穩(wěn)定的蛋白質(zhì)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種融合蛋白，其從N端至C端包含：a）家族B的G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）的第一部分，其包含GPCR的跨膜螺旋(TM)-1、TM2和TM3；b）穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域；和c）GPCR的第二部分，其包含GPCR的TM4、TM5、TM6和TM7。本發(fā)明也提供使GPCR結(jié)晶的方法，包括提供本發(fā)明的融合蛋白并使之結(jié)晶以獲得晶體。
【專利說明】穩(wěn)定的蛋白質(zhì)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及不易結(jié)晶的蛋白，并特別涉及不易穩(wěn)定并因此不易結(jié)晶的GPCR。本發(fā)明也涉及使這種蛋白結(jié)晶的方法，以及這種蛋白的各種用途。所述蛋白可用于藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)研究。
【背景技術(shù)】
[0002]GPCR組成了控制許多生理過程并且是許多有效藥物靶標的一個極大的蛋白家族。特別參照 Overington 等人(2006)Nature Rev.Drug Discovery5, 993-996,其指出現(xiàn)有藥物中超過四分之一具有作為靶標的GPCR。其在藥理學(xué)上相當重要。在Foord等人(2005)Pharmacol Rev.57，279-288中給出GPCR的列表，通過引用并入本文。
[0003]GPCR在分離時通常是不穩(wěn)定的，并且即使付出相當大努力，才僅可能使包括牛視紫質(zhì)(bovine rhodopsin)在內(nèi)的幾種GPCR結(jié)晶，牛視紫質(zhì)是天然格外穩(wěn)定的并且是β-2腎上腺素受體，其作為融合蛋白結(jié)晶或者與抗體片段形成復(fù)合物結(jié)晶。
[0004]人們認為GPCR以多種不同構(gòu)象存在，所述構(gòu)象與配體的不同藥理學(xué)種類，如激動劑和拮抗劑相關(guān)，并且為行使功能在這些構(gòu)象之間循環(huán)(Kenakin Τ.(1997)Ann N Y AcadSci812, 116-125)。在構(gòu)象之間的轉(zhuǎn)換也導(dǎo)致在獲得受體的晶體結(jié)構(gòu)上的困難。
[0005]雖然GPCR都具有特征性的7個跨膜(TM)結(jié)構(gòu)域，基于序列同源性和分子結(jié)構(gòu)，仍可將其分為三個家族(A、B和C)。最大的組家族A，由與視紫質(zhì)同源的受體組成。家族B也稱為腸促胰液素受體家族，其是受大肽激素如高血糖素激素家族調(diào)節(jié)的受體；該家族成員的特征在于含有幾個半胱氨酸的相對大的細胞外N端，所述幾個半胱氨酸形成二硫橋網(wǎng)絡(luò)并且是配體結(jié)合袋的一部分。家族C由與代謝型谷氨酸受體同源的受體組成；這些受體的特征是極長的細胞外N端和長的羧基尾巴，且所述N端形成配體結(jié)合袋，已證明其形成二硫化物連接的二聚體，在形狀上類似捕蠅草。
[0006]在過去的幾年中，已解析一些家族A GPCR的結(jié)構(gòu)，并通過開發(fā)一些關(guān)鍵技術(shù)已實現(xiàn)這些里程碑。一種這樣的技術(shù)是將T4溶菌酶(T4L)插入在細胞內(nèi)的細胞質(zhì)環(huán)(ICL)3中，并認為這樣將生成允許形成晶體接觸的大親水區(qū)域[2] [3]。這種技術(shù)與脂立方相結(jié)晶學(xué)相結(jié)合的應(yīng)用已允許Beta2、A2a、CXCR4和D3受體的高分辨率結(jié)構(gòu)確定[2]。因此，已從這些關(guān)于家族A受體的TM束的定位和組織的結(jié)構(gòu)中搜集到重要的信息。然而，幾乎沒有信息可用于家族B和C受體的成員，而且考慮到高度的序列分歧，在這些家族間的TM結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和組織上可能存在顯著的不同[I]。
[0007]在家族A受體中，因為認為螺旋5和6之間的距離與T4L的N和C端之間的距離接近，所以將T4L插入到ICL3中。因此，可能在這個位置容納融合蛋白，而不認為其它螺旋之間的距離有助于插入融合配偶體。事實上，已將T4L與一些不同的家族A受體在ICL3上相融合，在每種情況下功能蛋白都得 以表達并具有受體柔性減少的額外優(yōu)點，并因此增加整體穩(wěn)定性。
[0008]我們檢測了將T4L插入在家族B受體的內(nèi)環(huán)、特別在ICL3中的效果。我們的數(shù)據(jù)表明家族B受體不能在ICL3中容納T4L融合，然而令人驚訝和意想不到的是，考慮到家族A受體的結(jié)構(gòu)，將T4L加入ICL2中改善了家族B受體的生物化學(xué)性質(zhì)。ICL2將GPCR包含跨膜螺旋(TM) -1、TM2和TM3的部分連接到GPCR包含TM4、TM5、TM6和TM7的部分。目前的數(shù)據(jù)表明，與家族A受體不同，在家族B受體中，螺旋3和4之間的距離與T4L的N和C端之間的距離更接近，而不是螺旋5與6之間的距離與T4L的N和C端之間的距離更接近。因此，認為在GPCR的這兩個部分之間插入穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域代表了之前未能預(yù)測到的促進GPCR結(jié)晶的新技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]因此，本發(fā)明的第一方面提供融合蛋白，其從N端到C端包含:
[0010]a)家族B的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的第一部分，其包含GPCR的TM1、TM2和TM3 ；
[0011]b)穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域；以及
[0012]c) GPCR 的第二部分，其包含 GPCR 的 TM4、TM5、TM6 和 TM7。
[0013]我們以“GPCR”表示具有GPCR信號活性且保留完整7個TM區(qū)的G蛋白偶聯(lián)受體或多肽。本領(lǐng)域標準命名法將GPCR的跨膜螺旋從N端至C端命名為TMl、TM2、TM3、TM4、TM5、TM6和TM7。跨膜螺旋通過在TM2和TM3之間、在TM4和TM5之間、在TM6和TM7之間的細胞外氨基酸延伸連接，分別稱為細胞外環(huán)(ECL) 1、2和3?？缒ぢ菪ㄟ^在TMl和TM2之間、在TM3和TM4之間以及在TM5和TM6之間的細胞內(nèi)氨基酸延伸連接，分別稱為細胞內(nèi)環(huán)(ICL)1、2和3。因此，如上定義的第一和第二GPCR部分通過ICL2區(qū)天然地連接，即ICL2將連接至ICL2N端的第一部分(包含TMl、TM2和TM3)與連接到ICL2C端的第二部分(包含TM4、TM5、TM6 和 TM7)連接。
[0014]GPCR優(yōu)選地源自包含天然多態(tài)性的全長野生型序列，或源自被改變的突變體GPCR分子，例如為改善所述GPCR的一個或多個性質(zhì)如穩(wěn)定性而已將GPCR分子改變。
[0015]GPCR可源自野生型和突變體GPCR，其中所述突變體GPCR可以是偏向特定構(gòu)象，例如激動劑或拮抗劑的穩(wěn)定的GPCR。例如，隨后可將穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域插入在構(gòu)象上穩(wěn)定的GPCR的TM3和TM4之間。
[0016]我們之前已經(jīng)開發(fā)了在生物學(xué)相關(guān)構(gòu)象中穩(wěn)定GPCR的方法(參見W02008/114020 )，其描述了稱為StaRs?的穩(wěn)定GPCR生產(chǎn)，當從細胞膜中純化時，所述方法能夠純化保持其構(gòu)象、穩(wěn)定性和功能的重組G蛋白偶聯(lián)受體。此外，這種平臺技術(shù)也提供將偏向激動劑構(gòu)象或拮抗劑構(gòu)象的受體進行工程化的方法(也參見Magnani等，2008; Serrano-Vega等,2008; Shibata等,2009),即其在特定構(gòu)象中具有增加的穩(wěn)定性。這種穩(wěn)定的受體可用于本發(fā)明并具有一些優(yōu)勢，例如穩(wěn)定性、提高純化蛋白產(chǎn)量、減少變性和減少非特異性結(jié)合。在本發(fā)明中使用穩(wěn)定的突變體GPCR時，優(yōu)選地選擇和制備使用任何在PCT 申請 W02008/114020、W02009/114020 和 W02009/081136 中所述的方法。優(yōu)選地，第一和第二 GPCR部分來自于在特定構(gòu)象中、相對于親代GPCR具有增加穩(wěn)定性的GPCR (即增加的構(gòu)象穩(wěn)定性)。通過增加構(gòu)象的穩(wěn)定性，我們包括如下含義:當暴露在變性劑或變性條件中，與相同構(gòu)象的親代GPCR相比特定構(gòu)象的突變體GPCR具有增加的穩(wěn)定性(例如延長的壽命)。變性劑/變性條件的實例包括熱、去污劑、離液劑和極端pH。如本領(lǐng)域所公知，這樣的變性劑或變性條件可影響蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)而不是一級序列。[0017]在本發(fā)明實施中適合使用的GPCR包括任何家族B的GPCR，例如類胰高血糖素肽I受體(GLPlR)、類胰高血糖素肽2受體(GLP2R)、降鈣素受體(CT)、糊精/CGRP受體(AMY1 α )、糊精受體(AMY2 α )、糊精/CGRP受體(AMY3 α )、CGRP/腎上腺髓質(zhì)素受體(CGRP1 α )、腎上腺髓質(zhì)素/CGRP受體(AM1 α )、腎上腺髓質(zhì)素/CGRP受體(AM2 α受體)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子受體(CRF1)'尿皮質(zhì)素(UiOcortin)受體(CRF2)、生長激素釋放激素受體(GHRH)、抑胃多肽受體(GIP)、胰高血糖素受體、分泌素受體、TIP-39受體(PTH2)、甲狀旁腺激素受體(PTHl)、VIP/PACAP 受體(VPAC1)、PACAP 受體(PAC2)以及 VIP/PACAP受體(VPAC2)中的任意者。在具體優(yōu)選的實施方案中，所述GPCR是GLP1R。其它適合的GPCR是本領(lǐng)域公知的并且包括那些已列表在Overington等人(見上)中。另外，國際藥理學(xué)聯(lián)盟提出一個包括家族B的GPCR在內(nèi)的GPCR列表(Foord等人，(2005)Pharmacol.Rev.57, 279-288,并且這個列表定期地更新在網(wǎng)址 http://www.1uphar-db.0rg/GPCR/ReceptorFamiliesForward 上；家族 B 的 GPCR 作為 2 類 GPCR 列表在表 2 中)。
[0018]很容易獲得許多GPCR的氨基酸序列(和編碼所述氨基酸序列的cDNA的核苷酸序列)，例如通過參考GenBank。特別地,Foord等人(見上)從Entrez Gene (http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/entrez)給出人基因符號和人、小鼠和大鼠基因ID。應(yīng)該注意的還有，因為人基因組序列基本上完整，可以從其推斷出人GPCR的氨基酸序列。
[0019]雖然GPCR可以源自任何來源，特別優(yōu)選其來自真核生物來源。特別優(yōu)選地，其源自脊椎動物來源，如哺乳動物。特別優(yōu)選地，GPCR源自大鼠、小鼠、兔子或狗或非人靈長類動物或人。為了避免疑義，在“源自”意思中我們包括cDNA或基因是使用來自所述來源的遺傳材料最初獲得的，但是隨后所述蛋白可在任何宿主細胞中表達。因此，這將是平常的:真核生物GPCR (例如禽或哺乳動物GPCR)可在原核宿主細胞，如大腸桿菌中表達，但視情況而定也可認為其源自禽或哺乳動物。
[0020]在某些情況下，GPCR可由多于一個不同的亞基組成。例如，降鈣素基因相關(guān)的肽受體需要結(jié)合單一跨膜螺旋蛋白(RAMPl)而獲得其生理學(xué)配體結(jié)合特征。與GPCR組合形成或調(diào)節(jié)功能復(fù)合物的效應(yīng)器、附加物、輔助器或GPCR-相互作用蛋白在本領(lǐng)域中是公知的并且包括，例如受體激酶、G-蛋白和抑制蛋白(arrestin) (Bockaert等人,(2004)Curr Opinion Drug Discov and Dev7, 649-657)。在某些情況下，可將所述 GPCR 與 GPCR配體結(jié)合。通過“配體”，我們包括與GPCR結(jié)合的任何分子。許多配體是已知的，例如從W02008/114020 和 Neubig 等人(2003)Pharmacol.Rev.55，597-606，兩者都通過參考并入本文。因此，融合蛋白可包括含有TM1、TM2和TM3的GPCR部分，其與含有TM4、TM5、TM6和TM7的GPCR部分相連接，其中所述GPCR與GPCR結(jié)合配偶體結(jié)合。用這樣的方法，通過能夠使GPCR與其它分子的復(fù)合物結(jié)晶可能獲得在GPCR相互作用上的結(jié)構(gòu)啟示。優(yōu)選地，所述分子不是與GPCR的ICL2相結(jié)合的那些。
[0021]對任何給定的GPCR，技術(shù)人員使用本領(lǐng)域的標準技術(shù)可確定TM螺旋。例如，可用計算機程序，其基于疏水性為GPCR的跨膜區(qū)建模(Kyle&Dolittle (1982) J.Mol.Biol.157，105-132)。同樣，在萬維網(wǎng)上(World Wide Web)廣泛使用跨膜預(yù)測算法服務(wù)器(如Expasy)，其中的許多依賴于嗜水性分析。TMHMM是膜蛋白拓撲預(yù)測方法，可以根據(jù)隱馬爾可夫模型(hidden Markov model) (TMHMM Server v.2.0;http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)使用該方法。對于給定的GPCR，當其跨膜區(qū)例如通過結(jié)構(gòu)分析或嗜水性分析已知時，通過多重或成對地序列比對也可確定在其它GPCR中的類似區(qū)。例如，可使用Clustal W程序(Thompson等人，1994)進行比對。使用的參數(shù)可如下:快速配對比對參數(shù):K-元組(字碼)尺寸；1，窗口尺寸；5，空隙罰分；3，頂端對角線數(shù)；5 ;評分方法:x百分比。多重比對參數(shù):空隙開放罰分；10，空隙延伸罰分；0.05 ;評分矩陣:BL0SUM。
[0022]圖6列出家族B的GPCR的氨基酸序列，并突出TM3、ICL2和TM4的位置。例如，對于人 GLP1R，TM3 以 Phe257 結(jié)尾，ICL2 對應(yīng)于 Ser258 至 Ser261，TM4 以 Glu262 開始。因此合宜地，當GPCR是家族B受體時，當如使用CLUSTAL W比對序列時，通過定位氨基酸殘基可確定TM3、ICL2和TM4的位置，所述氨基酸殘基對應(yīng)于在圖6中定義的TM3、ICL2和TM4邊界的氨基酸。
[0023]然而應(yīng)當理解，所述邊界不是絕對的而且其可能非常依賴為GLPlR提供的曾用于定義其的模型。例如，在圖1中人GLPlR的TM3以Leu254結(jié)尾，ICL2對應(yīng)于Leu255至Trp264，以及TM4以Ile265開始。同樣，可將環(huán)區(qū)定義為連接α螺旋的氨基酸結(jié)構(gòu)或經(jīng)預(yù)測在膜外的氨基酸結(jié)構(gòu)，所述邊界將根據(jù)所用的定義而改變。
[0024]在一個實施方案中，將穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域插入到ICL2中。因此，本發(fā)明提供GPCR，在其中已將穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域插入到ICL2中。通過“插入到ICL2中”，我們包括氨基酸序列的添加和取代兩者，所述氨基酸序列的添加定義為穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域進入ICL2的氨基酸序列中而沒有刪除ICL2的任何氨基酸，所述取代為用編碼穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列取代ICL2的一個或多個或全部氨基酸。應(yīng)當理解，在此實施方案中除必要的跨膜螺旋以外，GPCR的第一和/或第二部分可包括至少一部分的ICL2。GPCR的第一部分可包括TMl、ΤΜ2和ΤΜ3以及ICL 2的N端部分。GPCR的第二部分可包括ΤΜ4、ΤΜ5、ΤΜ6和ΤΜ7以及ICL2的C端部分。
[0025]應(yīng)當理解，穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域可插入到ICL2中，并且在其N和/或C端側(cè)是一個或兩個間隔部分。以這種方式，所述穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域與ICL2不是直接相連而是間接相連。所述間隔部分可用于幫助減少在螺旋上的張力。
[0026]優(yōu)選地，通過使用穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列取代在ICL2氨基酸序列上的一個或多個連續(xù)氨基酸(例如，2、3、4或5個或更多氨基酸)從而將穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域插入在ICL2中。在一個實施方案中，被取代的一個或多個氨基酸是來自ΤΜ3的C端和/或ΤΜ4的N端的至少一個或兩個氨基酸。換句話說，所述融合蛋白在穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域的至少一側(cè)可具有ICL2的至少一個或兩個氨基酸。
[0027]如實施例1所述，我們已將Τ4溶菌酶插入至GLPlR的ICL2中的各種位置上，在Phe257和Ser261之間的插入導(dǎo)致產(chǎn)生的融合GLPlR受體。因此，特別優(yōu)選在根據(jù)圖6所示人GLPlR編號的與氨基酸Phe257和Ser261相對應(yīng)的氨基酸殘基之間的位置上，將穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域插入至GPCR的ICL2區(qū)。
[0028]因此，根據(jù)圖6所示的人GLPlR的編號，在與氨基酸Phe257相對應(yīng)的氨基酸之后并在與氨基酸Ser261或Phe260或Val259相對應(yīng)的氨基酸之前，可將穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域的氨基酸插入到GPCR的ICL2區(qū)。例如，根據(jù)圖6所示的人GLPlR的編號，穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列可取代與Ser258相對應(yīng)的氨基酸，或者其可取代與Ser258和Val259相對應(yīng)的氨基酸，或者其可取代與Ser258、Val259和Phe260相對應(yīng)的氨基酸。在這樣的位置上插入穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于圖1所示的GLP1R-T4溶菌酶融合構(gòu)建體lc、2c和3c。[0029]同樣地，根據(jù)圖6所示的人GLPlR的編號，在與氨基酸Ser258相對應(yīng)的氨基酸之后并在與氨基酸Ser261或Phe260或Val259相對應(yīng)的氨基酸之前，可將穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域的氨基酸插入到GPCR的ICL2區(qū)。例如，根據(jù)圖6所示的人GLPlR的編號，穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列可取代與Val259相對應(yīng)的氨基酸，或者其可取代與Val259和Phe260相對應(yīng)的氨基酸。在這樣的位置上插入穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于圖1所示的GLP1R-T4溶菌酶融合構(gòu)建體IcU2d和3d。
[0030]通過“相對應(yīng)的氨基酸殘基”，我們包括以下含義:當使用MacVector和CLUSTALW比較人GLPlR受體和其它GPCR時，與在人GLPlR上的給定的氨基酸殘基比對的另一個GPCR
上的氨基酸殘基。
[0031]雖然優(yōu)選地，根據(jù)圖6所示的人GLPlR的編號，在與氨基酸Phe257和Ser261相對應(yīng)的氨基酸殘基之間的位置上，將穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域插入到GPCR的ICL2區(qū)，應(yīng)當理解可將穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域插入到此區(qū)之外。
[0032]應(yīng)當理解，穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域的功能是為晶體接觸增加親水性表面以及減少GPCR的固有柔性以使得如改善GPCR的結(jié)晶性質(zhì)。因此，通過“穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域”，我們包括提供用于晶格接觸的親水表面的任何可溶的、折疊的多肽。此外，所述蛋白結(jié)構(gòu)域是穩(wěn)定的，從而在其折疊形式其對變性有抗性(例如，對熱、洗滌劑、離液劑等穩(wěn)定)。對蛋白穩(wěn)定性的檢測是本領(lǐng)域公知的并包括在W02008/114020中所述的那些。
[0033]通常，穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域是在細胞中從融合蛋白的GPCR部分自主折疊的那個。
[0034]合宜地，穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域是容易結(jié)晶的那個。因此，穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域可以是已解析出晶體結(jié)構(gòu)的蛋白，例如坐標(coordinate)已保存在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(http://www.pdb.0rg/)的蛋白。
[0035]穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域的特別優(yōu)選的特征是:
[0036]1、所述結(jié)構(gòu)域是可溶的、良好折疊的并在一個或多個表達系統(tǒng)可容易地表達；
[0037]2、所述結(jié)構(gòu)域的N和C端在空間上緊靠，通常在5-17 A的范圍內(nèi)，例如6-16A、7-15 A、7-10 A、10-13 A成 12-15 A;
[0038]3、所述結(jié)構(gòu)域耐熱和耐化學(xué)變性以及耐蛋白水解降解；
[0039]4、所述結(jié)構(gòu)域在各種空間群和晶體堆積排列中是高度可結(jié)晶的。
[0040]優(yōu)選地，所述結(jié)構(gòu)域不含半胱氨酸殘基，所以防止了在所述結(jié)構(gòu)域內(nèi)或在融合蛋白的GPCR部分中的二硫鍵形成。應(yīng)當理解既然所述結(jié)構(gòu)域可溶，那么其不應(yīng)是疏水的或者不應(yīng)傾向以無序方式聚集。
[0041]在一個實施方案中，穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域的長度在50和1000個氨基酸之間，優(yōu)選地在50和300個氨基酸或100和300個氨基酸之間、或在150和250個氨基酸之間。 [0042]一旦已發(fā)現(xiàn)適合所述穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域的多肽，也許有必要通過從或至所述多肽的N端、C端或兩端中刪除或添加氨基酸殘基對所述多肽進行修飾，以使得在所述多肽末端骨架上最接近的α碳原子被5-17Α范圍的距離所間隔，例如6-16Α、7-15 Αλ 7-10 A、10-13 A或 12-15 Ao
[0043]優(yōu)選地，穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域的插入不影響GPCR的生物學(xué)活性，例如結(jié)合活性或信號傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)活性。理想地，相對于在沒有穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域時的相同活性水平，所述融合蛋白應(yīng)保留其生物學(xué)活性的至少60%、或70%、或80%、或90%，最理想地保留其生物學(xué)活性的100%。用于評估GPCR結(jié)合和GPCR信號傳導(dǎo)的方法是本領(lǐng)域公知的并描述在如W02008/114020和W02009/101383中，兩者都通過引用并入本文。因此，當生物學(xué)活性是結(jié)合活性時，使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)結(jié)合分析可評估與任何GPCR結(jié)合配偶體的結(jié)合；當生物學(xué)活性是信號傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)活性時，通過任何適用于具體信號傳導(dǎo)通路的分析(如報告基因分析)可評估所述活性。
[0044]應(yīng)當理解，對于結(jié)晶用途而言保留的配體結(jié)合活性比保留的信號傳導(dǎo)活性更重要，因此可取地在結(jié)晶之前僅評估配體結(jié)合能力。因此，在一個具體優(yōu)選的實施方案中，穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域不影響GPCR的結(jié)合活性。
[0045]為避免疑義，穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域不是特定GPCR的ICL2或其部分。
[0046]在優(yōu)選的實施方案中，穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域是溶菌酶。已知溶菌酶容易結(jié)晶，各種野生型和變體溶菌酶的結(jié)構(gòu)已保藏在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(WWW.rcsb.0rg)。合適的實例包括135L、193L、194L、1AK1、1GBS、1IEE、1LZ1、1P7S、1REX、1VDQ、2ANV、2ANX、2D4K、2FBB、2IHL、2NWD、2XBR、2XBS、2Z2F、2ZYP、3A8Z、3K2R、3N9A、3N9C、3N9E 和 30D9。
[0047]盡管源自任何來源的溶菌酶都可用，特別優(yōu)選所述溶菌酶源自T4噬菌體。在圖7中提供T4噬菌體溶菌酶的兩個氨基酸序列，所述序列的任一個可用在本發(fā)明的背景中。溶菌酶可源自包括天然多態(tài)性的全長野生型序列，或者其也可以是，例如改善一個或多個性質(zhì)的已被改變的突變體溶菌酶。因此，可以理解可使用圖7所提供的氨基酸序列的變體，例如與圖7所示序列的任一個具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%的序列同一性的氨基酸序列，更優(yōu)選地與圖7所示序列任一個具有至少95%或99%的序列同一性的氨基酸序列。
[0048]可以通過使用如BLAST或PS1-BLAST的算法(Altschul等人，NAR(1997) ,25,3389-3402)或基于隱藏的馬爾可夫模型的方法(Eddy S等人，J ComputBiol (1995) Spring2 (I) 9-23.)測定序列同一'丨生。通?？梢允褂萌魏魏线m的計算機程序，例如威斯康星大學(xué)遺傳計算機組的GAP程序確定在兩個多肽之間的百分比序列同一性，并且應(yīng)理解的是計算涉及其序列已經(jīng)被優(yōu)化比對的多肽的百分比同一性?？蛇x擇地使用如上述的Clustal W程序(Thompson等人,1994)進行比對。
[0049]雖然溶菌酶是穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域的優(yōu)選實例，仍可使用一般原理利用具有上述特性的許多多肽。因此，合適的候選者包括那些含有易結(jié)晶蛋白的氨基酸序列，例如，通過查詢本領(lǐng)域已知的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫或其它結(jié)晶數(shù)據(jù)庫而發(fā)現(xiàn)的。其它實例包括在Engel等人(2002) (BBA1564:38-46)(通過引用并入本文)所述的那些，例如細胞色素b562、黃素氧化還原蛋白、β -內(nèi)酰胺酶和70kDa熱休克三磷酸腺苷酶結(jié)構(gòu)域。
[0050]可修飾融合蛋白以使其可更容易被檢測出，例如通過將其生物素化或通過并入本領(lǐng)域已知的任何可檢測標記，如放射性標記、突光標記或者酶標記。在特別優(yōu)選的實施方案中，所述標記是熒光標記如EGFP。同樣地，可修飾融合蛋白以促進純化，例如通過并入任何本領(lǐng)域已知的任何親和性部分，如GST標簽、6x His標簽、MBP或其它表位標簽。這樣的修飾可在GPCR的N端或C端或者在外環(huán)中。
[0051] 如實施例1所示，應(yīng)相信與沒有插入穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域的GPCR的生物化學(xué)性質(zhì)相比，本發(fā)明的融合蛋白具有改善的生物化學(xué)性質(zhì)。這種改善的性質(zhì)使得所述融合蛋白更適合結(jié)晶。因此，預(yù)期融合蛋白具有用于晶體接觸的更大的親水性表面。同樣地，與沒有插入穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域的GPCR相比，預(yù)期融合蛋白更加可溶，例如在洗滌劑溶液中顯示更少的聚集。用于評估GPCR溶解度的方法是本領(lǐng)域公知的，包括尺寸排阻色譜法，例如在實施例1中所述的用于評估在DDM中溶解度的熒光尺寸排阻色譜法。與沒有插入穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域的GPCR相比，所述融合蛋白也可以是更加穩(wěn)定的(例如，對熱、洗滌劑或離液劑中的任意者)。用于評估GPCR穩(wěn)定性的方法是本領(lǐng)域已知的，包括在W02008/114020所述的那些。
[0052]合宜地，通過標準分子生物學(xué)和重組DNA技術(shù)產(chǎn)生所述融合蛋白。例如，使用本領(lǐng)域公知的標準克隆技術(shù)和PCR可制成編碼第一和第二 GPCR部分以及穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域的DNA片段。然后依據(jù)傳統(tǒng)的實施可將片段在讀碼框內(nèi)連接在一起，例如通過利用平末端或交錯末端連接、限制性酶消化以提供合適的末端、酌情補平粘性末端、堿性磷酸處理以避免不需要的連接，以及酶連接。
[0053]同樣地，使用不依賴連接酶的克隆策略，例如InFusion或Gateway可制成融合構(gòu)建體。也可通過從頭開始的基因合成而合成地制成所述構(gòu)建體。
[0054]可以理解，可將GPCR和穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域中的一個或者兩個突變以改善溶解度、穩(wěn)定性、表達或結(jié)晶能力(crystallisability)中的任一項。
[0055]用于對基因和cDNA進行克隆和工程化、用于突變DNA和用于在宿主細胞中從多核苷酸表達多肽的分子生物學(xué)方法是本領(lǐng)域公知的，如在“Molecular cloning, alaboratory manual，，,第三版,Sambrook, J.和 Russell, D.ff.(編)，Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY中舉例說明的，通過引用并入本文。
[0056]合適的表達 系統(tǒng)包括在細菌或酵母、病毒表達系統(tǒng)(所述病毒表達系統(tǒng)例如桿狀病毒、semliki森林病毒和慢病毒)中的組成型或誘導(dǎo)型表達系統(tǒng)，或在昆蟲或哺乳動物細胞中的瞬時轉(zhuǎn)染。合適的宿主細胞包括大腸桿菌、乳球菌(Lactococcus lactis)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉紋夜蛾(Trichoplusiani)細胞。合適的動物宿主細胞包括HEK293、COS、S2、CHO、NSO、DT40等等。已知某些GPCR需要特定脂質(zhì)(例如膽固醇)以行使功能。在那種情況下，希望選擇含有所述脂質(zhì)的宿主細胞。此外或可選擇地，在分離和純化融合蛋白期間可以加入脂質(zhì)。通過標準技術(shù)，例如親和層析法可進行純化。
[0057]本發(fā)明的第二方面提供編碼根據(jù)本發(fā)明的第一方面的融合蛋白的多核苷酸。所述多核苷酸可以是RNA (如mRNA)或DNA，雖然通常其是DNA。
[0058]應(yīng)當理解，可將所述多核苷酸整合進載體中，因此本發(fā)明也提供包含根據(jù)本發(fā)明的第二方面的多核苷酸的載體。
[0059]合適的載體是在原核(如細菌)或真核(如哺乳動物)細胞中繁殖和/或允許融合蛋白表達的那些。例如，所述載體可以是質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或細菌人工染色體(BAC)。載體的多核苷酸序列將取決于預(yù)期宿主細胞的性質(zhì)、將本發(fā)明的第二方面的多核苷酸引入宿主細胞的方式、以及是希望維持還是整合游離基因。合宜地，所述載體包含至少一個可選擇的標志物，例如抗生素抗性標志物(例如卡那霉素或新霉素)。
[0060]載體用于復(fù)制本發(fā)明的第二方面的多核苷酸，也用于使用所述多核苷酸轉(zhuǎn)染細胞，以及也可用于促進融合蛋白的表達。[0061]典型的原核載體質(zhì)粒是:可獲自Biorad Laboratories (Richmond, CA,美國)的 pUC18、pUC19、pBR322 和 pBR329 ;可獲自 Pharmacia (Piscataway, NJ,美國)的pTrc99A、pKK233_3、pKK233_3、pDR540 和 pRIT5 ;可獲自 Stratagene CloningSystems (LaJolla, CA92037,美國)的 pBS 載體、Phagescript 載體、Bluescript 載體、pNH8A、pNH16A、PNH18A 和 pNH46A。
[0062]典型的哺乳動物細胞載體質(zhì)粒是可獲自Pharmacia(Piscataway, NJ,美國)的PSVL0這個載體使用SV40晚期啟動子以驅(qū)動克隆基因的表達，最高表達水平發(fā)現(xiàn)于T抗原產(chǎn)生細胞中，例如C0S-1細胞。另一個實例是用在C0S-1或C0S-7細胞中的pcDNA3.l(neo)(Invitrogen)。誘導(dǎo)型哺乳動物表達載體的實例是也可獲自Pharmacia (Piscataway, NJ,美國)的PMSG。所述載體使用小鼠乳腺腫瘤病毒長末端重復(fù)的糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)啟動子以驅(qū)動克隆基因的表達。
[0063]有用的酵母質(zhì)粒載體是pRS403-406和pRS413_416，以及通?？色@自于Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA92037,美國)。質(zhì)粒 pRS403、pRS404、pRS405和pRS406是酵母整合質(zhì)粒(YIps)，其包含酵母可選擇的標志物HIS3、TRP1、LEU2和URA3。質(zhì)粒pRS413-416是酵母著絲粒質(zhì)粒(YCps)。
[0064]在優(yōu)選的實施方案中，所述包含的本發(fā)明第二方面的多核苷酸的載體是pcDNA3.1(http://products, invitrogen.com/ivgn/product/V79020)。
[0065]在本領(lǐng)域已知的任何合適的方法可用于構(gòu)建含有本發(fā)明的第二方面的多核苷酸的載體，包括上述的連接技術(shù)。
[0066]本發(fā)明的第三方面提供含有根據(jù)本發(fā)明的第二方面的多核苷酸的細胞，或含有所述多核苷酸的載體。這種細胞可用于復(fù)制本發(fā)明的第二方面的多核苷酸，或可用于表達本發(fā)明的第一方面的融合蛋白。
[0067]所述細胞可以是原核的或真核的。
[0068]應(yīng)當理解，構(gòu)建和擴增本發(fā)明的第二方面的多核苷酸在細菌細胞中方便地進行。所述多核苷酸的表達可在細胞中進行，如哺乳動物細胞或細菌細胞。
[0069]細菌細胞是優(yōu)選的原核宿主細胞，通常是大腸桿菌株，例如可獲自BethesdaResearch Laboratories Inc.，Bethesda, MD,美國的大腸桿菌株 DH5、以及可獲自美國，MD, Rockville的美國典型培養(yǎng)物保藏所(American Type CultureCollection, ATCC) (ATCC號31343)的RR1。優(yōu)選的真核宿主細胞包括酵母、昆蟲和哺乳動物細胞或細胞系，優(yōu)選脊椎動物細胞或細胞系，例如來自小鼠、大鼠、猴子或人的那些。特別優(yōu)選的細胞是人胚胎腎細胞，例如HEK293T細胞。
[0070]可穩(wěn)定或不穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染用于表達融合蛋白的細胞。
[0071 ] 本發(fā)明的第四方面提供使根據(jù)本發(fā)明第一方面的融合蛋白結(jié)晶的方法，所述方法包括提供根據(jù)本發(fā)明第一方面的融合蛋白以及使其結(jié)晶以獲得晶體。
[0072]在一個實施方案中，通過培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明第三方面的宿主細胞以表達融合蛋白并分離所述蛋白從而提供融合蛋白。
[0073]任何合適的結(jié)晶方法可用于使融合蛋白結(jié)晶,例如那些綜述在“Crystal Iisationof Biological Macromolecules”(Alexander McPherson; ISBN:0-87969-617-6)中的任意者，其以參考并入本文。[0074]在優(yōu)選的實施方案中，使用脂立方相結(jié)晶學(xué)進行結(jié)晶(參見US2011/0031438，以參考并入本文)。
[0075]本發(fā)明的第五方面提供包含本發(fā)明的第一方面的融合蛋白的晶體。
[0076]本文公開的融合蛋白用于結(jié)晶研究以及用于藥物研發(fā)程序。其可用于受體/配體動力學(xué)和熱力學(xué)參數(shù)的生物物理學(xué)測量，例如通過表面等離子共振或基于熒光的技術(shù)。其可用于配體結(jié)合篩選，以及與固體表面相偶聯(lián)以用于高通量篩選或作為生物傳感器芯片。包含融合蛋白的生物傳感器芯片可用于檢測分子，尤其是生物分子。
[0077]本發(fā)明將借助下列附圖和實施例描述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0078]圖1:具有GLPlR的T4L融合構(gòu)建體的設(shè)計。T4L在ICL2 (左)和ICL3 (右)中被插入在指示的殘基之后。構(gòu)建體Ia表示T4L被插入在L255和S261之間。TM結(jié)構(gòu)域和環(huán)的模型基于參考文獻[4]。
[0079]圖2:與野生型(WT)和模擬轉(zhuǎn)染(U)樣本相比的GLP1R-T4L融合構(gòu)建體總EGFP信號。以50ug的總細胞材料一式兩份地進行每個測量。誤差線代表與平均值之間的標準偏差。 [0080]圖3:野生型GLPlR的典型的fSEC洗脫譜。
[0081]圖4:DDM溶解的在ICL2中的GLP1R-T4L融合構(gòu)建體的fSEC洗脫譜覆蓋野生型的譜。在每種情況下，野生型譜以紅色顯示，而融合構(gòu)建體以藍色顯示。
[0082]圖5 =DDM溶解的在ICL3上的GLP1R-T4L融合構(gòu)建體的fSEC洗脫譜覆蓋野生型譜。在每種情況下，野生型譜以紅色顯示，融合構(gòu)建體以藍色顯示。
[0083]圖6:顯示TM3、ICL2和TM4 (SEQ ID No:1-22)位置的家族B的GPCR的氨基酸序列。在GLPlR融合構(gòu)建體中被T4L取代的ICL2的部分在來自小鼠、大鼠和人的其它家族B受體中突出顯示。
[0084]圖7:T4噬菌體溶菌酶的氨基酸序列:(A)插入在家族A受體的ICL3上的序列
[2], [3] (SEQ ID No:23) ; (B)插入在家族B受體的ICL2上的序列(SEQ ID No:24)(參見實施例)。在框中顯示差異。
【具體實施方式】
[0085]實施例1:1CL2內(nèi)的T4L插入改善了 GLPlR的生物化學(xué)性質(zhì)。
[0086]概要
[0087]我們已經(jīng)檢測將T4L插入家族B受體內(nèi)環(huán)的效果。我們的數(shù)據(jù)表明，家族B受體不能容納在ICL3中的T4L融合，然而將T4L加至ICL2卻能改善受體的生物化學(xué)性質(zhì)。
[0088]結(jié)果
[0089]根據(jù)GLPlR的模型確定GLPlR的環(huán)區(qū)，并將編碼T4L的DNA插入至在ICL2和ICL3內(nèi)的不同位置(圖1)。為監(jiān)測總表達和使用熒光檢測尺寸排阻色譜法的單分散性，將GLPlR構(gòu)建體在C端用EGFP標記。
[0090]在序列確認后，這些構(gòu)建體在HEK293T中瞬時地表達。作為初始分析，在整個細胞中測量EGFP信號以評估總表達水平。有趣的是，在ICL3中的構(gòu)建體不能產(chǎn)生任何EGFP信號，表明在GLPlR這個區(qū)的T4L融合與此受體的整體結(jié)構(gòu)不相容。然而，在ICL2上的融合導(dǎo)致GLPlR的強烈表達(圖2)。
[0091]為分析GLP1R-T4L融合的生物化學(xué)性質(zhì)，將表達這些構(gòu)建體的細胞溶于十二烷基麥芽苷(DDM)中，并將其用于熒光檢測尺寸排阻色譜法(fSEC)。fSEC已廣泛用于提供關(guān)于蛋白質(zhì)的單分散性和聚集狀態(tài)的數(shù)據(jù)，特別是在預(yù)結(jié)晶篩選中[5]。一般地，條件越有利將導(dǎo)致越多的單分散性和減少的聚集。DDM溶解的野生型GLPlR的fSEC的洗脫譜顯示具有聚集肩的主單分散性峰以及游離的EGFP種類的存在，所述游離的EGFP種類是蛋白水解降解的結(jié)果(圖3)。
[0092]與圖2所示的EGFP信號數(shù)據(jù)相一致，ICL2T4L融合構(gòu)建體la、lb、2a、2b、3a和3b的洗脫譜表明細胞不能表達這些融合(圖4)。這最有可能因為T4L的N端與TM III的靠近導(dǎo)致破壞整體結(jié)構(gòu)。與之相反,構(gòu)建體lc、ld、2c、2d、3c和3d的洗脫譜顯示產(chǎn)生的融合受體得以表達，以及更顯著的是看起來T4L融合導(dǎo)致聚集峰的減少和伴隨的單分散性峰的改善，其一起表明T4L插入在受體的此區(qū)對于溶解的受體的生物化學(xué)性質(zhì)具有有利的影響(圖4)。在構(gòu)建體Ic和2c中這種影響最明顯。
[0093]對ICL3融合構(gòu)建體進行同樣的分析，其與圖2所示的EGFP信號數(shù)據(jù)相一致，在ICL3中的T4L融合中沒有導(dǎo)致表達任何產(chǎn)生的融合受體(圖5)。
[0094]綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明在GLPlR的第三細胞質(zhì)環(huán)中的T4L融合是不相容的，然而，將T4L插入在第二細胞質(zhì)環(huán)的某些位置不僅相容，并且其改善了溶解受體的生物化學(xué)性質(zhì)?？紤]到家族B的GPCR的成員之間的高度序列同源性，我們建議可將這些觀察延伸至這個家族的其它成員。 如圖6所示，在其它家族B成員中突出顯示在最佳構(gòu)建體(Ic)中被取代的ICL2的部分。
[0095]方法和材料
[0096]使用標準分子生物學(xué)技術(shù)將T4溶菌酶插入到人GLPlR的第二和第三細胞質(zhì)環(huán)中。在HEK293T細胞中從修飾的pcDNA3.1中瞬時表達這些構(gòu)建體，將產(chǎn)生的受體在其C端與EEGFP融合。根據(jù)制造商的指南使用GeneJuice (Merck Biosciences)進行轉(zhuǎn)染。通常，用6ug的DNA去轉(zhuǎn)染在IOcm平皿中的3xl06貼壁細胞。在轉(zhuǎn)染后約40小時收集細胞，并將其重懸于補充了完全無EDTA的蛋白酶抑制劑混合物(Complete EDTA-free proteaseinhibitor cocktail (Roche))的50mM HEPES pH7.5/150mM NaCl/0.5mM EDTA。通常，在4°C將每個樣本的650ug與1%DDM在200uL的總體積中溶解I小時，接著在50000rpm離心30分鐘。將50uL的上清上樣在BioSE印-SEC-S3000柱(Phenomenex)上，用SEC緩沖液(50mMHEPES pH7.5/150mM NaCl/0.5mM EDTA/0.03%DDM)進行預(yù)平衡，然后以 ImL/分鐘的流速運行15分鐘。使洗脫液通過在線熒光計，其具有下列設(shè)置:激發(fā)490nm、發(fā)射513nm和13的增益。
[0097]參考文獻
[0098][l]Kristiansen, K.Molecular mechanisms of ligand binding, signaling, andregulation within the superFamily of G-protein-coupled receptors:molecularmodeling and mutagenesis approaches to receptor structure and function.Pharma&Therap103, 21-80(2004).[0099][2]Bill RM, Henderson PJ, Iwata S, Kunji ER, Michel H, Neutze R, NewsteadS，Poolman B，Tate CG and Vogel H.0vercoming barriers to membrane proteinstructure determination.Nat Biotechnol.29 (4)，335-340 (2011).[0100][3]Kobilka BK, Kobilka TSj Daniel Kj Regan JWj Caron MG 和Lefkowitz RJ.Chimeric alpha2_，beta2_adrenergic receptors: delineation ofdomains involved in effector coupling and ligand binding specificity.Science240 (4857) 1310-6(1988).[0101][4]Frimurer TM 和 Bywater RP.Structure of the integral membrane domainof the GLPlreceptor.Proteins35(4), 375-86(1999).[0102][5]Kawate T 和 Gouaux E.Fluorescence-detection size-exclusionchromatography for precrystalliz ation screening of integral membrane proteins.Structurel4(4)，673-81(2004).
【權(quán)利要求】
1.一種融合蛋白，其從N端至C端包含: a)家族B的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的第一部分，其包含GPCR的跨膜螺旋(TM)_1、TM2和 TM3 ； b)穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域；以及 c)GPCR的第二部分，其包含GPCR的TM4、TM5、TM6和TM7。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中所述GPCR是家族B的GPCR，例如類胰高血糖素肽I受體(GLPlR)、類胰高血糖素肽2受體(GLP2R)、降鈣素受體(CT)、糊精/CGRP受體(AMY1 α )、糊精受體(AMY2 α )、糊精/CGRP受體(AMY3 a )、CGRP/腎上腺髓質(zhì)素受體(CGRP1 α )、腎上腺髓質(zhì)素/CGRP受體(AM1 α )、腎上腺髓質(zhì)素/CGRP受體(AM2 α受體)、促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子受體(CRF1)、尿皮質(zhì)素受體(CRF2)、生長激素釋放激素受體(GHRH)、抑胃多肽受體(GIP)、胰高血糖素受體、分泌素受體、ΤΙΡ-39受體(ΡΤΗ2)、甲狀旁腺激素受體(PTHl)、VIP/PACAP 受體(VPAC1)、PACAP 受體(PAC2)以及 VIP/PACAP 受體(VPAC2)中的任一。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述GPCR是相對其親代GPCR具有增加的構(gòu)象穩(wěn)定性的突變體GPCR。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的融合蛋白，其中所述穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域插入至GPCR的細胞內(nèi)環(huán)2 (ICL2)區(qū)，其中所述環(huán)連接GPCR的第一和第二部分。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的融合蛋白，其中根據(jù)圖6所示人GLPlR的編號，在與氨基酸Phe257和Ser261相對應(yīng)的氨基酸殘基之間的位置上,將穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域插入至所述GPCR 的 ICL2 區(qū)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的融合蛋白，其中根據(jù)圖6所示人GLPlR的編號，在與氨基酸Phe257相對應(yīng)的氨基酸之后并在與氨基酸Ser261或Phe260或Val259相對應(yīng)的氨基酸之前，將穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域插入至所述GPCR的ICL2區(qū)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的融合蛋白，其中根據(jù)圖6所示人GLPlR的編號，在與氨基酸Ser258相對應(yīng)的氨基酸之后并在與氨基酸Ser261或Phe260或Val259相對應(yīng)的氨基酸之前，將穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域插入至所述GPCR的ICL2區(qū)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述的融合蛋白，其中穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)域包含溶菌酶，如T4溶菌酶的氨基酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的融合蛋白，其進一步包含可檢測的部分，例如熒光標記、放射性標記或者酶標記中的任一。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的融合蛋白，其中所述可檢測的部分是EGFP。
11.一種編碼如權(quán)利要求1至10中任一項所述的融合蛋白的多核苷酸。
12.—種包含如權(quán)利要求11所述的多核苷酸的宿主細胞。
13.—種包含如權(quán)利要求1至10中任一項所述的融合蛋白的晶體。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項所述的融合蛋白，其處于溶解的形式或者其基本不含其它蛋白或者其固定至固相載體。
15.如權(quán)利要求1至 10中任一項所述的融合蛋白在用于結(jié)晶、或用于藥物發(fā)現(xiàn)如在配體結(jié)合篩選或在分析開發(fā)中、或作為生物傳感器中的用途。
16.一種使如權(quán)利要求1至10中任一項所述的融合蛋白結(jié)晶方法，所述方法包括提供如權(quán)利要求1至10中任一項所述的融合蛋白并使之結(jié)晶以獲得晶體。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中通過培養(yǎng)如權(quán)利要求12所述的宿主細胞以表達所述融合蛋白并分離所述蛋白來提供所述融合蛋白。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的方法，其中使用脂立方相結(jié)晶學(xué)進行結(jié)晶。
【文檔編號】C07K14/72GK103917553SQ201280049594
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2012年8月9日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月10日
【發(fā)明者】S·A·亞扎耶爾-徳茲浮力, F·H·馬歇爾 申請人:赫普泰雅治療有限公司