用于制備具有毒素、佐劑、檢測標(biāo)簽和藥代動(dòng)力學(xué)半衰期延長劑的蛋白質(zhì)的巖藻糖連接位 ...的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)在其糖部分和/或氨基酸上具有非典型的巖藻糖類似物之分子的真核細(xì)胞。本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)具有在其糖部分上的非典型巖藻糖類似物和/或氨基酸之分子的方法并涉及通過所述方法獲得的分子。它還涉及一種用于生產(chǎn)包含具有在其糖部分上的非典型巖藻糖類似物和/或氨基酸之分子和藥物活性化合物之綴合物的方法，以及通過所述方法獲得的綴合物。此外，本發(fā)明涉及特定的綴合物。
【專利說明】用于制備具有毒素、佐劑、檢測標(biāo)簽和藥代動(dòng)力學(xué)半衰期延長劑的蛋白質(zhì)的巖藻糖連接位點(diǎn)特異性綴合物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及真核細(xì)胞，其用于生產(chǎn)具有在其糖部分上的非典型巖藻糖類似物和/或氨基酸的分子。本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)具有在其糖部分上的非典型巖藻糖類似物和/或氨基酸的分子的方法以及通過所述方法獲得的分子。本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)綴合物的方法，所述綴合物包含具有在其糖部分上的非典型巖藻糖類似物和/或氨基酸之分子和藥物活性化合物，以及本發(fā)明涉及可通過所述方法獲得的綴合物。此外，本發(fā)明涉及特定的綴合物。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，插入活性部分的預(yù)定連接點(diǎn)對于生物學(xué)產(chǎn)物的有效結(jié)合起關(guān)鍵作用。蛋白質(zhì)和功能化合物的綴合通常通過將功能化合物連接至氨基酸殘基的側(cè)鏈來實(shí)現(xiàn)。已知的經(jīng)典生物綴合技術(shù)以非位點(diǎn)限制的方式進(jìn)行，這使得難以避免在關(guān)鍵氨基酸殘基處的不期望綴合并且由于綴合反應(yīng)結(jié)局的固有異質(zhì)性也導(dǎo)致了有關(guān)批次間一致性的風(fēng)險(xiǎn)。借助與蛋白質(zhì)連接的碳水化合物結(jié)構(gòu)之羥基基團(tuán)的非選擇性化學(xué)偶聯(lián)需要苛刻的反應(yīng)條件并且具有蛋白質(zhì)的氨基酸側(cè)鏈中不 希望之修飾的風(fēng)險(xiǎn)。非期望的偶聯(lián)或修飾可影響的關(guān)鍵殘基包含對于維持產(chǎn)物熱穩(wěn)定性和聚集傾向性來說重要的氨基酸側(cè)鏈。對于抗體來說，不想要的在互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)內(nèi)或鄰近的氨基酸側(cè)鏈的綴合可導(dǎo)致親和力和異質(zhì)性抗原結(jié)合特性的降低。化學(xué)偶聯(lián)通常是通過蛋白質(zhì)連接的官能團(tuán)來實(shí)現(xiàn)，例如伯胺、巰基、羰基、碳水化合物、羧酸和羥基。用于經(jīng)此類官能團(tuán)偶聯(lián)的反應(yīng)性基團(tuán)包括芳基疊氮化物、碳二亞胺、羰基、雙吖丙啶(diazirine)、酰肼、羥甲基膦、亞氨酸酯、異氰酸酯、馬來酰亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS-酯)、五氟苯基酯(PFP-酯)、補(bǔ)骨脂素(psoralen)和吡啶基二硫化物。
[0003]可以很容易地在疏基處引導(dǎo)綴合。然而，由于疏基的反應(yīng)性，在表達(dá)的蛋白質(zhì)中幾乎不存在自由巰基。因而自由巰基的直接標(biāo)記主要是依靠現(xiàn)有二硫鍵(S-S)的還原。在過去，作為治療性蛋白質(zhì)的主要群體之一的抗體已經(jīng)通過巰基與功能性化合物相偶聯(lián)。由于重鏈與輕鏈之間二硫鍵的還原發(fā)生的頻率約為重鏈與重鏈之間二硫鍵還原頻率的兩倍，所以這種部分還原的方法具有由于輕鏈丟失而導(dǎo)致蛋白質(zhì)破碎的風(fēng)險(xiǎn)(Sun，等人，Bioconjug Cheml6:1282-1290 (2005).)。特別的，關(guān)鍵的抗體CH2結(jié)構(gòu)域的熱穩(wěn)定性可能會(huì)受到層間二硫鍵還原的負(fù)面影響。從這樣的隨機(jī)型巰基偶聯(lián)反應(yīng)生產(chǎn)均質(zhì)產(chǎn)品是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜和低效的過程。cACIO抗體藥物綴合物的早期臨床前版本一巰基連接的免疫綴合物一涉及每個(gè)抗體8個(gè)細(xì)胞毒性藥物分子的連接(Doronina等，Nat.Biotechnol.21 (7):778-84(2003))。通過四個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵的還原獲得實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)的半胱氨酸殘基(Doronina等人，Nat.Biotechnol.21(7):778-84(2003))。二硫鍵的不完全還原導(dǎo)致了具有負(fù)載的少于八個(gè)藥物分子/抗體的不完整綴合物的異質(zhì)混合物(Hamblett等人Effects of drugloading on the antitumor activity of a monoclonal antibody-drug conjugate.Clinical Cancer Research，2004，10 (20):7063-70)。已證實(shí)對于巰基偶聯(lián)的綴合物來說很難實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品的均一'I"生，并且總產(chǎn)率相當(dāng)?shù)?Hamblett等人2004)。
[0004]通過賴氨酸殘基的氨基進(jìn)行的偶聯(lián)也是生產(chǎn)蛋白質(zhì)和功能性化合物之生物綴合物的常用模式。就在最近，含巰基美登木素生物堿(maytanSinoid)，DMl (美登木醇的N-甲基-N-[3-巰基-1-氧代丙基]-L-丙氨酸酯，臨床研究藥物美登素(maytansine)的類似物)被用于通過二硫鍵將美登木素生物堿與抗體相連(Barginear和Budman, 2009)。對于曲妥珠單抗-DM1，使用雙功能試劑SMCC(N-琥珀酰亞胺基-4-馬來酰亞胺基甲基-環(huán)己烷羧酸酯)將DMl連接到曲妥珠單抗。SMCC首先添加到蛋白質(zhì)上的賴氨酸殘基，以產(chǎn)生接頭修飾的抗體。SMCC的琥珀酰亞胺基與賴氨酸殘基的偶聯(lián)以隨機(jī)的方式發(fā)生，靶向于抗體所有表面暴露的賴氨酸殘基。隨后DMl中的巰基與接頭的馬來酰亞胺基團(tuán)反應(yīng)形成不可還原的硫醚鍵(Barginear和Budman, 2009)。在pH6.5-7.5時(shí)，馬來酰亞胺與巰基反應(yīng)形成穩(wěn)定的硫醚鍵。然而，在卩11值> 7.5時(shí)，馬來酰亞胺也與伯胺反應(yīng)，其可導(dǎo)致產(chǎn)生不希望的共價(jià)蛋白質(zhì)寡聚體。此外，SMCC與抗體的隨機(jī)偶聯(lián)導(dǎo)致非均質(zhì)的生物綴合物產(chǎn)物?？贵w重鏈的C-端賴氨酸容易在上游細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)期間發(fā)生剪切，并因此由于差異性剪切的C-末端賴氨酸殘基還可導(dǎo)致偶聯(lián)異質(zhì)性。每個(gè)曲妥珠單抗-DMl的抗體平均含有3.5個(gè)藥物分子(Smith SV.Technology evaluation, Hun901_dml, immunogen.Curr Opin Mol Ther2005 ；7:394-401.)，反映了每個(gè)抗體0到8個(gè)藥物分子的典型分布(Blattler WA, Chari RVJ，Vite GD, Altmann KH, Eds.Anticancer Agents-Frontiers in Cancer Chemotherapy,American Chemical Society, Washington2001 ;317_38.)。抗體和功能化合物的化學(xué)計(jì)量摩爾比是治療活性和綴合物穩(wěn)定性的重要決定因素。Kulkarni等(Cancer Research41:2700-2706(1981))發(fā)現(xiàn)，對甲氨蝶呤來說所獲得的最高效的抗體對毒素比例為每個(gè)抗體約10個(gè)甲氨蝶呤分子，并且增加藥物抗體摩爾比例超過這一閾值的嘗試降低了免疫綴合物的產(chǎn)量并且破壞了抗體活性。類似的結(jié)果已經(jīng)由Kanellos等(JNC75:319-329(1985))報(bào)道。
[0005]隨機(jī)偶聯(lián)的生物綴合物產(chǎn)物的固有不均一性對穩(wěn)定性研究、批次間一致性和過程中(in-process)分析帶來了挑戰(zhàn)。只有付出大量的下游努力并且伴隨了產(chǎn)率的大量損失才能實(shí)現(xiàn)從隨機(jī)偶聯(lián)反應(yīng)生產(chǎn)均質(zhì)的生物綴合物產(chǎn)物。因此需要具有一個(gè)或更多個(gè)預(yù)定位點(diǎn)的抗體用以按化學(xué)計(jì)量比連接功能化合物。
[0006]最近,Seattle Genetics Inc.(美國專利申請2008/0305044)描述了這樣的用于預(yù)定的定點(diǎn)(site-directed)巰基偶聯(lián)的抗體。盡管這種偶聯(lián)模式具有定點(diǎn)方法的所有優(yōu)點(diǎn)，但是三級結(jié)構(gòu)的微小破壞很可能會(huì)影響整體產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性。
[0007]美國專利申請2010/0254943AMIN0 ACID SUBSTITUTED MOLECULES 以及相關(guān)的屬于同一專利家族的申請公開了用于獲得蛋白質(zhì)的位點(diǎn)特定綴合物的方法，所述方法通過向蛋白質(zhì)序列中并入能夠?qū)崿F(xiàn)偶聯(lián)的非天然氨基酸，并且利用這樣的非天然氨基酸殘基作為用于進(jìn)一步化學(xué)或生物修飾的錨定位點(diǎn)。非天然氨基酸并入的氨基酸位置由以下密碼子來指定:通常用于指定天然氨基酸的密碼子(如擺動(dòng)密碼子(wobble codon)、偏好密碼子(bias codon)、第六盒密碼子(sixth box codon)、4盒密碼子(4box codon)或者任意其他宿主細(xì)胞或者體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)可以用于指定非天然氨基酸并入位點(diǎn)的有義密碼子)，或者由通常是終止密碼子(如琥珀(amber)、赭石(ochre)、或蛋白石(opal))或移碼密碼子。當(dāng)框內(nèi)終止密碼子用于人工并入非天然氨基酸時(shí)，細(xì)胞需要敲除同源釋放因子(或翻譯終止因子)。鑒于現(xiàn)有翻譯終止因子之間的冗余性，細(xì)胞總是會(huì)產(chǎn)生含有所并入的非天然氨基酸的正確全長蛋白質(zhì)和過早截短版本的靶蛋白兩者。這使得生產(chǎn)此類實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)之蛋白的方法非常低效，特別是在真核表達(dá)系統(tǒng)中，在真核表達(dá)系統(tǒng)中釋放因子eFRl用作全能的釋放因子并識(shí)別所有三種終止密碼子。盡管這種方法適用于生產(chǎn)能實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)引導(dǎo)且限定之偶聯(lián)的蛋白質(zhì)，但是仍然需要以遠(yuǎn)遠(yuǎn)更高的生產(chǎn)效率來生產(chǎn)此類限定的實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)的蛋白質(zhì)。
[0008]連接至天然占據(jù)N糖基化位點(diǎn)的聚糖結(jié)構(gòu)通常使得蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定。所連接的聚糖的尺寸表觀上對蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性只有極輕微的影響(Shental-Bechor和Levy, 2009),這使得天然N聚糖成為用于綴合功能化合物的理想接頭-即使這樣的化合物具有大的分子量。據(jù)此，美國專利7138371和美國專利申請2010/0048456公開了通過蛋白質(zhì)連接的糖結(jié)構(gòu)將多肽與聚乙二醇相綴合的方法。這兩個(gè)文獻(xiàn)以及相關(guān)的申請和專利都仍然沒有解決導(dǎo)致偶聯(lián)異質(zhì)性的問題。
[0009]因此，仍然需要均一且穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-藥物活性化合物-綴合物，其中所述藥物活性化合物通過精確限定的部分與所述蛋白質(zhì)偶聯(lián)。特別地，通過預(yù)定的糖連接位點(diǎn)將藥物活性化合物與蛋白質(zhì)定點(diǎn)偶聯(lián)是理想的。仍然需要用于以高產(chǎn)率生產(chǎn)蛋白質(zhì)的細(xì)胞，所述蛋白質(zhì)包含此精確限定的偶聯(lián)部分，并且其允許以高度均一并有效的偶聯(lián)藥物活性化合物，還仍然需要使用所述細(xì)胞生產(chǎn)此類蛋白質(zhì)的方法，以及仍然需要生產(chǎn)包含此類蛋白質(zhì)和藥物活性化合物之綴合物的方法。
[0010]本發(fā)明的發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，通過引入到分子(例如脂類或蛋白質(zhì))的糖結(jié)構(gòu)中的人工核心巖藻糖類似物可實(shí)現(xiàn)將藥物活性化合物均一、高效、穩(wěn)定且定點(diǎn)的與所述分子偶聯(lián)。他們還出人意料地發(fā)現(xiàn)通過連接到已并入或連接至蛋白質(zhì)(例如糖蛋白)之氨基酸序列的蛋白質(zhì)-O-巖藻糖基化位點(diǎn)的人工巖藻糖分子可實(shí)現(xiàn)將藥物活性化合物均一、高效、穩(wěn)定且定點(diǎn)的與所述蛋白質(zhì)偶聯(lián)。特別地，他們提供了允許以高產(chǎn)率生產(chǎn)所述分子(例如蛋白質(zhì)或脂質(zhì))以及所述分子(例如蛋白質(zhì)或脂質(zhì))和藥物活性化合物之綴合物的細(xì)胞和方法。所生成的綴合物是熱穩(wěn)定的且均一的。該分子可以是糖基化改造的蛋白質(zhì)、治療性蛋白質(zhì)、抗體、疫苗組分、甚至是包含在有包膜病毒的包膜中的蛋白質(zhì)。有利的總的發(fā)明構(gòu)思是通過下述細(xì)胞產(chǎn)生所述分子(例如蛋白質(zhì)或脂質(zhì))，所述細(xì)胞為了降低其蛋白質(zhì)組的固有巖藻糖基化而被改造使得外源添加的巖藻糖優(yōu)先地在特定位點(diǎn)并入并且這些外源添加的巖藻糖是化學(xué)激活的使得藥物活性化合物可進(jìn)一步選擇性共價(jià)連接到所述分子。添加的藥物活性化合物可以是增強(qiáng)或改變所述分子(例如蛋白質(zhì)如抗體或脂質(zhì))性質(zhì)的化合物，例如其可增加細(xì)胞毒性、提高生物半衰期、誘導(dǎo)所述分子靶向特定的組織、防止降解或聚集、誘導(dǎo)或增強(qiáng)固有或獲得性免疫、或者提高或降低活病毒的感染性。
[0011]在下文所描述的本發(fā)明的一個(gè)或更多個(gè)方面、實(shí)施方案、優(yōu)選實(shí)施方案或更優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含分子(例如蛋白質(zhì)或脂質(zhì))的特定巖藻糖類似物，或者具有定點(diǎn)連接的分子(例如蛋白質(zhì)或脂質(zhì))和藥物活性化合物的特定的巖藻糖類似物連接的綴合物(例如免疫綴合物)可以具有下列一個(gè)或更多個(gè)優(yōu)點(diǎn):
[0012](I)與蛋白質(zhì)的幾丁二糖核心的巖藻糖基化位點(diǎn)相連的巖藻糖類似物允許偶聯(lián)有限的且限定數(shù)目的藥物活性化合物，并且因此使得能夠生產(chǎn)均一偶聯(lián)的綴合物。這有利地影響產(chǎn)品的產(chǎn)率、批次間一致性、治療效果以及產(chǎn)品的可比性。
[0013](II)所述巖藻`糖類似物對整體蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性只有極輕微的影響。因此，可以通過避免無活性的化合物提高治療效果。[0014](III)由于在合適的天冬酰胺殘基附近引入了單個(gè)點(diǎn)突變而實(shí)現(xiàn)的其他所限定N-糖基化位點(diǎn)的人工引入允許每個(gè)蛋白質(zhì)分子進(jìn)一步定點(diǎn)偶聯(lián)其他藥物化合物。
[0015](IV)通過與幾丁二糖核心的巖藻糖基化位點(diǎn)相連的巖藻糖類似物連接藥用活性化合物是有利的，這是因?yàn)榫厶堑倪h(yuǎn)端部分易受到酶促降解，因此在那些遠(yuǎn)端位置偶聯(lián)將導(dǎo)致綴合物的不穩(wěn)定。將藥物活性化合物直接偶聯(lián)到巖藻糖類似物單糖實(shí)現(xiàn)了所述綴合物的化學(xué)均一性和偶聯(lián)穩(wěn)定性，所述巖藻糖類似物單糖與多肽鏈中(C聚糖或O-聚糖)或者聚糖結(jié)構(gòu)中限定的位置相連。對于N-連接聚糖，核心巖藻糖(即α-1，6-連接至N-聚糖之幾丁二糖核心之第一 N-乙酰葡糖胺殘基的還原端的特定巖藻糖殘基)構(gòu)成針對此類N-連接-糖綴合物的可能最短的限定的且均一的糖接頭(glyco-linker)。
[0016](V)巖藻糖類似物可添加到培養(yǎng)基中。然后其被常規(guī)的細(xì)胞攝取并進(jìn)一步代謝。然而，從豐富的單糖甘露糖(即自身是N聚糖的一部分)起始的巖藻糖從頭合成途徑(denovo synthetic pathaway)的有效性提供了 90%的⑶P巖藻糖庫,甚至是在存在外源巖藻糖的情況下亦如此，以及阻止了巖藻糖類似物有效并入糖蛋白并且不可避免地導(dǎo)致糖蛋白的異質(zhì)混合物，使得巖藻糖引導(dǎo)偶聯(lián)處于低水平。出人意料的是，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在含有特定的實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)之巖藻糖類似物的培養(yǎng)基中生長的具有中斷的巖藻糖生物合成途徑的細(xì)胞有效地將所述巖藻糖類似物并入在所述細(xì)胞中產(chǎn)生的糖蛋白。這導(dǎo)致了均一的糖蛋白混合物，其使得巖藻糖引導(dǎo)偶聯(lián)處于高水平。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了與在未摻入實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)的巖藻糖類似物之培養(yǎng)基中生長未修飾親代細(xì)胞系相類似的生長和表現(xiàn)參數(shù)。
[0017](VI)與其他依賴于將實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)的人工氨基酸或糖并入所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的偶聯(lián)技術(shù)不同，本文所描述的技術(shù)不會(huì)遭受此類經(jīng)修飾蛋白質(zhì)常見的使得產(chǎn)率下降的相關(guān)過程。特別是，本發(fā)明人并沒有觀察到如之前關(guān)注巖藻糖炔基或疊氮基巖藻糖之專利申請所描述的核心巖藻糖基化的阻斷。與此相反，本發(fā)明人觀察到疊氮基巖藻糖的意想不到的有效并入。
[0018](VII)結(jié)合了巖藻糖類似物的蛋白質(zhì)和所綴合的藥物活性化合物之間的共價(jià)化學(xué)鍵是穩(wěn)定的，對溫和還原不 敏感，因此降低了不期望的綴合之部分全身性釋放的風(fēng)險(xiǎn)。
[0019](VIII)除了通過所連接的毒素殺傷靶細(xì)胞的抗體藥物綴合物之外，細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)是治療性抗體(例如IgGl型治療性抗體)發(fā)揮作用的主要機(jī)制。這樣的抗體分子應(yīng)當(dāng)允許偶聯(lián)毒素或裝備成為了有效ADCC。還期望藥物綴合的分子無法ADCC，以避免針對效應(yīng)細(xì)胞的毒性。因此,希望毒素連接的綴合物在單一藥物中將兩種作用原理相結(jié)合，特別是如果抗體偶聯(lián)效率達(dá)不到100%。本發(fā)明可以提供一種解決方案:經(jīng)巖藻糖類似物連接的藥物會(huì)消除效應(yīng)子功能(例如ADCC)，在本文所公開的細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體組合物內(nèi)未偶聯(lián)的抗體將缺乏巖藻糖并因此提供增強(qiáng)的ADCC。
[0020](IX)如果直接連接到蛋白質(zhì)之多肽鏈中的巖藻糖類似物能夠?qū)崿F(xiàn)所述蛋白質(zhì)和藥物活性化合物之間化學(xué)上均一的偶聯(lián)是特別有利的。這在不修飾天然含有單個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)-O-巖藻糖基化位點(diǎn)之蛋白質(zhì)的情況下實(shí)現(xiàn)。對于不含有蛋白質(zhì)-O-巖藻糖基化位點(diǎn)或含有少于期望的蛋白質(zhì)-O-巖藻糖基化位點(diǎn)的蛋白質(zhì)來說，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)并入EGF樣重復(fù)(代表這樣的位點(diǎn))是非常理想的。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0021]在第一方面，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)包含巖藻糖類似物之分子的真核細(xì)胞，其中
[0022](i)在所述細(xì)胞中從⑶P-D-甘露糖起始的⑶P-L-巖藻糖合成途徑被阻斷，并且
[0023](ii)所述細(xì)胞包含⑶P-L-巖藻糖類似物。
[0024]在第二方面，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)包含巖藻糖類似物之分子的方法，包括以下步驟:
[0025](i)提供根據(jù)第一方面的真核細(xì)胞，和
[0026](ii)從i)中的細(xì)胞分離包含巖藻糖類似物的分子。
[0027]在第三方面，本發(fā)明涉及包含可通過第二方面的方法獲得的巖藻糖類似物的分子。
[0028]在第四方面，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)綴合物的方法，所述綴合物包含含有巖藻糖類似物和藥物活性化合物的分子，所述方法包括下列步驟:
[0029](i)實(shí)施第二方面的方法，和
[0030](ii)通過巖藻糖類似物將藥物活性化合物共價(jià)地偶聯(lián)到包含所述巖藻糖類似物的分子。
[0031]在第五方面，本發(fā)明涉及通過第四方面獲得的包含含有巖藻糖類似物和藥物活性化合物之分子的綴合物。
[0032]在第六方面，本發(fā)明涉及綴合物，其包含含有一個(gè)或更多個(gè)以下結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或多肽:
[0033]-NG-cF * -Y0-C,
[0034]其中，每個(gè)連接到所述蛋白質(zhì)或多肽中所包含的N-糖基化位點(diǎn)，
[0035]NG是所述蛋白質(zhì)或多肽的N-連接的糖部分，
[0036]CF *是核心巖藻糖類似物，
[0037]Y是間隔子單元，其中，O為整數(shù)O或1，以及
[0038]C是藥物活性化合物。
[0039]在第七方面中，本發(fā)明涉及包含蛋白質(zhì)或多肽的綴合物，所述蛋白質(zhì)或多肽含有一個(gè)或更多個(gè)EGF樣重復(fù)，所述重復(fù)包含連接有以下結(jié)構(gòu)的絲氨酸和/或蘇氨酸殘基:
[0040]-F * -Yp-C，
[0041]其中
[0042]F *是直接O-連接至所述絲氨酸和/或蘇氨酸殘基的巖藻糖類似物部分，
[0043]Y是間隔子單元，其中P是整數(shù)O或1，且
[0044]C是藥物活性化合物。
[0045]本
【發(fā)明內(nèi)容】
并沒有描述本發(fā)明的所有特征。
[0046]發(fā)明詳述
[0047]在下面對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述之前，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于本文中描述的特定方法、方案和試劑，因?yàn)樗鼈兛梢杂兴兓＿€應(yīng)當(dāng)理解，本文中使用的術(shù)語僅出于描述特定實(shí)施方案的目的，而非意在限制本發(fā)明的范圍(其僅由所附權(quán)利要求所限定)。除非另有定義，本文中使用的所有科技術(shù)語均具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解相同的含義。
[0048]優(yōu)選地，本文使用的術(shù)語如“A multilingual glossary of biotechnologicalterms: (I UPAC Recommendations)”，Leuenberger, H.G.ff, Nagel, B.和 KiHbl，H.編(1995)，, Helvetica Chimica Acta, CH_4010Basel, Switzerland 中所述地定義。
[0049]本說明書全文中引用了幾篇文獻(xiàn)。本文中引用的每篇文獻(xiàn)(包括所有專利、專利申請、科學(xué)出版物、制造商的說明書、說明、GenBank登錄號序列提交等)，無論在上文或下文中，均通過引用以整體并入本文中。本文中的任何內(nèi)容均不應(yīng)看作是承認(rèn)本發(fā)明無權(quán)借助在先發(fā)明而使本發(fā)明早于這些公開物。
[0050]下面將描述本發(fā)明的要素。這些要素通過具體的實(shí)施方案列出，然而，應(yīng)當(dāng)理解，它們可以以任意方式和任意數(shù)量進(jìn)行組合以獲得額外的實(shí)施方案。多方面描述的實(shí)施例和優(yōu)選實(shí)施方案不應(yīng)看作是將本發(fā)明僅僅限制為明確描述的實(shí)施方案。這種描述應(yīng)當(dāng)理解為支持并且涵蓋了將明確描述的實(shí)施方案與任意數(shù)量的公開和/或優(yōu)選的要素進(jìn)行組合的實(shí)施方案。此外，除非上下文另有說明，否則本申請中所描述的所有要素的任意排列和組合應(yīng)當(dāng)認(rèn)為已被本申請的描述公開。本發(fā)明的中心在于一種用于高效生產(chǎn)位點(diǎn)特異性巖藻糖連接的糖蛋白綴合物的方法。然而，通過該方法可實(shí)現(xiàn)的獨(dú)特類型產(chǎn)品的特定特征也是重要的并且在實(shí)施例1中特別的考慮。
[0051]本說明書和隨后的權(quán)利要求全文中，除非上下文另有要求，詞語“包含”及其變化形式例如“包含”和“包括”，將被理解為暗示包括所聲明的整數(shù)或步驟或者整數(shù)組或步驟組，但不排除任何其他整數(shù)或步驟或者其他整數(shù)組或步驟組。如本說明書和所附的權(quán)利要求書中所使用的，沒有數(shù)詞修飾的指代包括復(fù)數(shù)指代，除非內(nèi)容另有明確規(guī)定。[0052]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“肽”是指通過肽鍵連接的氨基酸的短聚合物。它具有與蛋白質(zhì)中的那些相同的肽鍵，但在長度上通常較短。最短的肽是二肽，由通過單個(gè)肽鍵連接的兩個(gè)氨基酸組成。也可以有三肽，四肽，五肽等。肽優(yōu)選為小于約30個(gè)氨基酸長以及更優(yōu)選小于約20個(gè)氨基酸長的肽。
[0053]如本文所使用的術(shù)語“多肽”，是指由通過肽鍵連接在一起的氨基酸的單一線性鏈構(gòu)成的蛋白質(zhì)的一部分。所述氨基酸鏈優(yōu)選為大于約30個(gè)氨基酸長或長于30個(gè)氨基酸。
[0054]如本文所使用的術(shù)語“蛋白質(zhì)”,是指包含一個(gè)或更多個(gè)復(fù)原(resume) 二級和三級結(jié)構(gòu)之多肽的蛋白質(zhì)以及另外指由一些形成四級結(jié)構(gòu)的氨基酸鏈(例如一些亞基)構(gòu)成的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)有時(shí)具有連接的非肽基團(tuán)，其可以被稱作輔基(prosthetic group)或輔因子(cofactor)。
[0055]如在本發(fā)明的上下文中使用的術(shù)語“多肽片段”，是指與全長多肽相比于具有缺失(例如氨基末端缺失、和/或羧基末端缺失、和/或內(nèi)部缺失)的多肽。
[0056]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“融合蛋白”指包含與異源氨基酸序列相偶聯(lián)之多肽或多肽片段的蛋白質(zhì)。因?yàn)榭梢詷?gòu)建成包含來自兩種或更多種不同蛋白質(zhì)的兩個(gè)或更多個(gè)所需功能元件，所以融合蛋白是有用的。
[0057]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“抗體”、“免疫球蛋白”、“Ig”和“Ig分子”可互換使用。每條重鏈的CH2結(jié)構(gòu)域包含單個(gè)位于天冬酰胺殘基的用于N-連接糖基化的位點(diǎn)，其將N-聚糖連接至抗體分子,通常在殘基Asn-297處(Kabat等人，Sequence of proteins ofimmunological interest, Fifth Ed., U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication N0.91-3242)。該術(shù)語的范圍包括 Ig 類，即 IgG, IgA, IgE, IgM 和 IgD0該術(shù)語的范圍還包括IgG的亞型，即IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。該術(shù)語取其廣義的含義，包括單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、單鏈抗體和多特異性抗體(例如雙特異性抗體)。
[0058]本發(fā)明上下文中使用的術(shù)語“抗體片段”是指含有重鏈免疫球蛋白恒定區(qū)CH2結(jié)構(gòu)域的至少一部分(其包含CH2結(jié)構(gòu)域的N-連接糖基化位點(diǎn))的抗體片段。它還可以是能夠特異性結(jié)合抗原，即至少一條\鏈和/或Vh鏈或其結(jié)合部分。
[0059]如本文使用的術(shù)語“Fe結(jié)構(gòu)域”和“Fe區(qū)”，是指抗體重鏈的C-末端部分，其與稱作Fe受體的細(xì)胞表面受體以及補(bǔ)體系統(tǒng)的某些蛋白相互作用。這個(gè)性質(zhì)允許抗體激活免疫系統(tǒng)。
[0060]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“糖蛋白”是指含有寡糖鏈(聚糖)的蛋白質(zhì)，所述寡糖鏈與所述蛋白質(zhì)的多肽側(cè)鏈共價(jià)連接。在共翻譯或翻譯后修飾中，所述碳水化合物與所述蛋白質(zhì)相連接。該過程被稱為“糖基化”，例如N-糖基化或O-糖基化。
[0061]“N-糖基化”是指糖鏈添加至天冬酰胺側(cè)鏈上的酰胺氮?！癘-糖基化”是指糖鏈添加至羥賴氨酸、羥脯氨酸、絲氨酸或蘇氨酸側(cè)鏈上的羥基氧。
[0062]本發(fā)明上下文中使用的術(shù)語“糖脂”是指與碳水化合物相連的脂質(zhì)。其出現(xiàn)于碳水化合物鏈與細(xì)胞膜的胞質(zhì)外面(exoplasmic surface)上的磷脂相連處。在所有真核細(xì)胞膜的外表面上發(fā)現(xiàn)了碳水化合物。糖脂的碳水化合物結(jié)構(gòu)受糖基轉(zhuǎn)移酶(其添加脂質(zhì))和糖基水解酶(其對添加后的聚糖進(jìn)行修飾)的調(diào)控。糖脂還出現(xiàn)于有包膜病毒(包括用作減毒活疫苗的病毒)的表面上。
[0063]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“聚糖”或“糖部分”可互換使用，其是指多籃或寡篚。術(shù)語“寡糖”是指含有小數(shù)目(通常3~10個(gè))組成糖(component sugar,也稱為“簡單糖”或“單糖”)的糖聚合物。術(shù)語“多糖”是指由通過糖苷鍵連接的重復(fù)單元(單糖或二糖，通常> 10個(gè))形成的多聚碳水化合物結(jié)構(gòu)。聚糖可被發(fā)現(xiàn)與蛋白質(zhì)相連接(如在糖蛋白中)或者與脂質(zhì)相連接(如在糖脂中)。該術(shù)語涵蓋了 N-聚糖(例如，高甘露糖型N-聚糖、復(fù)合型N-聚糖或雜合型N-聚糖)、O-聚糖或者。
`[0064]在本發(fā)明的上下文中，下列單糖縮寫如下:葡萄糖=Glc，半乳糖=Gal，甘露糖=Man,巖藻糖=Fuc或F, N-乙酰半乳糖胺=GalNAc,或N-乙酰葡糖胺=GlcNAc,巖藻糖類似物=Fuc *或F *。
[0065]“N-聚糖”是指N-連接的多籃或寡糖。N-連接的寡糖是例如連接了或者通過N-乙酰葡糖胺殘基連接了蛋白質(zhì)中天冬酰胺殘基的酰胺氮的寡糖。N-糖蛋白上發(fā)現(xiàn)的主要的糖類有葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸(例如N-乙酰-神經(jīng)氨酸(NANA))。對糖基團(tuán)的加工與翻譯共同發(fā)生在ER腔中，并且對于N-連接的糖蛋白來說在高爾基體中繼續(xù)進(jìn)行。N-聚糖具有共同的Man3GlcNAc2五糖核心(“Man”是指甘露糖，“Glc”是指葡萄糖，以及“NAc”是指N-乙?；?，GlcNAc是指N-乙酰葡糖胺)。N-聚糖根據(jù)分支(“觸角”)數(shù)目而不同，所述分支包含添加至Man3GlcNAc2核心結(jié)構(gòu)(也稱為“三甘露糖核心”、“五糖核心”或“寡甘露糖(paucimannose)核心”)的外周糖(例如GlcNAc、半乳糖、巖藻糖和唾液酸)。N-聚糖根據(jù)其分支組成而分類(例如高甘露糖型、復(fù)合型或雜合型)。
[0066]“高甘露糖型N-聚糖”是指具有五個(gè)甘露糖殘基(Man5)或更多甘露糖殘基(例如Man6> Man7或Man8)的N-連接多糖或寡糖。
[0067]“復(fù)合型N-聚糖”是指通常具有與“三甘露糖”核心的1，3甘露糖臂連接的至少一個(gè)GlcNAc以及與“三甘露糖”核心的1，6甘露糖臂連接的至少一個(gè)GlcNAc的N-連接多糖或寡糖。復(fù)合型N-聚糖還可以具有任選地用唾液酸或其衍生物(例如，“NANA”或“NeuAc”，其中“Neu”是指神經(jīng)氨酸，“Ac”是指乙?；?進(jìn)行修飾的半乳糖(“Gal”)或N-乙酰半乳糖胺(“GalNAc”)殘基。復(fù)合型N-聚糖還可以具有鏈內(nèi)替換，包括“二等分型”GlcNAc和核心巖藻糖(“Fuc”)。本發(fā)明上下文中的復(fù)合型N-聚糖可包含O個(gè)(G0)、1個(gè)(Gl)或2個(gè)(G2)半乳糖以及與還原端上第一個(gè)GlcNAc相連的一個(gè)巖藻糖(分別表不為GOF、GIF、G2F)。
[0068]“雜合型N-聚糖”是指在三甘露糖核心的1，3甘露糖臂末端上具有至少一個(gè)GlcNAc以及在所述三甘露糖核心的1，6甘露糖臂上的O個(gè)或更多個(gè)甘露糖的N-連接的多糖或寡糖。
[0069]本發(fā)明上下文中描述糖結(jié)構(gòu)時(shí)使用的縮寫如下:
[0070]核心=Man3GlcNAc2
[0071]GO = GlcNAc2 Man3 GlcNAc2
[0072]GO-GIcNAc =缺少 I 個(gè) GlcNAc 的 GO 結(jié)構(gòu)(即，GlcNAc Man3 GlcNAc2)
[0073]Gl =含有I個(gè)額外的半乳糖殘基的GO結(jié)構(gòu)(即，Gal GlcNAc2 Man3GlcNAc2)
[0074]G2 =含有2個(gè)額外的半乳糖殘基的GO結(jié)構(gòu)(即，Gal2 GlcNAc2 Man3GlcNAc2)
[0075]GOF =含有I個(gè)額外的巖藻糖殘基的GO結(jié)構(gòu)，所述巖藻糖殘基與五糖核心的第一個(gè) GlcNAc 殘基相連(即，GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 Fuc)
[0076]GOF-GlcNAc =含有I個(gè)額外的巖藻糖殘基的G0_GlcNAc結(jié)構(gòu)，所述巖藻糖殘基與五糖核心的第一個(gè)GlcNAc殘基相連(即，GlcNAc Man3GlcNAc2Fuc)
[0077]GlF =含有I個(gè)額外的巖藻糖殘基的Gl結(jié)構(gòu)，所述巖藻糖殘基與五糖核心的第一個(gè) GlcNAc 殘基相連(即，Gal GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 Fuc)
[0078]G2F =含有I個(gè)額外的巖藻糖殘基的G2結(jié)構(gòu)，所述巖藻糖殘基與五糖核心的第一個(gè) GlcNAc 殘基相連(即，Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 Fuc)
[0079]Man4 =含有I個(gè)額外的甘露糖殘基的核心結(jié)構(gòu)(即，Man Man3 GlcNAc2)
[0080]Man5 =含有2個(gè)額外的甘露糖殘基的核心結(jié)構(gòu)(即，Man2 Man3 GlcNAc2)
[0081]Man6 =含有3個(gè)額外的甘露糖殘基的核心結(jié)構(gòu)(即，Man3 Man3 GlcNAc2)
[0082]Man7 =含有4個(gè)額外的甘露糖殘基的核心結(jié)構(gòu)(即，Man4 Man3 GlcNAc2)
[0083]Man8 =含有5個(gè)額外的甘露糖殘基的核心結(jié)構(gòu)(即，Man5 Man3 GlcNAc2)
[0084]為了示例性的描述包含巖藻糖類似物的糖結(jié)構(gòu)，上述F(巖藻糖)可以簡單地用F* (巖藻糖類似物)替代。例如，某種情況下，使用本發(fā)明的方法產(chǎn)生具有包含核心巖藻糖類似物(cF * )的N-聚糖結(jié)構(gòu)的抗體。
[0085]“O-聚糖”是指O-連接的多籃或寡糖。O-連接的聚糖通常通過絲氨酸或蘇氨酸殘基與肽鏈相連。O-連接的糖基化是真正的翻譯后事件，其發(fā)生于高爾基體中，并且其不需要共有的序列且蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)不需要寡糖前體。O-連接的聚糖的最常見類型包含初始GalNAc殘基(或Tn表位)，這些常被稱為粘蛋白(mucin)型聚糖。其它的O-連接聚糖包括葡糖胺、木糖、半乳糖、巖藻糖或甘露糖作為初始糖與Ser/Thr殘基結(jié)合。O-連接的糖蛋白通常是大的蛋白(> 200kDa)，其常常是雙“觸角”型的，且分支相對少于N-聚糖。
[0086]動(dòng)物和人細(xì)胞有巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，其將巖藻糖殘基添加至蛋白質(zhì)上N-聚糖的還原性末端處的GlcNAc殘基或者糖脂上的其他新生糖結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)或脂質(zhì)所連接的糖部分的巖藻糖基化需要核苷酸糖GDP-L-巖藻糖作為供體，并且還存在特定的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，其將巖藻糖基殘基從供體轉(zhuǎn)移到接受體分子(Becker和Lowe，1999)。在真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)中，GDP-L-巖藻糖可以通過兩種不同的途徑合成，通過較主要的巖藻糖從頭途徑(de novo pathway)或通過次要補(bǔ)救途徑(Becker和Lowe, 1999)。補(bǔ)救途徑或“清道夫(scavenger) ”途徑是GDP-L-巖藻糖的次要來源(大約10% )，來自細(xì)胞培養(yǎng)基的游離巖藻糖和巖藻糖基化之糖蛋白的缺乏可輕易地阻斷該來源。補(bǔ)救途徑從細(xì)胞外巖藻糖起始，通過巖藻糖特異性質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)體(transporter)可以將細(xì)胞外巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)入胞質(zhì)區(qū)室?；蛘?，從內(nèi)吞的糖蛋白切除的巖藻糖可以進(jìn)入胞質(zhì)。巖藻糖激酶將胞質(zhì)L-巖藻糖磷酸化為巖藻糖-1-磷酸，然后GDP-巖藻糖焦磷酸化酶將其轉(zhuǎn)變?yōu)镚DP-L-巖藻糖(圖1，右圖)。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)提示補(bǔ)救途徑對胞衆(zhòng)GDP-L-巖藻糖池(pool)來說貢獻(xiàn)相對較小(Becker andLowe,1999)。
[0087]更加占據(jù)優(yōu)勢地位的巖藻糖從頭途徑從GDP-D-甘露糖起始并且由GDP-甘露糖脫水酶(⑶P-mannose dehydratase, GMD)和⑶P-酮-脫氧-甘露糖-差向異構(gòu)酶 /GDP-麗-脫氧-半乳糖-還原酶(GDP-keto-deoxy-mannose-epimerase/GDP-keto-deoxy-galactose-reduct ase, GMER,在人中也稱作 Fx)組成，二者均位于細(xì)胞質(zhì)，其共同將⑶P-甘露糖轉(zhuǎn)變?yōu)棰荘-L-巖藻糖(圖1，左圖)。隨后，⑶P-L-巖藻糖通過位于高爾基體膜中的⑶P-巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)體被轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體。一旦⑶P-L-巖藻糖已進(jìn)入高爾基體腔內(nèi)區(qū)室，巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶可以將⑶P-L-巖藻糖共價(jià)連接至高爾基內(nèi)的新生糖部分。特別地，巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FutS)通過1，6_連接將巖藻糖殘基轉(zhuǎn)移至在N-聚糖還原末端的GlcNAc殘基的6位。
[0088]如上所述，將藥物活性化合物以穩(wěn)定、特異、均一、有效的方式偶聯(lián)至蛋白質(zhì)(例如抗體)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中是非常期望的。特別地，經(jīng)預(yù)定連接位點(diǎn)的綴合物的定點(diǎn)偶聯(lián)是期望的。
[0089]本發(fā)明的發(fā)明人出人意料地確定，通過引入分子(例如脂質(zhì)或蛋白質(zhì)(例如糖蛋白例如抗體))糖結(jié)構(gòu)中的人工核心巖藻糖類似物可以實(shí)現(xiàn)藥物活性化合物與所述分子的均一、有效、穩(wěn)定且定點(diǎn)的偶聯(lián)。他們還出人意料地發(fā)現(xiàn)，通過連接到蛋白質(zhì)-O-巖藻糖基化位點(diǎn)的人工巖藻糖類似物可實(shí)現(xiàn)將藥物活性化合物與蛋白質(zhì)(例如糖蛋白例如抗體)的均一、有效、穩(wěn)定且定點(diǎn)的偶聯(lián)，所述蛋白質(zhì)-O-巖藻糖基化位點(diǎn)并入或連接至所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列。此外，所述巖藻糖類似物相比于天然巖藻糖分子有特定的優(yōu)勢，所述巖藻糖類似物允許藥物活性化合物特異性地偶聯(lián)至巖藻糖類似物所連接的分子(例如蛋白質(zhì)或脂質(zhì))。
[0090]此外，本發(fā)明的發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)，在起始自GDP-D-甘露糖的GDP-L-巖藻糖合成途徑(從頭途徑)被阻斷的細(xì)胞中，可以以高產(chǎn)量產(chǎn)生在其糖部分或氨基酸包含有巖藻糖類似物以取代天然巖藻糖的分子。其原因是在這樣的糖改造的(gycoengineered)細(xì)胞中天然巖藻糖的任何競爭性并入被完全消除。使用無巖藻糖培養(yǎng)基和巖藻糖從頭合成途徑被阻斷的細(xì)胞使得巖藻糖類似物作為此類細(xì)胞中存在的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的唯一底物。此外，由于天然GDP-巖藻糖`(巖藻糖從頭合成途徑的產(chǎn)物)是補(bǔ)救途徑巖藻糖激酶的競爭性抑制劑，從頭合成的阻斷另外地加速補(bǔ)救途徑的效率，由此加速了巖藻糖類似物的代謝的⑶P形式(metabolized⑶P form)的產(chǎn)生,其可并入所述細(xì)胞中存在的分子(例如并入蛋白質(zhì)的新生糖結(jié)構(gòu)中)。因此，使用巖藻糖從頭合成途徑被阻斷并且包含巖藻糖類似物的細(xì)胞，可以以化學(xué)計(jì)量上有效的方式產(chǎn)生在其表面上帶有巖藻糖類似物的分子(例如蛋白質(zhì)或脂類)。
[0091]這樣，在第一方面，本發(fā)明提供用于生產(chǎn)包含巖藻糖類似物之分子的真核細(xì)胞，其中
[0092](i)在所述細(xì)胞中從⑶P-D-甘露糖起始的⑶P-L-巖藻糖合成途徑被阻斷，并且
[0093](ii)所述細(xì)胞包含⑶P-L-巖藻糖類似物。
[0094]本發(fā)明的上下文中所使用術(shù)語“包含巖藻糖類似物的分子”指在本發(fā)明的真核細(xì)胞(優(yōu)選脊椎動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生的任意化合物，所述細(xì)胞能夠?qū)r藻糖類似物(替代天然巖藻糖)添加至所述化合物(如添加至其其糖部分或氨基酸)，即具有將巖藻糖類似物(替代天然巖藻糖)添加至所述所述化合物(如添加至其糖部分或氨基酸)的能力，所述化合物包含至少一個(gè)巖藻糖類似物(例如在其糖部分或氨基酸上)。這樣的分子包含聚糖轉(zhuǎn)移酶所識(shí)別的至少一個(gè)或更多個(gè)序列模體，例如包含Asp、Ser或Thr殘基，優(yōu)選三肽序列Asn-X-Ser/Thr,其中X是除Pro之外的任意氨基酸。在本發(fā)明的細(xì)胞中包含的所述聚糖轉(zhuǎn)移酶還能夠?qū)?如果天然巖藻糖不可用)巖藻糖類似物連接至所述分子(例如其糖部分或氨基酸)。換句話說，在未改變的細(xì)胞中產(chǎn)生后可天然地包含巖藻糖分子(例如在其糖部分或氨基酸上)的分子在本發(fā)明的細(xì)胞中產(chǎn)生后包含巖藻糖類似物(例如在其糖部分或氨基酸上)。產(chǎn)生包含具有天然巖藻糖之氨基酸或糖部分的細(xì)胞為例如CHO、AGE1.HN, AGE1.CR、AGE1.CR.PIX 或 AGE1.CS 細(xì)胞。
[0095]技術(shù)人員可容易地通過實(shí)驗(yàn)確定在特定分子(例如抗體分子)的糖部分上巖藻糖類似物的存在和/或巖藻糖類似物的量，其通過(i)在產(chǎn)生目的分子的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)胞，(?)從所述細(xì)胞分 離所述分子和(iii)針對連接至所述分子糖部分的巖藻糖殘基分析所述分子的糖鏈結(jié)構(gòu)，并確定巖藻糖殘基的類型和/或計(jì)算所述分子的糖鏈結(jié)構(gòu)上存在的巖藻糖殘基的平均值，以及(iv)將結(jié)果與在用無巖藻糖類似物的模式產(chǎn)生所述分子的相同細(xì)胞中產(chǎn)生的相同分子(例如抗體分子)的結(jié)果比較。優(yōu)選地，在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中使用的細(xì)胞是相同的，差別僅在于其一的細(xì)胞(本發(fā)明的細(xì)胞)在巖藻糖類似物的存在下培養(yǎng)。優(yōu)選地，兩者的細(xì)胞在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)以排除可以由培養(yǎng)條件的不同導(dǎo)致的巖藻糖基化的變化。相同的方法可用于通過實(shí)驗(yàn)確定在特定分子(例如抗體分子)的氨基酸結(jié)構(gòu)上巖藻糖類似物的存在和巖藻糖類似物的量。
[0096]可以通過二維糖鏈作圖法容易地分析分子(例如抗體分子)中的糖鏈結(jié)構(gòu)(Anal.Biochem., 171,73 (1988), Biochemical Experimentation Methods23-Methodsfor Studying Glycoprotein Sugar Chains(Japan Scientific Societies Press)Reiko Takahashi編輯(1989))。由二維糖鏈作圖法推斷出的結(jié)構(gòu)可以通過進(jìn)行每個(gè)糖鏈的質(zhì)譜(例如MALDI (基質(zhì)輔助激光解吸/電離，Matrix Assisted Laser Desorption/1nisation)-T0F-MS)來確定。
[0097]本文所使用的術(shù)語從⑶P-D-甘露糖起始的⑶P-L-巖藻糖合成途徑(從頭途徑)被“阻斷”指所述途徑被阻斷至少50 %，優(yōu)選地至少60 %或70 %，更優(yōu)選地至少80 %或90%,以及最優(yōu)選地至少 95%或 100%，例如至少 50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%。技術(shù)人員可以容易地通過實(shí)驗(yàn)確定從頭途徑(de novo pathway)阻斷的等級,其通過確定在從⑶P_D_甘露糖起始的⑶P-L-巖藻糖合成途徑(從頭途徑)被阻斷或擾亂的細(xì)胞中所產(chǎn)生的⑶P-L-巖藻糖水平并將其與在從GDP-D-甘露糖起始的GDP-L-巖藻糖合成途徑(從頭途徑)未被阻斷或擾亂的細(xì)胞中所產(chǎn)生的GDP-L-巖藻糖水平進(jìn)行比較。在本文中，例如GDP-L-巖藻糖的水平相比于在對照細(xì)胞中確定的GDP-L-巖藻糖的水平降低50%意味著從頭途徑阻斷50%，以及GDP-L-巖藻糖的水平相比于在對照細(xì)胞中確定的GDP-L-巖藻糖的水平降低100%意味著從頭途徑阻斷100%。優(yōu)選地，在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中使用的細(xì)胞是相同的，差別僅在于其一的細(xì)胞(本發(fā)明的細(xì)胞)包含例如至少一種使用⑶P-6-脫氧-D-來蘇-4-己酮糖作為底物的酶，其中所述酶不催化將GDP-6-脫氧-D-來蘇-4-己酮糖轉(zhuǎn)變?yōu)镚DP-L-巖藻糖的反應(yīng)從而阻斷從頭途徑。優(yōu)選地，兩者的細(xì)胞都在相同培養(yǎng)條件(例如細(xì)胞培養(yǎng)基或培養(yǎng)時(shí)間)下培養(yǎng)以排除可以由培養(yǎng)條件的不同導(dǎo)致的巖藻糖基化的變化。特別優(yōu)選的是兩者的細(xì)胞都在缺乏外部巖藻糖源的條件下培養(yǎng)，以消除補(bǔ)救途徑對在所述細(xì)胞中產(chǎn)生的GDP-L-巖藻糖之量的影響。此外，技術(shù)人員知道如何確定GDP-L-巖藻糖的水平以計(jì)算從頭途徑之阻斷的水平/等級。
[0098]可以任意方式或者在從頭途徑中任意步驟(例如在一個(gè)或更多個(gè)步驟)實(shí)現(xiàn)阻斷從GDP-D-甘露糖起始的GDP-L-巖藻糖合成途徑(從頭途徑)，只要在所述細(xì)胞中(參見上文)從⑶P-D-甘露糖產(chǎn)生⑶P-L-巖藻糖的水平降低(至少50% )，優(yōu)選地沒有⑶P-L-巖藻糖。這可以通過以下來實(shí)現(xiàn):(i)所述途徑中所涉及酶的突變使得其酶活性降低或消除，(?)敲除或部分敲除基因或調(diào)節(jié)所述基因的啟動(dòng)子區(qū)域，使得不產(chǎn)生所述通路中所涉及的具有酶活性的酶或者使得所述通路中所涉及的具有酶活性的酶產(chǎn)生減少，和/或(iii)用miRNA技術(shù)敲低或部分敲低編碼所述酶的mRNA，使得不產(chǎn)生所述通路中所涉及的具有酶活性的酶或使得所述通路中所涉及的具有酶活性的酶產(chǎn)生減少(參見圖1，左圖)。所述酶可以是例如⑶P-甘露糖脫水酶(GMD)和/或⑶P-巖藻糖合成酶(GFS)。
[0099]在真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)中包含糖部分的分子(例如蛋白質(zhì)或脂質(zhì))的巖藻糖基化需要核苷酸糖(GDP-L-巖藻糖)做為供體并且還存在特定的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，其將巖藻糖基殘基從供體轉(zhuǎn)移到接受體分子。如上所述，在真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)中可以通過兩種不同的途徑合成GDP-L-巖藻糖，通過較主要的巖藻糖從頭途徑或次要的補(bǔ)救途徑。
[0100]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，從GDP-D-甘露糖起始的GDP-L-巖藻糖合成途徑(從頭途徑)被阻斷，優(yōu)選地阻斷80%，更優(yōu)選地阻斷90%和最優(yōu)選地阻斷95%或100%，其由于在真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)中存在下述酶，所述酶使用GDP-6-脫氧-D-來蘇-4-己酮糖作為底物，但不催化將⑶P-6-脫氧-D-來蘇-4-己酮糖轉(zhuǎn)變?yōu)棰荘-L-巖藻糖的反應(yīng)。從這方面講，應(yīng)當(dāng)注意術(shù)語“⑶P-6-脫氧-D-來蘇-4-己酮糖”與術(shù)語“⑶P-4-酮-6-脫氧-D-甘露糖”是同義詞。二者在本文可以交換使用。
[0101]在真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)中存在的所述酶可以是使用GDP-6-脫氧-D-來蘇-4-己酮糖作為底物的任意酶，前提是所述酶不催化將GDP-6-脫氧-D-來蘇-4-己酮糖轉(zhuǎn)變?yōu)镚DP-L-巖藻糖的反應(yīng)。在真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)中所述酶將GDP-6-脫氧-D-來蘇-4-己酮糖轉(zhuǎn)變?yōu)闊o法再用于⑶P-L-巖藻糖合成的產(chǎn)物。優(yōu)選地包含于真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)的酶是通常不存在于所述細(xì)胞中的酶，即異源或人工酶，例如來自其他界生物(例如原核生物，優(yōu)選細(xì)菌)的酶。作為替代地，所述酶也可以是通?？梢栽谡婧思?xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)中存在的酶，但其不將底物GDP-6-脫氧-D-來蘇-4-己酮糖轉(zhuǎn)變?yōu)镚DP-L-巖藻糖，而是轉(zhuǎn)變?yōu)椴煌漠a(chǎn)物，例如由于突變的存在。
[0102]所述酶(優(yōu)選地存在與真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)中)可以通過例如蛋白質(zhì)顯微注射(microinjection)、蛋白質(zhì)電穿孔(electroporation)或蛋白質(zhì)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(Iipofection)引入所述細(xì)胞。也可以通過例如DNA顯微注射、DNA電穿孔或DNA脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將編碼所述酶的核酸序列引入，優(yōu)選地整合在表達(dá)載體中，至脊髓動(dòng)物細(xì)胞中，其隨后在真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)中分別轉(zhuǎn)錄并翻譯為各蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知用于將蛋白質(zhì)或編碼蛋白質(zhì)的核酸序列引入真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)的分子生物學(xué)技術(shù)，例如顯微注射、電穿孔或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，并且知道如何操作這些技術(shù)。
[0103]優(yōu)選地，在真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)中存在兩個(gè)或更多個(gè)(即2、3、4、5、6或7)使用⑶P-6-脫氧-D-來蘇-4-己酮糖作為底物但不催化⑶P-6-脫氧-D-來蘇-4-己酮糖轉(zhuǎn)變?yōu)镚DP-L-巖藻糖的酶，從而有效地阻斷所述細(xì)胞中巖藻糖從頭途徑。
[0104]優(yōu)選地，所述使用⑶P-6-脫氧-D-來蘇-4-己酮糖作為底物的酶選自⑶P-6-脫氧-D-來蘇-4-己酮糖還原酶(與⑶P-4-酮-6-脫氧-D-甘露糖還原酶同義，簡稱RMD)、⑶P-過骨胺合成酶(perosamine synthetase) (Per)、⑶P-6_脫氧_D_塔洛糖合成酶(GTS)、⑶P-巖藻糖合成酶Cysl09Ser- (GFS-Cys 109Ser)突變體、⑶P_4_酮-6-脫氧甘露糖_3_脫水酶(ColD)，優(yōu)選地⑶P-4-酮-6-脫氧甘露糖-3-脫水酶(ColD)結(jié)合⑶P-L-可立糖合酶(ColC)，以及其變體，優(yōu)選地所述酶來自細(xì)菌或源自這樣的細(xì)菌酶。更優(yōu)選地，所述使用⑶P-6-脫氧-D-來蘇-4-己酮糖作為底物的酶⑶P-6-脫氧-D-來蘇-4-己酮糖還原酶(RMD)、⑶P-巖藻糖合成酶Cysl09Ser-(GFS-Cysl09Ser)突變體和/或⑶P-過骨胺合成酶(Per)。
[0105]⑶P-6-脫氧-D-來蘇-4-`己酮糖還原酶(RMD)將底物⑶P_6_脫氧-D-來蘇_4_己酮糖還原為GDP-D-鼠李糖。在細(xì)菌中GDP-D-鼠李糖是D-鼠李糖基化的核苷酸糖供體，其不存在于真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)中。真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)中還缺乏特異性鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶，以致于GDP-D-鼠李糖不能摻入到真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)內(nèi)糖蛋白或糖脂的新生糖結(jié)構(gòu)中。
[0106]⑶P-6-脫氧-D-塔洛糖合成酶(GTS)將底物⑶P_6_脫氧-D-來蘇_4_己酮糖還原成GDP-脫氧-D-塔洛糖。GDP-脫氧-D-塔洛糖是細(xì)菌中6-脫氧-D-塔洛糖基化的核苷酸糖供體，其不存在于真核生物(例如脊椎動(dòng)物)中。真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)中還缺乏特異性脫氧塔洛糖基轉(zhuǎn)移酶，以致于GDP-脫氧-D-塔洛糖不能摻入到脊椎動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的新生糖結(jié)構(gòu)中。
[0107]此外，⑶P-過骨胺合成酶(Per)將底物⑶P_6_脫氧_D_來蘇_4_己酮糖還原并且轉(zhuǎn)氨基成⑶P-D-過骨胺(⑶P-D-perosamine)(⑶P_D_4_氨基-4，6- 二脫氧-D-甘露糖)。⑶P-D-過骨胺是細(xì)菌(例如大腸桿菌(E.coli)中過骨胺化的核苷酸糖供體。⑶P-D-過骨胺通常不存在于真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)中。真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)還缺乏特異性過骨胺基轉(zhuǎn)移酶，以致于⑶P-D-過骨胺不能與真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)內(nèi)的新生糖結(jié)構(gòu)相連接。
[0108]因此，異源酶GTS和/或Per (i)耗盡真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)中的底物⑶P-6-脫氧-D-來蘇-4-己酮糖，以及(ii)導(dǎo)致不能再用于合成⑶P-L-巖藻糖的人工產(chǎn)物(即，在GTS情況下的GDP-脫氧-D-塔洛糖，以及在Per情況下的GDP-D-過骨胺)的合成。
[0109]因此，對于在從頭途徑?jīng)]有被阻斷的真核細(xì)胞中在其糖部分和/或氨基酸上通常包含(天然)巖藻糖的分子來說，在本發(fā)明的真核細(xì)胞中(例如在包含GTS和/或Per和巖藻糖類似物的真核細(xì)胞中)所產(chǎn)生的分子在其糖部分和/或氨基酸上缺乏(天然)巖藻糖，取而代之的是包含(天然)巖藻糖的巖藻糖類似物。
[0110]⑶P-4-酮-6-脫氧甘露糖-3-脫水酶(ColD)使用底物⑶P_6_脫氧-D-來蘇_4_己酮糖，并將其轉(zhuǎn)化成⑶P-4-酮-3，6- 二脫氧-D-甘露糖。由于中間產(chǎn)物⑶P-4-酮-3，6- 二脫氧-D-甘露糖在真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)中不穩(wěn)定，因此優(yōu)選ColD與GDP-L-可立糖合酶(ColC)聯(lián)用。酶ColC屬于⑶P-4-脫氫-6-脫氧-D-甘露糖差向異構(gòu)酶/還原酶類。酶ColC還將中間產(chǎn)物⑶P-4-酮-3，6- 二脫氧-D-甘露糖轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的終產(chǎn)物⑶P-L-可立糖。由于所述細(xì)胞缺乏將⑶P-4-酮-3，6- 二脫氧-D-甘露糖和/或⑶P-L-可立糖轉(zhuǎn)移至所述細(xì)胞中存在之分子的糖部分的相應(yīng)糖基轉(zhuǎn)移酶，因此這兩種產(chǎn)物都不能摻入到真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)內(nèi)的新生糖結(jié)構(gòu)中。因此，優(yōu)選地ColD與ColC相組合地存在于真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)中。
[0111]⑶P-巖藻糖合成 酶(⑶P-Fucose synthetase，GFS)(也稱為“⑶P-4-酮_6_脫氧-D-甘露糖差向異構(gòu)酶/還原酶”，GMER)在真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)中將⑶P-4-酮-6-脫氧-D-甘露糖轉(zhuǎn)化成⑶P-L-巖藻糖。GFS反應(yīng)涉及C-3 "和C-5 "的差向異構(gòu)化，隨后在C-4羰基處發(fā)生NADPH依賴性還原反應(yīng)。本發(fā)明中使用活性位點(diǎn)突變體(優(yōu)選GFS-Cys 109Ser)，其將⑶P-4-酮-6-脫氧-D-甘露糖轉(zhuǎn)化成不同于⑶P-L-巖藻糖的產(chǎn)物，即 GDP-6-脫氧-D-阿卓糖(參見 Lau S.T.B., Tanner, Μ.Ε.2008.Mechanism andactive site residues of GDP—Fucose Synthase, Journal of the American ChemicalSociety, Vol.130，N0.51，17593-17602 頁)。
[0112]優(yōu)選地，真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)中存在兩種或更多種(即，2、3、4、5、6或7種)選自與⑶P-L-可立糖合酶(ColC)相組合的⑶P-6-脫氧-D-來蘇-4-己酮糖還原酶(MD)、⑶P-過骨胺合成酶(Per)、⑶P_6_脫氧-D-塔洛糖合成酶(GTS)、⑶P-巖藻糖合成酶Cysl09Ser-(GFS-Cysl09Ser)突變體、⑶P-4-酮-6-脫氧甘露糖_3_脫水酶(ColD)的酶(優(yōu)選GDP-4-酮-6-脫氧甘露糖-3-脫水酶(ColD))及其變體。
[0113]本發(fā)明中優(yōu)選的RMD、Per、GTS、GFS-Cysl09Ser、ColD或ColC酶的變體與其所來源的RMD、Per、GTS、GFS-Cysl09Ser、ColD或ColC酶的不同在于氨基酸序列中多至150個(gè)(SP，多至 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140或150個(gè))氨基酸改變(即替換、插入、缺失、N-末端截短和/或C-末端截短)。氨基酸替換可以是保守性或非保守性的。本發(fā)明中優(yōu)選的RMD、Per、GTS、GFS-Cysl09Ser、ColD或ColC酶的變體可以作為替代地或額外地具有如下特征，即，與其所來源的RMD、Per、GTS、GFS-Cysl09Ser、ColD或ColC酶具有一定程度的序列同一性。因此，本發(fā)明中優(yōu)選的RMD、Per、GTS、GFS-Cysl09Ser、ColD或ColC酶的變體與相應(yīng)的參照RMD、Per、GTS、GFS_Cysl09Ser、ColD或ColC酶具有至少80%、至少81 %、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96 %、至少97 %、至少98%或至少99 %的序列同一性。優(yōu)選地，序列同一性是針對40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300或更多個(gè)氨基酸的連續(xù)序列的，優(yōu)選地是針對相應(yīng)參照RMD、Per、GTS、GFS-Cysl09Ser、ColD或ColC酶的全長的。特別優(yōu)選地，序列同一性是針對各參照RMD、Per、GTS、GFS_Cysl09Ser、ColD或ColC酶全長的至少80%、針對全長的至少85%、針對全長的至少90%、針對全長的至少95%、針對全長的至少98%或針對全長的至少99.5%。還特別優(yōu)選地，序列同一性是針對各參照RMD、Per、GTS、GFS_Cysl09Ser、ColD或ColC酶中至少200或250個(gè)氨基酸的至少80%、針對至少200或250個(gè)氨基酸的至少85%、針對至少200或250個(gè)氨基酸的至少90%、針對至少200或250個(gè)氨基酸的至少95%、針對至少200或250個(gè)氨基酸的至少98%或針對至少200或250個(gè)氨基酸的至少99.5%。
[0114]RMD、Per、GTS、GFS-Cysl09Ser、ColD或ColC酶的片段(或缺失變體)優(yōu)選地在其N-末端和 / 或 C-末端和 / 或內(nèi)部具有多至 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140 或 150 個(gè)氨基酸的缺失。
[0115]此外，如果與所述參照酶具有如上所示之程度的相關(guān)性的RMD、Per、GTS、GFS-Cysl09Ser、ColD或ColC酶表現(xiàn)出各參照酶活性之至少30%程度的相關(guān)生物學(xué)活性，才將其視作變體。本發(fā)明上下文中相關(guān)的“生物學(xué)活性”是“酶活性”，即RMD、Per、GTS、GFS-Cysl09Ser、ColD或ColC酶的變體利用底物⑶P-6-脫氧-D-來蘇-4-己酮糖并將其分別轉(zhuǎn)化成⑶P-D-鼠李糖、⑶P-D-過骨胺(4-氨基-4，6- 二脫氧-D-甘露糖)、⑶P-脫氧-D-塔洛糖、⑶P-6-脫氧-D-阿卓糖、⑶P-4-酮-3，6- 二脫氧-D-甘露糖或⑶P-L-可立糖的活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地評估RMD、Per、GTS、GFS_Cysl09Ser、ColD或ColC酶的變體是否具有各參照酶RMD、Per、GTS、GFS_Cysl09Ser、ColD或ColC之酶活性的至少30%的酶活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于確定與各參照酶之酶活性相比的酶變體之“酶活性”的合適測定(例如酶活性測定)。
[0116]優(yōu)選地，GDP-6-脫氧-D-來蘇_4_己酮糖還原酶(GDP-6-deoxy-D-lyxo-4-hexulose reductase, RMD)來自銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa) (SEQ ID NO: I) ? GDP-6-脫氧-D-塔洛糖合成酶(GDP-6-deoxy-D-talosesynthetase,GTS)優(yōu)選地來自伴放線放線桿菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)(SEQ ID NO:2)。優(yōu)選地，GDP-過骨胺合成酶(GDP-perosamine synthetase, Per)來自霍亂弧菌(Vibrio cholerae) (SEQ ID NO:3)。優(yōu)選地，⑶P_4_酮-6-脫氧甘露糖-3-脫水酶(GDP-4-keto-6-deoxymannose-3-dehydratase,ColD)來自大腸桿菌(E.coli) (SEQ ID NO:4)。優(yōu)選地,還使用來自大腸桿菌的⑶P-L-可立糖合酶(⑶P-L-colitose synthase,ColC)(SEQ ID NO:7)。野生型⑶P-巖藻糖合成酶(⑶P-Fucose synthetase,GFS)來自中國倉鼠(Cricetulus griseus)(中國倉鼠)(SEQ ID NO:5)。來自中國倉鼠(Cricetulus griseus)(中國倉鼠)的 GDP-巖藻糖合成酶 Cysl09Ser-(GDP_Fucose synthetase CyslO9Ser-,GFS-Cys 109Ser)突變體具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
[0117]如上所述，本發(fā)`明涵蓋了利用⑶P-6-脫氧-D-來蘇-4-己酮糖作為底物的酶的變體。因此，本發(fā)明還涵蓋了上述序列識(shí)別號的變體，即SEQ ID NO:1的變體、SEQ ID NO:2的變體、SEQ ID NO:3 的變體、SEQ ID NO:4 的變體、SEQ ID NO:5 的變體、SEQ ID NO:6 的變體以及SEQ ID NO:7的變體。至于所述變體的結(jié)構(gòu)和/或功能定義，參考前述段落。
[0118]核酸序列的相似性，例如序列同一性的百分比，可以通過序列比對確定。這樣的比對可以用一些本領(lǐng)域已知算法進(jìn)行，優(yōu)選使用以下算法=Karlin和Altschul(Karlin&Altschul (1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:5873-5877)、hmmalign (HMMER package, http//:hmmer.wustl.edu/)或 CLUSTAL 算法(Thompson, J.D.，Higgins, D.G.&Gibson, T.J.(1994) Nucleic acids Res.22,4673-80)例如在 http: //www.eb1.ac.uk/Tools/clustalw/ 或在 http: //eb1.ac.uk/Tools/clustalw2/index, html 上或在 http://npsa-pbil.1bcp.fr/cg1-bin/npsa automat.pl? page = /NPSA/npsa clustalw.html上可得的。優(yōu)選使用的參數(shù)為如其在http://www.eb1.ac.uk/Tools/clustalw/或 http: //www.eb1.ac.uk/Tools/clustalw2/index, html 上所設(shè)置的黒犬認(rèn)參數(shù)。序歹丨J 同一性(序列匹配)的級別可以使用例如BLAST或BlastZ (或BlastX)計(jì)算。類似的算法被并入 BLASTP 程序(Altschul 等(1990) J.Mol.Biol.215:403-410)。
[0119]優(yōu)選地，RMD、Per、GTS、ColD、ColC或GFS_Cysl09Ser的核酸序列是經(jīng)密碼子優(yōu)化的。本發(fā)明上下文中使用的術(shù)語“經(jīng)密碼子優(yōu)化”是指例如去除內(nèi)部TATA盒、chi位點(diǎn)、核糖體進(jìn)入位點(diǎn)、RNA不穩(wěn)定性模體、重復(fù)序列、緊密(intense)的RNA 二級結(jié)構(gòu)和隱蔽剪接位點(diǎn)以及使用真核(例如脊椎動(dòng)物)細(xì)胞中較高利用度(higher utilization)的密碼子或者利用真核(例如脊椎動(dòng)物)細(xì)胞中高表達(dá)基因的密碼子。
[0120]真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)的酶另外地或作為替代地包含⑶P-D-鼠李糖、⑶P-D-過骨胺、⑶P-脫氧-D-塔洛糖、⑶P-6-脫氧-D-阿卓糖、⑶P-4-酮_3，6_ 二脫氧-D-甘露糖和/或⑶P-L-可立糖，以抑制或阻止⑶P-L-巖操糖合成，因?yàn)楸景l(fā)明人已出乎意料地發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充(特別是胞漿補(bǔ)充)(例如通過胞質(zhì)內(nèi)注射)人工糖⑶P-D-鼠李糖、⑶P-D-過骨胺、⑶P-脫氧-D-塔洛糖、⑶P-6-脫氧-D-阿卓糖、⑶P-4-酮-3，6- 二脫氧-D-甘露糖和/或GDP-L-可立糖對抑`制真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)中巖藻糖的轉(zhuǎn)移有積極的貢獻(xiàn)。特別優(yōu)選補(bǔ)充人工糖:GDP-6-脫氧-D-阿卓糖、GDP-D-鼠李糖和/或⑶P-D-過骨胺。
[0121]優(yōu)選地，利用⑶P-6-脫氧-D-來蘇-4-己酮糖作為底物但不催化將⑶P-6-脫氧-D-來蘇-4-己酮糖轉(zhuǎn)化成GDP-L-巖藻糖之反應(yīng)的酶表達(dá)自瞬時(shí)存在于或者穩(wěn)定維持于脊椎動(dòng)物細(xì)胞中(例如作為附加體或在染色體上)的核酸序列。
[0122]將編碼酶(優(yōu)選⑶P-6-脫氧-D-來蘇-4-己酮糖還原酶(RMD)、⑶P-過骨胺合成酶(Per)、⑶P-6-脫氧-D-塔洛糖合成酶(GTS)、⑶P-巖藻糖合成酶Cysl09Ser-(GFS-Cysl09Ser)突變體、⑶P_4_酮-6-脫氧甘露糖-3-脫水酶(ColD)或GDP-L-可立糖合酶(ColC))的核酸序列整合在用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的表達(dá)載體中。
[0123]合適的表達(dá)載體包括質(zhì)粒、粘粒(cosmid)、細(xì)菌人工染色體(BAC)和病毒載體。優(yōu)選地，使用非病毒表達(dá)載體。
[0124]編碼酶之核酸的表達(dá)受表達(dá)控制序列的控制。術(shù)語“表達(dá)控制序列”是指影響與其有效連接之編碼序列在真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)中表達(dá)的核苷酸序列。表達(dá)控制序列是控制核酸序列的轉(zhuǎn)錄(例如啟動(dòng)子、TATA盒、增強(qiáng)子)、轉(zhuǎn)錄后事件(例如多聚腺苷酸化)以及翻譯的序列。優(yōu)選地，編碼上述酶的核酸序列受組成型啟動(dòng)子的控制，優(yōu)選地受人轉(zhuǎn)運(yùn)延伸因子2(EF2)啟動(dòng)子的調(diào)控。其他在本領(lǐng)域已知的組成型啟動(dòng)子。
[0125]優(yōu)選地，表達(dá)載體中編碼酶RMD、Per、GTS、GFS_Cysl09Ser、ColD或ColC的核酸序列與真核(例如脊椎動(dòng)物)特異性表達(dá)控制序列有效連接，這使得編碼RMD、Per、GTS、GFS-Cysl09Ser、ColD或ColC的核酸序列能夠在真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)中表達(dá)。因此，在本發(fā)明的真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)中以有利于期望效果的產(chǎn)量表達(dá)RMD、Per、GTS、GFS-Cysl09Ser和/或ColD (ColD優(yōu)選與ColC組合)。取決于用于表達(dá)的酶和細(xì)胞的性質(zhì)，這些產(chǎn)量可以為高、中或低水平的。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易選擇合適的真核(例如脊椎動(dòng)物)特異性表達(dá)控制序列來實(shí)現(xiàn)高、中或低水平的表達(dá)。
[0126]因此，對于在從頭途徑?jīng)]有被阻斷的真核細(xì)胞中在其糖部分和/或氨基酸上通常包含(天然)巖藻糖的分子，在本發(fā)明的真核細(xì)胞中(例如在包含GTS和/或Per和巖藻糖類似物的真核細(xì)胞中)產(chǎn)生的分子在其糖部分和/或氨基酸上缺乏(天然)巖藻糖，取而代之的是包含(天然)巖藻糖的巖藻糖類似物。
[0127]如上所提及的，包含巖藻糖類似物之分子的有效產(chǎn)生顯著地受益于巖藻糖從頭途徑的缺乏。阻斷從頭途徑避免了天然巖藻糖的競爭性結(jié)合并且大大增加巖藻糖類似物的并入效率。以下描述破壞或阻斷從頭途徑的其他一些優(yōu)選實(shí)施方案。[0128]⑶P-甘露糖脫水酶(GMD)是通常催化將⑶P-甘露糖轉(zhuǎn)變?yōu)棰荘-6-脫氧-D-來蘇-4-己酮糖之反應(yīng)的酶，并且⑶P-巖藻糖合成酶(GFS)是使用⑶P-6-脫氧-D-來蘇-4-己酮糖作為底物并且將其轉(zhuǎn)變?yōu)棰荘-L-巖藻糖的酶(參見圖1，左圖)。這樣，如果在所述細(xì)胞中沒有具有酶活性的GMD和/或GFS存在，或如果在所述細(xì)胞中存在酶活性降低的GMD和/或GFS，則從⑶P-D-甘露糖起始的⑶P-L-巖藻糖合成途徑(從頭途徑)被阻斷。
[0129]因此，作為替代地或額外地，優(yōu)選地本發(fā)明的真核細(xì)胞:
[0130](i)不包含具有酶活性的⑶P-甘露糖脫水酶(GMD)或包含酶活性降低的⑶P-甘露糖脫水酶(GMD)，和/或
[0131](ii)不包含具有酶活性的⑶P-巖藻糖合成酶(GFS)或包含酶活性降低的⑶P-巖藻糖合成酶(GFS)。
[0132]術(shù)語GMD或GFS的“酶活性降低的”意味著減少或降低GMD或GFS的生物學(xué)活性(即GMD利用底物⑶P-甘露糖并將其轉(zhuǎn)變?yōu)棰荘-6-脫氧-D-來蘇-4-己酮糖的活性或GFS利用底物⑶P-6-脫氧-D-來蘇-4-己酮糖并將其轉(zhuǎn)變?yōu)棰荘-L-巖藻糖的活性)。優(yōu)選地，GMD或GFS的生物學(xué)活性降低50 %或60 %，更優(yōu)選至少70 %或80 %，最優(yōu)選至少90 %、95% 或 99%，例如至少 50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%。可以由于向氨基酸序列引入突變?nèi)缫粋€(gè)或更多個(gè)(例如1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個(gè))添加、缺失、插入和/或替換來實(shí)現(xiàn)所述酶活性降低。技術(shù)人員可以容易地評估GMD或GFS (例如GMD或GFS突變體)的活性相比于完全(100% )活性的GMD或GFS(例如非突變的野生型GMD或GFS)是否降低。合適的酶活性實(shí)驗(yàn)為本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知。然而，如上所提及的，GMD和/或GFS的酶活性降低必須達(dá)到下述程度/水平，即:使得從GDP-D-甘露糖起始的GDP-L-巖藻糖合成途徑(從頭途徑)阻斷至少50 %，優(yōu)選至少60 %或70 %，更優(yōu)選至少80 %或90 %，最優(yōu)選至少95 %或100 %(見上文)。
[0133]因此，對于在從頭途徑?jīng)]有被阻斷的真核細(xì)胞中其糖部分和/或氨基酸上通常包含(天然)巖藻糖的分子，在本發(fā)明的真核細(xì)胞中(例如在包含GMD和/或GFS和巖藻糖類似物的真核細(xì)胞中)產(chǎn)生的分子在其糖部分和/或氨基酸上缺乏(天然)巖藻糖，取而代之的是包含(天然)巖藻糖的巖藻糖類似物。
[0134]在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞不包含具有酶活性的GDP-甘露糖脫水酶(GMD)，這是由于
[0135](i)所述GMD被突變使得其無法催化將⑶P-甘露糖轉(zhuǎn)變?yōu)棰荘-6-脫氧-D-來蘇
4-己酮糖的反應(yīng)，
[0136](ii)編碼GMD的基因被部分地或全部敲除使得不表達(dá)具有酶活性的GMD，所述具有酶活性的GMD能夠催化將⑶P-甘露糖轉(zhuǎn)變?yōu)棰荘-6-脫氧-D-來蘇-4-己酮糖的反應(yīng)，或者
[0137](iii)調(diào)節(jié)GMD基因表達(dá)的啟動(dòng)子區(qū)被部分地或全部缺失使得不表達(dá)具有酶活性的GMD，所述具有酶活性的GMD能夠催化將⑶P-甘露糖轉(zhuǎn)變?yōu)棰荘-6-脫氧-D-來蘇-4-己酮糖的反應(yīng)，和/或
[0138]所述細(xì)胞不包含具有酶活性的⑶P-巖藻糖合成酶(GFS)，這是由于
[0139](i)所述GFS被突變使得使得其不能使用⑶P-6-脫氧-D-來蘇_4_己酮糖作為底物并將其轉(zhuǎn)變?yōu)镚DP-L-巖藻糖，
[0140](ii)編碼GFS的基因被部分地或全部敲除使得不表達(dá)具有酶活性的GFS，所述具有酶活性的GFS能使用GDP-6-脫氧-D-來蘇-4-己酮糖作為底物并將其轉(zhuǎn)變?yōu)镚DP-L-巖藻糖，或
[0141](iii)調(diào)節(jié)GFS基因表達(dá)的啟動(dòng)子區(qū)被部分地或全部缺失使得不表達(dá)具有酶活性的GFS，所述具有酶活性的GFS能使用GDP-6-脫氧-D-來蘇-4-己酮糖作為底物并將其轉(zhuǎn)變?yōu)棰荘-L-巖藻糖。
[0142]優(yōu)選地，還敲低或部分敲低GMD和/或GFS的酶活性。GMD和/或GFS的酶活性敲低可以由特異性siRNA或miRNA的組成型和穩(wěn)定表達(dá)(例如在所述細(xì)胞中以附加體形式存在)實(shí)現(xiàn)，所述siRNA或miRNA在mRNA水平阻斷/抑制GMD和/或GFS的表達(dá)。
[0143]可以通過蛋白質(zhì)顯微注射、蛋白質(zhì)電穿孔或蛋白質(zhì)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將所述GMD和/或GFS突變體引入本發(fā)明的真核細(xì)胞中。也可以通過DNA顯微注射、DNA電穿孔或DNA脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將編碼GMD突變體的核酸序列和/或編碼GFS突變體的核酸序列(優(yōu)選整合在表達(dá)載體中)引入本發(fā)明的真核細(xì)胞中。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述GMD突變體和/或GFS突變體表達(dá)自在本發(fā)明的真核細(xì)胞中瞬時(shí)存在或穩(wěn)定存在的核酸序列。
[0144]還優(yōu)選，在所述真核細(xì)胞中巖藻糖補(bǔ)救途徑被另外地阻斷。由此，當(dāng)培養(yǎng)本發(fā)明的真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)時(shí)，優(yōu)選使用不合巖藻糖和巖藻糖基化糖蛋白的培養(yǎng)基。
[0145]取而代之地，生長培養(yǎng)基或培養(yǎng)培養(yǎng)基中摻入巖藻糖類似物，其被本發(fā)明的真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì) 胞)所攝取(例如通過主動(dòng)運(yùn)輸或被動(dòng)擴(kuò)散)，所述巖藻糖類似物被本發(fā)明的真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)耐受并經(jīng)補(bǔ)救途徑代謝，并且所述巖藻糖類似物穩(wěn)定的足以在上游細(xì)胞培養(yǎng)過程中替代天然巖藻糖連接至糖部分和/或氨基酸。[0146]優(yōu)選地，本發(fā)明的真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)還包括至少一個(gè)(接受體(acceptor))分子，其是/能夠作為巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的底物(例如蛋白質(zhì)或脂質(zhì))。
[0147]本發(fā)明上下文中使用的術(shù)語“是/能夠作為巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶底物的(接受體)分子”是指如果在具有未經(jīng)改變之巖藻糖基化活性的細(xì)胞中產(chǎn)生則包含與至少一個(gè)巖藻糖殘基連接之糖部分和/或氨基酸的任何目的化合物(例如，蛋白質(zhì)、多肽、肽、脂質(zhì)、脂質(zhì)片段或融合蛋白)。這種化合物是巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的合適底物。因此，優(yōu)選的(接受體)分子為糖蛋白、糖多肽、糖肽、糖脂、糖脂片段或者糖基化的融合蛋白。本發(fā)明上下文中使用的術(shù)語“能夠作為巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶底物的(接受體)分子”還表示任何目的化合物(例如，蛋白質(zhì)、多肽、肽、脂質(zhì)、脂質(zhì)片段或融合蛋白)，前提是如果在具有未經(jīng)改變之巖藻糖基化活性的細(xì)胞中產(chǎn)生則其為與至少一個(gè)巖藻糖殘基連接的預(yù)期糖基化化合物(例如糖蛋白、糖多肽、糖肽、糖脂、糖脂片段或經(jīng)糖基化的融合蛋白)。優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)不是原核生物來源的。特別優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)是哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)或由其來源的蛋白質(zhì)。 [0148]在本發(fā)明的真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)中(即在從頭途徑被阻斷并且另外優(yōu)選地由于在缺乏巖藻糖但包含巖藻糖類似物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)補(bǔ)救途徑被抑制的細(xì)胞中)存在能夠作為巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶之底物的分子導(dǎo)致產(chǎn)生在其糖部分和/或氨基酸上不包含(天然)巖藻糖但在其糖部分和/或氨基酸上包含巖藻糖類似物的分子。
[0149]因此，所述分子(例如蛋白質(zhì)或脂質(zhì))可以是下述分子:即所述分子(i)在其糖部分上天然地包含(天然)巖藻糖和/或(ii)在其結(jié)構(gòu)(例如氨基酸序列)中包含蛋白質(zhì)-O-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶識(shí)別位點(diǎn)。
[0150]所述蛋白質(zhì)-O-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶識(shí)別位點(diǎn)可以是天然的識(shí)別位點(diǎn)例如在所述分子結(jié)構(gòu)(例如氨基酸序列)中天然存在的，或者可以是非天然(人工)識(shí)別位點(diǎn)例如另外地引入所述分子(例如蛋白質(zhì)或脂質(zhì))的分子結(jié)構(gòu)(例如氨基酸序列)的識(shí)別位點(diǎn)。
[0151]優(yōu)選地，所述分子(例如蛋白質(zhì))包含(例如天然地和/或人工地)一個(gè)或更多個(gè)(例如1、2、3、4、5、6、7或8個(gè)，優(yōu)選地I或2個(gè))EGF樣重復(fù)，所述EGF樣重復(fù)包含絲氨酸和/或蘇氨酸殘基，其被蛋白質(zhì)-O-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(優(yōu)選地，P0FUT1)識(shí)別。所述酶可以以O(shè)-連接將巖藻糖糖類添加至在所述EGF樣重復(fù)中第二個(gè)和第三個(gè)保守的半胱氨酸之間的絲氨酸或蘇氨酸殘基。所述蛋白質(zhì)是反向(inverting)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶,其意味著所述酶使用GDP-L-巖藻糖作為供體底物并將O-連接的巖藻糖轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)從而產(chǎn)生巖藻糖-α -O-絲氨酸/蘇氨酸。在本發(fā)明的真核細(xì)胞中(即在從頭途徑被阻斷并且另外優(yōu)選地由于在缺乏巖藻糖但包含巖藻糖類似物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)補(bǔ)救途徑被抑制的細(xì)胞中)，所述酶，即蛋白質(zhì)-O-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(優(yōu)選地P0FUT1)將巖藻糖類似物而不是(天然)巖藻糖結(jié)合至其識(shí)別位點(diǎn)。
[0152]更優(yōu)選地，所述EGF樣重復(fù)是具有SEQ ID NO: 10或其變體之氨基酸序列的EGF樣重復(fù)，所述變體與所述氨基酸序列有至少80 %或85 %，更優(yōu)選地90 %或95 %，最優(yōu)選地 98 % 或 99 %，例如 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、95、96、97、98，或99%的同一性。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述序列同一性是針對至少10、12、15、17、20、22或更多個(gè)氨基酸的連續(xù)延伸，優(yōu)選地針對各自參考序列(SEQ ID NO:10)的整個(gè)長度。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述序列同一性是針對各自參考序列多肽(SEQ IDNO:10)之全長的至少95%、針對全長的至少96%、針對全長的至少97%、針對全長的至少98%或針對全長的至少99%。還特別優(yōu)選上述變體是功能活性變體。這意味著一個(gè)或更多個(gè)(例如1、2、3、4或5個(gè))氨基酸替換、添加、缺失或插入之形式的變化位于允許蛋白質(zhì)-O-巖藻糖基化位點(diǎn)的識(shí)別和/或通過蛋白質(zhì)-O-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶將巖藻糖類似物連接至至所述位點(diǎn)的以上所述的氨基酸位置之外。本領(lǐng)域的技術(shù)人員清楚如何評估巖藻糖類似物是否仍然可以連接至包含于上述分子中之EGF樣重復(fù)變體的技術(shù)。一種合適的技術(shù)為例如 MALD1-TOF/TOF。
[0153]最優(yōu)選地，所述EGF樣重復(fù)(例如SEQ ID NO:10或其變體)結(jié)合在/包含于所述分子(例如蛋白質(zhì))的C末端和/或N末端。
[0154]另外地或作為替代地，還優(yōu)選所述分子(例如蛋白質(zhì))包含(例如天然地和/或人工地)一個(gè)或更多個(gè)血小板反應(yīng)蛋白(thrombospondin)重復(fù),所述血小板反應(yīng)蛋白重復(fù)包含被蛋白質(zhì)-O-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(優(yōu)選地P0FUT2)識(shí)別的絲氨酸和/或蘇氨酸殘基。所述酶可以以O(shè)連接將巖藻糖糖類添加至血小板反應(yīng)蛋白重復(fù)。所述蛋白質(zhì)是反向巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，其意味著所述酶使用GDP-L-巖藻糖作為供體底物并將巖藻糖以O(shè)連接轉(zhuǎn)移至所述蛋白質(zhì)從而產(chǎn)生巖藻糖-α -O-絲氨酸/蘇氨酸。在本發(fā)明的真核細(xì)胞中，即在從頭途徑被阻斷并且補(bǔ)救途徑優(yōu)選地另外被抑制的細(xì)胞中，由于在缺乏巖藻但包含巖藻糖類似物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述酶，即蛋白質(zhì)-O-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(優(yōu)選地P0FUT2)，將巖藻糖類似物而不是(天然)巖藻糖結(jié)合至其識(shí)別位點(diǎn)。
[0155]本發(fā)明上下文中使用的術(shù)語“在其糖部分上天然地包含巖藻糖的分子”是指在能夠?qū)r藻糖加至糖部分(即，具有未經(jīng)改變的將巖藻糖加至糖部分的能力)的真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生后包含含有至少一個(gè)巖藻糖殘基之糖部分的任何化合物。這種分子包含被聚糖轉(zhuǎn)移酶識(shí)別的至少一個(gè)或更多個(gè)序列模體，例如包含Asp、Ser或Thr殘基(優(yōu)選三肽序列Asn-X-Ser/Thr，其中X是除Pro以外的任意氨基酸)。產(chǎn)生包含具有巖藻糖之糖部分的細(xì)胞(例如真核細(xì)胞，如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)的優(yōu)選實(shí)例有CH0、AGE1.HN、AGE1.CR、AGE1.CR.PIX*AGE1.CS。優(yōu)選地，這種化合物是融合蛋白或脂質(zhì)。優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)是真核(優(yōu)選脊椎動(dòng)物，`最優(yōu)選哺乳動(dòng)物來源或由其衍生的)的。在本發(fā)明的真核細(xì)胞中，即在從頭途徑被阻斷并且優(yōu)選地補(bǔ)救途徑另外被抑制的細(xì)胞中，由于在缺乏巖藻但包含巖藻糖類似物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述分子在其糖部分上包含(優(yōu)先或僅僅)巖藻糖類似物，而不是(天然)巖藻糖。
[0156]所述能夠作為巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶之底物的分子也可以是病毒組分。所述的病毒組分可以是任何糖基化的實(shí)體，例如包含于包膜活病毒(無論減毒的還是野生型)、滅活的或裂開的死包膜病毒、分離的或純化的病毒糖蛋白或病毒糖脂、或由生產(chǎn)細(xì)胞所感染的病毒表達(dá)載體編碼并產(chǎn)生的糖蛋白。為了獲得已將巖藻糖類似物并入其病毒組分的病毒，必須使用根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞，即經(jīng)改造的阻斷了巖藻糖的從頭合成并且優(yōu)選地消除了 α-1，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的細(xì)胞。
[0157]優(yōu)選地，能夠作為巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶之底物的分子為蛋白質(zhì)或多肽，優(yōu)選內(nèi)源或外源蛋白質(zhì)或多肽。術(shù)語“外源蛋白質(zhì)或多肽”是指來自相應(yīng)細(xì)胞外部的任何蛋白質(zhì)或多肽或者在細(xì)胞內(nèi)部由導(dǎo)入相應(yīng)細(xì)胞中的核酸表達(dá)的任何蛋白質(zhì)或多肽。術(shù)語“內(nèi)源蛋白質(zhì)或多肽”是指由細(xì)胞基因組編碼的任何蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，目的蛋白質(zhì)或多肽(即，期望的糖蛋白或糖多肽)在真核細(xì)胞中重組表達(dá)。優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)或多肽由瞬時(shí)存在或穩(wěn)定維持于真核細(xì)胞中的核酸序列表達(dá)。合適的表達(dá)載體和表達(dá)控制序列已在上文有關(guān)酶的描述中有述。這些可以等同地用于編碼目的蛋白質(zhì)之核酸的表達(dá)的情況中。
[0158]因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)包含:
[0159](i)至少一種多核苷酸,其包含編碼酶⑶P-6-脫氧-D-來蘇-4-己酮糖還原酶(MD)、⑶P-過骨胺合成酶(Per)、⑶P_6_脫氧-D-塔洛糖合成酶(GTS)、⑶P-巖藻糖合成酶Cysl09Ser-(GFS-Cysl09Ser)突變體、⑶P-4-酮-6-脫氧甘露糖_3_脫水酶(ColD)或GDP-L-可立糖合酶(ColC)的核酸序列，所述核酸序列與允許編碼所述各個(gè)酶的核酸序列表達(dá)的特異性表達(dá)控制序列有效連接，和
[0160](ii)至少一種多核苷酸，其包含編碼目的蛋白(即，期望的糖蛋白，例如抗體，如IgGl)的核酸序列，所述核酸序列與導(dǎo)致編碼所述目的蛋白(例如抗體，如IgGl)的核酸序列在所述細(xì)胞中表達(dá)的特異性表達(dá)控制序列有效連接。
[0161]因此，(i)酶觀0、？61'、6了5、6?5-078109561'和/或(:010，優(yōu)選地(:010與(:01(:的組合，和(ii)目的蛋白質(zhì)(即期望的糖蛋白，例如抗體，如IgGl)在本發(fā)明的真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)中表達(dá)。
[0162]以上所提到的多核苷酸可以通過轉(zhuǎn)染、電穿孔或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染引入細(xì)胞。所述轉(zhuǎn)染、電穿孔或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染可以根據(jù)本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行。在引入外源核酸之后，可以通過向培養(yǎng)基添加例如抗生素(例如G418、嘌呤霉素、新霉素或遺傳霉素)來施加選擇壓力從而篩選經(jīng)轉(zhuǎn)染、經(jīng)電穿孔或經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。合適的選擇系統(tǒng)在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。
[0163]優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)或多肽為抗原結(jié)合蛋白或多肽，優(yōu)選地是抗體，更優(yōu)選地為IgGl抗體，抗體片段，更優(yōu)選地包含抗體的Fe區(qū)的抗體片段，抗體融合蛋白，更優(yōu)選地是包含抗體Fe區(qū)的抗體融合蛋白，病毒蛋白，病毒蛋白片段，或抗原。另一個(gè)優(yōu)選的蛋白質(zhì)是酶、細(xì)胞因子、淋巴因子、激動(dòng)劑、拮抗劑或激素。
[0164]期望的蛋白質(zhì)或多肽的特定實(shí)例包括但不限于，胰島素、胰島素樣生長因子、hGH、tPA、細(xì)胞因子例如白介素(IL)(如 IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-1U IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18)、干擾素(IFN) a、IFN^、IFNy、IFNco、或 IFN tau、腫瘤壞死因子(TNF)例如 TNFa 和 TNFP、TNF Y、TRAIL、G_CSF、GM-CSF、M-CSF、MCP-1和VEGF。還包括產(chǎn)生促紅細(xì)胞生成素或任何其它激素生長因子。優(yōu)選地，上述分子具有治療和/或診斷用途。
[0165]所述抗體可以是單克隆抗體(包括全長抗體)或多克隆抗體。優(yōu)選地，所述抗體或抗體片段選自=IgG(例如IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)、IgA、IgE、IgMjP IgD、單鏈抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、scFv、dsFv、scFab、maxibody、納米抗體、transbody、雙抗體、adnectin、evibody、DARpin、親和體(affibody)、錨蛋白(ankyrin)、iMab、駱駝科動(dòng)物(camelid)抗體、衍生自駱駝科動(dòng)物僅重鏈抗體的糖基化單結(jié)構(gòu)域抗原結(jié)合片段、工程化脂質(zhì)運(yùn)載蛋白型蛋白質(zhì)例如Anticalin、Affilin或Kunitz結(jié)構(gòu)域和knottin,隨后是免疫球蛋白(優(yōu)選地人來源)的至少一個(gè)優(yōu)選兩個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域(Fe)。
[0166]優(yōu)選地，所述抗體或抗體片段為
[0167](i)天然抗體或抗體片段[0168](ii)非天然抗體或抗體片段,優(yōu)選抗體突變體或抗體片段突變體。
[0169]所述抗體突變體或抗體片段突變體也可以被指定為經(jīng)修飾抗體或經(jīng)修飾抗體片段。所述天然抗體或天然抗體片段也可以被指定為未經(jīng)修飾抗體或未經(jīng)修飾抗體片段。
[0170]在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，(天然的或經(jīng)修飾)抗體包含兩條重鏈或者(天然的或經(jīng)修飾)抗體片段包含重鏈，更優(yōu)選地重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域(CH結(jié)構(gòu)域)。
[0171]特別優(yōu)選地，所述天然抗體包含兩條重鏈，其中每條重鏈具有在天冬酰胺N297處的天然N-糖基化位點(diǎn)(根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號)，或者所述天然抗體片段包含重鏈，更優(yōu)選地重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域(CH結(jié)構(gòu)域)，其具有在天冬酰胺N297處的天然N-糖基化位點(diǎn)(根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號)。
[0172]還特別優(yōu)選地，所述經(jīng)修飾抗體包含兩條重鏈，其中每條重鏈具有在天冬酰胺N159處的人工N-糖基化位點(diǎn)，特別地由于S161替換G161而產(chǎn)生，和/或在天冬酰胺N276處的人工N-糖基化位點(diǎn)，特別地由于S278替換Y278而產(chǎn)生(全部根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號)，或者該經(jīng)修飾抗體片段包含重鏈，更優(yōu)選地，重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域(CH結(jié)構(gòu)域)，其在天冬酰胺N159處具有人工N-糖基化位點(diǎn)，特別地由于S161替換G161而產(chǎn)生，和/或在天冬酰胺N276處具有人工N-糖基化位點(diǎn)，特別地由于S278替換Y278而產(chǎn)生(全部根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號)。
[0173]優(yōu)選地，上述經(jīng)修飾抗體或經(jīng)修飾抗體片段與其對應(yīng)的野生型/非經(jīng)修飾抗體或抗體片段的差異在于經(jīng)修飾抗體或經(jīng)修飾抗體片段每條重鏈(更優(yōu)選地重鏈的每個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域(CH結(jié)構(gòu)域))包含一個(gè)或更多個(gè)例如1、2、3、4、5、6、7或8個(gè)(優(yōu)選地1、2、3或4個(gè))另外的功能性N-糖基化糖連接用肽段(N-glycosylation sequon)。這對于另外的人工N-聚糖的連接是特別有用的。因此，所述經(jīng)修飾抗體或經(jīng)修飾抗體片段可提供每個(gè)抗體分子多于兩個(gè)的通?？纱嬖诘腘-糖基化糖連接用肽段(每條重鏈或CH結(jié)構(gòu)域一個(gè))。這又允許每個(gè)抗體分子偶聯(lián)多于兩個(gè)的巖藻糖類似物(每條重鏈或CH結(jié)構(gòu)域一個(gè))，其可以與另外的人工N-聚糖連接。
`[0174]本文所使用的術(shù)語“糖連接用肽段(sequon) ”指在蛋白質(zhì)或多肽中的3個(gè)連續(xù)氨基酸的序列，其可以作為多糖(糖)連接位點(diǎn)(稱為N-連接-聚糖)。其為通過在天冬酰胺(Asn)側(cè)鏈中的氮原子與蛋白或多肽相連的多糖。糖連接用肽段可以是Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。
[0175]因此，還特別優(yōu)選，所述經(jīng)修飾抗體包含兩條重鏈，其中每條重鏈在天冬酰胺N297處有天然的N糖基化位點(diǎn)并且還在天冬酰胺N159處有人工N糖基化位點(diǎn)(特別地，由于S161替換G161而產(chǎn)生)和/或在天冬酰胺N276處有人工N-糖基化位點(diǎn)(特別地，由于S278替換Y278而產(chǎn)生)(全部根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號)，或者所述經(jīng)修飾抗體片段包含重鏈優(yōu)選重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域(CH結(jié)構(gòu)域)，其在天冬酰胺N297處有天然的N糖基化位點(diǎn)并且還在天冬酰胺N159處有人工N糖基化位點(diǎn)(特別地，由于S161替換G161而產(chǎn)生)和/或在天冬酰胺N276處有人工N-糖基化位點(diǎn)(特別地，由于S278替換Y278而產(chǎn)生)(全部根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號)。
[0176]因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含兩條重鏈的抗體或包含重鏈(H)(優(yōu)選重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域(CH結(jié)構(gòu)域))的抗體片段包含一個(gè)或更多個(gè)選自以下的N-糖基化位點(diǎn)--天冬酰胺N297、天冬酰胺N159和天冬酰胺N276 (全部根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含兩條重鏈的抗體每條重鏈包含1、2或3個(gè)選自以下的N-糖基化位點(diǎn):天冬酰胺N297、天冬酰胺N159和天冬酰胺N276 (全部根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號)，或者包含重鏈(H)(優(yōu)選重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域(CH結(jié)構(gòu)域))的抗體片段包含1、2或3個(gè)選自以下的N-糖基化位點(diǎn):天冬酰胺N297、天冬酰胺N159和天冬酰胺N276 (全部根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號)。如上所述，在天冬酰胺N159處的N糖基化位點(diǎn)特別地由于S161替換G161而產(chǎn)生，以及在天冬酰胺N276處的N-糖基化位點(diǎn)特別地由于S278替換Y278而產(chǎn)生(全部根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號)。
[0177]更優(yōu)選地，所述抗體或抗體片段包含抗體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域具有根據(jù)SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的核酸序列，其中氨基酸G161 (CH)和/或Y278 (CH)(根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號)被絲氨酸所替換。這些替換允許在天冬酰胺N159和/或N276處N糖基化(參見上文)。所述抗體或抗體片段還可包含在天冬酰胺N297處(CH)(根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號)的功能性天然N糖基化位點(diǎn)。因此，這樣的經(jīng)修飾抗體可以實(shí)現(xiàn)所限定的兩個(gè)至六個(gè)巖藻糖類似物的連接，或者這樣的經(jīng)修飾抗體片段可以實(shí)現(xiàn)所限定的一個(gè)至三個(gè)巖藻糖類似物的連接。
[0178]還優(yōu)選根據(jù)SEQ ID NO:8 (IgGlCH等位基因01，人)之氨基酸序列的變體，其中氨基酸G161 (CH)和/或Y278 (CH)(根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號)被絲氨酸替換，其與所述氨基酸序列有至少90%，更優(yōu)選地至少95%，最優(yōu)選地至少99%，例如90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%的同一性；或者根據(jù)SEQ ID NO:9 (IgGlCH等位基因02，人)之氨基酸序列的變體，其中氨基酸G161 (CH)和/或Y278 (CH)(根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號)被絲氨酸替換，其與所述氨基酸序列有至少90%，更優(yōu)選地至少95%，最優(yōu)選地至少99%，例如90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%的同一性。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，序列同一性是針對20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、120個(gè)或更多個(gè)氨基酸的連續(xù)延伸，優(yōu)選地針對各參考多肽的全長。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，針對相應(yīng)參考多肽的整個(gè)長度，同一性為至少95%、針對整個(gè)長度至少96%、針對整個(gè)長度至少97%、針對整個(gè)長度至少98%或針對整個(gè)長度至少99%。
[0179]還特別優(yōu)選,之前提到的變體是功能活性變體。這意味著上文所示范圍中一個(gè)或更多個(gè)(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個(gè))氨基酸替換、添加、插入或缺失之形式的變化位于允許N-糖基化位點(diǎn)的識(shí)別和額外人工N-聚糖和/或天然N-聚糖連接至所述位點(diǎn)的以上所述的氨基酸位置之外或不同于上文所述氨基酸位置。這意味著(i)根據(jù)SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之氨基酸序列的功能活性(functionally active)變體(其中S161替換了 G161從而在天冬酰胺N159處生成N-糖基化位點(diǎn))在這些位置沒有氨基酸變化，可以在以上限定的范圍內(nèi)的另外的氨基酸位置發(fā)生變化，(ii)根據(jù)SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之氨基酸序列的功能活性變體(其中S278替換了 Y278從而在天冬酰胺N276處生成N-糖基化位點(diǎn))在這些位置沒有氨基酸變化，可以在以上限定的范圍內(nèi)的另外的氨基酸位置發(fā)生變化，(iii)根據(jù)SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之氨基酸序列的功能活性變體(其中G161替換了 S161從而在天冬酰胺N159處生成N-糖基化位點(diǎn)并且S278替換了 Y278從而在天冬酰胺N276處生成N-糖基化位點(diǎn))在這些位置沒有氨基酸變化，可以在以上限定的范圍內(nèi)的另外的氨基酸位置發(fā)生變化。所述功能活性變體還可包含在未突變的天冬酰胺N297處的N-糖基化位點(diǎn)(全部根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號)。[0180]換句話說，在上述功能活性變體中，聚糖轉(zhuǎn)移酶所識(shí)別的序列模體(例如包含Asp、Ser或Thr殘基,優(yōu)選三肽序列Asn-X-Ser/Thr,其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)仍然存在并且未突變。
[0181]本領(lǐng)域的技術(shù)人員清楚用于以下的技術(shù):如何評估N-聚糖是否仍可連接另外的人工N-聚糖和/或在上述抗體或抗體片段變體中包含的天然N-聚糖，并因此評估是否仍可偶聯(lián)巖藻糖類似物。一種合適的技術(shù)是例如MALD1-T0F/T0F。
[0182]對于Kabat 編號方案，可參見 Kabat 等，1983E.A.Kabat, Τ.Τ.W u, H.Bilofsky,M.Reid-MiIIer和H.Perry,Sequence of Protein of Immunological Interest,NationalInstitutes of Health,Bethesda(1983))。盡管Fe區(qū)的邊界可以變化,但是人IgG重鏈Fe區(qū)通常被定義為包含殘基C226或P230至其羧基末端，其中根據(jù)如EU指數(shù)編號，如描述于Kabat 等(1991, NIH PubIication91-3242, National Technical Information Service,Springfield, Va.)。“EU指 數(shù)按照Kabat設(shè)置”指人IgGlEU抗體按照在Kabat等中的描述編號。
[0183]優(yōu)選地，病毒蛋白或病毒蛋白片段包含于有包膜病毒的包膜中。特別優(yōu)選的是，該病毒蛋白是來自呼吸道合胞病毒的G或F蛋白并且所述病毒蛋白片段是所述蛋白質(zhì)的細(xì)胞外片段。本發(fā)明的另一個(gè)方面是包含所述病毒蛋白或病毒蛋白片段的病毒。
[0184]還優(yōu)選所述能夠作為巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶底物的分子是脂質(zhì)。優(yōu)選地，所述脂質(zhì)是甘油糖脂，最優(yōu)選半乳糖脂、硫脂(SQDG)或鞘糖脂，最優(yōu)選腦苷脂(例如半乳糖腦苷脂或葡萄糖腦苷脂)、神經(jīng)節(jié)苷脂、紅細(xì)胞糖苷、硫腦苷脂或糖磷酸鞘脂(glycophosphosphingolipid)。
[0185]特別優(yōu)選鞘糖脂(glycosphingolipid,GSL)。鞘糖脂含有疏水性神經(jīng)酰胺錨定部分N-?；拾贝家约坝商墙M成的親水性頭部基團(tuán)。其通常存在于細(xì)胞膜的外表面。糖部分的組成是細(xì)胞類型特異性的，其取決于生物體的發(fā)育階段，或者可以隨細(xì)胞的致癌狀態(tài)而改變。
[0186]特別優(yōu)選包含于包膜病毒的包膜中的脂質(zhì)。
[0187]本發(fā)明的又一方面是包含所述脂質(zhì)的病毒。本發(fā)明的另一方面是包含所述脂質(zhì)和所述蛋白質(zhì)的病毒。最優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)或脂質(zhì)包含于包膜病毒的包膜中。如以上已經(jīng)提及的，所述蛋白質(zhì)或脂質(zhì)可以是包含于包膜病毒之包膜中的病毒蛋白質(zhì)或脂質(zhì)。優(yōu)選地，所述包膜病毒被完整地或部分地用作病毒疫苗的活性組分。術(shù)語“病毒疫苗”指被減弱或殺死的病毒制劑，其在施用后能刺激抗體的生產(chǎn)或針對病毒的細(xì)胞免疫，但無法引起嚴(yán)重感染。
[0188]上文所述的病毒可以通過病毒感染導(dǎo)入真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)中。還可以通過導(dǎo)入編碼待產(chǎn)生病毒之所有或一部分的核酸而將病毒導(dǎo)入真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)中。在有必要提供復(fù)制、裝配等所需蛋白質(zhì)的情況下，這通常通過利用能夠表達(dá)一種或更多種病毒蛋白的病毒產(chǎn)生細(xì)胞系來實(shí)現(xiàn)。例如，HEK293、Per.C6和AGE1.HN細(xì)胞表達(dá)腺病毒ElA蛋白，并因此能夠補(bǔ)償缺乏El編碼區(qū)的DNA。
[0189]在真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)中包含糖部分之分子(例如蛋白質(zhì)或脂質(zhì))的巖藻糖基化需要核苷酸糖(GDP-L-巖藻糖)作為供體并且還需要存在特定的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，所述酶將巖藻糖基殘基從供體轉(zhuǎn)移至接受體分子。在來自真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)的聚糖中，巖藻糖可通過α -1，3連接(末端巖藻糖)連接至觸角GlcNAc,或通過α 1，6連接(核心巖藻糖)連接至連接了天冬酰胺的GlcNAc。
[0190]為了實(shí)現(xiàn)將巖藻糖類似物均一、穩(wěn)定、定點(diǎn)地結(jié)合至所述分子(例如蛋白質(zhì)例如抗體)，優(yōu)選通過α 1，6連接將巖藻糖類似物(而不是天然巖藻糖)結(jié)合至幾丁二糖核心。因此，本發(fā)明的真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)優(yōu)選地包含具有酶活性的α-1，6_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。在本發(fā)明的真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)中，如果想要產(chǎn)生僅包含1，6巖藻糖基化位點(diǎn)的結(jié)合巖藻糖類似物的蛋白質(zhì)(例如天然的，未修飾的抗體)，那么(僅)存在具有酶活性的α-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是特別優(yōu)選的。這還可以另外提高通過α-1，6_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶N-糖基化位點(diǎn)偶聯(lián)至蛋白質(zhì)的巖藻糖類似物的電荷均一性。
[0191]作為替代地或另外地，本發(fā)明的真核細(xì)胞優(yōu)選地包含具有酶活性的蛋白質(zhì)-O-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。蛋白質(zhì)-O-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(POFUTl)是通常負(fù)責(zé)將巖藻糖糖類以O(shè)-連接添加至絲氨酸或蘇氨酸殘基的酶。該蛋白是反向糖基轉(zhuǎn)移酶，這意味著所述酶使用GDP-P-L-巖藻糖作為供體底物并將巖藻糖以O(shè)-連接轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)產(chǎn)生巖藻糖基- α -O-絲氨酸/蘇氨酸。在本發(fā)明的真核細(xì)胞，它可以以O(shè)-連接將巖藻糖類似物而不是天然巖藻糖添加到包含于分子結(jié)構(gòu)的絲氨酸或蘇氨酸殘基。在本發(fā)明的真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)中，如果想要產(chǎn)生包含一個(gè)或更多個(gè)例如1、2、3或4個(gè)EGF樣重復(fù)的偶聯(lián)巖藻糖類似物的蛋白質(zhì)，所述EGF樣重復(fù)包含絲氨酸和/或蘇氨酸殘基，其中所述殘基被蛋白質(zhì)-O-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶所識(shí)別，那么(僅)存在蛋白質(zhì)-O-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是特別優(yōu)選的。這還可以提高通過蛋白質(zhì)-O-巖藻糖基化位點(diǎn)偶聯(lián)至蛋白質(zhì)之巖藻糖類似物的電荷均一性。
[0192]在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的真核細(xì)胞不包含具有酶活性的α-1，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。優(yōu)選地，α-1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性被消除，由于α-1，3-巖藻糖基化抑制因子(suppressor)例如組蛋白去乙?；?histone deacetylase5, Hdac5)的過表達(dá)，更優(yōu)選組成型和/或穩(wěn)定過表達(dá)。還優(yōu)選所述細(xì)胞不包含具有酶活性的-1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，這是由于(i)所述酶被突變使得其不再有功能活性，(ii)編碼所述酶的基因被部分或全部敲除使得不表達(dá)具有功能活性的酶，或(iii)調(diào)控所述酶之基因表達(dá)的啟動(dòng)子區(qū)被部分或完全缺失使得不表達(dá)具有功能活性的酶。也可以使用miRNA和/或siRNA敲低所述α-1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。
[0193]在本發(fā)明的真核細(xì)胞(例如脊椎動(dòng)物細(xì)胞)中，如果想要產(chǎn)生除天然N-糖基化位點(diǎn)之外包含人工引入的N-糖基化位點(diǎn)(例如在抗體中在氨基酸位置Ν276和/或Ν159處弓丨入的人工N-糖基化位點(diǎn)，和在氨基酸位置Ν297處的天然N-糖基化位點(diǎn)(根據(jù)Kabat系統(tǒng)編號))的偶聯(lián)巖藻糖類似物的蛋白質(zhì)(例如抗體)，則不存在具有酶活性的α-1，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是特別優(yōu)選的。α-1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和α-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶可接近所述人工N糖基化位點(diǎn)(由于該位置處的特定聚糖結(jié)構(gòu))，而α-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶可接近天然N糖基化位點(diǎn)(由于該位置處的特定聚糖結(jié)構(gòu))。因此，為了允許產(chǎn)生具有高結(jié)合穩(wěn)定性和同質(zhì)性的分子-藥物活性化合物-綴合物，優(yōu)選(僅)存在具有酶活性的α-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶并且缺乏具有酶活性的α -1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。
[0194]使用優(yōu)選地缺乏α-1，3_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的本發(fā)明的真核細(xì)胞導(dǎo)致僅保留蛋白質(zhì)-O-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和`α -1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性，并且因此留下蛋白質(zhì)-O-連接氨基酸位點(diǎn)和α -1,6-連接核心巖藻糖基化位點(diǎn)作為僅有的巖藻糖類似物可以結(jié)合的位點(diǎn)。這允許產(chǎn)生具有高結(jié)合穩(wěn)定性和同質(zhì)性的結(jié)合了巖藻糖類似物的蛋白質(zhì)，特別地產(chǎn)生抗體，其包含可以被α -1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶識(shí)別的N-糖基化位點(diǎn)和可以被蛋白質(zhì)-O-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶識(shí)別的氣基酸殘基二者。
[0195]優(yōu)選地，所述真核細(xì)胞是脊椎動(dòng)物細(xì)胞。特別優(yōu)選的是脊椎動(dòng)物細(xì)胞為哺乳動(dòng)物、魚類、兩棲類、爬行類的細(xì)胞或鳥類細(xì)胞。
[0196]更優(yōu)選為:
[0197](i)哺乳動(dòng)物細(xì)胞是人、小鼠、大鼠、倉鼠、狗或猴細(xì)胞，更特別地中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、敘利亞倉鼠成纖維(BHK21)細(xì)胞(ATCC CCL-10)、SP2/0_Agl4細(xì)胞(ATCCCRL-1581)、NSO 細(xì)胞(ECACC 號 85110503)、人宮頸癌(HELA)細(xì)胞(ATCC CCL2)、人 PER.C6細(xì)胞或人AGE1.HN細(xì)胞，
[0198](ii)魚類細(xì)胞是斑點(diǎn)叉尾麵(Ictalurus punctatus)(河It)細(xì)胞，更特別地斑點(diǎn)叉尾鮰(河鯰)卵巢(CCO)細(xì)胞(ATCC CRL-2772)，
[0199](iii)兩棲動(dòng)物細(xì)胞是非洲爪蟾(Xenopus Iaevis)細(xì)胞，更特別地非洲爪蟾腎細(xì)胞(ATCC CCL-102)，
[0200](iv)爬行動(dòng)物的細(xì)胞是綠鬣蜥(Iguana iguana)細(xì)胞，更特別地綠鬣蜥心臟(IgH-2)細(xì)胞(ATCC CCL-108)，或
[0201](V)鳥類細(xì)胞是鳥視網(wǎng)膜細(xì)胞，特別地AGE1.CR.PIX細(xì)胞，或鳥體節(jié)細(xì)胞。
[0202]細(xì)胞系A(chǔ)GE1.CR.PIX于2005年11月24日保藏于德國微生物菌種保藏中心(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, MascheroderWeglb，3812姐raunschweig，Germany)，保藏號為 DSM ACC2749。細(xì)胞系 AGEl.HN 于 2005 年 11月4日保藏于德國微生物菌種保藏中心(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH,Mascheroder Weglb, 38124Braunschweig, Germany),保藏號為 DSMACC2744。
[0203]如上所述，特別優(yōu)選所述細(xì)胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。CHO細(xì)胞是最初于1952年分離的細(xì)胞。親本譜系CHO pro-的衍生物(特別是CH0-K1)(其可以在本文使用)為CHO-S和CHO-SV細(xì)胞。該譜系的一個(gè)變體(DUKX Bll)經(jīng)修改從而僅含有一個(gè)被突變失活的dhfr基因等位基因。另一個(gè)CHO亞系(DG44)從共同的祖先更早的脫離并缺乏兩個(gè)dhfr等位基因(Urlaub 等，1986，Proc Natl Acad Sci USA.83 (2):337-341)。在本發(fā)明的一些最優(yōu)選實(shí)施方案中，中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞為CHO-Kl或CH0-DG44細(xì)胞。
[0204]CHO-Kl或CH0-DG44細(xì)胞在生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)和抗體中廣泛使用。除了 CHO通常的高靈活性(flexibility)，CHO-Kl或CH0-DG44細(xì)胞均有各自的獨(dú)特特征。CHO-Kl細(xì)胞生長至更高的峰值細(xì)胞密度，而DG44細(xì)胞通常表現(xiàn)出更高的單位生產(chǎn)力(specificproductivity)。通常情況下,培養(yǎng)基無法兼容這兩個(gè)細(xì)胞系。優(yōu)選的細(xì)胞系總結(jié)在下表1:
[0205]表1
[0206]
【權(quán)利要求】
1.一種真核細(xì)胞，其用于產(chǎn)生包含巖藻糖類似物的分子，其中 (i)在所述細(xì)胞中從GDP-D-甘露糖起始的GDP-L-巖藻糖合成途徑被阻斷，并且 (?)所述細(xì)胞包含⑶P-L-巖藻糖類似物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞,其中所述細(xì)胞包含至少一種使用GDP-6-脫氧-D-來蘇-4-己酮糖作為底物的酶，其中所述酶不催化將GDP-6-脫氧-D-來蘇-4-己酮糖轉(zhuǎn)變成⑶P-L-巖藻糖的反應(yīng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的細(xì)胞，其中所述使用GDP-6-脫氧-D-來蘇-4-己酮糖作為底物的酶選自:⑶P-6-脫氧-D-來蘇-4-己酮糖還原酶(RMD)、⑶P-過骨胺合成酶(Per)、⑶P-6-脫氧-D-塔洛糖合成酶(GTS)、⑶P-巖藻糖合成酶Cysl09Ser-(GFS-Cysl09Ser)突變體、⑶P-4-酮-6-脫氧甘露糖-3-脫水酶(ColD)，優(yōu)選⑶P-4-酮-6-脫氧甘露糖_3_脫水酶(ColD)聯(lián)合GDP-L-可立糖合酶(ColC)，及其變體。
4.權(quán)利要求2或3所述的細(xì)胞，其中所述酶由瞬時(shí)存在或穩(wěn)定維持于所述細(xì)胞中的核酸序列表達(dá)。
5.權(quán)利要求1至4所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞 (i)不包含具有酶活性的⑶P-甘露糖脫水酶(GMD)或包含酶活性降低的⑶P-甘露糖脫水酶(GMD)，和/或 (?)不包含具有酶活性的⑶P-巖藻糖合成酶(GFS)或包含酶活性降低的⑶P-巖藻糖合成酶(GFS)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞還包含至少一種能夠作為巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶底物的分子。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)`胞，其中所述分子是蛋白質(zhì)或脂質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的細(xì)胞，其中所述蛋白質(zhì)是內(nèi)源性或外源性蛋白質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的細(xì)胞，其中所述外源性蛋白質(zhì)由瞬時(shí)存在或穩(wěn)定維持于所述細(xì)胞中的核酸序列表達(dá)。
10.權(quán)利要求7至9所述的細(xì)胞，其中所述蛋白質(zhì)為抗原結(jié)合蛋白，優(yōu)選抗體，更優(yōu)選IgGl抗體，病毒蛋白或抗原。
11.權(quán)利要求1至10所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞不包含具有酶活性的α-1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。
12.權(quán)利要求1至11所述的細(xì)胞,其中所述細(xì)胞是脊椎動(dòng)物細(xì)胞。
13.權(quán)利要求12所述的細(xì)胞，其中所述脊椎動(dòng)物細(xì)胞是哺乳動(dòng)物、魚、兩棲類、爬行類的細(xì)胞或鳥類細(xì)胞。
14.權(quán)利要求13所述的細(xì)胞，其中 (i)所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是人、倉鼠、狗或猴細(xì)胞，優(yōu)選中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、敘利亞倉鼠成纖維(BHK21)細(xì)胞(ATCC CCL-10)、SP2/0-Agl4 細(xì)胞(ATCC CRL-1581)、NSO 細(xì)胞(ECACC 號 85110503)、人宮頸癌(HELA)細(xì)胞(ATCC CCL2)、人 PER.C6 細(xì)胞或人 AGE1.HN 細(xì)胞， (?)所述魚細(xì)胞是斑點(diǎn)叉尾麵(Ictalurus punctatus)(河It)細(xì)胞,優(yōu)選斑點(diǎn)叉尾鮰(河鯰)卵巢(CCO)細(xì)胞(ATCC CRL-2772)，(iii)所述兩棲類細(xì)胞是非洲爪蟾(XenopusIaevis)細(xì)胞，優(yōu)選非洲爪蟾腎細(xì)胞(ATCC CCL-102)， (iv)所述爬行類細(xì)胞是綠鬣蜥(Iguanaiguana)細(xì)胞,優(yōu)選綠鬣蜥心臟(IgH_2)細(xì)胞(ATCC CCL-108);或者 (V)所述鳥類細(xì) 胞是鳥視網(wǎng)膜細(xì)胞，優(yōu)選AGE1.CR.PIX細(xì)胞或鳥體節(jié)細(xì)胞。
15.權(quán)利要求1至14所述的細(xì)胞，其中所述GDP-L-巖藻糖類似物包含一個(gè)或更多個(gè)反應(yīng)性或活化的取代。
16.權(quán)利要求1至15所述的細(xì)胞，其中所述GDP-L-巖藻糖類似物是從L-巖藻糖類似物合成的。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的細(xì)胞，其中L-巖藻糖類似物是全乙?；膸r藻糖類似物，優(yōu)選1，2，3，4-四乙?；?疊氮基-巖藻糖的吡喃糖形式。
18.一種用于生產(chǎn)包含巖藻糖類似物之分子的方法，包括以下步驟: (i)提供根據(jù)權(quán)利要求1至17所述的真核細(xì)胞，和 (?)從來自i)的細(xì)胞中分離包含巖藻糖類似物的分子。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述細(xì)胞在步驟(ii)分離所述分子之前培養(yǎng)于缺乏天然巖藻糖或天然巖藻糖代謝前體的細(xì)胞培養(yǎng)基中。
20.可由權(quán)利要求18或19所述方法獲得的包含巖藻糖類似物的分子。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的分子，其中所述巖藻糖類似物包含用于結(jié)合藥物活性化合物的一個(gè)或更多個(gè)反應(yīng)性或活化的取代。
22.用于生產(chǎn)包含分子和藥物活性化合物之綴合物的方法，所述分子包含巖藻糖類似物，所述方法包括以下步驟: (i)實(shí)施權(quán)利要求18或19所述的方法，和 (?)通過巖藻糖類似物將藥物活性化合物共價(jià)地偶聯(lián)到包含所述巖藻糖類似物的分子。
23.可由權(quán)利要求22所述方法獲得的包含含巖藻糖類似物之分子和藥物活性化合物的綴合物。
24.包含蛋白質(zhì)或多肽綴合物，所述蛋白質(zhì)或多肽包含一個(gè)或更多個(gè)以下結(jié)構(gòu):-NG-cF * -Y0-C, 其中每一個(gè)連接到在所述蛋白質(zhì)或多肽中包含的N-糖基化位點(diǎn)， NG是所述蛋白質(zhì)或多肽的N-連接的糖部分， CF *是核心巖藻糖類似物， Y是間隔子單元，其中，ο為整數(shù)O或1，以及 C是藥物活性化合物。
25.權(quán)利要求24所述的綴合物，其中所述糖部分是復(fù)合型的N-連接糖部分。
26.權(quán)利要求24或25所述的綴合物，其中所述多肽是抗體重鏈(H)。
27.包含兩個(gè)如權(quán)利要求26中所定義之綴合物的抗體。
28.包含蛋白質(zhì)或多肽的綴合物，所述蛋白質(zhì)或多肽包含一個(gè)或更多個(gè)EGF樣重復(fù)，所述重復(fù)包含與以下結(jié)構(gòu)相連接的絲氨酸和/或蘇氨酸殘基:_F * -Yp-C, 其中F *是直接連接到所述絲氨酸和/或蘇氨酸殘基的巖藻糖類似物部分，Y是間隔子單元，其中P是整數(shù)O或1，且C是藥物活性化合物。
29.權(quán)利要求28所述的綴合物，其中所述多肽是抗體重鏈(H)。
30.包含兩個(gè)如權(quán)利要求29中所定義之綴合物的抗體。
【文檔編號】C07K16/00GK103732619SQ201280038331
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年5月31日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月31日
【發(fā)明者】漢斯·亨寧·馮霍爾斯滕, 沃爾克·桑迪希, 英戈·喬丹, 卡斯滕·溫克勒 申請人:普羅拜奧金股份有限公司