通過經(jīng)改良的重組菌株來生產(chǎn)異丙醇的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及表達(dá)載體，其包含：編碼形成具有使得能夠?qū)⒁阴Ｒ阴?CoA轉(zhuǎn)化為乙酰乙酸的酶促活性的多肽復(fù)合物的多肽的核酸，任選地，至少一種編碼具有使得能夠?qū)⒁阴Ｒ宜徂D(zhuǎn)化為丙酮的酶促活性的多肽的核酸，和至少一種編碼具有使得能夠?qū)⒈D(zhuǎn)化為異丙醇的酶促活性的多肽的核酸，所述核酸的表達(dá)由位于上述核酸上游的單一組成型啟動(dòng)子控制。
【專利說明】通過經(jīng)改良的重組菌株來生產(chǎn)異丙醇
[0001]COLLAS Florent;CONTRERAS-LOPEZ Ana;MARCHAL R6my 和 CLEMENT Benjamin。
[0002]本發(fā)明涉及通過經(jīng)改良的重組菌株來生產(chǎn)異丙醇的方法。
[0003]文獻(xiàn)研究
[0004]異丙醇(也稱為2-丙醇，或異丙基醇)主要用作用于制備墨水和表面活性劑的溶劑。它的其他應(yīng)用涉及羧甲基纖維素(CMC)的防腐劑和溶劑的特性。異丙醇還被用于美容學(xué)基質(zhì)的生產(chǎn)，用作殺蟲劑的溶劑，或者在有機(jī)合成中用作材料來源。作為參考情況，可以提及在1990年在美國異丙醇的產(chǎn)量升高至四千五百萬噸(Papa A, 2005)。
[0005]現(xiàn)今，異丙醇通過本質(zhì)上化學(xué)的方法來生產(chǎn)，所述方法在于按照直接途徑或間接途徑的丙烯的水合。間接途徑采用兩個(gè)步驟。在第一個(gè)步驟中，產(chǎn)生硫酸單異丙酯和硫酸二異丙酯的混合物，其在第二個(gè)步驟中被水解為異丙醇。直接途徑采用在酸性“固化床”催化劑上在高壓和低溫下的丙烯的水合(Logsdon J.E.和Loke R.A.，2001)。
[0006]從1942至1958年，在臺灣已經(jīng)通過發(fā)酵途徑來生產(chǎn)異丙醇(Rogers等人，2006)。發(fā)酵的底物為甘薯、木薯、小麥淀粉，然而微生物為野生菌株?，F(xiàn)今，該異丙醇生產(chǎn)方法已經(jīng)不再在工業(yè)上使用了。這是因?yàn)椋靡吧晁@得的低產(chǎn)量(對于拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)而言,2至3g/L的異丙醇)不允許建立經(jīng)濟(jì)上可行的方法。正如ABE (丙酮、丁醇、乙醇)溶劑生成發(fā)酵那樣，IBE (異丙醇、丁醇、乙醇)發(fā)酵在20世紀(jì)60年代開始時(shí)就已經(jīng)隨著石油化學(xué)工業(yè)的發(fā)展而被放棄了。
[0007]由于生態(tài)學(xué)和經(jīng)濟(jì)學(xué)的考慮，對于通過微生物發(fā)酵來生產(chǎn)異丙醇的研究近些年來已經(jīng)引起興趣的恢復(fù)。產(chǎn)生異丙醇的發(fā)酵以IBE發(fā)酵的名稱而為人所知。它與另一種產(chǎn)生溶劑的發(fā)酵(ABE發(fā)酵)的不同之處在于，它唯獨(dú)地或大部分地通過消耗丙酮來產(chǎn)生異丙醇。產(chǎn)生溶劑的菌株屬于梭菌屬(Clostridium)。它們被再分類為四個(gè)物種:丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)、拜氏梭菌(C.beijerinckii)、金黃丁酸梭菌(C.aurantibutyricum)、糖多丁基丙酮梭菌(C.saccharoperbutylacetonicum) (Keis 等人，2001)。
[0008]丙酮丁醇梭菌是在ABE發(fā)酵中經(jīng)常使用的菌株。因此，用丙酮丁醇梭菌進(jìn)行的發(fā)酵的主要產(chǎn)物為丙酮、乙醇和丁醇。異丙醇不由丙酮丁醇梭菌的野生菌株產(chǎn)生。異丙醇是從前命名為“丁酸梭菌(Clostridium butylicum)”的微生物的特征性產(chǎn)物(Osburn等Λ , 1937 ;Langlykke等人，1937)。1983年,George等人證明，丁酸梭菌與拜氏梭菌類似。因此，在目前的分類中，拜氏梭菌這一物種包含從前被分類為丁酸梭菌的菌株。然而，不是所有的拜氏梭菌菌株都產(chǎn)生異丙醇。例如，拜氏梭菌菌株NRRL B593產(chǎn)生異丙醇，而拜氏梭菌菌株NRRL B592不產(chǎn)生異丙醇。
[0009]在拜氏梭菌中異丙醇的生物合成途徑包括下列步驟:
[0010](i)兩分子的乙酰-CoA通過乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶(EC2.3.1.9)(也稱為硫解酶(Thl))而縮合成一分子的乙酰乙酰-CoA ；
[0011](ii)乙酰-CoA的CoA通過乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶(Ca_CtfAB) (EC2.8.3.9)而轉(zhuǎn)移至乙酸或丁酸，從而產(chǎn)生乙酰乙酸；[0012](iii)然后，乙酰乙酸通過乙酸脫羧酶(Ca_Adc) (EC4.1.1.4)而轉(zhuǎn)化為丙酮和CO2;
[0013](iv)最后,丙酮通過仲醇脫氫酶(Cb_s_Adh) (EC1.1.1.2)而轉(zhuǎn)化為異丙醇。
[0014]在拜氏梭菌NRRL B593和拜氏梭菌NRRL B592 (其分別產(chǎn)生和不產(chǎn)生異丙醇)中的酶促活性的比較顯示，分泌異丙醇的能力與仲醇脫氫酶Cb_s-Adh的活性相關(guān)(Yan等人，1988)。已經(jīng)從拜氏梭菌NRRL B593的無細(xì)胞提取物中純化出了負(fù)責(zé)的酶(Ismaiel等人，1993)。為了比較目的，還純化了拜氏梭菌NEST255的脫氫酶。拜氏梭菌菌株NRRL B593和拜氏梭菌菌株NEST255的仲醇脫氫酶依賴于NADP。在體外，它們?nèi)缢A(yù)期的那樣使用仲醇(異丙醇)，但也使用伯醇，尤其是丁醇，然而具有較低的活性。酶的動(dòng)力學(xué)研究已經(jīng)確認(rèn)，仲醇脫氫酶的生理學(xué)底物確實(shí)是丙酮而不是異丙醇(Chen等人，1995)。拜氏梭菌的仲醇脫氫酶(Cb-s-Adh)明顯地不同于來自相同微生物的伯醇脫氫酶，后者在體內(nèi)將丁醛還原為丁醇。
[0015]編碼Cb_s_Adh的基因已被測序(Petretz等人，1997)。已經(jīng)通過X射線測定了該酶的結(jié)構(gòu)。Cb_s-Adh是一種含鋅的同型四聚體酶，其包含四條具有351個(gè)氨基酸的多肽鏈。每個(gè)單體由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。第一個(gè)結(jié)構(gòu)域(殘基154-294)允許輔因子的結(jié)合，而第二個(gè)結(jié)構(gòu)域整合了催化結(jié)構(gòu)域(殘基1-153和295-351) (Korkhin等人，1998 ；Goihberg等人，2010)。Cb_s_Adh以75%的序列同一性接近來自嗜熱細(xì)菌布氏熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter brocki i )的其同源物(Tb_s_Adh)。在特性方面,這兩種酶由于其熱穩(wěn)定性而是不同的(Korkin等人，1999)。在Cb_s_Adh中，在氨基酸序列中將GlnlOO替換為ProlOO顯著提高了 Cb_s-Adh的熱穩(wěn)定性(Goihberg等人，2007),其原本是較低的。
[0016]用拜氏梭菌的野生菌株,異丙醇的最大生產(chǎn)能力是相對低的(2至3g/L) (Chen等人，1986)。專利申請US2009/246842描述了一種在用表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(E.coli)菌株中生產(chǎn)異丙醇的方法，所述表達(dá)載體包含編碼丙酮丁醇梭菌的乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶的基因(Ca_thl)、編碼丙酮丁醇梭菌的乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶的基因(Ca_CtfAB)、編碼丙酮丁醇梭菌的乙酸脫羧酶的基因(Ca_adc)和編碼拜氏梭菌的仲醇脫氫酶的基因(Cb_s-adh)。在該載體中，仲醇脫氫酶的表達(dá)處于可被IPTG誘導(dǎo)的啟動(dòng)子Puac^1的控制之下，而基因Ca_thl、Ca_CtfAB和Ca_adc的表達(dá)處于丙酮丁醇梭菌的基因Ca_thl的天然啟動(dòng)子的控制之下。該方法的缺點(diǎn)是，需要使用富含營養(yǎng)(尤其是酵母提取物Gg.L—1))的生產(chǎn)培養(yǎng)基，以及誘導(dǎo)物，例如異丙基_β -硫代吡喃半乳糖苷或IPTG。此外，仲醇脫氫酶僅當(dāng)在培養(yǎng)基中添加IPTG時(shí)才表達(dá)，這延遲了異丙醇的產(chǎn)生并限制了發(fā)酵的生產(chǎn)率。
[0017]國際申請WOl 1/037414描述了另一種能夠生產(chǎn)異丙醇的方法。該方法在于使用用表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的梭菌屬的微生物，所述表達(dá)載體包含編碼丙酮丁醇梭菌的乙酸脫羧酶的基因(Ca_adc)、編碼丙酮丁醇梭菌的乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶的基因(Ca_CtfAB)和編碼拜氏梭菌的仲醇脫氫酶的基因(Cb_s_adh)。該載體需要兩個(gè)啟動(dòng)子:僅控制仲醇脫氫酶的表達(dá)的組成型啟動(dòng)子Ca_thlp，和控制蛋白質(zhì)Ca_CtfAB和Ca_Adc的表達(dá)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Ca_adcp。鑒于蛋白質(zhì)Ca_CtfAB和Ca_Adc僅在溶劑生成階段期間表達(dá)，因而仲醇脫氫酶在該階段之前不具有底物(丙酮)。因此，異丙醇(發(fā)酵的終產(chǎn)物)僅在培養(yǎng)15小時(shí)后產(chǎn)生，這限制了用該生產(chǎn)方法的異丙醇的生產(chǎn)率。
[0018] 因此，總是存在著對于開發(fā)出具有更好的生產(chǎn)率和更好的產(chǎn)率的異丙醇生產(chǎn)方法的需要。
[0019]本發(fā)明的目標(biāo)是糾正現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，并提出具有更好的生產(chǎn)率和更好的產(chǎn)率的通過發(fā)酵來生產(chǎn)異丙醇的方法。
[0020]發(fā)明描述
[0021]發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，有利地，可能通過使用其中引入了載體的重組微生物來生產(chǎn)異丙醇，所述載體包含編碼將乙酰乙酰-CoA引向丙酮的代謝途徑的酶(即CoA轉(zhuǎn)移酶亞基A和B以及乙酰乙酸脫羧酶)的基因，以及編碼拜氏梭菌NRRL B593的仲醇脫氫酶的基因。
[0022]本發(fā)明的第一個(gè)目標(biāo)旨在提供表達(dá)載體，其包含:
[0023]-編碼形成具有使得能夠?qū)⒁阴Ｒ阴?CoA轉(zhuǎn)化為乙酰乙酸的酶促活性的多肽復(fù)合物的多肽的核酸，
[0024]-至少一種編碼具有使得能夠?qū)⒈D(zhuǎn)化為異丙醇的酶促活性的多肽的核酸，和
[0025]-任選地，至少一種編碼具有使得能夠?qū)⒁阴Ｒ宜徂D(zhuǎn)化為丙酮的酶促活性的多肽的核酸，
[0026]所述核酸的表達(dá)由位于上述核酸上游的單一組成型啟動(dòng)子控制。
[0027]“表達(dá)載體”是指環(huán)形的外源DNA分子，其能夠自主地和不依賴于宿主細(xì)胞染色體DNA地進(jìn)行復(fù)制，這使得能夠借助于宿主細(xì)胞來進(jìn)行包含在所述DNA分子中的基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。
[0028]在本發(fā)明中，術(shù)語“載體”和術(shù)語“質(zhì)?！笨梢曰ハ嗵娲?。
[0029]“啟動(dòng)子”是指這樣的DNA區(qū)域，在該DNA區(qū)域處RNA聚合酶進(jìn)行結(jié)合并且該DNA區(qū)域使該酶朝向基因轉(zhuǎn)錄將會(huì)開始的位點(diǎn)方向。
[0030]所述啟動(dòng)子可以是組成型的或誘導(dǎo)型的。
[0031]“組成型啟動(dòng)子”是指允許相關(guān)基因的連續(xù)轉(zhuǎn)錄的不受調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子。
[0032]與組成型啟動(dòng)子相反,誘導(dǎo)型啟動(dòng)子允許響應(yīng)于特定化合物的存在(例如，IPTG的存在)或者確定的外部條件(例如，聞溫)而發(fā)生的相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。
[0033]“位于...核酸上游的...啟動(dòng)子”是指位于所述核酸的5’末端前面的啟動(dòng)子。
[0034]乙酰乙酰-CoA至乙酰乙酸的轉(zhuǎn)化通過乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶來進(jìn)行。在大部分微生物中，該酶由兩個(gè)被兩個(gè)不同基因編碼的亞基形成。因此，大腸桿菌的乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶(Ato AD)由亞基A和D形成，而丙酮丁醇梭菌的乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶(Ca_CtfAB)由亞基A和B構(gòu)成。
[0035]在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及載體，其包含:
[0036]-編碼乙酸乙酸-CoA轉(zhuǎn)移酶的核酸(Ca_CtfAB),和
[0037]-至少一種編碼拜氏梭菌的仲醇脫氫酶的基因(Cb_s-adh)的核酸；和
[0038]-任選地，至少一種編碼乙酰乙酸脫羧酶的基因(Ca_adc)的核酸。
[0039]拜氏梭菌NRRL B593的仲醇脫氫酶基因的表達(dá)使得能夠確保丙酮至異丙醇的轉(zhuǎn)化以及異丙醇的分泌。表達(dá)該酶的重組菌株可以使幾乎所有的丙酮和乙偶姻(3-羥基-2-丁酮)分別還原為異丙醇和2，3- 丁二醇。盡管已知拜氏梭菌菌株NRRL B593的酶Cb_s_Adh可以還原丙酮和丁酮，但是該酶對于乙偶姻的活性由發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)。
[0040]在一個(gè)更特別的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及載體，其包含:
[0041]-由序列SEQID NO:1所示的核酸，或與序列SEQ ID NO:1具有至少85%，特別地90%,尤其是95%的序列同一性的核酸，和
[0042]-由序列SEQID NO:2所示的核酸，或與序列SEQ ID NO:2具有至少85%，特別地90%,尤其是95%的序列同一性的核酸，和
[0043]-由序列SEQID NO:3所示的核酸，或與序列SEQ ID NO:3具有至少85%，特別地90%,尤其是95%的序列同一性的核酸，和
[0044]-任選地，由序列SEQID NO:4所示的核酸,或與序列SEQ IDN0:4具有至少85%,特別地90%，尤其是95%的序列同一性的核酸。
[0045]由序列SEQ ID NO:1所示的核酸編碼丙酮丁醇梭菌ATCC824的乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶的亞基A (Ca_ctfA)。
[0046]由序列SEQ ID NO: 2所示的核酸編碼丙酮丁醇梭菌ATCC824的乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶的亞基B (Ca_ctfB)。
[0047]由序列SEQ ID NO:3所示的核酸編碼拜氏梭菌的仲醇脫氫酶(Cb_s_adh)。
[0048]由序列SEQ ID N0:4所示的核酸編碼丙酮丁醇梭菌的乙酰乙酸脫羧酶(Ca_adc)。
[0049]兩個(gè)肽序列之間或兩個(gè)核酸序列之間的同一性百分比可以根據(jù)下式來進(jìn)行計(jì)算:
[0050]相同殘基的數(shù)目XlOO
[0051]最短序列的殘基的數(shù)目。
[0052]上述核酸(或基因)的組合形成“ipa”操縱子。上述ipa操縱子的基因的表達(dá)由位于上述核酸(或基因)上游的單一組成型啟動(dòng)子控制。僅控制ipa操縱子的表達(dá)的組成型啟動(dòng)子準(zhǔn)許ipa操縱子的組成性表達(dá)，這允許包含本發(fā)明的載體的重組菌株從發(fā)酵的頭幾個(gè)小時(shí)起就產(chǎn)生異丙醇。
[0053]由于導(dǎo)致異丙醇產(chǎn)生的基因的過早表達(dá)，溶劑生成的機(jī)制在包含根據(jù)本發(fā)明的載體的重組菌株中比在野生菌株中更早地被發(fā)動(dòng)。因此，發(fā)酵的兩個(gè)階段，即酸生成(acidogenesis)和溶劑生成(solventogenesis),在包含根據(jù)本發(fā)明的載體的重組菌株中同時(shí)發(fā)生，這使得能夠?qū)l(fā)酵持續(xù)時(shí)間減少至少20小時(shí)。
[0054]在本發(fā)明的載體的構(gòu)建中所使用的組成型啟動(dòng)子可以是由序列SEQ ID N0:5所示的編碼丙酮丁醇梭菌ATCC824的硫解酶的基因的啟動(dòng)子，或由序列SEQ ID N0:6所示的丙酮丁醇梭菌ATCC824的磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶的基因的啟動(dòng)子。
[0055]在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)載體包含:
[0056]-由序列SEQID NO:1所示的核酸，或與序列SEQ ID NO:1具有至少85%，特別地90%,尤其是95%的序列同一性的核酸，其編碼丙酮丁醇梭菌的乙酰乙酰-Cok轉(zhuǎn)移酶的亞基A，和
[0057]-由序列SEQID NO:2所示的核酸，或與序列SEQ ID NO:2具有至少85%，特別地90%,尤其是95%的序列同一性的核酸，其編碼丙酮丁醇梭菌的乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶的亞基B，和
[0058]-任選地，由序列SEQID NO:4所示的核酸，或與序列SEQ ID N0:4具有至少85%，特別地90%，尤其是95%的序列同一性的核酸，其編碼丙酮丁醇梭菌的乙酰乙酸脫羧酶，和
[0059] -由序列SEQID NO:3所示的核酸，或與序列SEQ ID NO:3具有至少85%，特別地90%，尤其是95%的序列同一性的核酸，其編碼拜氏梭菌的仲醇脫氫酶，[0060]所述核酸的表達(dá)由位于上述核酸上游的單一組成型啟動(dòng)子控制，所述啟動(dòng)子選自由序列SEQ ID N0:5所示的啟動(dòng)子(thl啟動(dòng)子)和由序列SEQ ID N0:6所示的啟動(dòng)子。
[0061]在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體包含:
[0062]-由序列SEQID NO:1所示的核酸，
[0063]-由序列SEQID NO:2所示的核酸，
[0064]-由序列SEQID NO:3所示的核酸，
[0065]-由序列SEQID N0:4所示的核酸，和
[0066]-由序列SEQID N0:5所示的啟動(dòng)子。
[0067]該被命名為pFC007的載體，以從5’末端至3’末端的順序，包含拜氏梭菌NRRLB593的編碼仲醇脫氫酶的基因(Cb_s-adh)以及丙酮丁醇梭菌ATCC824的編碼乙酰乙酸脫羧酶的基因(Ca_adc)和編碼輔酶A轉(zhuǎn)移酶的亞基A和B的基因(Ca_CtfAB)。載體pFC007允許在唯一的組成型啟動(dòng)子(丙酮丁醇梭菌ATCC824的乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶的基因(硫解酶，Ca_thl)的啟動(dòng)子)的控制之下“ipa7”操縱子的基因的過表達(dá)。因此，其各個(gè)酶(Cb_s_Adh、Ca_Adc和Ca_CtfAB)的產(chǎn)生從發(fā)酵的頭幾個(gè)小時(shí)起(大約4和10小時(shí)后)就開始了。
[0068]在另一個(gè)特別的實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體包含:
[0069]-由序列SEQID NO:1所示的核酸，
[0070]-由序列SEQID NO:2所示的核酸，
[0071]-由序列SEQID N0:3所示的核酸，和
[0072]-由序列SEQID N0:5所示的啟動(dòng)子。
[0073]該被命名為pFC006的載體包含拜氏梭菌NRRL B593 (DSMZ6423)的編碼仲醇脫氫酶的基因(Cb_s-adh)以及丙酮丁醇梭菌ATCC824的編碼輔酶A轉(zhuǎn)移酶的亞基A和B的基因(Ca_CtfAB)。這些基因處于唯一的丙酮丁醇梭菌ATCC824的乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶基因(或者硫解酶或Ca_thl)的組成型啟動(dòng)子的控制之下。
[0074] 根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體還可以包含任何其他對于上面提及的酶的轉(zhuǎn)錄和翻譯來說必需的元件，例如RBS (核糖體結(jié)合位點(diǎn))區(qū),一個(gè)或多個(gè)選擇基因。
[0075]RBS區(qū)允許核糖體在基因的起始密碼子之前結(jié)合至信使RNA分子。在本發(fā)明的載體中所使用的RBS區(qū)的序列可以是任何的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的原核生物來源的RBS區(qū)的序列。
[0076]在根據(jù)本發(fā)明的載體中選擇基因的存在使得能夠選擇出經(jīng)成功轉(zhuǎn)化的微生物。在載體中的選擇基因允許包含所述基因的微生物在某些特定條件下存活，或者導(dǎo)致可容易地定位的分子的存在。在本發(fā)明的載體中使用的選擇基因可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何選擇基因，尤其是允許微生物抵抗抗生素的基因，例如Amp或ErmB基因。
[0077]所述表達(dá)載體還包含復(fù)制起點(diǎn)，其允許在宿主微生物中所述載體的復(fù)制的起始。在本發(fā)明的載體中使用的復(fù)制起點(diǎn)可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何起點(diǎn)。
[0078]本發(fā)明還旨在提供用于以更好的生產(chǎn)率和更好的產(chǎn)率來生產(chǎn)異丙醇的重組微生物。
[0079]所述微生物包含有在本發(fā)明中所描述的表達(dá)載體。
[0080]特別地，所述微生物包含載體，所述載體包含:
[0081]-由序列SEQID NO:1所示的核酸，或與序列SEQ ID NO:1具有至少85%，特別地90%,尤其是95%的序列同一性的核酸，和
[0082]-由序列SEQID NO:2所示的核酸，或與序列SEQ ID NO:2具有至少85%，特別地90%,尤其是95%的序列同一性的核酸，和
[0083]-由序列SEQID NO:3所示的核酸，或與序列SEQ ID NO:3具有至少85%，特別地90%,尤其是95%的序列同一性的核酸，和
[0084]-任選地，由序列SEQID NO:4所示的核酸，或與序列SEQ ID N0:4具有至少85%，特別地90%，尤其是95%的序列同一性的核酸，
[0085]所述核酸的表達(dá)由位于上述核酸上游的單一組成型啟動(dòng)子控制，所述啟動(dòng)子選自由序列SEQ ID N0:5所示的啟動(dòng)子(thl啟動(dòng)子)和由序列SEQ ID N0:6所示的啟動(dòng)子。
[0086]在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，所述微生物包含載體pFC007。
[0087]在另一個(gè)有利的實(shí)施方案中，所述微生物包含載體pFC006。
[0088]本發(fā)明的所述微生物可以選自梭菌屬(Clostridium)的細(xì)菌，例如丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)、拜氏梭菌(C.beijerinckii)、糖多丁基丙酮梭菌(C.saccharope rbuty lacetoni cum) > 糖丁醇梭菌(C.saccharobutylicum);芽抱桿菌屬(Bacillus)的細(xì)菌,例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis);或腸桿菌,例如大腸桿菌(E.coli)。
[0089]在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的微生物為丙酮丁醇梭菌。
[0090]在一個(gè)更特別的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的微生物為丙酮丁醇梭菌菌株ATCC824。
[0091]在一個(gè)特別有利的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含載體pFC007的丙酮丁醇梭菌ATCC824的重組菌株。該重組菌株被命名為ATCC824(pFC007)。
[0092]在另一個(gè)特別有利的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含載體pFC006的丙酮丁醇梭菌ATCC824的重組菌株。該重組菌株被命名為ATCC824(pFC006)。
[0093]對于所述兩種重組菌株(ATCC824(pFC007)和ATCC824 (pFC006))，從培養(yǎng)的前10個(gè)小時(shí)起就可以檢測到異丙醇的產(chǎn)生，而在丙酮丁醇梭菌ATCC824的野生菌株或者其中插入了僅包含編碼拜氏梭菌NRRL B593的仲醇脫氫酶的基因(Cb_s_adh)的載體的丙酮丁醇梭菌ATCC824的重組菌株中，痕量的溶劑(ABE)都無法檢測到。
[0094]本發(fā)明的目標(biāo)還在于提供以更好的生產(chǎn)率和更好的產(chǎn)率來生產(chǎn)異丙醇和/或D-和L_2, 3- 丁二醇的方法。
[0095]所述方法至少包括下列步驟:
[0096]-在允許產(chǎn)生異丙醇的條件(例如，由Gapes等人(Gapes,1996)所描述的培養(yǎng)基)下，在包含至少一種碳源和至少一種氮源的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的微生物，
[0097]-從培養(yǎng)基中回收異丙醇和/或D-和L-2，3-丁二醇。
[0098]所述培養(yǎng)基是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
[0099]所述碳源可以為淀粉、葡萄糖、木糖、木質(zhì)素纖維素水解物。
[0100]所述氮源可以為氨、酵母提取物、蛋白胨、尿素。
[0101]梭菌屬、芽孢桿菌屬或大腸桿菌細(xì)菌的微生物的培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
[0102]從培養(yǎng)基中異丙醇和/或D-和L-2，3_ 丁二醇的回收通過蒸餾來進(jìn)行(Mujiburohman 等人，2006 )。[0103]下面給出的實(shí)施例和附圖使得能夠更詳細(xì)地說明本發(fā)明。然而，本發(fā)明的范圍決不應(yīng)當(dāng)被限制于這些實(shí)施例或附圖。
[0104]附圖
[0105]圖1:該圖圖解說明了從質(zhì)粒PMTL500E開始的載體pFC007的構(gòu)建。
[0106]圖2:該圖呈現(xiàn)了質(zhì)粒pMTL500E的限制位點(diǎn)。
[0107]圖3:該圖圖解說明了載體PFC007的限制圖譜。
實(shí)施例
[0108]材料和方法
[0109]材料
[0110]在表1中呈現(xiàn)了在分子生物學(xué)操作(質(zhì)粒載體的構(gòu)建)期間所使用的試劑盒。
[0111]表1:在分子生物學(xué)操作期間所使用的試劑盒和材料
[0112]
【權(quán)利要求】
1.表達(dá)載體，其包含:-由序列SEQ ID NO:1所示的核酸，或與序列SEQ ID NO:1具有至少85%，特別地90%，尤其是95%的序列同一性的核酸，其編碼丙酮丁醇梭菌的乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶的亞基A，和-由序列SEQ ID NO: 2所示的核酸，或與序列SEQ ID NO: 2具有至少85%，特別地90%，尤其是95%的序列同一性的核酸，其編碼丙酮丁醇梭菌的乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶的亞基B，和-任選地，由序列SEQ ID N0:4所示的核酸，或與序列SEQ ID NO:4具有至少85%，特別地90%，尤其是95%的序列同一性的核酸，其編碼丙酮丁醇梭菌的乙酰乙酸脫羧酶，和 -由序列SEQ ID NO:3所示的核酸，或與序列SEQ ID NO:3具有至少85%，特別地90%，尤其是95%的序列同一性的核酸，其編碼拜氏梭菌的仲醇脫氫酶， 所述核酸的表達(dá)由位于上述核酸上游的單一組成型啟動(dòng)子控制，所述啟動(dòng)子選自由序列SEQ ID N0:5所示的啟動(dòng)子(thl啟動(dòng)子)和由序列SEQ ID N0:6所示的啟動(dòng)子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的表達(dá)載體,其特征在于,所述載體包含: -由序列SEQ ID NO:1所示的核酸， -由序列SEQ ID NO:2所示的核酸， -由序列SEQ ID NO:3所示的核酸， -由序列SEQ ID N0:4所示的核酸，和 -由序列SEQ ID NO:5所示的啟動(dòng)子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的表達(dá)載體,其特征在于,所述載體包含: -由序列SEQ ID NO:1所示的核酸， -由序列SEQ ID NO:2所示的核酸， -由序列SEQ ID NO:3所示的核酸，和 -由序列SEQ ID NO:5所示的啟動(dòng)子。
4.微生物,其包含根據(jù)權(quán)利要求1至3之一的表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的微生物，其特征在于，所述微生物選自梭菌屬細(xì)菌、芽孢桿菌屬細(xì)菌或腸桿菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的微生物，其特征在于，所述微生物選自丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、糖多丁基丙酮梭菌、糖丁醇梭菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的微生物，其特征在于，所述微生物為枯草芽孢桿菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的微生物，其特征在于，所述微生物為大腸桿菌。
9.生產(chǎn)異丙醇和/或D-和L-2，3-丁二醇的方法，其特征在于，所述方法包括: -允許產(chǎn)生異丙醇的條件下，在含至少一種碳源和至少一種氮源的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求4至8中任一項(xiàng)的微生物， -從培養(yǎng)基中回收異丙醇和/或D-和L-2，3- 丁二醇。
【文檔編號】C07C29/04GK103930391SQ201280049943
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2012年10月3日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月11日
【發(fā)明者】F·科拉, R·馬沙爾, B·克萊蒙特, A·M·洛佩茲孔特雷拉斯, P·A·M·克拉森 申請人:Ifp新能源公司, 農(nóng)業(yè)服務(wù)研究基金會(huì)