ID NO: 105-107，并且所述 VH2 CDR是 SEQ ID NO:108-110。[0297]59.如實施方案50所述的結(jié)合分子，其中所述VLl CDR是SEQ ID N0:97_99，所述VHl CDR 是 SEQ ID NO: 100-102，所述 VL2 CDR是 SEQ ID NO:409-411，并且所述 VH2 CDR 是SEQ ID N0:412-414。
[0298]60.如實施方案50所述的結(jié)合分子，其中所述VLl CDR是SEQ ID NO: 385-387，所述 VHl CDR 是 SEQ ID NO: 388-390，所述 VL2 CDR是 SEQ ID NO: 105-107，并且所述 VH2 CDR是 SEQ ID NO:108-110。
[0299]61.如實施方案50所述的結(jié)合分子，其中所述VLl CDR是SEQ ID N0:409_411，所述 VHl CDR是 SEQ ID N0:412_414，所述 VL2 CDR是 SEQ ID NO: 105-107，并且所述 VH2 CDR是 SEQ ID NO:108-110。
[0300]62.如實施方案50所述的結(jié)合分子，其中所述VLl CDR是SEQ ID NO: 105-107，所述 VHl CDR 是 SEQ ID NO: 108-110，所述 VL2 CDR是 SEQ ID NO: 385-387，并且所述 VH2 CDR是 SEQ ID NO:388-390。
[0301]63.如實施方案50所述的結(jié)合分子，其中所述VLl CDR是SEQ ID NO: 105-107，所述 VHl CDR 是 SEQ ID NO:` 108-110，所述 VL2 CDR是 SEQ ID NO:409-411，并且所述 VH2 CDR是 SEQ ID N0:412-414。
[0302]64.如實施方案50所述的結(jié)合分子，其中所述VLl CDR是SEQ ID NO: 369-371，所述 VHl CDR 是 SEQ ID NO: 372-374，所述 VL2 CDR 是 SEQ ID NO: 105-107，并且所述 VH2 CDR是 SEQ ID NO:108-110。
[0303]65.如實施方案50至64所述的結(jié)合分子，其中所述(Xl)n是選自由SEQ IDNO:415-484組成的組。
[0304]66.如實施方案50-64所述的結(jié)合分子，其中所述(Xl)n是選自由SEQ ID NO:440,441、437、438、431、432、483 和 484 組成的組。
[0305]67.如實施方案50至64所述的結(jié)合分子，其中所述VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n鏈的所述(Xl)n 是 SEQ ID NO:440?
[0306]68.如實施方案50至64所述的結(jié)合分子，其中所述VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n鏈的所述(Xl)n 是 SEQ ID NO:441 ?
[0307]69.如實施方案50至64所述的結(jié)合分子，其中所述VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n鏈的所述(Xl)n 是 SEQ ID NO:437?
[0308]70.如實施方案50至64所述的結(jié)合分子，其中所述VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n鏈的所述(Xl)n 是 SEQ ID NO:438?
[0309]71.如實施方案50至64所述的結(jié)合分子，其中所述VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n的所述(Xl)η 是 SEQ ID NO:440。
[0310]72.如實施方案50至64所述的結(jié)合分子，其中所述VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n的所述(Xl)η 是 SEQ ID NO:441。
[0311]73.如實施方案50至64所述的結(jié)合分子，其中所述VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n的所述(Xl)η 是 SEQ ID NO:483。
[0312]74.如實施方案50至64所述的結(jié)合分子，其中所述VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n的所述(Xl)η 是 SEQ ID NO:484。
[0313]75.如實施方案50至64所述的結(jié)合分子，其中所述VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n的所述(Xl)η 是 SEQ ID NO:431。
[0314]76.如實施方案50至64所述的結(jié)合分子，其中所述VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n的所述(Xl)η 是 SEQ ID NO:432。
[0315]77.如實施方案1、3、6、24、26和50所述的結(jié)合分子，其中所述VHl-(Xl)n-VH2-C- (X2) η 和 VLl- (Xl) n-VL2_C- (X2) η 鏈上的所述(Xl) η 是不同的。
[0316]78.一種產(chǎn)生結(jié)合硬化蛋白與DKK-1 二者的結(jié)合分子的方法，其包含以下步驟:(a)獲得可結(jié)合硬化蛋白或DKK-1的第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分；(b)獲得可結(jié)合硬化蛋白或DKK-1的第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分；(c)構(gòu)建包含VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)η的第一和第三多肽鏈，其中:VH1是得自所述第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第一重鏈可變結(jié)構(gòu)域；VH2是得自所述第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第二重鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl) η是接頭，限制條件為其不為CHl，其中所述(Xl) η存在或不存在；且(Χ2) η是Fe區(qū)，其中所述(Χ2)η存在或不存在；(d)構(gòu)建包含VLl-(Xl) n_VL2_C-(X2) η的第二和第四多肽鏈，其中=VLl是得自所述第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第一輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；VL2是得自所述第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第二輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl)n是接頭，其中所述(Xl)n存在或不存在；且(X2) η不包含F(xiàn)e區(qū)，其中所述(Χ2)η存在或不存在；和(e)表達所述第一、第二、第三和第四多肽鏈，以產(chǎn)生結(jié)合硬化蛋白與DKK-1 二者的結(jié)合分子。
[0317]79.如實施方案78所述的方法，其中所述VHl和VH2重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含選自由以下組成的組的氨基酸序列:硬化蛋白結(jié)合劑SEQ ID N0:95、96、104、112、120、128、136、144、152、160、168、176、184、192、200、208 和 216，或 DKK-1 結(jié)合劑 SEQ ID N0:224、232、240、248、256、264、272、280、288、296、304、312、320、328、336、344、352、360、368、376、384、392,400和408，且其中所述VLl 和VL2輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含選自由以下組成的組的氨基酸序列:硬化蛋白結(jié)合劑 SEQ ID N0:94、103、lll、119、127、135、143、151、159、167、175、183、191、199、207 和 215，或DKK-1 結(jié)合劑 SEQ ID NO: 223、231、239、247、255、263、271、279、287、295、303、311、319、327、335、343、351、359、367、375、383、391、399 和 407。
[0318]80.如實施方案78所述的方法，其中所述第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分中的每一者和所述第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分中的每一者是單獨地選自由人抗體、CDR移植抗體和人源化抗體組成的組。
[0319]81.如實施方案78所述的方法，其中所述第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分中的每一者和所述第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分中的每一者是單獨地選自由以下組成的組:Fab片段；F(ab' )2片段；二價片段，其包含于鉸鏈區(qū)由二硫橋鍵連接的兩個Fab片段；Fd片段，其由VH和CHl結(jié)構(gòu)域組成；Fv片段，其由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成；dAb片段；分離的互補決定區(qū)(CDR);單鏈抗體和雙功能抗體。
[0320]82.如實施方案78所述的方法，其中所述第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分具有由所述結(jié)合分子展現(xiàn)的至少一種期望性質(zhì)。
[0321]83.如實施方案78所述的方法，其中所述第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分具有由所述結(jié)合分子展現(xiàn)的至少一種期望性質(zhì)。
[0322]84.如實施方案78所述的方法，其中所述Fe區(qū)是選自由天然序列Fe區(qū)和變異型序列Fe區(qū)組成的組。[0323]85.如實施方案78所述的方法，其中所述Fe區(qū)是選自由來自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE 和 IgD 的 Fe 區(qū)組成的組。
[0324]86.如實施方案78所述的方法，其中所述期望性質(zhì)是選自一個或多個抗體參數(shù)。
[0325]87.如實施方案78所述的方法，其中所述期望性質(zhì)是選自一個或多個抗體參數(shù)。
[0326]88.如實施方案78所述的方法，其中所述抗體參數(shù)是選自由以下組成的組:抗原特異性、與抗原的親和力、效能、生物學功能、表位識別、穩(wěn)定性、溶解性、產(chǎn)生效率、免疫原性、藥物動力學、生物利用度、組織交叉反應(yīng)性和直系同源抗原結(jié)合。
[0327]89.如實施方案78所述的方法，其中所述抗體參數(shù)是選自由以下組成的組:抗原特異性、與抗原的親和力、效能、生物學功能、表位識別、穩(wěn)定性、溶解性、產(chǎn)生效率、免疫原性、藥物動力學、生物利用度、組織交叉反應(yīng)性和直系同源抗原結(jié)合。
[0328]90.如實施方案78所述的方法，其中所述第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合所述第一抗原的親和力不同于所述第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合所述第二抗原的親和力。
`[0329]91.如實施方案78所述的方法，其中所述第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合所述第一抗原的效能不同于所述第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合所述第二抗原的效能。
[0330]92.如實施方案78所述的方法，限制條件為所述接頭不為CHl。
[0331]93.一種藥物組合物，其包含如實施方案I至77中任一實施方案所述的結(jié)合分子。
[0332]94.如實施方案I至77中任一實施方案所述的結(jié)合分子，其與藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載劑中的一者或多者組合。
[0333]95.一種治療骨病癥的方法，其包含向有需要的患者施用如實施方案I至77中任一實施方案所述的結(jié)合分子。
[0334]96.一種加速骨折修復的方法，其包含向有需要的患者施用如實施方案I至77中任一實施方案所述的結(jié)合分子。
[0335]97.一種增加骨密度的方法，其包含向有需要的患者施用如實施方案I至77中任一實施方案所述的結(jié)合分子。
[0336]98.一種增加骨強度的方法，其包含向有需要的患者施用如實施方案I至77中任一實施方案所述的結(jié)合分子。
[0337]99.如實施方案96至98所述的方法，其中與未治療患者相比，使BMC增加至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、I10%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190% 或 200%。
[0338]100.如實施方案96至98所述的方法，其中與未治療患者相比，使BMD增加至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、I10%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190% 或 200%。
[0339]101.一種多核苷酸，其編碼如實施方案I至77中任一實施方案所述的結(jié)合分子。
[0340]102.如實施方案26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl- (Xl) n-VH2_C- (X2) η與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID NO:486 與 488。
[0341]103.如實施方案26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID NO:490 與 492。
[0342]104.如實施方案26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl- (Xl) n-VH2_C- (X2) η與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID NO:494 與 496。
[0343]105.如實施方案50所述的結(jié)合分子，其中所述VLlCDR是SEQ ID NO: 225-227，所述 VHlCDR 是 SEQ ID NO: 228-230，所述 VL2 CDR 是 SEQ ID NO: 105-107，并且所述 VH2 CDR是 SEQ ID NO:108-110。
[0344]如某些國家管轄區(qū)所允許，本文所公開所有參考文獻的全文以引用方式并入本文，如同每一者皆出于任何目的(包括授予本發(fā)明權(quán)利和描述本發(fā)明)個別地并入本文一般。以下實施例僅提供用于闡釋本文所提供抗體、片段和組合物的某些方面且因此不應(yīng)視為限制所要求發(fā)明的范圍。
[0345]表1
【權(quán)利要求】
1.一種結(jié)合分子，其包含多肽鏈，其中所述多肽鏈包含VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n，其中=VHl是得自第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第一重鏈可變結(jié)構(gòu)域；VH2是得自第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第二重鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl)n是接頭，其中所述(Xl) η存在或不存在；并且(Χ2) η是Fe區(qū)，其中所述(Χ2) η存在或不存在，其中所述結(jié)合分子特異性結(jié)合硬化蛋白(sclerostin)與DKK-1 二者。
2.如權(quán)利要求1所述的結(jié)合分子，其中VHl和VH2包含選自由以下組成的組的氨基酸序列:硬化蛋白結(jié)合劑 SEQ ID N0:95、96、104、112、120、128、136、144、152、160、168、176、184、192、200、208 和 216，或DKK-1 結(jié)合劑 SEQ ID NO: 224、232、240、248、256、264、272、280、288、296、304、312、320、328、336、344、352、360、368、376、384、392、400 和 408。
3.一種結(jié)合分子，其包含多肽鏈，其中所述多肽鏈包含VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n，其中=VLl是得自第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第一輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；VL2是得自第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第二輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl)n是接頭，其中所述(Xl) η存在或不存在；并且(Χ2) η是Fe區(qū)，其中所述(Χ2) η存在或不存在，其中所述結(jié)合分子特異性結(jié)合硬化蛋白與DKK-1 二者。
4.如權(quán)利要求3所述的結(jié)合分子，其中VLl和VL2包含選自由以下組成的組的氨基酸序列:硬化蛋白結(jié)合劑 SEQ ID N0:94、103、lll、119、127、135、143、151、159、167、175、183、191、199、207 和 215，或DKK-1 結(jié)合劑 SEQ ID NO: 223、231、239、247、255、263、271、279、287、295、303、311、319、327、335、343、351、359、367、375、383、391、399 和 407。
5.如權(quán)利要求1或3所述的結(jié)合分子，其中(Χ2)η不存在。
6.一種結(jié)合分子，其包含 第一和第二多肽鏈，其中所述第一多肽鏈包含VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n，其中VHl是得自第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第一重鏈可變結(jié)構(gòu)域；VH2是得自第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第二重鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl) η是接頭，其中所述(Xl) η存在或不存在；并且(Χ2) η是Fe區(qū)，其中所述(Χ2)η存在或不存在；并且其中所述第二多肽鏈包含VLl-(Xl) n-VL2-C-(X2)n，其中VLl是得自第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第一輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；VL2是得自第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第二輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl) η是接頭，其中所述(Xl) η存在或不存在；并且(Χ2)η不包含F(xiàn)e區(qū)，其中所述(Χ2)η存在或不存在，其中所述結(jié)合分子特異性結(jié)合硬化蛋白與DKK-1。
7.如權(quán)利要求6所述的結(jié)合分子，其中所述VHl和VH2重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含選自由以下組成的組的氨基酸序列:硬化蛋白結(jié)合劑SEQ ID Ν0:95、96、104、112、120、128、136、144、152、160、168、176、184、192、200、208 和 216，或DKK-1 結(jié)合劑 SEQ ID NO: 224、232、240、248、256、264、272、280、288、296、304、312、320、328、336、344、352、360、368、376、384、392、400 和408，并且其中所述VLl和VL2輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含選自由以下組成的組的氨基酸序列:硬化蛋白結(jié)合劑 SEQ ID N0:94、103、lll、119、127、135、143、151、159、167、175、183、191、199、207 和 215，或DKK-1 結(jié)合劑 SEQ ID NO: 223、231、239、247、255、263、271、279、287、295、303、311、319、327、335、343、351、359、367、375、383、391、399 和 407。
8.如權(quán)利要求1、3或6所述的結(jié)合分子，其中(Χ1)η是選自由SEQID Ν0:415至482組成的組的氨基酸序列。
9.如權(quán)利要求6所述的結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子包含兩條第一多肽鏈和兩條第二多肽鏈。
10.如權(quán)利要求1、3或6所述的結(jié)合分子，其中所述Fe區(qū)是選自由天然序列Fe區(qū)和變異型序列Fe區(qū)組成的組。
11.如權(quán)利要求10所述的結(jié)合分子，其中所述Fe區(qū)是選自由IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD的Fe區(qū)組成的組。
12.如權(quán)利要求1、3或6所述的結(jié)合分子，其中所述第一多肽鏈的所述VHl和所述第二多肽鏈的所述VLl是得自相同的親本抗體或其抗原結(jié)合部分。
13.如權(quán)利要求1、3或6所述的結(jié)合分子，其中所述第一多肽鏈的所述VHl和所述第二多肽鏈的所述VLl是得自不同的親本抗體或其抗原結(jié)合部分。
14.如權(quán)利要求1、3或6所述的結(jié)合分子，其中所述第一多肽鏈的所述VH2和所述第二多肽鏈的所述VL2是得自相同的親本抗體或其抗原結(jié)合部分。
15.如權(quán)利要求1、3或6所述的結(jié)合分子，其中所述第一多肽鏈的所述VH2和所述第二多肽鏈的所述VL2是得自不同的親本抗體或其抗原結(jié)合部分。
16.如權(quán)利要求1、3或6所述的結(jié)合分子，限制條件為所述接頭不為CH1。
17.如權(quán)利要求1、3或6所述的結(jié)合分子，其中所述第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合所述第一抗原的效能不 同于所述第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合所述第二抗原的效能。
18.如權(quán)利要求1、3或6所述的結(jié)合分子，其中所述第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合所述第一抗原的親和力不同于所述第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合所述第二抗原的親和力。
19.如權(quán)利要求1、3或6所述的結(jié)合分子，其中所述第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分和所述第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分是選自由人抗體、CDR移植抗體和人源化抗體組成的組。
20.如權(quán)利要求1、3或6所述的結(jié)合分子，其中所述第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分和所述第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分是選自由以下組成的組=Fab片段；F(ab' )2片段；二價片段，其包含兩個于鉸鏈區(qū)由二硫橋鍵連接的Fab片段；Fd片段，其由VH和CHl結(jié)構(gòu)域組成；Fv片段，其由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成；dAb片段；分離的互補決定區(qū)(CDR)；單鏈抗體；和雙功能抗體(diabody)。
21.如權(quán)利要求1、3或6所述的結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子具有至少一種由所述第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分或所述第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分展現(xiàn)的期望性質(zhì)。
22.如權(quán)利要求21所述的結(jié)合分子，其中所述期望性質(zhì)是選自一個或多個抗體參數(shù)。
23.如權(quán)利要求21所述的結(jié)合分子，其中所述抗體參數(shù)是選自由以下組成的組:抗原特異性、與抗原的親和力、效能、生物學功能、表位識別、穩(wěn)定性、溶解性、產(chǎn)生效率、免疫原性、藥物動力學、生物利用度、組織交叉反應(yīng)性和直系同源抗原結(jié)合。
24.一種結(jié)合硬化蛋白與DKK-1 二者的結(jié)合分子，其包含四條多肽鏈，其中第一和第三多肽鏈包含VHl-(Xl) n-VH2-C-(X2)n，其中:VH1是第一重鏈可變結(jié)構(gòu)域；VH2是第二重鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl)n是接頭，其中所述(Xl)n存在或不存在；并且(X2)n是Fe區(qū)，其中所述(X2)n存在或不存在；并且其中第二和第四多肽鏈包含VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n，其中VLl是第一輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；VL2是第二輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl)n是接頭，其中所述(Xl)n存在或不存在；并且(X2)n不包含F(xiàn)e區(qū)，其中所述(X2) η存在或不存在，其中所述VHl和VH2重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含選自由以下組成的組的氨基酸序列:硬化蛋白結(jié)合劑SEQ ID Ν0:95、96、104、112、120、128、136、144、152、160、168、.176、184、192、200、208 和 216，或DKK-1 結(jié)合劑 SEQ ID NO: 224、232、240、248、256、264、272、.280、288、296、304、312、320、328、336、344、352、360、368、376、384、392、400 和 408，并且其中所述VLl和VL2輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含選自由以下組成的組的氨基酸序列:硬化蛋白結(jié)合劑 SEQ ID NO:94、103、111、119、127、135、143、151、159、167、175、183、191、199、207 和 215，或 DKK-1 結(jié)合劑 SEQ ID Ν0:223、231、239、247、255、263、271、279、287、295、303、311、319、.327、335、343、351、359、367、375、383、391、399 和 407。
25.如權(quán)利要求24所述的結(jié)合分子，限制條件為所述接頭不為CHl。
26.—種結(jié)合硬化蛋白與DKK-1 二者的結(jié)合分子，其包含四條多肽鏈，其中第一和第三多肽鏈包含VHl-(Xl) n-VH2-C-(X2)n，其中:VH1是第一重鏈可變結(jié)構(gòu)域；VH2是第二重鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl)n是接頭，其中所述(Xl)n存在或不存在；并且(X2)n是Fe區(qū)，其中所述(X2)n存在或不存在；并且其中第二和第四多肽鏈包含VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n，其中VLl是第一輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；VL2是第二輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl)n是接頭，其中所述(Xl)n存在或不存在；并且(X2)n不包含F(xiàn)e區(qū)，其中所述(X2)n存在或不存在，其中所述結(jié)合分子包含選自由以下組成的組的VHl-(Xl)n-VH2-C- (X2) n 與 VLl-(Xl) n-VL2-C- (X2)n 的配對:
SEQ ID NO: 18 與 20 ；22 與 24 ；26 與 28 ；30 與 32 ；34 與 36 ；38 與 40 ；42 與 44 ；46 與.48 ；50 與 52 ；54 與 76 ；56 與 72 ；58 與 60 ；62 與 64 ；66 與 68 ；70 與 72 ；74 與 76 ；78 與 80 ；.82 與 84 ；86 與 88 ；90 與 92 ；486 與 488 ；490 與 492 ;和 494 與 496。
27.如權(quán)利要求26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID NO: 18 與 20。
28.如權(quán)利要求26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID NO:22 與 24。
29.如權(quán)利要求26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID NO:26 與 28。
30.如權(quán)利要求26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID NO:30 與 32。
31.如權(quán)利要求26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID NO:34 與 36。
32.如權(quán)利要求26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID NO:38 與 40。
33.如權(quán)利要求26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID NO:42 與 44。
34.如權(quán)利要求26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID NO:46 與 48。
35.如權(quán)利要求26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID NO:50 與 52。
36.如權(quán)利要求26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)η 的配對是 SEQ ID NO:54 與 76。
37.如權(quán)利要求26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID NO:56 與 72。
38.如權(quán)利要求26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID NO:58 與 60。
39.如權(quán)利要求26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)η 的配對是 SEQ ID NO:62 與 64。
40.如權(quán)利要求26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl-(Xl) n-VH2-C- (X2) η與VLl- (Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID NO:66 與 68。
41.如權(quán)利要求26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID NO:70 與 72。
42.如權(quán)利要求26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)η 的配對是 SEQ ID NO:74 與 76。
43.如權(quán)利要求26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID NO:78 與 80。
44.如權(quán)利要求26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)η 的配對是 SEQ ID NO:82 與 84。
45.如權(quán)利要求26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID NO:86 與 88。
46.如權(quán)利要求26所述的結(jié)合分子，其中所述VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n與VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n 的配對是 SEQ ID NO:90 與 92。
47.如權(quán)利要求1、3或6所述的結(jié)合分子，其中所述硬化蛋白結(jié)合劑的VH包含選自由以下SEQ ID NO組成的組的3個⑶R:
a)100、101、102 ；
b)108、109、110；
c)116、117、118；
d)124、125、126 ；
e)132,133,134 ；
f)140、141、142 ；
g)148、149、150 ；
h)156,157,158；
i)164、165、166；
j)172、173、174 ；
k) 180,181,182 ；
I)188、189、190 ；
m)196、197、198 ；
η)204,205,206 ；
ο)212、213、214 ;和p)220、221、222， 并且其中所述DKKl結(jié)合劑的VH包含選自由以下SEQ ID NO組成的組的3個⑶R:
a)228,229,230 ；
b)236,237,238；
c)244,245,246；
d)252,253,254；
e)260、261、262；
f)268、269、270 ；
g)276,277,278 ；
h)284,285,286；
i)292、293、294；
j)300,301,302 ；
k) 308,309,310 ；
1)316,317,318 ；
m) 324,325,326 ；
η)332,333,334 ；
0)340、341、342；
p)348,349,350 ；
q) 356,357,358 ；
r)364,365,366 ；
s)372、373、374 ；
t)380、381、382 ；
u)388,389,390 ；
v)396,397,398 ；
w)404,405,406 ;和
x)412、413、414。
48.如權(quán)利要求1、3或6所述的結(jié)合分子，其中所述硬化蛋白結(jié)合劑的VL包含選自由以下SEQ ID NO組成的組的3個⑶R:
a)97、98、99 ；
b)105、106、107；
c)113、114、115；
d)121、122、123 ；
e)129、130、131；
f)137,138,139 ；
g)145、146、147 ；
h)153、154、155；
1)161,162,163；
j)169、170、171 ；
k) 177、178、179 ；I)185,186,187 ；
m)193、194、195 ；
η)201,202,203 ；
ο)209、210、211 ;和
ρ)217、218、219， 并且其中所述DKKl結(jié)合劑的VL包含選自由以下SEQ ID NO組成的組的3個⑶R:
b)225、226、227；
c)233,234,235；
d)241,242,243 ；
e)249、250、251；
f)257,258,259 ；
g)265,266,267 ；
h)273,274,275；
i)281、282、283；
j)289,290,291 ；
k)297,298,299 ；
1)305,306,307 ；
m)313、314、315 ；
n)321、322、323 ；
o)329、330、331 ；
p)337,338,339 ；
q)345,346,347 ；
r)353,354,355 ；
s)361、362、363 ；
t)369、370、371 ；
u)377,378,379 ；
v)385,386,387 ；
w) 393,394,395 ；
x)401,402,403 ;和
y)409、410、411。
49.如權(quán)利要求1、3或6所述的結(jié)合分子，其中所述硬化蛋白結(jié)合劑的VH包含選自由以下SEQ ID NO組成的組的3個⑶R:
a)100、101、102 ；
b)108、109、110；
c)116、117、118；
d)124、125、126 ；
e)132,133,134 ；
f)140、141、142 ；
g)148、149、150 ；h)156,157,158；i)164、165、166；j)172、173、174 ；k) 180,181,182 ；I)188、189、190 ；m)196、197、198 ；n)204,205,206 ；0)212、213、214;和p)220、221、222，并且其中所述DKKl結(jié)合劑的VH包含選自由以下SEQ ID NO組成的組的3個⑶R:a)228,229,230 ；b)236,237,238；c)244,245,246；d)252,253,254；e)260、261、262； f)268、269、270 ；g)276,277,278 ；h)284,285,286；1)292、293、294；j)300,301,302 ；k) 308,309,310 ；1)316,317,318 ；m) 324,325,326 ；η)332,333,334 ；o)340、341、342 ；p)348,349,350 ；q) 356,357,358 ；r)364,365,366 ；s)372、373、374 ；t)380、381、382 ；u)388,389,390 ；v)396,397,398 ；w)404,405,406 ;和x)412、413、414，并且其中所述硬化蛋白結(jié)合劑的VL包含選自由以下SEQ ID NO組成的組的3個CDR:a)97、98、99 ；b)105、106、107；c)113、114、115；d)121、122、123 ；e)129、130、131；
f)137,138,139 ；
g)145、146、147 ；
h)153、154、155；
i)161,162,163；
j)169、170、171 ；
k) 177、178、179 ；
I)185,186,187 ；
m)193、194、195 ；
n)201,202,203 ；
0)209、210、211;和
p)217、218、219， 并且其中所述DKKl結(jié)合劑的VL包含選自由以下SEQ ID NO組成的組的3個⑶R:
a)225,226,227 ；
b)233,234,235；
c)241、242、243；
d)249,250,251 ；
e)257,258,259；
f)265、266、267；
g)273,274,275 ；
h)281,282,283；
1)289、290、291；
j)297,298,299 ；
k)305,306,307 ；
1)313、314、315 ；
m)321、322、323 ；
n)329、330、331 ；
o)337、338、339 ；
p)345,346,347 ；
q) 353,354,355 ；
r)361、362、363 ；
s)369、370、371 ；
t)377,378,379 ；
u)385,386,387 ；
v)393,394,395 ；
w)401、402、403 ;和
x)409、410、411。
50.一種結(jié)合分子，其包含四條多肽鏈，其中第一和第三多肽鏈包含VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n，其中:VH1是第一重鏈可變結(jié)構(gòu)域；VH2是第二重鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl)n是接頭，其中所述(Xl)n存在或不存在；并且(X2)η是Fe區(qū)，其中所述(Χ2) η存在或不存在；并且其中第二和第四多肽鏈包含VLl- (Xl) n-VL2-C- (X2) n，其中VLl是第一輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；VL2是第二輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl)η是接頭，其中所述(Χ1)η存在或不存在；并且(Χ2)η不包含F(xiàn)e區(qū)，其中所述(Χ2)η存在或不存在，其中所述結(jié)合分子包含3個VHl⑶R、3個VH2⑶R、3個VLl⑶R和3個VL2⑶R，其中所述配對的VHl和VLl⑶R和配對的VH2和VL2⑶R是選自由以下組成的組:
SEQ ID NO:
a)97 至 102 ；
b)105 至 110 ；
c)113 至 118 ；
d)121 至 126 ；
e)129 至 134 ；
f)137 至 142 ；
g)145 至 150 ；
h)153 至 158 ；
i)161 至 166 ；
j) 169 至 174 ；
k) 177 至 182 ；
I) 185 至 190 ；
m) 193 至 198 ；
η) 201 至 206 ；
ο)209 至 214 ；
ρ)217 至 222，
或 SEQ ID NO:
b)225至 230 ；
c)233至 238 ；
d)241至 246 ；
e)249至 254 ；
f)257至 262 ；
g)265至 270 ；
h)273至 278 ；
i)281至 286 ；
j) 289 至 294 ；
k)297 至 302 ；
1)305 至 310 ；
m)313 至 318 ；
η) 321 至 326 ；
0)329 至 334 ；
P) 337 至 342 ；q)345 至 350 ；
r)353 至 358 ；
s)361 至 366 ；
t)369 至 374 ；
u)377 至 382 ；
V) 385 至 390 ；
w)393 至 398 ；
x) 401 至 406 ；
y) 409 至 414。
51.如權(quán)利要求50所述的結(jié)合分子，其中所述VLl⑶R是SEQID NO: 161至163，所述VHl CDR 是 SEQ ID NO: 164 至 166，所述 VL2 CDR是 SEQ ID NO: 385 至 387，并且所述 VH2CDR是 SEQ ID NO:388 至 390。
52.如權(quán)利要求50所述的結(jié)合分子，其中所述VLlCDR是SEQ ID NO: 385至387，所述VHl CDR 是 SEQ ID NO: 388 至 390，所述 VL2 CDR 是 SEQ ID NO: 161 至 163，并且所述 VH2CDR 是 SEQ ID NO: 164 至 166。
53.如權(quán)利要求50所述的結(jié)合分子，其中所述VLl⑶R是SEQID NO: 153至155，所述VHl CDR 是 SEQ ID NO: 156 至 158，所述 VL2 CDR 是 SEQ ID NO: 385 至 387，并且所述 VH2CDR 是 SEQ ID NO: 388 至 390。
54.如權(quán)利要求50所述的結(jié)合分子，其中所述VLl⑶R是SEQID NO: 385至387，所述VHl CDR 是 SEQ ID NO: 388 至 390，所述 VL2 CDR 是 SEQ ID NO: 153 至 155，并且所述 VH2CDR 是 SEQ ID NO: 156 至 158。
55.如權(quán)利要求50所述的結(jié)合分子，其中所述VLlCDR是SEQ ID N0:409至411，所述VHl CDR 是 SEQ ID NO:412 至 414，所述 VL2 CDR 是 SEQ ID NO: 121 至 123，并且所述 VH2CDR 是 SEQ ID NO: 124 至 126。
56.如權(quán)利要求50所述的結(jié)合分子，其中所述VLlCDR是SEQ ID N0:409至411，所述VHl CDR 是 SEQ ID NO:412 至 414，所述 VL2 CDR 是 SEQ ID NO: 177 至 179，并且所述 VH2CDR 是 SEQ ID NO: 180 至 182。
57.如權(quán)利要求50所述的結(jié)合分子，其中所述VLl⑶R是SEQID N0:409至411，所述VHl CDR 是 SEQ ID NO: 412 至 414，所述 VL2 CDR 是 SEQ ID NO: 97 至 99，并且所述 VH2 CDR是 SEQ ID NO:100 至 102。
58.如權(quán)利要求50所述的結(jié)合分子，其中所述VLlCDR是SEQ ID NO: 385至387，所述VHl CDR 是 SEQ ID NO: 388 至 390，所述 VL2 CDR 是 SEQ ID NO: 105 至 107，并且所述 VH2CDR 是 SEQ ID NO: 108 至 110。
59.如權(quán)利要求50所述的結(jié)合分子，其中所述VLlCDR是SEQ ID NO:97至99，所述VHlCDR 是 SEQ ID NO: 100 至 102，所述 VL2 CDR 是 SEQ ID NO:409 至 411，并且所述 VH2 CDR 是SEQ ID NO:412 至 414。
60.如權(quán)利要求50所述的結(jié)合分子，其中所述VLl⑶R是SEQID NO: 385至387，所述VHl CDR 是 SEQ ID NO: 388 至 390，所述 VL2 CDR 是 SEQ ID NO: 105 至 107，并且所述 VH2CDR 是 SEQ ID NO: 108 至 110。
61.如權(quán)利要求50所述的結(jié)合分子，其中所述VLl⑶R是SEQID N0:409至411，所述VHl CDR 是 SEQ ID NO:412 至 414，所述 VL2 CDR 是 SEQ ID NO: 105 至 107，并且所述 VH2CDR 是 SEQ ID NO: 108 至 110。
62.如權(quán)利要求50所述的結(jié)合分子，其中所述VLl⑶R是SEQID NO: 105至107，所述VHl CDR 是 SEQ ID NO: 108 至 110，所述 VL2 CDR 是 SEQ ID NO: 385 至 387，并且所述 VH2CDR 是 SEQ ID NO: 388 至 390。
63.如權(quán)利要求50所述的結(jié)合分子，其中所述VLl⑶R是SEQID NO: 105至107，所述VHl CDR 是 SEQ ID NO: 108 至 110，所述 VL2 CDR 是 SEQ ID NO:409 至 411，并且所述 VH2CDR 是 SEQ ID NO:412 至 414。
64.如權(quán)利要求50所述的結(jié)合分子，其中所述VLl⑶R是SEQID NO: 369至371，所述VHl CDR 是 SEQ ID NO: 372 至 374，所述 VL2 CDR 是 SEQ ID NO: 105 至 107，并且所述 VH2CDR 是 SEQ ID NO: 108 至 110。
65.如權(quán)利要求50至64中任一項所述的結(jié)合分子，其中所述(Xl)η是選自由SEQ IDNO:415至484組成的組。
66.如權(quán)利要求50至64中任一項所述的結(jié)合分子，其中所述(Xl)η是選自由SEQ IDΝ0:440、441、437、438、431、432、483 和 484 組成的組。
67.如權(quán)利要求50至64中任一項所述的結(jié)合分子 ，其中所述VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n鏈的所述(Xl)n 是 SEQ ID NO:440?
68.如權(quán)利要求50至64中任一項所述的結(jié)合分子，其中所述VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n鏈的所述(Xl)n 是 SEQ ID NO:441 ?
69.如權(quán)利要求50至64中任一項所述的結(jié)合分子，其中所述VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n鏈的所述(Xl)n 是 SEQ ID NO:437?
70.如權(quán)利要求50至64中任一項所述的結(jié)合分子，其中所述VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n鏈的所述(Xl)n 是 SEQ ID NO:438。
71.如權(quán)利要求50至64中任一項所述的結(jié)合分子，其中所述VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n的所述(Xl)n 是 SEQ ID NO:440?
72.如權(quán)利要求50至64中任一項所述的結(jié)合分子，其中所述VLl-(Xl) n_VL2_C- (X2) η的所述(Χ1)η 是 SEQ ID NO:441 ?
73.如權(quán)利要求50至64中任一項所述的結(jié)合分子，其中所述VLl-(Xl) n_VL2_C- (X2) η的所述(Χ1)η 是 SEQ ID NO:483?
74.如權(quán)利要求50至64中任一項所述的結(jié)合分子，其中所述VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n的所述(Xl)n 是 SEQ ID NO:484?
75.如權(quán)利要求50至64中任一項所述的結(jié)合分子，其中所述VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n的所述(Xl)n 是 SEQ ID NO:431。
76.如權(quán)利要求50至64中任一項所述的結(jié)合分子，其中所述VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n的所述(Xl)n 是 SEQ ID NO:432?
77.如權(quán)利要求1、3、6、24、26和50中任一項所述的結(jié)合分子，其中所述VHl-(Xl)n-VH2-C- (X2) η 和 VLl- (Xl) n-VL2_C- (X2) η 鏈上的所述(Xl) η 不同。
78.—種產(chǎn)生結(jié)合硬化蛋白與DKK-1的結(jié)合分子的方法，其包括以下步驟:(a)獲得可結(jié)合硬化蛋白或DKK-1的第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分；(b)獲得可結(jié)合硬化蛋白或DKK-1的第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分；(c)構(gòu)建包含VHl-(Xl)n-VH2-C-(X2)n的第一和第三多肽鏈，其中:VH1是得自所述第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第一重鏈可變結(jié)構(gòu)域；VH2是得自所述第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第二重鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl)n是接頭，限制條件為其不為CH1，其中所述(Xl)n存在或不存在；并且(X2)n是Fe區(qū)，其中所述(X2)n存在或不存在；(d)構(gòu)建包含VLl-(Xl)n-VL2-C-(X2)n的第二和第四多肽鏈，其中:VL1是得自所述第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第一輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；VL2是得自所述第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分的第二輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；C是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域；(Xl) n是接頭，其中所述(Xl) n存在或不存在；并且(Χ2)n不包含F(xiàn)e區(qū)，其中所述(Χ2)n存在或不存在；和(e)表達所述第一、第二、第三和第四多肽鏈，以產(chǎn)生結(jié)合硬化蛋白與DKK-1的結(jié)合分子。
79.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述VHl和VH2重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含選自由以下組成的組的氨基酸序列:硬化蛋白結(jié)合劑SEQ ID N0:95、96、104、112、120、128、136、144、152、160、168、176、184、192、200、208和 216，或DKK-1 結(jié)合劑 SEQ ID NO: 224、232、240、248、256、264、272、280、288、296、304、312、320、328、336、344、352、360、368、376、384、392、400 和408，并且其中所述VLl和VL2輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含選自由以下組成的組的氨基酸序列:硬化蛋白結(jié)合劑 SEQ ID N0:94、103、lll、119、127、135、143、151、159、167、175、183、191、199、207 和 215，或DKK-1 結(jié)合劑 SEQ ID NO: 223、231、239、247、255、263、271、279、287、295、303、311、319、327、335、343、351、359、367、375、383、391、399 和 407。
80.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分各自和所述第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分各自分別地選自由人抗體、CDR移植抗體和人源化抗體組成的組。
81.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分各自和所述第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分各自分別地選自由以下組成的組=Fab片段；F(ab' )2片段；二價片段，其包含兩個于鉸鏈區(qū)由二硫橋鍵連接的Fab片段；Fd片段，其由VH和CHl結(jié)構(gòu)域組成；Fv片段，其由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成；dAb片段；分離的互補決定區(qū)(CDR);單鏈抗體，和雙功能抗體。
82.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分具有至少一種由所述結(jié)合分子展現(xiàn)的期望性質(zhì)。
83.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分具有至少一種由所述結(jié)合分子展現(xiàn)的期望性質(zhì)。
84.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述Fe區(qū)是選自由天然序列Fe區(qū)和變異型序列Fe區(qū)組成的組。
85.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述Fe區(qū)是選自由IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD的Fe區(qū)組成的組。
86.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述期望性質(zhì)是選自一個或多個抗體參數(shù)。
87.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述期望性質(zhì)是選自一個或多個抗體參數(shù)。
88.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述抗體參數(shù)是選自由以下組成的組:抗原特異性、與抗原的親和力、效能、生物學功能、表位識別、穩(wěn)定性、溶解性、產(chǎn)生效率、免疫原性、藥物動力學、生物利用度、組織交叉反應(yīng)性和直系同源抗原結(jié)合。
89.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述抗體參數(shù)是選自由以下組成的組:抗原特異性、與抗原的親和力、效能、生物學功能、表位識別、穩(wěn)定性、溶解性、產(chǎn)生效率、免疫原性、藥物動力學、生物利用度、組織交叉反應(yīng)性和直系同源抗原結(jié)合。
90.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合所述第一抗原的親和力不同于所述第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合所述第二抗原的親和力。
91.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述第一親本抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合所述第一抗原的效能不同于所述第二親本抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合所述第二抗原的效能。
92.如權(quán)利要求78所述的方法，限制條件為所述接頭不為CHl。
93.一種藥物組合物，其包含如權(quán)利要求1至77中任一項所述的結(jié)合分子。
94.如權(quán)利要求1至77中任一項所述的結(jié)合分子，其與藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載劑中的一者或多者組合。
95.一種治療骨病癥的方法，其包括向有需要的患者施用如權(quán)利要求1至77中任一項所述的結(jié)合分子。
96.一種加速骨折修 復的方法，其包括向有需要的患者施用如權(quán)利要求1至77中任一項所述的結(jié)合分子。
97.一種增加骨密度的方法，其包括向有需要的患者施用如權(quán)利要求1至77中任一項所述的結(jié)合分子。
98.一種增加骨強度的方法，其包括向有需要的患者施用如權(quán)利要求1至77中任一項所述的結(jié)合分子。
【文檔編號】C07K16/22GK103649118SQ201280021425
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2012年2月29日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月1日
【發(fā)明者】M·弗羅里奧, T·阿羅拉, C·J·R·帕斯蒂, W·G·理查德斯 申請人:安進公司