顯示出縮短的生物學(xué)活性的神經(jīng)毒素的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及制藥領(lǐng)域。具體地，預(yù)期編碼神經(jīng)毒素多肽的多核苷酸，所述多肽在對象中顯示出生物學(xué)效應(yīng)的減少的持續(xù)時(shí)間，其中所述多肽在輕鏈中包含至少一個(gè)E3連接酶識別基序，其中所述E3連接酶識別基序優(yōu)選是E3連接酶MDM2的結(jié)合基序。本發(fā)明還涉及由本發(fā)明多核苷酸編碼的多肽和包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換的多肽。本發(fā)明還涵蓋包含所述多核苷酸的載體和宿主細(xì)胞，由此編碼的多肽，和特異性地與所述多肽結(jié)合的抗體。此外，本發(fā)明涉及包含所述多核苷酸和多肽的藥物以及該藥物特定的治療應(yīng)用。此外，本發(fā)明預(yù)期用于所述多肽和藥物生產(chǎn)的方法。
【專利說明】顯示出縮短的生物學(xué)活性的神經(jīng)毒素
[0001]本發(fā)明涉及制藥領(lǐng)域。具體地，其考慮編碼神經(jīng)毒素多肽的多核苷酸，所述多肽在對象中顯示出生物學(xué)效應(yīng)的減少的持續(xù)時(shí)間，其中所述多肽在輕鏈中包含至少一個(gè)E3連接酶識別基序，其中所述E3連接酶識別基序優(yōu)選地是E3連接酶MDM2的結(jié)合基序。本發(fā)明還涉及由本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽以及包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換的多肽。本發(fā)明還涵蓋包含所述多核苷酸的載體和宿主細(xì)胞，由此編碼的多肽，和特異性地與所述多肽結(jié)合的抗體。此外，本發(fā)明涉及包含所述多核苷酸和多肽的藥物以及該藥物特定的治療應(yīng)用。此外，本發(fā)明考 慮用于所述多肽和藥物生產(chǎn)的方法。
[0002]肉毒桿菌和破傷風(fēng)梭菌產(chǎn)生高效的神經(jīng)毒素，即分別為肉毒毒素(BoNT)和破傷風(fēng)毒素(TeNT)。這些梭菌神經(jīng)毒素(CNT)與神經(jīng)元細(xì)胞特異性地結(jié)合并且干擾神經(jīng)遞質(zhì)釋放。每種毒素被合成為無活性的未加工的約150kDa的單鏈蛋白。翻譯后加工涉及二硫橋的形成和細(xì)菌蛋白酶的有限蛋白酶解(切割)?；钚缘纳窠?jīng)毒素由兩條鏈組成，它們是通過二硫鍵連接的約50kDa的N端輕鏈和約IOOkDa的重鏈。CNT由三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，即催化輕鏈，涵蓋易位結(jié)構(gòu)域(N端的一半)和受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(C端的一半)的重鏈，見 Krieglsteinl990, Eur J Biocheml88, 39 ；Krieglsteinl991, Eur J Biochem202, 41 ；Krieglsteinl994, J Protein Cheml3，49。肉毒神經(jīng)毒素以分子復(fù)合體形式合成,其包含150kDa的神經(jīng)毒素蛋白和相關(guān)的無毒性的復(fù)合蛋白?；谒缶旰筒煌纳窠?jīng)毒素血清型，復(fù)合體的大小在300kDa至900kDa的范圍內(nèi)變化。在這些復(fù)合體中的復(fù)合蛋白穩(wěn)定神經(jīng)毒素并且保護(hù)其免于降解，見Chenl998，Infect Immun66 (6): 2420-2425。
[0003]肉毒桿菌分泌七種抗原性不同的血清型，其被稱作肉毒神經(jīng)毒素(BoNT)的A至G型。全部血清型和破傷風(fēng)梭菌分泌的相關(guān)破傷風(fēng)神經(jīng)毒素(TeNT)是Zn2+內(nèi)切蛋白酶，所述Zn2+內(nèi)切蛋白酶通過切割SNARE蛋白封閉突觸的胞吐作用，見Couesnoη, 2006, Microbiology, 152,759。BoNT在肉毒中毒中引起可見的弛緩性肌肉麻痹，見Fischer2007, PNAS104, 10447。
[0004]盡管它具有毒性作用，肉毒毒素已經(jīng)用于很多疾病或病癥的治療劑。在1989年肉毒毒素血清型A在美國被批準(zhǔn)用于人的斜視、瞼痙攣和其他的病癥的治療。它可作為具有復(fù)合的蛋白質(zhì)的肉毒毒素A神經(jīng)毒素通過商業(yè)途徑得到，例如以商品名BOTOX (AllerganInc)或者商品名DYSPORT (Ipsen Ltd.)獲得。改進(jìn)的沒有復(fù)合體的神經(jīng)毒素A多肽制劑以商品名XEOMIN(Merz Pharmaceuticals LLC)獲得。肉毒毒素的效應(yīng)只是暫時(shí)的，這是需要肉毒毒素的重復(fù)施用以維持治療效果的原因。
[0005]梭菌神經(jīng)毒素減弱隨意肌強(qiáng)度并且是斜視、包括頸肌張力障礙的灶性張力障礙，以及良性特發(fā)性瞼痙攣的有效的治療劑。已經(jīng)進(jìn)一步地顯示梭菌神經(jīng)毒素減輕單側(cè)面部痙攣和局限性痙攣，并且，此外，其對多種其他的適應(yīng)癥如胃腸病癥、多汗以及美容除皺是有效的，見 Jost2007, Drugs67, 669。
[0006]然而，對于醫(yī)學(xué)病況或疾病如傷口愈合、骨的固定和腱斷裂治療、外科手術(shù)后固定，特別用于痔切除術(shù)、牙植入物的引入或者髖關(guān)節(jié)置換術(shù)(內(nèi)假體)、膝關(guān)節(jié)成形術(shù)、眼科手術(shù)、痤瘡、易激腸疾病、陰道痙攣、下背痛、或良性前列腺增生，減弱肌肉強(qiáng)度和收縮也是所希望的。神經(jīng)毒素通常在一段時(shí)間內(nèi)顯示它們的生物學(xué)效應(yīng)，所述一段時(shí)間比所述疾病或病況的有效治療實(shí)際需要的時(shí)間長。然而，在所述醫(yī)學(xué)病況或疾病的治療中延長的肌肉麻痹是有害的或者至少不是優(yōu)選的。然而，只在所希望的時(shí)間段內(nèi)顯示它們的生物學(xué)效應(yīng)的神經(jīng)毒素還不能得到。
[0007]因此，本發(fā)明的技術(shù)問題可以看作是提供滿足前述需要的工具和方法。通過權(quán)利要求和下文表征的實(shí)施方案解決了該技術(shù)問題。
[0008]因此，本發(fā)明涉及編碼神經(jīng)毒素多肽的多核苷酸，所述多肽在對象中顯示生物學(xué)效應(yīng)的減少的持續(xù)時(shí)間，其中所述多肽在輕鏈中包含至少一個(gè)E3連接酶識別基序，其中所述E3連接酶識別基序優(yōu)選地是E3連接酶MDM2的結(jié)合基序。如此修飾的多肽的生物學(xué)活性的減少的持續(xù)時(shí)間已經(jīng)由BoNT/E-MDM2示例。此外，通過輕鏈中的特定氨基酸殘基的定向誘變已經(jīng)進(jìn)一步優(yōu)化了所述神經(jīng)毒素多肽。為了這個(gè)目的，已經(jīng)通過三維結(jié)構(gòu)分析鑒定了位置與引入的E3連接酶識別基序空間上臨近的神經(jīng)毒素輕鏈中的暴露的氨基酸殘基。隨后，已經(jīng)用賴氨酸殘基替換了神經(jīng)毒素輕鏈中的鑒定的暴露的氨基酸殘基。這一優(yōu)化方法導(dǎo)致與未突變的BoNT/E-MDM2多肽相比，突變的BoNT/E_MDM2多肽的甚至更快的降解，如在以下實(shí)施例中所證明的。
[0009]因此，本發(fā)明的此類修飾的或突變的神經(jīng)毒素多肽對于需要神經(jīng)毒素的生物學(xué)效應(yīng)的短的或減少的持續(xù)時(shí)間的疾病的療法特別有用。
[0010]本文使用的術(shù)語“多核苷酸”指的是單鏈或雙鏈DNA分子以及RNA分子。所述術(shù)語涵蓋基因組DNA、cDNA、hnRNA、mRNA以及這些分子種類所有的天然存在的或者人工修飾的衍生物。一方面，該多核苷酸可以是線性或者環(huán)形分子。此外，除了編碼前述神經(jīng)毒素多肽的核酸序列，本發(fā)明的多核苷酸可以包含正確的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯需要的額外的序列，如5'或3' UTR序列。本發(fā)明的 多核苷酸編碼經(jīng)修飾的神經(jīng)毒素多肽，所述神經(jīng)毒素多肽可來源于肉毒神經(jīng)毒素的抗原性不同的血清型之一，即BoNT/A、BoNT/B、BoNT/Cl、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G或者破傷風(fēng)神經(jīng)毒素(TeNT)。在本發(fā)明的一方面，所述多核苷酸包含(在本發(fā)明的修飾，即用至少一個(gè)E3連接酶識別基序修飾輕鏈之前)如在SEQ ID NO:1 (BoNT/A)、SEQ ID N0:3(BoNT/B)、SEQ ID NO:5(BoNT/Cl)、SEQ ID NO:7(BoNT/D)、SEQ ID NO:9 或81(BoNT/E)、SEQ ID NO: 11 (BoNT/F)、SEQ ID NO: 13 (BoNT/G)或者 SEQ ID NO: 15 (TeNT)中所示的核酸序列。此外，在一方面涵蓋包含核酸序列的多核苷酸，所述核酸序列編碼(在本發(fā)明的修飾，即用至少一個(gè)E3連接酶識別基序修飾輕鏈之前)如在SEQ ID N0:2(BoNT/A)、SEQ ID N0:4(BoNT/B)、SEQ ID NO:6(BoNT/Cl)、SEQ ID NO:8(BoNT/D)、SEQ ID N0:10(BoNT/E)、SEQ ID NO: 12 (BoNT/F)、SEQ ID NO: 14 (BoNT/G)或 SEQ ID NO: 16 (TeNT)中的任一個(gè)所不的氨基酸序列。另一方面，所述多核苷酸是前述多核苷酸的變體，所述變體包含一個(gè)或者多個(gè)核苷酸替換、缺失和/或添加，在另一方面該變體仍可導(dǎo)致具有一個(gè)或者多個(gè)氨基酸的替換、缺失和/或添加的被編碼的氨基酸。此外，在另一方面，本發(fā)明的變體多核苷酸應(yīng)當(dāng)包含這樣的核酸序列變體，所述變體與如SEQ ID N0:l、3、5、7、9、81、ll、13或者15的任一個(gè)中所示的核酸序列具有至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%同一性，或者100%同一性，或者包含這樣的核酸序列變體，該核酸序列變體編碼的氨基酸序列與如SEQ ID勵(lì):2，4，6，8，10，82，12，14，或者16中的任一個(gè)顯示的氨基酸序列具有至少40%，至少50 %，至少60 %，至少70 %，至少75 %，至少80 %，至少85 %，至少90 %，至少95 %，至少96 %，至少97 %，至少98 %，至少99 %同一性，或者100 %同一性。在一個(gè)方面，每個(gè)前述變體多核苷酸編碼變體多肽，所述變體多肽保留一種或多種生物學(xué)性質(zhì)，并且在另一個(gè)方面，各個(gè)神經(jīng)毒素多肽即，BoNT/A, BoNT/B, BoNT/Cl, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G 或破傷風(fēng)神經(jīng)毒素(TeNT)的全部生物學(xué)性質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，僅在蛋白酶解激活后才維持全部生物學(xué)活性，盡管未經(jīng)加工的前體可能能夠產(chǎn)生一些生物學(xué)功能或部分有活性。術(shù)語“生物學(xué)性質(zhì)”如本文所用指(a)受體結(jié)合，(b)內(nèi)化，(C)跨內(nèi)體膜易位至細(xì)胞質(zhì)中，和/或(d)涉及突觸囊泡膜融合的蛋白質(zhì)的內(nèi)切蛋白酶解切割。在另外的方面，變體多核苷酸能夠編碼具有改善的或改變的生物學(xué)性質(zhì)的變體多肽，例如，它們可包含切割位點(diǎn)，所述切割位點(diǎn)關(guān)于酶識別進(jìn)行改善或可能關(guān)于受體結(jié)合或上文描述的任何其他性質(zhì)進(jìn)行改善。在另一個(gè)方面，變體多核苷酸應(yīng)當(dāng)編碼這樣的融合神經(jīng)毒素多肽，所述融合神經(jīng)毒素多肽包含不同血清型的至少兩種神經(jīng)毒素多肽的一部分,例如包含BoNT/A的重鏈和BoNT/E的輕鏈或BoNT/E的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和BoNT/A的易位結(jié)構(gòu)域和輕鏈的融合神經(jīng)毒素。
[0011]此處使用的術(shù)語“同一性”指的是序列同一性，其如下表征:確定兩種核酸序列或者氨基酸序列之間相同的氨基酸數(shù)目，其中所述序列被比對以取得最高階匹配。使用計(jì)算機(jī)程序中編碼的公開的技術(shù)或方法例如BLASTP，BLASTN或FASTA(Altschul 1990，JMol Biol215，403)可以計(jì)算序列同一性。一方面，在完整氨基酸序列上計(jì)算百分比同一性值。技術(shù)人員可得到用于比較不同序列的基于多種算法的一系列程序。在本上下文中，Needleman和Wunsch或者Smith和Waterman的算法提供特別可信的結(jié)果。可以使用程序 PileUp (Higginsl989, CAB10S5, 151)或者程序 Gap 和 BestFit (Needlemanl970, J MolBiol48 ；443 ；Smithl981, Adv Appl Math2, 482)進(jìn)行序列比對，所述程序是GCG軟件包(Genetics Computer Groupl991, 575Science Drive, Madison, Wisconsin, USA53711)的一部分。在本發(fā)明的另一方面，在完整序列區(qū)使用程序GAP確定上文所述的序列同一性值(以百分比(％)表示)，使用以下設(shè)定:空位權(quán)重:50，長度權(quán)重:3，平均匹配:10.000和平均錯(cuò)配:0.000,除非另外特別指出，該設(shè)定將一直用作序列比對的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定。
[0012]術(shù)語神經(jīng)毒素的“活性”、“功能”、“生物學(xué)活性”、“生物學(xué)功能”、或“生物學(xué)效應(yīng)”如本文所用表示每單位時(shí)間抑制的來自細(xì)胞的細(xì)胞胞吐作用(例如來自靶細(xì)胞(例如神經(jīng)元)的神經(jīng)遞質(zhì)(例如乙酰膽堿)的胞吐作用)的量。更具體地，其指表現(xiàn)出(a)受體結(jié)合，(b)內(nèi)化，(c)跨內(nèi)體膜易位至細(xì)胞質(zhì)中，和/或(d)涉及突觸囊泡膜融合的蛋白質(zhì)的內(nèi)切蛋白酶解切割成熟的雙鏈神經(jīng)毒素多肽的生物學(xué)活性。術(shù)語“在對象中(神經(jīng)毒素的)生物學(xué)效應(yīng)的持續(xù)時(shí)間”如本文所用意為在已經(jīng)應(yīng)用了神經(jīng)毒素的對象中神經(jīng)毒素的生物學(xué)活性的時(shí)期。用于評估生物學(xué)活性的體內(nèi)測定法包括Pearce等人(Pearcel994, ToxicolAppl Pharmacol 128:69-77)和 Dressier 等人(Dressler2005, Mov Disord20:1617-1619，Keller2006，Neurosciencel39:629-637)描述的小鼠LD50測定法和離體小鼠半隔膜測定法。也能夠通過例如如Whitemarsh等人所描述的基于細(xì)胞的測定法評估生物學(xué)活性(Whitemarsh 等人.2012，Toxicol.Sc1.126:426-435)。生物學(xué)活性通常用小鼠單位(MU)表示。此處使用的IMU是在腹膜內(nèi)注射后殺死指定的小鼠群體的50%的神經(jīng)毒素組分的量，即小鼠1.p.LD50。術(shù)語“對象”如本文所用意為哺乳動物，優(yōu)選是人。
[0013]此外，還包含可 檢測的標(biāo)記物肽或標(biāo)簽的融合多肽涵蓋在由于輕鏈中的至少一個(gè)E3連接酶識別基序在對象中表現(xiàn)出生物學(xué)效應(yīng)的減少的持續(xù)時(shí)間的本發(fā)明的神經(jīng)毒素多肽的其他方面中。在一個(gè)方面中，適合的標(biāo)簽是FLAG-標(biāo)簽，Myc-標(biāo)簽，His-標(biāo)簽，HA-標(biāo)簽或GST-標(biāo)簽，所述標(biāo)簽也允許帶標(biāo)簽的多肽的更有效率的純化。在一個(gè)方面，可檢測的標(biāo)記物肽包括熒光蛋白如GFP，BFP, YFP等等。在一些方面，所述融合多肽可以包含額外的多肽結(jié)構(gòu)域。例如，本發(fā)明的神經(jīng)毒素多肽可以包含這樣的肽結(jié)構(gòu)域，其介導(dǎo)細(xì)胞穿透以接近神經(jīng)毒素輕鏈的作用位點(diǎn)，即神經(jīng)元靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。為此目的，例如可以使用聚精氨酸肽用于與本發(fā)明的神經(jīng)毒素多肽融合，這是本領(lǐng)域普遍知曉的。 [0014]本發(fā)明的(由多核苷酸編碼的)神經(jīng)毒素多肽在其輕鏈中還包含至少一個(gè)E3連接酶識別基序。如本文別處更加詳細(xì)描述的以及如以下實(shí)施例中所展示的，可以通過向輕鏈中摻入至少一個(gè)E3連接酶識別基序或向輕鏈的N或C端添加至少一個(gè)E3連接酶識別基序影響，即改變，對象中神經(jīng)毒素的生物學(xué)效應(yīng)的持續(xù)時(shí)間。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明的神經(jīng)毒素在輕鏈中包含至少一種內(nèi)部或末端引入的E3連接酶識別基序。此類修飾導(dǎo)致與不包含E3連接酶識別基序的神經(jīng)毒素相比，本發(fā)明的神經(jīng)毒素在對象中的生物學(xué)效應(yīng)的減少的持續(xù)時(shí)間。在本發(fā)明的一個(gè)方面，由本發(fā)明的多核苷酸編碼的神經(jīng)毒素多肽的所述輕鏈通過輕鏈的修飾得到，所述輕鏈由包含前述特定的核酸序列或者上文描述的它們的變體中的任一個(gè)的多核苷酸編碼。如上所述并且是本領(lǐng)域所普遍知曉的，通過前體多肽的蛋白酶解切割產(chǎn)生神經(jīng)毒素多肽的輕鏈。該輕鏈?zhǔn)乔绑w多肽的N端部分，所述N端部分由于所述蛋白酶解切割得到。一方面，可以從表1中指出的野生型神經(jīng)毒素的切割位點(diǎn)推導(dǎo)上文涉及的神經(jīng)毒素多肽輕鏈的氨基酸序列。在重組神經(jīng)毒素中，在形成重鏈和輕鏈之間的二硫橋的兩個(gè)半胱氨酸之間的序列中，優(yōu)選地在本文別處定義的接頭中，引入切割位點(diǎn)(例如凝血酶切割位點(diǎn)或腸激酶切割位點(diǎn))。
[0015]表1:神經(jīng)毒素和可以用來形成活性雙鏈分子的切割位點(diǎn)
[0016]
【權(quán)利要求】
1.編碼神經(jīng)毒素多肽的多核苷酸，所述神經(jīng)毒素多肽在對象中顯示出生物學(xué)效應(yīng)的減少的持續(xù)時(shí)間，其中所述多肽在輕鏈中包含至少一個(gè)E3連接酶識別基序，其中所述E3連接酶識別基序是E3連接酶MDM2的結(jié)合基序。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中E3連接酶MDM2的所述結(jié)合基序選自由ETFSDLffKLLPE(SEQ ID NO:26), TSFAEYffNLLSP(SEQ ID NO:27), LTFEHYffAQLTS(SEQ IDNO:28), LTFEHWffAQLTS(SEQ ID NO:29), LTFEHSffAQLTS(SEQ ID NO:30), ETFEHNWAQLTS(SEQID NO:3 I) , LTFEHNffAQLTS(SEQ ID NO:3 2) , LTFEHffffASLTS(SEQ IDNO:33), LTFEHWffSSLTS(SEQ ID NO:34),LTFTHWffAQLTS(SEQ ID NO:35), ETFEHWffAQLTS(SEQID NO:36) , LTFEHffffSQLTS(SEQ ID NO: 3 7), LTFEHffffAQLLS (SEQ IDNO:38), ETFEHWffSQLLS(SEQ ID NO:39), RFMDYffEGL(SEQ ID NO:40), MPRFMDYffEGLN(SEQ IDNO:41), SQETFSDLffKLLPEN(SEQ ID NO:42)和/或LTFEHNWAQLEN(SEQ ID NO:78)組成的組。
3.權(quán)利要求1或2的多核苷酸，其中所述生物學(xué)效應(yīng)導(dǎo)致對象中的肌肉麻痹。
4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的多核苷酸，其中所述減少的持續(xù)時(shí)間在對象中，優(yōu)選人中，保持少于5,4,3,2周或少于I周。
5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的多核苷酸，其中多肽的輕鏈通過修飾由包含核酸序列的多核苷酸編碼的輕鏈得到，所述核酸序列選自由以下組成的組: a)具有如SEQID ΝΟ:1、3、5、7、9、81、11、13或者15中顯示的核苷酸序列的核酸序列； b)編碼具有如SEQID N0:2、4、6、8、10、82、12、14或者16中顯示的氨基酸序列的多肽的核酸序列；和 c)與a)或b)的核酸序列有至少40%同一性的核酸序列。
6.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的多核苷酸,其中所述多核苷酸包含核酸序列,所述核酸序列選自由以下組成的組: a)具有如SEQID NO:51或79中所示的核苷酸序列的核酸序列； b)編碼具有如SEQID NO:52或80中所示的氨基酸序列的多肽的核酸序列；和 c)與a)或b)的核酸序列具有至少40%同一性的核酸序列。
7.載體，其包含權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的多核苷酸。
8.宿主細(xì)胞,其包含權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的多核苷酸或者權(quán)利要求7的載體。
9.權(quán)利要求8的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞或者梭菌屬或者芽孢桿菌屬細(xì)胞。
10.由權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的多核苷酸編碼的多肽。
11.權(quán)利要求10的多肽，還包含在神經(jīng)毒素多肽的輕鏈中用賴氨酸替換至少一個(gè)氨基酸。
12.權(quán)利要求10或11的多肽，其包含選自由Q53K、N72K、N378K、N379K、R394K和T400K組成的組的氨基酸替換中的至少一種。
13.抗體，其與權(quán)利要求10至12中任一項(xiàng)的多肽特異性結(jié)合。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的多核苷酸，其用作藥物。
15.根據(jù)權(quán)利要求10至12中任一項(xiàng)的多肽，其用作藥物。
16.權(quán)利要求14的多核苷酸或權(quán)利要求15的多肽，其中藥物用于治療傷口愈合、骨的固定和腱斷裂治療、外科手術(shù)后固定，特別用于痔切除術(shù)、牙移植物的引入、或髖關(guān)節(jié)置換術(shù)(內(nèi)假體)、上髁炎、膝關(guān)節(jié)成形術(shù)、眼科手術(shù)、痤瘡、易激腸疾病、陰道痙攣、下背疼、或良性前列腺增生。
17.制備由權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的多核苷酸編碼的神經(jīng)毒素多肽的方法，所述方法包括以下步驟: a)在允許由權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的多核苷酸編碼的神經(jīng)毒素多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求8或9的宿主細(xì)胞，并且 b)從a)的宿主細(xì)胞中得到由權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的多核苷酸編碼的神經(jīng)毒素多肽。
18.制備藥物的方法，所述方法包括權(quán)利要求17的方法的步驟和將由權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的多核苷酸編碼的神經(jīng)毒素多肽配制為藥物的另外的步驟。
【文檔編號】C07K14/435GK103974973SQ201280055116
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2012年11月8日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月9日
【發(fā)明者】M·施密特, J·弗雷韋特, F·霍夫曼, G·格勒爾 申請人:莫茨制藥有限及兩合公司