合成淀粉樣蛋白球體的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明提供效率提高的合成淀粉樣蛋白球體的制造方法。所述合成淀粉樣蛋白球體的制造方法包含在增塑劑的存在下對含有淀粉樣蛋白β肽的液體進行攪拌的工序。淀粉樣蛋白球體是指能夠選擇性誘發(fā)功能上成熟的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞死亡的淀粉樣蛋白β肽的寡聚體。淀粉樣蛋白球體被認(rèn)為在阿耳茨海默病或路易體癡呆的發(fā)病中發(fā)揮重要的作用。
【專利說明】合成淀粉樣蛋白球體的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及合成淀粉樣蛋白球體(amylospheroid)的制造方法。
【背景技術(shù)】
[0002]阿耳茨海默病是經(jīng)過突觸變性、成熟神經(jīng)細(xì)胞發(fā)展至死亡的疾病。通過最近的研究逐漸清楚，阿耳茨海默病的發(fā)病是階段性的。最初的階段有主要發(fā)生突觸變性的階段。該階段為可逆性的階段。所述可逆性階段的下一階段為發(fā)生神經(jīng)細(xì)胞死亡的階段。該階段為不可逆性的階段，認(rèn)為由于到了該不可逆性階段而導(dǎo)致阿耳茨海默病發(fā)病(非專利文獻I)。
[0003]突觸變性主要是蓄積的β淀粉樣蛋白(Α β ) 二聚體和十二聚體作用于谷氨酸受體等而發(fā)生的。但是，Αβ 二聚體和十二聚體在體外和體內(nèi)均不引起神經(jīng)細(xì)胞死亡(非專利文獻2)。因此，為了分析人的阿耳茨海默病的病理狀態(tài)，需要弄清楚在可逆性的突觸變性階段之后的不可逆性階段發(fā)生的神經(jīng)細(xì)胞死亡的原因和分子機理。
[0004]淀粉樣蛋白球體(ASPD)為對非神經(jīng)細(xì)胞和幼稚神經(jīng)細(xì)胞不顯示毒性而選擇性地引起功能上成熟的神經(jīng)細(xì)胞死亡的獨特的Αβ集合體(Αβ aggregate)(非專利文獻I)。淀粉樣蛋白球體最初作為在體外引起神經(jīng)細(xì)胞死亡的直徑為約IOnm的球狀Αβ集合體而被分離(非專利文獻3)。其后，制作了針對該合成淀粉樣蛋白球體的特異性抗體(專利文獻I和2)，使用該抗體從阿耳茨海默病的人患者的腦中分離了在生物體內(nèi)形成(即天然的)的淀粉樣蛋白球體(非專利文獻3)。從使用了該天然的淀粉樣蛋白球體的研究弄清楚了:i)天然的淀粉樣蛋白球體 與合成淀粉樣蛋白球體同樣地選擇性地誘發(fā)成熟神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞死亡，并且ii)可見神經(jīng)細(xì)胞脫落的阿耳茨海默病患者的大腦皮質(zhì)中的天然的淀粉樣蛋白球體量與阿耳茨海默病的嚴(yán)重程度相關(guān)地增加，而且iii)幾乎未見神經(jīng)細(xì)胞脫落的阿耳茨海默病患者的小腦中的天然的淀粉樣蛋白球體量僅微量存在(非專利文獻3)。因此認(rèn)為，淀粉樣蛋白球體在阿耳茨海默病發(fā)病的不可逆性階段發(fā)揮著重要作用。此外，天然的淀粉樣蛋白球體還從路易體癡呆(Dementia withLewy Bodies)患者的腦中檢測到(非專利文獻
I)，考慮對于路易體癡呆，淀粉樣蛋白球體也在其發(fā)病中發(fā)揮著重要作用。
[0005]另外還顯示，淀粉樣蛋白球體與被認(rèn)為是引起突觸變性的主要原因的Αβ 二聚體和十二聚體雖然均為Αβ集合體，但是其是由Αβ單體通過不同路徑而形成的。即，與Αβ二聚體和十二聚體經(jīng)由Αβ 二聚體不同，淀粉樣蛋白球體由Αβ三聚體形成(非專利文獻4)。
[0006]現(xiàn)有技術(shù)文獻
[0007]專利文獻
[0008]專利文獻1:TO2006/016644
[0009]專利文獻2:W02009/057664
[0010]非專利文獻
[0011]非專利文獻I =Noguchi et al.J.Biol.Chem.vol.284n0.47, 32895-32905 (2009)
[0012]非專利文獻2:Shankar et al.Nature Medicinel4, 837-842 (2008)[0013]非專利文 獻 3:Hoshi et al.Pr0.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.vol.100，n0.11，6370-6375 (2003)
[0014]非專利文獻4:Matsumura et al.J.Biol.Chem.vol.286n0.13, 11555-11562(2011)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]發(fā)明欲解決的課題
[0016]如上所述，淀粉樣蛋白球體在阿耳茨海默病、路易體癡呆中發(fā)揮重要作用。但是，從患者腦中純化天然的淀粉樣蛋白球體并用于治療藥等的開發(fā)是非常困難的。因此認(rèn)為，如果與患者腦中存在的天然淀粉樣蛋白球體等價的合成淀粉樣蛋白球體能夠在體外更容易地制造，則將對阿耳茨海默病、路易體癡呆的研究、和針對這些疾病的預(yù)防方法和預(yù)防藥、以及治療方法和預(yù)防、治療藥的開發(fā)提供很大幫助。例如，以合成淀粉樣蛋白球體本身為抗原的主動疫苗療法的開發(fā)、神經(jīng)細(xì)胞死亡的分子機理研究、神經(jīng)細(xì)胞死亡阻斷藥的開發(fā)將變得容易。另外，由于目前并不清楚人腦中凝聚體形成的機制，因此將合成淀粉樣蛋白球體的形成用于模型體系，還能夠開發(fā)用于阻斷淀粉樣蛋白球體的形成的預(yù)防藥。
[0017]因此，本發(fā)明提供效率提高的合成淀粉樣蛋白球體的制造方法。
[0018]用于解決課題的手段
[0019]本發(fā)明在一個方式中涉及包含在增塑劑存在下攪拌含有淀粉樣蛋白β肽的液體的合成淀粉樣蛋白球體的制造方法(以下也稱為“本發(fā)明的制造方法”)。
[0020]發(fā)明的效果
[0021]根據(jù)本發(fā)明的制造方法，能夠提高合成淀粉樣蛋白球體的制造效率。
【專利附圖】

【附圖說明】 [0022]圖1為表示實施例1 (DEHP+)和比較例I (DEHP-)中的ASTO形成效率的測定結(jié)果的一個例子的圖。
[0023]圖2為表示實施例1 (DEHP+)和比較例I (DEHP-)中的細(xì)胞毒性試驗的結(jié)果的一個例子的圖。
[0024]圖3為實施例1 (DEHP存在下)和比較例I (無DEHP存在下)的電子顯微鏡觀察照片的一個例子。
[0025]圖4為表示實施例3~6和比較例I中的ASH)形成效率測定和細(xì)胞毒性試驗的結(jié)果的一個例子的圖。
【具體實施方式】
[0026]本發(fā)明基于下述認(rèn)識:在通過攪拌含有淀粉樣蛋白β肽的液體來形成合成淀粉樣蛋白球體的情況下，當(dāng)所述溶液中存在增塑劑時形成效率顯著提高。換言之，本發(fā)明基于下述認(rèn)識，通過在增塑劑存在下進行非專利文獻I和3中記載的以往的合成ASro的制造方法中的攪拌，能夠顯著提高合成淀粉樣蛋白球體的形成效率。
[0027]所述增塑劑存在時合成淀粉樣蛋白球體的形成效率提高的機理的詳細(xì)情況尚不清楚，但推測如下。淀粉樣蛋白β通常作為單體形式是穩(wěn)定的(Grant MA etal.PNAS104，16522-16527,2007)。并且，淀粉樣蛋白β形成纖維時，淀粉樣蛋白β的二聚體首先形成，另外已知，淀粉樣蛋白β形成淀粉樣蛋白球體時，淀粉樣蛋白β的三聚體首先形成(Matsumura et alJBC2011,非專利文獻4)。此外已知，與纖維形成不同，淀粉樣蛋白球體在生理性溶劑環(huán)境中在磷酸等具有特定的部分結(jié)構(gòu)的溶質(zhì)存在下形成時，其形成得到促進(星6學(xué)會発表7)。因此認(rèn)為，增塑劑通過與淀粉樣蛋白β單體相互作用而發(fā)揮促進三聚體形成的效果，特別是促進淀粉樣蛋白球體形成。但是，本發(fā)明也可以不限定地解釋為該機制。另外，本說明書中，“合成淀粉樣蛋白球體的形成效率”例如可以表述為所制造的合成淀粉樣蛋白球體中所含的淀粉樣蛋白β肽量與所使用的淀粉樣蛋白β肽量的比例(形成合成ASF1D的A β量/原料的Αβ量)。所述比例可以為重量比，也可以為摩爾比。
[0028][淀粉樣蛋白球體]
[0029]本說明書中，淀粉樣蛋白球體(以下也稱為“ASPD”0)是指能夠選擇性地誘發(fā)功能上成熟的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞死亡的Aβ集合體。ASro包括“合成Asro”和“天然ASH)”。合成Asro (合成淀粉樣蛋白球體)是指可使用合成Αβ在體外制備和分離的電子顯微鏡觀察時為直徑約10~15nm的球狀體的ASTO(非專利文獻3)。另外，天然ASTO是指可從人生物體內(nèi)(特別是阿耳茨海默病和/或路易體癡呆患者的腦)分離的ASPD (非專利文獻I)。合成ASro和天然ASro均誘發(fā)成熟人神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞死亡。還制作了能夠識別ASro的特異性立體結(jié)構(gòu)的抗Asro抗體(單克隆抗體和多克隆抗體)(例如專利文獻I和2中公開的haASDl、haASD2、mASD3等)。從抗ASTO單克隆抗體的特性分析、ASPD的NMR分析的結(jié)果已知，ASH)具有與到目前為止所報告的其它A β集合體不同的獨特的立體結(jié)構(gòu)(例如非專利文獻I的Supplemental Table SI)。因此，本說明書中，ASPD也指與專利文獻I和2中公開的針對ASro的特異性抗ASro抗體反應(yīng)且能夠選擇性地誘發(fā)功能上成熟的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞死亡的A β集合體。
[0030][淀粉樣蛋白β肽]`[0031]本說明書中，“淀粉樣蛋白β肽”是指淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)被α-、β _、Y-分泌酶切斷而切出的肽，也表示為“β淀粉樣蛋白”、“Αβ”或“Αβ肽”。另外，本說明書中，A β根據(jù)其氨基酸序列的長度也可包括被稱為A β i_39、A β β i_41、A β卜42和A β卜43的肽。本說明書中，Αβ可以是人型(存在于人的序列)的，也可以是非人型(存在于除人以外的動物的序列)。另外，本說明書中，Αβ可包括生物體內(nèi)的(天然)Αβ和合成的Αβ。合成Αβ沒有特別限定，可以通過公知的肽合成法(例如Fmoc法或Boc法)合成，例如利用公知的肽合成機制造。人型的Αβ卜42 (也稱為“Α β 42”)為由氨基酸序列(從N末端起):DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(序列號I)所示的氨基酸序列構(gòu)成的肽。另外，人型的Ai^41 (Αβ 41)、AiV40 (AMOWPAiV39 (Αβ 39)為由從序列號I的氨基酸序列的C末端起分別缺少了 Α、ΙΑ和VIA的氨基酸序列構(gòu)成的肽。此外，人型的Αβ U (Αβ 43)為由在序列號I的氨基酸序列的C末端附加有I個蘇氨酸殘基(T/Thr)的氨基酸序列構(gòu)成的肽。
[0032][增塑劑]
[0033]本說明書中，“增塑劑”沒有特別限定地可列舉出公知的增塑劑。作為本發(fā)明的制造方法中使用的增塑劑，從提高合成Asro的形成效率的觀點出發(fā)，例如優(yōu)選鄰苯二甲酸二正辛酯、鄰苯二甲酸二-2-乙基己酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二芐酯、鄰苯二甲酸二異癸酯等鄰苯二甲酸酯、間苯二甲酸二辛酯等間苯二甲酸酯、己二酸二正丁酯、己二酸二辛酯等己二酸酯、馬來酸二正丁酯等馬來酸酯、乙?；』鶛幟仕狨サ葯幟仕狨ァ⒁驴邓釂味□サ纫驴邓狨?、油酸丁酯等油酸酯、二乙?；了釂胃视王?、二乙?；鹿鹚釂胃视王?、蓖麻醇酸單甘油酯、十聚甘油單油酸酯等多元醇酯、磷酸三甲酚酯等磷酸酯、聚乙二醇(以下記為PEG)、PEG 二乙酸酯、聚丙二醇(以下記為PPG)、PEG-PPG-PEG嵌段共聚物、PPG-PEG-PPG嵌段共聚物等聚烷二醇類、三乙二醇單甲基醚乳酸寡聚物酯等乳酸寡聚物酯類、乙酸二乙二醇松香酯等香茅酸酯類。其中，從同樣的觀點出發(fā)，更優(yōu)選鄰苯二甲酸二正辛酯、鄰苯二甲酸二-2-乙基己酯、鄰苯二甲酸二芐酯、鄰苯二甲酸二異癸酯等鄰苯二甲酸酯，進一步優(yōu)選鄰苯二甲酸二-2-乙基己酯。
[0034][攪拌]
[0035]本說明書中，“攪拌”是指對流體施以動作。本發(fā)明中，“攪拌”優(yōu)選為低速和/或穩(wěn)定攪拌，以不影響Αβ的集合和/或ASro的形成。本發(fā)明中的攪拌可以通過使保持含有Αβ的液體的容器搖動，例如向所述容器施以旋轉(zhuǎn)、振蕩、搖動和它們的組合的動作來進行，或者也可以在含有Αβ的液體中配置攪拌子，通過使所述攪拌子旋轉(zhuǎn)來進行。攪拌的強度如上所述優(yōu)選為低速和/或穩(wěn)定的，也可以與非專利文獻I和3中記載的以往的合成ASro的制造方法中的攪拌為同等程度。另外，本發(fā)明的制造方法中的攪拌可以在規(guī)定的時間內(nèi)連續(xù)進行，也可以斷續(xù)進行。
[0036][合成ASro的形成]
[0037]本發(fā)明的制造方法包括在增塑劑的存在下攪拌含有Αβ的液體。合成ASH)認(rèn)為是通過使所述攪拌中的所述Aβ集合或締合而形成的。因此，本發(fā)明的制造方法在一個實施方式中包含合成ASro形成工序，所述工序包括對含有A β和增塑劑的液體進行攪拌。
[0038]供于合成ASro形成工序的含有Αβ和增塑劑的液體中的Αβ的含量從提高合成ASPD的形成效率的觀點出發(fā)，優(yōu)選為0.1~500 μ Μ、更優(yōu)選為I~350 μ Μ、進一步優(yōu)選為10~200 μ Μ、進一步更優(yōu)選為20~100 μ Μ、進一步更優(yōu)選為30~75 μ Μ、進一步更優(yōu)選為40~60 μ M0所述液體中所含的A β從提高合成ASH)的形成效率的觀點出發(fā)優(yōu)選為單體，即優(yōu)選在合成ASro形成工序之前沒有形成Aβ集合體。另外，所述液體中所含的Αβ可以為I種、也可以為多種的混合物。例如，可以為Αβ42或Αβ40中的I種、也可以為Aβ 42與Αβ40的混合物。
[0039]供于合成ASro形成工序的含有Αβ和增塑劑的液體中的增塑劑的含量從提高合成ASro的形成效率的觀點出發(fā)，優(yōu)選為IOyM~10mM、更優(yōu)選為100~1000 μ M、進一步優(yōu)選為200~900 μ Μ、進一步更優(yōu)選為400~800 μ Μ,進一步更優(yōu)選為500~750 μ Μ、進一步更優(yōu)選為600~700 μ M0所述液體中所含的增塑劑可以是I種、也可以是多種的混合物。
[0040]合成ASro形成工序中的攪拌的溫度從提高合成ASro的形成效率的觀點出發(fā)，優(yōu)選為超過(TC且為40°C以下、更優(yōu)選為37°C以下、進一步優(yōu)選為32°C以下、進一步更優(yōu)選為12°C以下、進一步更優(yōu)選為5°C以下。另外，本說明書中，“攪拌的溫度”是指進行攪拌的環(huán)境溫度或周圍溫度。
[0041]合成ASro形成工序中的攪拌的時間例如為10小時~8天。當(dāng)供于所述工序的所述液體中的Αβ為Αβ 42 時，攪拌時間從提高合成ASro的形成效率的觀點出發(fā)，優(yōu)選為10~20小時、更優(yōu)選為11~18小時、進一步優(yōu)選為12~16小時、進一步更優(yōu)選為13~15小時。當(dāng)所述Αβ為Αβ 40時，攪拌時間從提高合成ASH)的形成效率的觀點出發(fā)，優(yōu)選為4~8天、更優(yōu)選為5~7天。當(dāng)所述Αβ為除此之外的A β或為混合物時，可在上述范圍內(nèi)進行適當(dāng)調(diào)節(jié)。
[0042][確認(rèn)合成ASro的形成]
[0043]通過本發(fā)明的制造方法或所述合成ASro形成工序形成的合成ASro可利用細(xì)胞毒性和/或抗體反應(yīng)性進行確認(rèn)。例如，當(dāng)添加到成熟的神經(jīng)細(xì)胞中時能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡(細(xì)胞凋亡)時，則能夠確認(rèn)ASro的存在(非專利文獻I和3)。或者，ASro的存在可以使用針對ASPD的特異性抗體進行確認(rèn)。作為所述抗體，可以使用專利文獻I和2中公開的haASDl、haASD2、mASD3等針對ASH)的特異性單克隆抗體或rpASDl等針對ASTO的特異性多克隆抗體。當(dāng)使用這些抗體時，還可以根據(jù)以往公知的方法對合成Asro進行定量。
[0044][合成ASro的純化]
[0045]通過本發(fā)明的制造方法或所述合成ASro形成工序形成的合成ASro可以如下進行純化:使用孔徑為0.22μm的過濾器將攪拌后的液體過濾,將其濾液用截止50kDa或IOOkDa的超濾器過濾，回收滯留物。或者，所述合成ASH)還可以通過使用了針對Asro的特異性抗體、例如所述專利文獻I或2中公開的抗體的免疫沈降法來進行純化。本發(fā)明的制造方法可以包含對形成的合成Asro進行純化的工序。但合成ASro的純化方法并不限定于該方法。
[0046][含有Aβ和增塑劑的液體的制備]
[0047]本發(fā)明的制造方法中，供于攪拌的含有Αβ和增塑劑的液體從提高合成ASH)的形成效率的觀點出發(fā)，優(yōu)選通過包含將Αβ溶解到含有增塑劑的有機溶劑、和用水性溶液對得到的Αβ溶液進行稀釋的方法制備。因此，本發(fā)明的制造方法在另一實施方式中還涉及合成ASro的制造方法，其包含1)含有々0和增塑劑的液體的制備工序和2)合成ASro形成工序，所述工序I)包含將Aβ溶解于含有增塑劑的有機溶劑、和用水性溶液對得到的Aβ溶液進行稀釋，所述工序2)包含對通過所述工序I)得到的含有Αβ和增塑劑的液體進行攪拌。
[0048]溶解于含有增塑劑的有機溶劑的A β從提高合成ASH)的形成效率的觀點出發(fā)，優(yōu)選為冷凍干燥的。所述有機溶劑從提高合成Asro的形成效率的觀點出發(fā)，優(yōu)選為可溶解A β和增塑劑且為水混和性的有機溶劑，更優(yōu)選為選自N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)、N，N- 二甲基乙酰胺(DMAc)、四氫呋喃(THF)、二甲基亞砜(DMS0)、丙酮和它們的混合物的有機溶劑、進一步優(yōu)選為二甲基亞砜(DMS0)、進一步更優(yōu)選為無水DMS0。
[0049]含有所述增塑劑的有機溶劑中的增塑劑的濃度可由利用后述的水性溶液的稀釋倍率和前述的含有Αβ和增塑劑的液體中的增塑劑濃度來適當(dāng)決定。
[0050]用于稀釋的水性溶液可以使用以往公知的緩沖劑溶液或細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基。作為所述水性溶液，從提高合成ASro的形成效率的觀點出發(fā)，優(yōu)選具有生理性離子強度和pH的水性溶液。
[0051]作為用作所述水性溶液的緩沖劑溶液，從提高合成ASro的形成效率的觀點出發(fā)，優(yōu)選磷酸緩沖生理鹽水(PBS)、具有三(羥甲基)甲基骨架((H0CH2)3C-骨架)的緩沖劑的溶液、2-(羥甲基)-1，3-丙二醇(HMPD)溶液和1，3_丙二醇溶液。其中，作為所述具有三(羥甲基)甲基骨架的緩沖劑，可列舉出N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)、N-[三(羥甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)、N-三(羥甲基)甲基_3_氨基丙磺酸(TAPS)和1，I, 1-三(輕甲基)乙烷(THME)。作為所述水性溶液，從同樣的觀點出發(fā)，更優(yōu)選PBS、進一步優(yōu)選不含鈣和鎂的Dulbecco磷酸緩沖生理鹽水(D-PBS (-))。
[0052]作為用作所述水性溶液的細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基，從提高合成ASro的形成效率的觀點出發(fā)，優(yōu)選為BME培養(yǎng)基、BGJb培養(yǎng)基、CMRL1066培養(yǎng)基、GlasgowMEM培養(yǎng)基、ImprovedMEM Zinc Option 培養(yǎng)基、MDM 培養(yǎng)基、Mediuml99 培養(yǎng)基、EagleMEM 培養(yǎng)基、a MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、Ham’ s F12培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、Fischer’ s培養(yǎng)基和它們的混合培養(yǎng)基等，這些培養(yǎng)基中，更優(yōu)選除去了 PH指示劑的培養(yǎng)基。作為所述水性溶液，從同樣的觀點出發(fā)，更優(yōu)選Ham’s F12培養(yǎng)基，進一步優(yōu)選不含L谷氨酰胺和酚紅的Ham’sF12培養(yǎng)基。
[0053]用所述水性溶液對所述A β溶液進行稀釋的稀釋倍率從提高合成ASH)的形成效率的觀點出發(fā)，優(yōu)選為5~5000倍、更優(yōu)選為10~1000倍、進一步優(yōu)選為50~500倍、進一步更優(yōu)選為75~200倍、進一步更優(yōu)選為90~120倍。
[0054][前處理]
[0055]供于所述“含有A β和增塑劑的液體的制備”的A β從提高合成ASH)的形成效率的觀點和誘導(dǎo)Αβ發(fā)生α螺旋的觀點出發(fā)，優(yōu)選實施包含溶解于揮發(fā)性溶劑并進行冷凍干燥的前處理。另外，所述前處理從同樣的觀點出發(fā)，進行I個循環(huán)的將粉末狀或冷凍干燥的Αβ溶解于揮發(fā)性溶劑并進行冷凍干燥、優(yōu)選進行2~3個循環(huán)。在所述第I個循環(huán)中，為了使Αβ完全溶解，優(yōu)選在用揮發(fā)性溶劑溶解后進行孵育。所述孵育例如在2~8°C (優(yōu)選為約4°C)下孵育過夜(例如6~12小時)，優(yōu)選在25~40°C (優(yōu)選為約37°C)下孵育30分鐘~4小時(優(yōu)選為約2小時)，但并不限定于該條件。另外，所述孵育在一個或多個實施方式中，優(yōu)選進行在2~8°C下進行的第I孵育和在25~40°C下進行的第2孵育這2個階段的孵育。第I孵育的溫度為2~8°C、優(yōu)選為約4°C，時間例如為過夜、優(yōu)選為6~12小時。第2孵育的溫度為25~40°C、優(yōu)選為約37°C，時間例如為30分鐘~4小時、優(yōu)選為約2小時。
``[0056]所述前處理中使用的揮發(fā)性溶劑從提高合成ASro的形成效率的觀點和誘導(dǎo)A β發(fā)生α螺旋的觀點出發(fā)，優(yōu)選二氯甲烷、丙酮、1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(冊1?)、四氫呋喃(THF)和它們的組合等，更優(yōu)選HFIP。
[0057][試劑盒]
[0058]本發(fā)明在另一方式中涉及含有冷凍干燥的A β、所述有機溶劑和所述增塑劑的、用于通過本發(fā)明的制造方法制造合成ASro的試劑盒。所述冷凍干燥的Αβ優(yōu)選為進行了所述前處理的Αβ。通過本發(fā)明的試劑盒，能夠容易地進行所述“含有Αβ和增塑劑的液體的制備”，能夠更簡便地進行本發(fā)明的制造方法。
實施例
[0059][實施例1]
[0060]在下述條件下制備的冷凍干燥狀態(tài)的Αβ 42原料(Ca.50nmol/管)中添加10 μ L如下制備的含有65mM鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)的DMSO溶液并使其溶解，得到5mM Αβ溶液。向該5mM Αβ溶液中添加990 μ L不含L-谷氨酰胺和酚紅的F12緩沖劑(KOHJIN BIO公司制)，得到50 μ M Αβ溶液。通過將該50 μ MAβ溶液使用旋轉(zhuǎn)器在4°C下旋轉(zhuǎn)攪拌14小時，形成合成ASH)。從含有所形成的合成ASH)的所述溶液中在下述條件下對合成ASro進行純化。純化的合成ASro通過下述條件算出的合成ASro形成效率為57%(以單體換算)。另外，形成了合成ASro的確認(rèn)通過電子顯微鏡觀察、和使用了抗ASro抗體的點印跡法、氨基酸分析來進行，最終神經(jīng)毒性采用下述條件的細(xì)胞毒性試驗進行。
[0061]〔Αβ 42原料的制備方法〕
[0062]使用肽合成機(Applied Biosystems公司制、model433A)通過Fmoc法合成由序列表的序列號I的氨基酸序列構(gòu)成的A β 42肽并進行純化。向冷凍干燥后的約50mg的A β 42肽中添加IOOmL的HFIP (I, I, 1，3，3，3-六氟-2-丙醇，HPLC用，關(guān)東化學(xué)公司制)并溶解，在4°C下孵育過夜，在37°C下孵育3小時，其后，每次500 μ L地分次注入到管中，在一80°C下儲存。將儲存的A β 42溶液冷凍干燥后，再次添加500 μ L HFIP將A β 42溶解(Α β濃度為Ca.100 μ Μ)。將該溶液再次冷凍干燥、在一 20°C下儲存，制成Αβ42原料。
[0063]〔65禮 DEHP/DMS0 溶液的制備〕
[0064]向75.7μ L的無水DMSO (無水二甲基亞砜，SIGMA公司制)中添加2μ L的DEHP(鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯，東京化成工業(yè)公司制)，制成65mM DEHP/DMS0溶液。
[0065]〔合成ASro的純化條件〕
[0066]將旋轉(zhuǎn)攪拌后的500 μ L合成ASH)溶液用孔徑為0.22 μ m的過濾器過濾，將濾液用截止IOOkDa或50kDa的超濾器過濾，回收滯留物，作為“ 158_669kDa合成ASTO片段”。
[0067](ASPD形成效率的測定條件(算出方法)〕
`[0068]為了研究ASH)形成效率，通過使用了兔多克隆抗ASH)抗體rpASDl的點印跡法、以濃度已知的標(biāo)準(zhǔn)Asro為基礎(chǔ)算出如上所述進行了純化的Asro量。為了進一步對其進行確認(rèn)，通過氨基酸分析求出淀粉樣蛋白β含量。
[0069]〔細(xì)胞毒性試驗〕
[0070]ASPD的形成通過以下的細(xì)胞毒性試驗進行確認(rèn)。使用來自成熟的大鼠海馬的原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞(培養(yǎng)19天以后)，給予規(guī)定量的ASro —晚，使用Roche公司制的Cell DeathDetection ELISA、按照實驗方案(protocol)對神經(jīng)毒性進行測定。其為對細(xì)胞凋亡所產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)的組蛋白結(jié)合DNA片段進行定量檢測的ELISA試劑盒。
[0071][比較例I]
[0072]使用無水DMSO替換含有65mM DEHP的DMSO溶液，除此以外，與實施例1同樣地從Αβ42肽制造合成ASH)。其結(jié)果，合成ASro形成效率為1.2% (以單體換算)。
[0073]將實施例1和比較例I的點印跡法和氨基酸分析的結(jié)果的一個例子示于圖1。如圖1所示，實施例1 (DEHP+)顯示與比較例I (DEHP-)相比ASTO形成效率顯著提高。
[0074]另外，將使用了通過實施例1和比較例I制造的合成ASro的細(xì)胞毒性試驗的結(jié)果的一個例子示于圖2。圖2為以圖2所示的Αβ 42換算濃度(1、2、4μ Μ)使用含有純化前的合成ASH)的實施例1 (DEHP+)的溶液和比較例I (DEHP-)的溶液進行細(xì)胞毒性試驗而得到的結(jié)果。如圖2所示，實施例1的溶液濃度依賴性地顯示與比較例I的溶液相比更顯著的細(xì)胞毒性。另外，不含有合成ASH)的同濃度的含有DEHP的溶液未見細(xì)胞毒性(未顯示數(shù)據(jù))。
[0075]圖3為電子顯微鏡觀察含有純化前的合成ASH)的實施例1 (DEHP存在下)的溶液和比較例1(無DEHP存在下)的溶液的照片的一個例子。如圖3所示，與比較例I相比，實施例1中確認(rèn)到大量直徑為約10~15nm的球狀體的合成ASH)。
[0076][實施例3~6]
[0077]除了使65mM DEHP/DMS0溶液的DEHP的濃度為13、26、51和102mM外，與實施例1同樣地從A β 42肽制造合成ASH)(實施例3~6)，并與實施例1同樣地進行ASTO形成效率的測定和細(xì)胞毒性試驗。其結(jié)果，合成ASH)形成效率分別為67%、61%、38%和28% (以單體換算)。將比較例1和實施例3~6 (DEHP濃度分別為0、13、26、51和102mM)的ASPD形成效率的測定結(jié)果和細(xì)胞毒性試驗的結(jié)果的一個例子示于圖4。如圖4所示，依賴于Asro形成中所使用的DEHP濃度地ASH)形成效率和細(xì)胞毒性增加。
[0078]產(chǎn)業(yè)上的可利用性
[0079]本發(fā)明在例如阿耳茨海默病和/或路易體癡呆相關(guān)的醫(yī)療和醫(yī)藥、研究的領(lǐng)域中是有用的。
【權(quán)利要求】
1.一種合成淀粉樣蛋白球體的制造方法，其包含在增塑劑的存在下對含有淀粉樣蛋白β肽的液體進行攪拌的工序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成淀粉樣蛋白球體的制造方法，其包含: 將淀粉樣蛋白β肽溶解于含有所述增塑劑的有機溶劑的工序， 用水性溶液對所述淀粉樣蛋白β肽的溶液進行稀釋的工序，和 對所述稀釋后的溶液進行攪拌的工序。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成淀粉樣蛋白球體的制造方法，其中，所述有機溶劑為水混和性溶劑。
4.權(quán)利要求1~3中任一項所述的合成淀粉樣蛋白球體的制造方法，其中，所述增塑劑為鄰苯二甲酸酯。
5.用于權(quán)利要 求2~4中任一項所述的制造方法的試劑盒，其包含經(jīng)冷凍干燥的淀粉樣蛋白β肽、所述有機溶劑和所述增塑劑。
【文檔編號】C07K14/435GK103827140SQ201280046592
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2012年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月22日
【發(fā)明者】星美奈子 申請人:道健康生活醫(yī)藥株式會社