對人ox40具有特異性的抗體分子的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及對人OX40的抗原決定簇具有特異性的抗體分子、這些抗體分子的治療用途以及用于產(chǎn)生所述抗體分子的方法。
【專利說明】對人0X40具有特異性的抗體分子
[0001] 本發(fā)明涉及對0X40的抗原決定簇具有特異性的抗體分子和包括其的組合物。本發(fā)明還涉及這些抗體分子、組合物的治療用途以及制造所述抗體分子的方法。
[0002]0X40 (也稱為CD134、TNFRSF4、ACT35或TXGP1L)是TNF受體超家族的一名成員，該超家族包括4-1BB、⑶27、⑶30以及⑶40。0X40的胞外配體結(jié)合域由3個完全的半胱氨酸富集域(CRD)和第四個C端不完全CRD組成(博德默(Bodmer)等人，2002，《生物化學(xué)科學(xué)趨勢》(Trends Biochem Sci), 27, 19-26)。
[0003]0X40的配體為0X40L并且3個拷貝的0X40結(jié)合于三聚體配體以形成0X40-0X40L 復(fù)合體(孔龐(Compaan)和希莫威茨(Hymowitz), 2006,《結(jié)構(gòu)》(Structure),14，1321-1330)。0X40是膜結(jié)合受體；然而也已檢測到可溶的同種型(泰勒(Taylor)和施瓦茲(Schwarz), 2001,《免疫學(xué)方法雜志》(J.1mmunol.Methods), 255，67-72)?？扇苄问降墓δ芤饬x目前未知。0X40并不表達于靜息T細胞上，但與T細胞受體(TCR)連接后瞬時表達于活化T細胞上。0X40的配體0X40L是TNF家族的一名成員并且表達于活化的抗原呈遞細胞(APC)，包括B細胞、巨噬細胞、內(nèi)皮細胞以及樹突狀細胞(DC)上。
[0004]0X40是主要的共刺激受體，其中⑶28與0X40的依序銜接為最佳的T細胞增殖和存活所必需。0X40在活化T細胞上的連接導(dǎo)致增強的細胞因子產(chǎn)生以及⑶4+和⑶8+T細胞兩者的增殖(格拉馬利亞(Gramaglia)等人，2000，《免疫學(xué)雜志》(J.1mmunol),165, 3043-3050,邦薩爾_帕卡拉(Bansal-Pakala)等人，2004，《免疫學(xué)雜志》，172，4821-425)并且可以有利于正在進行的Thl和Th2應(yīng)答兩者(格拉馬利亞等人，1998，《免疫學(xué)雜志》，161，6510-6517，阿里斯蒂德斯(Arestides)等人，2002，《歐洲免疫學(xué)雜志》(Eur.J.1mmunol.) 32，2874-2880)。0X40共刺激使T細胞的存活延長到超過免疫應(yīng)答的初始效應(yīng)期并且通過抑制效應(yīng)T細胞的死亡而增加記憶T細胞的數(shù)目。
[0005]當(dāng)免疫激活過度或不受控制時，可能發(fā)生病理性過敏、哮喘、炎癥、自體免疫以及其他相關(guān)疾病。由于0X40對增強免疫應(yīng)答有作用，故它可以加重自體免疫和炎性疾病。
[0006]0X40/0X40L相互作用在疾病模型中的作用已在0X40基因敲除小鼠中被證實。在實驗性過敏性腦脊髓炎(EAE ;—種多發(fā)性硬化的模型)中，在0X40基因敲除小鼠中注意到CNS內(nèi)較不嚴重的疾病臨床體征和減少的炎性浸潤(卡爾博尼(Carboni)等人，2003，《神經(jīng)免疫學(xué)雜志》(J.Neuroimmunology), 145，1-11)。同時用卵白蛋白初免并且激發(fā)的0X40基因敲除小鼠表現(xiàn)出肺部炎癥的減少(嗜酸粒細胞增多方面減少80% -90% )、粘液產(chǎn)生減少以及明顯減弱的氣道高反應(yīng)性(金貝爾(Jember)等人)，2001，《實驗醫(yī)學(xué)雜志》(J.Exp.Med.)，193，387-392)。鼠0X40配體的單克隆抗體已在以下中顯示出有益作用:類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型(吉岡(Yoshioka)等人，2000，《歐洲免疫學(xué)雜志》，30，2815-2823)、EAE (野原(Nohara)等人，2001，《免疫學(xué)雜志》，166，2108-2115)、非肥胖糖尿病(NOD)小鼠(帕卡拉等人，2004，《歐洲免疫學(xué)雜志》，34，3039-3046)、T細胞重建小鼠的結(jié)腸炎(馬爾姆斯特倫(Malmstrom)等人，2001，《免疫學(xué)雜志》，166，6972-6981，戶冢(Totsuka)等人,2003,《美國生理學(xué)雜志-胃腸與肝臟生理學(xué)》(Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.), 284，G595-G603)以及肺部炎癥的模型(薩拉克-阿爾達卡尼(Salek-Ardakani)等人,2003,《實驗醫(yī)學(xué)雜志》，198，315-324,星野(Hoshino)等人，2003，《歐洲免疫學(xué)雜志》，33，861-869)。人0X40L的抗體已在恒河猴肺部炎癥的模型中描述并且導(dǎo)致過敏原激發(fā)后的細支氣管灌洗液中IL-5、IL-13以及效應(yīng)記憶T細胞的水平減少(賽沙賽耶(Seshasayee)等人，2007，《臨床研究雜志》(J.Clin.1nvest), 117，3868-3878)。
[0007]已在數(shù)種自體免疫和炎性疾病中注意到0X40表達的增加。這包括從類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑液分離的T細胞上0X40表達的增加(布魯尼奧尼D(Brugnoni D)等人，1998，《風(fēng)濕病學(xué)雜志》(Br.J.Rheum.),37, 584-585 ;吉岡等人，2000，《歐洲免疫學(xué)雜志》，30，2815-2823 ;賈科梅利R(GiacomelIi R)等人，2001，《臨床與實驗風(fēng)濕病學(xué)》(Clin.Exp.Rheumatol.)，19，317-320)。類似地，在患有潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩氏病的患者的胃腸組織中(索薩(Souza)等人，1999，《消化道》(Gut)，45，856-863 ;施圖貝爾(Stuber)等人，2000，《歐洲臨床研究雜志》(Eur.J.Clin.1nvest.)，30, 594-599)和患有多發(fā)性硬化的患者的活動病灶(卡爾博尼等人，2003，《神經(jīng)免疫學(xué)雜志》，145，1-11)中已注意到0X40表達的增加。人氣道平滑肌(ASM)上也可以檢測到0X40L并且哮喘患者ASM細胞顯示出比健康供體對0X40L連接更強的炎性應(yīng)答，指示哮喘中0X40/0X40L通路的作用(伯吉斯(Burgess)等人,2004,《過敏和臨床免疫雜志》(J.Allergy Clin Immunol.), 113，683-689 ;伯吉斯等人，2005，《過敏和臨床免疫雜志》，115，302-308)。還已報導(dǎo)從系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者的外周血液分離的CD4+T細胞表達的0X40水平升高，這種升高與疾病活動度相關(guān)(帕琴(Patschan)等人,2006,《臨床與實驗免疫學(xué)》(Clin.Exp.Tmmunol.)，145, 235-242)。
[0008]鑒于0X40在過敏、哮喘以及與自體免疫和炎癥相關(guān)的疾病中的作用，一種治療這些疾病的方法是通過使用抗0X40L抗體或拮抗性抗0X40抗體阻斷0X40-0X40L信號傳導(dǎo)。
[0009]抗0X40L抗體已被描述于參見例如W02006/029879。已描述許多激動性抗0X40抗體，但非常少拮抗 抗0X40抗體是已知的。兔多克隆抗小鼠0X40抗體由施圖貝爾等人，1996，《實驗醫(yī)學(xué)雜志》，183，979-989制造，該抗體阻斷了 0X40與0X40L之間的相互作用。結(jié)合人0X40的小鼠單克隆抗體131和315由伊穆拉(Imura)等人，1996，《實驗醫(yī)學(xué)雜志》，2185-2195 產(chǎn)生。
[0010]完整的人拮抗性抗體已被描述于W02007/062245，這些抗體的最高親和力對細胞表面表達的0X40 (活化T細胞)具有IlnM的親和力。
[0011]人源化的拮抗性抗體已被描述于W02008/106116并且對0X40具有最佳親和力的抗體具有0.94nM的親和力。
[0012]已描述了其他抗0X40抗體，包括鼠L106(美國專利號6，277，962)和鼠ACT35，可商購自電子生物科學(xué)公司(eBioscience)。
[0013]我們先前已在國際專利申請?zhí)朩02010/096418中描述了高親和力拮抗性抗0X40抗體。
[0014]我們先前也已在國際專利申請?zhí)朩02010/035012中描述了一種新穎的多特異性抗體融合分子(下文稱作Fab-dsFv且在此示出于圖1中)。同一申請?zhí)峁┝丝梢杂糜谘娱L該分子半衰期的有用的抗白蛋白結(jié)合可變區(qū)。
[0015]在本發(fā)明中，這些白蛋白結(jié)合可變區(qū)已經(jīng)改進并且以Fab-dsFv形式與W02010/096418中描述的抗0X40抗體組合。本發(fā)明的新的雙特異性分子在與先前描述于W02010/096418中的Fab’ -PEG分子相比時在許多在此描述的體外和體內(nèi)分析中具有改進的功效。因此，本發(fā)明提供了一種結(jié)合人0X40和人血清白蛋白兩者的雙特異性抗體融合蛋白，它適用于治療或防治由0X40介導(dǎo)或與0X40水平提高相關(guān)的病理性病癥。
[0016]附圖簡述
[0017]圖1示出了本發(fā)明的一種雙特異性抗體融合體(Fab-dsFv形式)。
[0018]圖2-8示出了與根據(jù)本披露的一種抗體有關(guān)的某些氨基酸或DNA序列。
[0019]圖9a 不出了 AlexaFluor488 標記的 A26Fab_dsFv 與活化的人 CD4+0X40+T 細胞的
結(jié)合?
[0020]圖9b示出了在5 % HSA存在下在活化的人CD4+、0X40+T細胞上的A26Fab’、A26Fab-Fv 以及 A26Fab’ -PEG 的結(jié)合。
[0021]圖1Oa示出了 A26Fab_dsFv對來自暴露于屋塵螨過敏性提取物的PBMC的細胞因子產(chǎn)生的作用。
[0022]圖1Ob示出了 A26Fab_dsFv在Hu-NSG小鼠模型中抑制CD4+和CD8+T細胞增殖的能力。
[0023]圖1la示出了 A26Fab_dsFv對0X40L結(jié)合于人活化的CD4+0X40+T細胞的抑制。
[0024]圖1lb 示出了 A26Fab’、A26Fab_dsFv、A26Fab’ -PEG 以及兩種對照對 0X40L 結(jié)合于人活化的⑶4+0X40+T細胞的抑制。 [0025]圖12a示出了 A26Fab_Fv抑制人混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)。
[0026]圖12b示出了 A26Fab_Fv在人MLR的過程中抑制IFN- Y產(chǎn)生。
[0027]圖13示出了在使用屋塵螨過敏原提取物進行二級抗原再刺激之后A26Fab_Fv減小活化的(⑶25+)⑶4+T細胞的百分比。
[0028]圖14示出了在細胞轉(zhuǎn)移之前投與的Fab-Fv和Fab-PEG在Hu-NSG模型中劑量依賴性地抑制⑶4+和⑶8+T細胞增殖。
[0029]人源化CA044_00026抗0X40抗體在此稱為A26。
[0030]本發(fā)明的抗體融合分子(在此稱為Fab-dsFv)在圖1中示出。在本發(fā)明中，F(xiàn)ab部分(包括第一重鏈和輕鏈可變區(qū)和恒定域)結(jié)合人0X40，并且dsFv部分(包括第二重鏈和輕鏈可變區(qū)，由二硫鍵連接)結(jié)合人血清白蛋白。具體來說，F(xiàn)ab部分包括來源于拮抗性抗0X40抗體的⑶R，并且Fv部分包括人源化抗白蛋白抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)，并且這些白蛋白結(jié)合可變區(qū)是由二硫鍵連接的。
[0031]因此，本發(fā)明提供了一種結(jié)合人0X40和人血清白蛋白的雙特異性抗體融合蛋白，包括:
[0032]重鏈，該重鏈從N端依序包括第一重鏈可變域(VhI)、CHl域以及第二重鏈可變域(Vh2)，
[0033]輕鏈，該輕鏈從N端依序包括第一輕鏈可變域('I)、CL域以及第二輕鏈可變域(Vl2),
[0034]其中所述重鏈和所述輕鏈被對齊，使得VhI和'I形成一個第一抗原結(jié)合位點并且Vh2和\2形成一個第二抗原結(jié)合位點，
[0035]其中由該第一抗原結(jié)合位點結(jié)合的抗原是人0X40，并且由該第二抗原結(jié)合位點結(jié)合的抗原是人血清白蛋白，具體來說
[0036]其中該重鏈的第一可變域(VhI)包括針對⑶R-Hl在SEQ ID NO:1中給出的序列、針對CDR-H2在SEQ ID NO: 2中給出的序列以及針對CDR-H3在SEQ ID NO: 3中給出的序列，并且該輕鏈的第一可變域('I)包括針對⑶R-Ll在SEQ ID NO:4中給出的序列、針對CDR-L2在SEQ ID NO:5中給出的序列以及針對CDR-L3在SEQ ID NO:6中給出的序列，
[0037]其中該第二重鏈可變域(Vh2)具有在SEQ ID NOill中給出的序列，并且該第二輕鏈可變域(八2)具有在SEQ ID NO: 12中給出的序列，并且
[0038]該第二重鏈可變域(Vh2)和該第二輕鏈可變域('2)是由二硫鍵連接的。
[0039]抗體可變域中的殘基常規(guī)地根據(jù)由卡巴特(Kabat)等人設(shè)計的系統(tǒng)編號。這一系統(tǒng)闡述于卡巴特等人，1987,《免疫感興趣的蛋白序列》(Sequences of Proteins ofImmunological Interest),美國衛(wèi)生和公共服務(wù)部(US Department of Health and HumanServices)，NIH，美國(此后“卡巴特等人(見上文))中。除非另外指明時，否則將這一編號系統(tǒng)用于本說明書。
[0040]卡巴特Kabat殘基命名并不總是直接與氨基酸殘基的線性編號對應(yīng)。無論是框架還是互補決定區(qū)(CDR)，實際的線性氨基酸序列可能比嚴格的Kabat編號包含更少或另外的氨基酸，對應(yīng)于縮短或插入基本可變域結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)組分。對于給定的抗體，殘基的正確卡巴特編號可以通過比對抗體序列與“標準”卡巴特編號序列的同源性殘基來確定。
[0041]重鏈可變域的⑶R根據(jù)卡巴特編號系統(tǒng)位于殘基31-35 (OTR-Hl)、殘基50-65 (CDR-H2)以及殘基 95-102 (CDR-H3)。然而，根據(jù) Chothia(喬西亞 C.(Chothia, C.)和萊斯克 A.M.(Lesk, A.M.)《分子生物學(xué)雜志》(J.Mol.Biol.)，196，901-917 (1987))，等同于⑶R-Hl的環(huán)從殘基26延伸到殘基32。因此除非另外指明，否則如在此采用的‘⑶R-H1’是打算指殘基26到35，如利用卡巴特編號系統(tǒng)和喬西亞的拓撲環(huán)定義的組合所述。 [0042]輕鏈可變域的⑶R根據(jù)卡巴特編號系統(tǒng)位于殘基24-34(⑶R-L1)、殘基50-56 (CDR-L2)以及殘基 89-97 (CDR-L3)。
[0043]本發(fā)明的雙特異性融合蛋白包括先前描述于W02010/096418中的抗0X40拮抗性抗體的Fab片段。如在此所使用，術(shù)語‘拮抗性’描述了一種抗體融合蛋白，它能夠抑制和/或中和0X40的生物信號傳導(dǎo)活性，例如通過阻斷或?qū)嵸|(zhì)上減少0X40與0X40配體的結(jié)合，并且由此抑制0X40的活化。
[0044]對抗體進行篩選以鑒別結(jié)合0X40的抗體可以使用測量對人0X40的結(jié)合的分析和/或測量阻斷0X40與其配體0X40L的結(jié)合的能力的分析執(zhí)行。結(jié)合分析的一個實例是ELISA，具體來說，它使用被固定在板上的人0X40和人Fe的融合蛋白，并且采用一種結(jié)合的二級抗體以檢測結(jié)合于融合蛋白的抗0X40抗體。阻斷分析的一個實例是一種基于流式細胞術(shù)的分析，它測量0X40配體融合蛋白結(jié)合于人CD4細胞上的0X40的阻斷。一種熒光標記的二級抗體被用于檢測結(jié)合于細胞的0X40配體融合蛋白的量。這一分析是尋找由于上清液中的抗體阻斷了配體融合蛋白與0X40的結(jié)合而減小的信號。阻斷分析的另一個實例是以下分析:其中通過測量氚化胸苷摻入，來測量對由涂布到板上的0X40配體融合蛋白所介導(dǎo)的天然人T細胞共刺激的阻斷。
[0045]在本發(fā)明中，可變區(qū)是人源化的。人源化抗體(它們包括CDR移植抗體)是具有一個或多個來自非人物種的互補決定區(qū)(CDR)和來自人免疫球蛋白分子的框架區(qū)的抗體分子(參見例如US5，585，089 ；W091/09967)。應(yīng)了解，唯一可能必需的是轉(zhuǎn)移這些⑶R的特異性決定殘基而非整個CDR (參見例如克什米爾(Kashmiri)等人，2005，《方法》(Methods)，36，25-34)。人源化抗體可以任選地進一步包括一個或多個來源于⑶R所來源的非人物種的框架殘基。
[0046]在本發(fā)明中，VhI和VlI的CDR是來源于W02010/096418中所述的稱為A26的抗體。因此，在本發(fā)明的雙特異性抗體融合蛋白中，重鏈的第一可變域(VhI)包括針對⑶R-Hl在SEQ ID NO:1中給出的序列、針對CDR-H2在SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 23中給出的序列以及針對⑶R-H3在SEQ ID NO:3中給出的序列，并且輕鏈的第一可變域(八I)包括針對CDR-Ll 在 SEQ ID N0:4 或 SEQ ID NO:24 中給出的序列、針對 CDR-L2 在 SEQ ID N0:5 中給出的序列以及針對⑶R-L3在SEQ ID NO: 6中給出的序列。
[0047]應(yīng)了解，可以對由本發(fā)明提供的CDR作出一個或多個氨基酸取代、添加和/或缺失而不顯著改變抗體結(jié)合到0X40以及中和0X40活性的能力。任何氨基酸取代、添加和/或缺失的作用可以輕易地由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員測試，例如通過使用W02010/096418中所述的方法進行，從而測定0X40結(jié)合和對0X40/0X40L相互作用的抑制。因此，本發(fā)明提供了一種對人0X40具有特異性的雙特異性抗體，它包括⑶RH-1 (SEQ ID NO:1),⑶RH_2 (SEQID N0:2)、CDRH-3(SEQ ID NO: 3)、CDRL-1 (SEQ ID NO: 4)、CDRL-2 (SEQ ID NO:5)以及⑶RL-3(SEQ ID N0:6)，如圖2(c)中所示，例如在該雙特異性抗體中，這些⑶R中的一者或多者中的一個或多個氨基酸(例如I或2個氨基酸)已被另一個氨基酸(如在此下文所定義的一個類似氨基酸)取代。[0048]在一個實施例中，本發(fā)明的雙特異性抗體融合蛋白包括重鏈，其中該重鏈的第一可變域包括三個⑶R，其中⑶RH-1的序列與在SEQ ID NO:1中給出的序列具有至少90%一致性或相似性，⑶RH-2與在SEQ ID NO:2中給出的序列具有至少90% —致性或相似性和/或⑶RH-3與在SEQ ID NO:3中給出的序列具有至少90%—致性或相似性。在另一個實施例中，本發(fā)明的雙特異性抗體融合蛋白包括重鏈，其中該重鏈的可變域包括三個CDR，其中⑶RH-1的序列與在SEQ ID NO:1中給出的序列具有至少95%或98%—致性或相似性，⑶RH-2與在SEQ ID NO:2中給出的序列具有至少95%或98%—致性或相似性和/或⑶RH-3與在SEQ ID NO:3中給出的序列具有至少95%或98%—致性或相似性。
[0049]如在此所使用的“一致性”指示在所比對序列中的任何特定位置，序列之間的氨基酸殘基是相同的。如在此所使用的“相似性”指示在所比對序列中的任何特定位置，序列之間的氨基酸殘基具有相似的類型。舉例來說，亮氨酸可以被異亮氨酸或纈氨酸取代。其他可以經(jīng)常彼此取代的氨基酸包括(但不限于):
[0050]-苯丙氨酸、酪氨酸以及色氨酸(具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸)；
[0051]-賴氨酸、精氨酸以及組氨酸(具有堿性側(cè)鏈的氨基酸)；
[0052]-天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性側(cè)鏈的氨基酸)；
[0053]-天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺側(cè)鏈的氨基酸)；以及
[0054]-半胱氨酸和蛋氨酸(具有含硫側(cè)鏈的氨基酸)?？梢匀菀椎赜嬎愠鲆恢滦院拖嗨菩缘某潭?《計算分子生物學(xué)》(Computational Molecular Biology),萊斯克A.Μ.編，牛津大學(xué)出版社(Oxford University Press),紐約，1988 ;《生物計算:信息學(xué)和基因組計劃》(Biocomputing.1nformatics and Genome Pro jects),史密斯 D.W.(Smith, D.ff.)編，學(xué)術(shù)出版社(Academic Press),紐約，1993 ;《序列數(shù)據(jù)的計算機分析》(Computer Analysisof Sequence Data),第 I 部分，格里芬 A.M.(Griffin, A.Μ.)和格里芬 H.G.(Griffin, H.G.)編，胡馬納出版社(Humana Press),新澤西，1994 ;《分子生物學(xué)中的序列分析》(Sequence Analysis in Molecular Biology),馮海因耶 G.(von Heinje, G.),學(xué)術(shù)出版社，1987,《序列分析引物》(Sequence Analysis Primer),格里布斯科夫 M.(Gribskov, Μ.)和德弗羅J.(Devereux, J.)編，M斯多克頓出版社(M Stockton Press),紐約，1991,可獲得自NCBI的BLAST?軟件(阿特休爾S.F.(Altschul, S.F.)等人，1990，《分子生物學(xué)雜志》215:403-410 ;吉什 W.(Gish, W.)和斯特絲 D.J.(States, D.J.) 1993，《自然-遺傳學(xué)》(Nature Genet.) 3:266-272。麥頓 T.L.(Madden, T.L.)等人，1996，《酶學(xué)方法》(Meth.Enzymol.) 266:131-141 ;阿特休爾S.F.等人，1997,《核酸研究》(NucleicAcids Res.)25:3389-3402 ;張 J.(Zhang, J.)和麥頓 T.L.1997，《基因組研究》(GenomeRes.)7:649-656)。
[0055]在另一個實施例中，本發(fā)明的雙特異性抗體融合蛋白包括輕鏈，其中該輕鏈的第一可變域包括三個⑶R，其中⑶RL-1的序列與在SEQ ID N0:4中給出的序列具有至少90%一致性或相似性，⑶RH-2與在SEQ ID NO:5中給出的序列具有至少90% —致性或相似性和/或⑶RH-3與在SEQ ID NO:6中給出的序列具有至少90%—致性或相似性。在另一個實施例中，本發(fā)明的雙特異性抗體融合蛋白包括輕鏈，其中該輕鏈的第一可變域包括三個⑶R，其中⑶RL-1的序列與在SEQ ID NO: 4中給出的序列具有至少95%或98%—致性或相似性，⑶RL-2與在SEQ ID NO:5中給出的序列具有至少95%或98%—致性或相似性和/或⑶RL-3與在SEQ ID NO:6中給出的序列具有至少95%或98%—致性或相似性。
[0056]在一個實施例中，由本發(fā)明提供的雙特異性抗體融合蛋白的Fab部分是人源化或CDR移植抗體分子，其包括SEQ ID N0:l、2、3、4、5和/或6(圖2(c))中提供的CDR中的一者或多者或其變體。如在此所使用，術(shù)語‘CDR移植抗體分子’是指以下抗體分子，其中重鏈和/或輕鏈包含一個或多個來自供體抗體(例如鼠單克隆抗體)的CDR(如果希望的話，包括一個或多個修飾的CDR)，這一個或多個CDR被移植到接受體抗體(例如人抗體)的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)框架。關(guān)于綜述，參見沃恩(Vaughan)等人，《自然_生物技術(shù)》(NatureBiotechnology) ,16, 535-539, 1998。在一個實施例中，并非轉(zhuǎn)移整個⑶R，而是僅將來自上文在此所述的任何一個CDR的一個或多個特異性決定殘基轉(zhuǎn)移到人抗體框架(參見例如克什米爾等人，2005，《方法》，36，25-34)。在一個實施例中，僅將來自上文在此所述的一個或多個CDR的特異性決定殘基轉(zhuǎn)移到人抗體框架。在另一個實施例中，僅將來自上文在此所述的每個CDR的特異性決定殘基轉(zhuǎn)移到人抗體框架。
[0057]當(dāng)CDR或特異性決定殘基被移植時，可以顧及這些CDR所來源的供體抗體的種類/類型使用任何適當(dāng)接受體可變區(qū)框架序列，包括小鼠、靈長類動物以及人框架區(qū)。適當(dāng)?shù)?，根?jù)本發(fā)明的CDR移植抗體具有包括人接受體框架區(qū)以及上述一個或多個CDR或特異性決定殘基的可變域。因此，在一個實施例中提供了其中可變域包括人接受體框架區(qū)和非人供體⑶R的中和性⑶R移植抗體。
[0058]可以用于本發(fā)明的人框架的實例是KOL、NEWM、RE1、EU、TUR、TE1、LAY以及POM(卡巴特等人，見上文)。舉例來說，KOL和NEWM可以用于重鏈，REI可以用于輕鏈，并且EU、LAY以及POM可以用于重鏈和輕 鏈兩者?？商娲兀梢允褂萌朔N系序列；這些可獲自=http://vbase.mrc-cpe.cam, ac.uk/。
[0059]在本發(fā)明的CDR移植抗體中，接受體重鏈和輕鏈并不一定需要來源于同一抗體并且如果希望的話，可以包括具有來源于不同鏈的框架區(qū)的復(fù)合鏈。
[0060]本發(fā)明的第一重鏈可變域(VHl)的適合的框架區(qū)來源于人亞群VH3序列1_33_07以及JH4。第一輕鏈可變域(VLl)的輕鏈的適合的框架區(qū)來源于人種系亞群VKl序列2-11-02 以及 JK4。
[0061]此外，在本發(fā)明的CDR移植抗體可變區(qū)中，框架區(qū)不需要與接受體抗體的那些具有完全相同的序列。舉例來說，罕見殘基可以變成對該接受體鏈類別或類型更頻繁存在的殘基?？商娲兀邮荏w框架區(qū)中所選的殘基可以被改變以使它們對應(yīng)于供體抗體的相同位置處發(fā)現(xiàn)的殘基(參見賴克曼(Reichmann)等人，1998，《自然》，332，323-324)。這樣的改變應(yīng)保持最小必要性以恢復(fù)供體抗體的親和力。一種選擇接受體框架區(qū)中可能需要被改變的殘基的方案闡述于W091/09967中。
[0062]適當(dāng)?shù)?，在本發(fā)明的第一重鏈可變區(qū)(VHl)中，如果接受體重鏈具有人VH3序列1-33-07以及JH4，那么該重鏈的接受體框架區(qū)除包括一個或多個供體⑶R外，還在位置37、73、78或94(根據(jù)卡巴特等人(見上文))中的至少一者處包括供體殘基。因此，提供了一種雙特異性抗體融合蛋白，其中至少在重鏈的第一可變域的位置37、73、78以及94處的殘
基是供體殘基。
[0063]適當(dāng)?shù)?，在本發(fā)明的第一輕鏈可變區(qū)(VLl)中，如果接受體輕鏈具有人亞群VKl序列2-11-02以及JK4，那么該輕鏈的接受體框架區(qū)除包括一個或多個供體⑶R外，還在位置64或71中的至少一者 處包括供體殘基。因此，提供了一種雙特異性抗體融合蛋白，其中至少在輕鏈的第一可變域的位置64和71處的殘基是供體殘基。
[0064]供體殘基為來自供體抗體(即CDR最初來源的抗體)的殘基。
[0065]在一個實施例中，本發(fā)明的雙特異性抗體融合蛋白包括重鏈，其中該重鏈的第一可變域(VhI)包括在圖2(b) SEQ ID NO: 8中給出的序列。
[0066]應(yīng)了解，可以對由本發(fā)明提供的第一重鏈和輕鏈可變域作出一個或多個氨基酸(例如I或2個氨基酸)取代、添加和/或缺失而不顯著改變抗體融合蛋白結(jié)合到0X40以及中和0X40活性的能力。任何氨基酸取代、添加和/或缺失的作用可以容易地由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員測試，例如通過使用W02010/096418中所述的方法進行，從而測定0X40結(jié)合和配體阻斷。
[0067]在一個實施例中，本發(fā)明的雙特異性抗體融合蛋白包括重鏈，其中該重鏈的第一可變域包括與在圖2(b) SEQ ID N0:8中給出的序列具有至少60%—致性或相似性的序列。在一個實施例中，本發(fā)明的抗體融合蛋白包括重鏈(VHl)，其中該重鏈的第一可變域包括與在SEQ ID N0:8中給出的序列具有至少70%、80%、90%、95%或98%—致性或相似性的序列。
[0068]在一個實施例中，本發(fā)明的雙特異性抗體融合蛋白包括輕鏈，其中該輕鏈的第一可變域(VLl)包括在圖2 (a) SEQ ID NO: 7中給出的序列。
[0069]在另一個實施例中，本發(fā)明的雙特異性抗體融合蛋白包括輕鏈，其中該輕鏈的第一可變域包括與在SEQ ID N0:7中給出的序列具有至少60% —致性或相似性的序列。在一個實施例中，本發(fā)明的抗體融合蛋白包括輕鏈，其中該輕鏈的第一可變域包括與在SEQ IDNO:7中給出的序列具有至少70%、80%、90%、95%或98%—致性或相似性的序列。
[0070]在一個實施例中，本發(fā)明的雙特異性抗體融合蛋白包括重鏈和輕鏈，其中該重鏈的第一可變域(VHl)包括在SEQ ID N0:8中給出的序列，其中該輕鏈的第一可變域(VLl)包括在SEQ ID NO:7中給出的序列。
[0071]在本發(fā)明的另一個實施例中，抗體融合蛋白包括重鏈和輕鏈，其中該重鏈的第一可變域包括與在SEQ ID N0:8中給出的序列具有至少60%—致性或相似性的序列，并且該輕鏈的第一可變域包括與在SEQ ID N0:7中給出的序列具有至少60%—致性或相似性的序列。適當(dāng)?shù)?，抗體融合蛋白包括重鏈和輕鏈，其中該重鏈的第一可變域包括與在SEQ IDNO:8中給出的序列具有至少70%、80%、90%、95%或98%—致性或相似性的序列，其中該輕鏈的第一可變域包括與在SEQ ID N0:7中給出的序列具有至少70%、80%、90%、95%或98 % 一致性或相似性的序列。
[0072]在本發(fā)明的雙特異性抗體融合蛋白中，重鏈包括CHl域，并且輕鏈包括CL域，或者K或者入。
[0073]在一個實施例中，本發(fā)明的雙特異性抗體融合蛋白包括重鏈和輕鏈，其中該重鏈包括在SEQ ID NO: 10中給出的序列，其中該輕鏈包括在SEQ ID Ν0:9中給出的序列。
[0074]應(yīng)了解，可以對由本發(fā)明提供的抗體可變域和/或恒定域作出一個或多個氨基酸(例如I或2個氨基酸)取代、添加和/或缺失而不顯著改變抗體結(jié)合到0X40以及中和0X40活性的能力。任何氨基酸取代、添加和/或缺失的作用可以容易地由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員測試，例如通過使用W02010096418中所述的方法進行，從而測定0X40結(jié)合和0X40/0X40L相互作用的阻斷。
[0075]在本發(fā)明的一個實施例中，抗體融合蛋白包括重鏈，其中重鏈的VHl和CHl域包括與在SEQ ID NO: 10中給出的序列具有至少60%—致性或相似性的序列。適當(dāng)?shù)兀贵w融合蛋白包括重鏈，其中重 鏈的VHl和CHl域包括與在SEQ ID NO: 10中給出的序列具有至少70%、80%、90%、95%或98%—致性或相似性的序列。
[0076]在一個實施例中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體融合分子包括輕鏈，該輕鏈包括在圖2(d) SEQ ID NO: 9中給出的序列。
[0077]在本發(fā)明的一個實施例中，抗體融合蛋白包括輕鏈，其中該輕鏈的'I和CHl域包括與在SEQ ID Ν0:9中給出的序列具有至少60%—致性或相似性的序列。舉例來說，抗體融合蛋白包括輕鏈，其中該輕鏈的VLl和CL域包括與在SEQ ID NO: 9中給出的序列具有至少70%、80%、90%、95%或98%—致性或相似性的序列。
[0078]由本發(fā)明的雙特異性抗體融合蛋白結(jié)合的第二抗原是人血清白蛋白。這是由Fab-dsFv的Fv部分結(jié)合的，該Fv部分是由第二重鏈和輕鏈可變域VH2和\2組成。在本發(fā)明中，Vh2和Vl2是來源于W02010/035012中所述的抗體中的一者，并且代表該抗體的一種改進的更人化的移植物。
[0079]在一個實施例中，第二重鏈可變域(Vh2)具有在圖3 (a) SEQ ID NO: 11中給出的序列。
[0080]在一個實施例中，第二輕鏈可變域(八2)具有在圖3(b) SEQ ID NO: 12中給出的序列。
[0081]因此，本發(fā)明提供了一種結(jié)合人0X40和人血清白蛋白的雙特異性抗體融合蛋白，包括:
[0082]重鏈，從N端依序包括第一重鏈可變域(VhI)、CHl域以及第二重鏈可變域(VH2)，[0083] 輕鏈，從N端依序包括第一輕鏈可變域('I)、CL域以及第二輕鏈可變域(VJ)，
[0084]其中所述重鏈和所述輕鏈被對齊，使得VhI和'I形成一個第一抗原結(jié)合位點并且Vh2和\2形成一個第二抗原結(jié)合位點，
[0085]其中由該第一抗原結(jié)合位點結(jié)合的抗原是人0X40，并且由該第二抗原結(jié)合位點結(jié)合的抗原是人血清白蛋白，
[0086]其中該重鏈的第一可變域(VhI)包括針對⑶R-Hl在SEQ ID NO:1中給出的序列、針對CDR-H2在SEQ ID NO: 2中給出的序列以及針對CDR-H3在SEQ ID NO: 3中給出的序列，并且該輕鏈的第一可變域('I)包括針對⑶R-Ll在SEQ ID NO:4中給出的序列、針對CDR-L2在SEQ ID NO:5中給出的序列以及針對CDR-L3在SEQ ID NO:6中給出的序列，
[0087]其中該第二重鏈可變域(Vh2)具有在SEQ ID NOill中給出的序列，并且該第二輕鏈可變域(八2)具有在SEQ ID NO: 12中給出的序列，并且
[0088]該第二重鏈可變域(Vh2)和該第二輕鏈可變域％2)是由二硫鍵連接的。
[0089]優(yōu)選地，CHl域和第二重鏈可變域(Vh2)經(jīng)由連接子連接，并且CL域和第二輕鏈可變域(\2)經(jīng)由連接子連接。任何適合的肽連接子序列都可以被使用，并且這些肽連接子序列在每條鏈中可以是相同的或不同的。適合的連接子先前已描述于W02010/035012中并且通過引用結(jié)合在此。適合的連接子的實例在圖3(c)和(d)中示出。在一個實施例中，CHl域與第二重鏈可變域(VH2)之間的連接子包括在圖3 (c) SEQ ID NO: 13中給出的序列或者由其組成。在一個實施例中，CHl域與第二重鏈可變域(Vh2)之間的連接子包括在圖3 (c) SEQID NO: 14中給出的序列或者由其組成。在一個實施例中，CL域與第二輕鏈可變域('2)之間的連接子包括在圖3(d) SEQ ID NO: 14中給出的序列或者由其組成。
[0090]在一個實施例中，輕鏈中的連接子是15個氨基酸序列，具體來說GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:29)。
[0091]在一個實施例中，重鏈中的連接子是16個氨基酸序列，具體來說SGGGGSGGGGTGGGGS(SEQ ID NO:30)。
[0092]在一個實施例中，本發(fā)明提供了一種雙特異性抗體融合蛋白，其中該重鏈包括在圖3(e) (SEQ ID NO: 15)中給出的序列或者由其組成，并且輕鏈包括在圖3 (f) (SEQ IDNO: 16)中給出的序列或者由其組成。
[0093]在本發(fā)明的一個實施例中，雙特異性抗體融合蛋白包括重鏈和輕鏈，其中該重鏈包括與在SEQ ID NO: 15中給出的序列具有至少60%—致性或相似性的序列，并且該輕鏈包括與在SEQ ID NO: 16中給出的序列具有至少60%—致性或相似性的序列。總體而言，抗體融合體包括重鏈和輕鏈，其中該重鏈包括與在SEQ ID NO: 15中給出的序列具有至少70%、80%、90%、95%或98%—致性或相似性的序列，其中該輕鏈包括與在SEQ ID NO: 16中給出的序列具有至少70 %、80 %、90 %、95 %或98 % —致性或相似性的序列。
[0094]本發(fā)明的抗體融合分子適當(dāng)?shù)鼐哂懈呓Y(jié)合親和力，具體來說對于人0X40的皮摩爾親和力和對于人血清白蛋白的納摩爾親和力。親和力可以使用本領(lǐng)域已知的任何適合方法，包括表面等離子共振，例如BIAcore?，如針對W02010096418中0X40和W02010/035012中血清白蛋白所述，使用分離的天然或重組0X40或血清白蛋白或適合的融合蛋白/多肽來測量。
[0095]在一個實例中，親和力使用如W02010/096418中所述的重組人0X40胞外域來測量。在一個實例中，所用的重組人0X40胞外域是二聚體，例如Fe融合二聚體。適當(dāng)?shù)?，本發(fā)明的抗體融合分子對分離的人0X40具有約200pM或更小的結(jié)合親和力。在一個實施例中，本發(fā)明的抗體分子具有約IOOpM或更小的結(jié)合親和力。在一個實施例中，本發(fā)明的抗體分子具有約50pM或更小的結(jié)合親和力。在一個實施例中，本發(fā)明的抗體融合分子具有約40pM或更小的結(jié)合親和力。
[0096]本發(fā)明的抗體融合分子適當(dāng)?shù)貙υ诨罨疶細胞的表面上表達的人0X40具有高結(jié)合親和力，例如納摩爾或皮摩爾親和力。親和力可以使用本領(lǐng)域已知的任何適合方法(包括TO2010096418中所述的方法)使用活化的⑶4+0X40+人T細胞來測量。具體來說，本發(fā)明的抗體融合分子對細胞表面表達的人0X40具有約2nM或更好的結(jié)合親和力。在一個實例中，本發(fā)明的抗體分子對細胞表面表達的人0X40具有約InM或更好的結(jié)合親和力。在另一個實例中，本發(fā)明的抗體分子對細胞表面表達的人0X40具有約0.5nM或更好的結(jié)合親和力。在另一個實例中，本發(fā)明的抗體分子對細胞表面表達的人0X40具有約0.2nM或更好的結(jié)合親和力。
[0097]適當(dāng)?shù)?，本發(fā)明的抗體融合分子對分離的人血清白蛋白具有約50nM或更小的結(jié)合親和力。適當(dāng)?shù)?，本發(fā)明的抗體融合分子對分離的人血清白蛋白具有約20nM或更小的結(jié)合親和力。在一個實施例中，本發(fā)明的抗體分子具有約IOnM或更小的結(jié)合親和力。在一個實施例中，本發(fā)明的抗體分子具有約5nM或更小的結(jié)合親和力。在一個實施例中，本發(fā)明的抗體融合分子具有約2nM或更小的結(jié)合親和力。
[0098]本發(fā)明的抗體融合分子可以結(jié)合人血清白蛋白和食蟹獼猴、小鼠以及大鼠血清白蛋白。在一個實施例中，本發(fā)明的抗體融合蛋白以5nM或更小的親和力結(jié)合食蟹獼猴血清白蛋白。在一個實施例中，本發(fā)明的抗體融合蛋白以5nM或更小的親和力結(jié)合小鼠血清白蛋白。
[0099]本發(fā)明的抗體融合分子能夠同時結(jié)合人0X40和人血清白蛋白。
[0100]有利地，本發(fā)明的融合分子對0X40具有高親和力并且還具有治療有用的適當(dāng)體內(nèi)半衰期，例如半衰期在5-15天范圍內(nèi)，如7-11天。
[0101]應(yīng)了解，由本發(fā)明提供的抗體融合蛋白對人0X40和/或人血清白蛋白的親和力可以使用本領(lǐng)域已知的任何適合方法改變。因此，本發(fā)明還涉及本發(fā)明的抗體分子的變體，這些變體對0X40或人血清白蛋白具有提高的親和力。這些變體可以通過許多親和力成熟方案獲得，包括使⑶R突變(楊(Yang)等人，《分子生物學(xué)雜志》，2M，392-403, 1995)、鏈改組(馬克斯(Marks)等人，《生物技術(shù)》(Bio/Technology) ,10, 779-783，1992)、大腸桿菌增變菌株的使用(樓(Low)等人，《分子生物學(xué)雜志》，2迎，359-368，1996) ,DNA改組(帕特恩(Patten)等人,《生物技術(shù)新見》(Curr.0pin.Biotechnol.) ,8, 724-733，1997)、卩遼菌體展示(湯普森(Thompson)等人，《分子生物學(xué)雜志》，迪包77-88，1996)以及有性PCR(克拉默瑞(Crameri)等人，《自然》，皿，288-291，1998)。沃恩等人(見上文)討論了親和力成熟的這些方法。
[0102]在一個實施例中，本發(fā)明的雙特異性抗體融合分子阻斷0X40與0X40L之間的相互作用。適用于確定抗體阻斷這一相互作用的能力的許多分析描述于W02010/096418中。在一個實施例中，本發(fā)明提供了一種對人0X40具有特異性的抗體融合蛋白，它能夠在低于0.5nM的濃度下抑制人0X40L (在2 μ g/ml的最終濃度下測試)與活化的人CD4+0X40+T細胞結(jié)合達50 %。在一個實施例中，用于該分析的人0X40L是天然人0X40。在一個實施例中，用于該分析的人0X40是重組人0X40。
[0103]如果希望的話，用于本發(fā)明的抗體可以結(jié)合于一個或多個效應(yīng)分子。應(yīng)了解，該效應(yīng)分子可以包括單個效應(yīng)分子或者兩個或更多個如此連接的這類分子以形成可以連接于本發(fā)明的抗體的單個部分。當(dāng)所希望的是獲得與效應(yīng)分子連接的抗體片段時，這可以通過標準化學(xué)或重組DNA程序制備，在這些程序中該抗體片段或者直接或者經(jīng)由偶聯(lián)劑與效應(yīng)分子連接。用于將這類效應(yīng)分子結(jié)合到抗體的技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知(參見海爾斯特倫(Hellstrom)等人，《受控藥物遞送》(Controlled Drug Delivery),第2版，魯賓遜(Robinson)等人編，1987，第623-53頁；索普(Thorpe)等人，1982，《免疫學(xué)綜述》(Immunol.Rev.),62:119-58以及杜博維奇克(Dubowchik)等人，1999,《藥理學(xué)與治療學(xué)》(Pharmacology and Therapeutics),83，67-123)。具體的化學(xué)程序包括例如描述于 TO93/06231、W092/22583、W089/00195、W089/01476 以及 W003/031581 中的那些?？商娲兀?dāng)效應(yīng)分子為蛋白或多肽時，連接可以使用重組DNA程序?qū)崿F(xiàn)，例如W086/01533和EP0392745 中所述。
[0104]如在此所使用的術(shù)語效應(yīng)分子包括例如抗腫瘤劑、藥物、毒素、生物活性蛋白例如酶、其他抗體或抗體片段、合成或天然存在的聚合物、核酸和其片段例如DNA、RNA和其片段、放射性核素、特別是放射性碘、放射性同位素、螯合金屬、納米粒子以及報導(dǎo)基團如熒光化合物或可以通過NMR或ESR光譜檢測的化合物。
[0105]效應(yīng)分子的實例可以包括細胞毒素或細胞毒素劑，包括對細胞有害的(例如殺死細胞)的任何藥劑。實例 包括考布他汀、海兔毒素、埃博霉素、星形孢菌素、美登木素生物堿、海綿抑制素、根瘤菌素、軟海綿素、桿孢菌素、哈米特林(hemiasterlin)、紫杉醇、細胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、依米丁、絲裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、長春新堿、長春堿、秋水仙素、多柔比星、柔紅霉素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放線菌素D、1-去氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾以及嘌呤霉素以及它們的類似物或同系物。
[0106]效應(yīng)分子還包括(但不限于)抗代謝物(例如甲氨蝶呤、6-疏基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶達卡巴嗪)、烷化劑(例如氮芥、塞替派苯丁酸氮芥、美法侖、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲佐菌素、絲裂霉素C以及順二氯二氨合鉬(II) (DDP)順鉬)、蒽環(huán)類(例如柔紅霉素(原先的道諾霉素)和多柔比星)、抗生素(例如更生霉素(原先的放線菌素)、博萊霉素、光神霉素、安曲霉素(AMC)、刺孢霉素或倍癌霉素)以及抗有絲分裂劑(例如長春新堿和長春堿)。
[0107]其他效應(yīng)分子可以包括螯合的放射性核素，如111In和9°Y、Lu177、鉍213、锎252、銥192以及鎢187錸188 ;或藥物如(但不限于)烷基磷酸膽堿、拓撲異構(gòu)酶I抑制劑、紫杉烷以及蘇拉明。其他效應(yīng)分子包括蛋白、肽以及酶。感興趣的相關(guān)酶包括(但不限于)蛋白水解酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)移酶。感興趣的相關(guān)蛋白、多肽以及肽包括(但不限于)免疫球蛋白、毒素如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白Α、假單胞菌外毒素或白喉毒素，蛋白如胰島素、腫瘤壞死因子、α-干擾素、β_干擾素、神經(jīng)生長因子、血小板衍生生長因子或組織纖溶酶原激活物、血栓生成劑或抗血管生成劑，例如血管抑制素或內(nèi)皮抑制素，或者，生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑如淋巴因子、白介素-1 (IL-1)、白介素-2 (IL-2)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、神經(jīng)生長因子(NGF)或其他生長因子和免疫球蛋白。
[0108]其他效應(yīng)分子可以包括適用于例如診斷的可檢測物質(zhì)?？蓹z測物質(zhì)的實例包括不同酶、輔基、突光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物發(fā)光物質(zhì)、放射性核素、正電子發(fā)射金屬(用于正電子發(fā)射斷層掃描)以及非放射性順磁金屬離子?？傮w上參見美國專利號4，741，900關(guān)于可以結(jié)合于抗體用作診斷劑的金屬離子。適合的酶包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β -半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；適合的輔基包括鏈霉親和素、抗生物素蛋白以及生物素；適合的熒光物質(zhì)包括傘形花內(nèi)酯、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪基胺熒光素、丹磺酰氯以及藻紅蛋白；適合的發(fā)光物質(zhì)包括魯米諾；適合的生物發(fā)光物質(zhì)包括螢光素酶、螢光素以及水母素；并且適合的放射性核素包括1251、1311、mIn以及"Tc。
[0109]當(dāng)效應(yīng)分子為聚合物時，它可以總體上為合成或天然存在的聚合物，例如任選被取代的直鏈或分支鏈聚亞烷基、聚亞烯基或聚氧化烯聚合物或者分支鏈或非分支鏈多糖，例如同多糖或雜多糖。
[0110]可以可能存在于上述合成聚合物上的特定任選取代基包括一個或多個羥基、甲基或甲氧基。
[0111]合成聚合物的特定實例包括任選被取代的直鏈或分支鏈聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物，特別是任選被取代的聚(乙二醇)如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。
[0112]具體的天然存在的聚合物包括乳糖、直鏈淀粉、葡聚糖、糖原或其衍生物。
[0113]如在此所使用的“衍生物”打算包括反應(yīng)衍生物，例如硫醇選擇性反應(yīng)基團，如馬來酰亞胺等。該反應(yīng)基 團可以直接與聚合物連接或通過連接子區(qū)段與聚合物連接。應(yīng)了解，這類基團的殘基在一些情況下將作為抗體片段與聚合物之間的連接基團形成產(chǎn)物的一部分。
[0114]聚合物的大小可以如所希望的變化，但總體上平均分子量范圍將為從500Da到50000Da，例如從 5000 到 40000Da，如從 20000 到 40000Da。
[0115]在一個實例中，適合的效應(yīng)分子可以通過位于抗體融合蛋白中的任何可獲得的氨基酸側(cè)鏈或末端氨基酸官能團(例如任何游離的氨基、亞氨基、巰基、羥基或羧基)連接。這類氨基酸可以天然存在于抗體片段中或者可以使用重組DNA方法工程化到片段中(參見例如 US5, 219，996 ；US5, 667，425 ；W098/25971)。
[0116]本發(fā)明還提供了一種分離的DNA序列，它編碼本發(fā)明的抗體分子的一條或多條重鏈和/或輕鏈。適當(dāng)?shù)?，該DNA序列編碼本發(fā)明的抗體分子的重鏈或輕鏈。本發(fā)明的DNA序列可以包括例如通過化學(xué)加工而制造的合成DNA、cDNA、基因組DNA或其任何組合。編碼本發(fā)明的抗體分子的DNA序列可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的方法獲得。舉例來說，編碼一部分或完全的抗體重鏈和輕鏈的DNA序列可以如所希望的從確定的DNA序列或基于相應(yīng)的氨基酸序列合成。
[0117]編碼接受體框架序列的DNA對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說為廣泛可獲得的并且可以容易地基于其已知的氨基酸序列合成。
[0118]分子生物學(xué)的標準技術(shù)可以用于制備編碼本發(fā)明的抗體分子的DNA序列。所希望的DNA序列可以完全或部分使用寡核苷酸合成技術(shù)合成。適當(dāng)時可以使用定點誘變和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)。[0119]適合的序列的實例提供于:圖5 (a) SEQ ID N0:21 ;圖5(b)SEQ ID NO: 22 ;圖6(a)SEQ ID NO:23 ;圖 6(b) SEQ ID NO:24。SEQ ID N021 中的核苷酸 1-63 和 SEQ ID NO:23 中的核苷酸1-63編碼信號肽序列OmpA，將該信號肽序列裂解以得到本發(fā)明的拮抗性抗體融合分子。本發(fā)明還提供了一種分離的DNA序列，它編碼包括SEQ ID N0:21或SEQ ID NO:22的本發(fā)明的抗體融合蛋白的重鏈。本發(fā)明還提供了一種分離的DNA序列，它編碼包括SEQID N0:23或SEQ ID NO:24的本發(fā)明的抗體融合分子的輕鏈。
[0120]適合的序列的其他實例提供于:圖7 (a) SEQ ID NO:25 ;圖7 (b) SEQ ID N0:26;圖8 (a) SEQ ID NO: 27 ;圖 6 (b) SEQ ID NO: 28。SEQ ID N025 中的核苷酸 1-57 和 SEQ ID N027中的核苷酸1-60編碼來自小鼠抗體B72.3的信號肽序列(維妥(Whittle)等人，1987，《蛋白質(zhì)工程》(Protein Eng.) U6) 499-505)，將該信號肽序列裂解以得到本發(fā)明的拮抗性抗體融合分子。本發(fā)明還提供了一種分離的DNA序列，它編碼包括SEQ ID N0:25或SEQ IDN0:26的本發(fā)明的抗體融合蛋白的重鏈。本發(fā)明還提供了一種分離的DNA序列，它編碼包括SEQ ID N0:27或SEQ ID NO:28的本發(fā)明的抗體融合分子的輕鏈。
[0121]本發(fā)明還涉及一種克隆或表達載體，它包括本發(fā)明的一個或多個DNA序列。因此，提供了一種克隆或表達載體，它包括編碼本發(fā)明的抗體融合蛋白的一個或多個DNA序列。適當(dāng)?shù)兀摽寺』虮磉_載體包括兩個DNA序列，分別編碼本發(fā)明的抗體分子的輕鏈和重鏈。適當(dāng)?shù)?，根?jù)本發(fā)明的載體包括在SEQ ID N0:21和SEQ ID N0:23中給出的序列。SEQ IDN021中的核苷酸1-63和SEQ ID N023中的核苷酸1_63編碼來自O(shè)mpA的信號肽序列。
[0122]可以構(gòu)建載體的一般方法、轉(zhuǎn)染方法以及培養(yǎng)方法為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知。在這一方面，參考“《現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗指南》(Current Protocols in MolecularBiology) ”, 1999,F.M.奧蘇貝爾(F.M.Ausubel)(編)，威利跨學(xué)科(Wiley Interscience),紐約和由冷泉港(Cold Spring Harbor)出版的《馬尼亞蒂手冊》(Maniatis Manual)。
[0123]還提供了一種宿主細胞，包括一個或多個克隆或表達載體，該一個或多個克隆或表達載體包括一個或多個編碼本發(fā)明的抗體融合蛋白的DNA序列。任何適合的宿主細胞/載體系統(tǒng)都可以用于表達編碼本發(fā)明的抗體分子的DNA序列?？梢允褂眉毦绱竽c桿菌和其他微生物系統(tǒng)，或者還可以使用真核例如哺乳動物宿主細胞表達系統(tǒng)。適合的哺乳動物宿主細胞包括CH0、骨髓瘤或雜交瘤細胞。
[0124]本發(fā)明還提供了一種用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的抗體融合分子的方法，包括將包含本發(fā)明的載體的宿主細胞在適于引起從編碼本發(fā)明的抗體分子的DNA表達蛋白的條件下培養(yǎng)，以及分離該抗體分子。
[0125]對于產(chǎn)生包括重鏈和輕鏈兩者的產(chǎn)物，細胞株可以用兩種載體轉(zhuǎn)染，即編碼輕鏈多肽的一個第一載體和編碼重鏈多肽的一個第二載體?？商娲?，可以使用單一載體，該載體包括編碼輕鏈和重鏈多肽的序列。
[0126]由于本發(fā)明的抗體融合蛋白有用于治療和/或防治病理性病況，所以本發(fā)明還提供了一種醫(yī)藥或診斷組合物，它包括本發(fā)明的抗體分子以及醫(yī)藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載劑中的一者或多者。因此，提供了本發(fā)明的抗體融合蛋白的用途，用于制造藥物。該組合物通常將作為通常將作為包括醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑的無菌醫(yī)藥組合物的一部分提供。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可以另外地包括醫(yī)藥學(xué)上可接受的佐劑。
[0127]本發(fā)明還提供了一種用于制備醫(yī)藥或診斷組合物的方法，包括添加并且混合本發(fā)明的抗體融合分子以及醫(yī)藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載劑中的一者或多者。
[0128]該抗體融合分子可以是醫(yī)藥或診斷組合物中唯一的活性成分或者可以伴隨其他活性成分，包括其他抗體成分例如抗TNF、抗IL-1 β、抗T細胞、抗IFNy或抗LPS抗體，或非抗體成分如黃嘌呤。其他適合的活性成分包括能夠誘導(dǎo)耐受性的抗體，例如抗CD3或抗CD4抗體。
[0129]在另一個實施例中，根據(jù)本披露的抗體融合蛋白或組合物與另外的醫(yī)藥活性劑組合使用，該醫(yī)藥活性劑為例如皮質(zhì)類固醇(如丙酸氟替卡松)和/或β_2-激動劑(如沙丁胺醇、沙美特羅或福莫特羅)或細胞生長和增殖的抑制劑(如雷帕霉素、環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤)或替代的CD28和/或CD40抑制劑。在一個實施例中，該抑制劑是小分子。在另一個實施例中，該抑制劑是對標靶具有特異性的抗體。
[0130]醫(yī)藥組合物適當(dāng)?shù)匕ㄖ委熡行Я康谋景l(fā)明的抗體融合蛋白。如在此所使用的術(shù)語“治療有效量”是指對治療、改善或預(yù)防目標疾病或病況所需的治療劑的量或?qū)Ρ憩F(xiàn)出可檢測的治療或預(yù)防作用所需的治療劑的量。對于任何抗體，治療有效量可以最初或者在細胞培養(yǎng)分析中或者在動物模型中，通常在嚙齒類動物、兔、狗、豬或靈長類動物中估算。動物模型還可以用于確定投藥的適當(dāng)濃度范圍和途徑。這類信息可以接著用于確定對于在人中投藥的適用劑量和途徑。
[0131]人受試者的精確治療有效量將取決于疾病狀況的嚴重性、受試者的一般健康狀況、受試者的年齡、體重以及性別、飲食、投藥時間和頻率、一種或多種藥物組合、反應(yīng)靈敏度以及對療法的耐受/ 應(yīng)答。這個量可以通過常規(guī)實驗測定并且在臨床醫(yī)生的判斷范圍內(nèi)?？傮w而言，治療有效量將為從0.01mg/kg到50mg/kg，例如0.lmg/kg到20mg/kg。醫(yī)藥組合物可以便利地以每劑包含預(yù)定量的本發(fā)明的活性劑的單位劑量形式呈現(xiàn)。
[0132]組合物可以單獨地投與患者或者可以與其他藥劑、藥物或激素組合(例如同時、依序或分別地)投與。
[0133]本發(fā)明的抗體融合分子投與的劑量取決于待治療病況的性質(zhì)、存在的炎癥的程度以及抗體分子是否被防治性地使用或用于治療已存在的病況。
[0134]劑量的頻率將取決于抗體融合分子的半衰期和它作用的持續(xù)時間。如果抗體分子具有短的半衰期(例如2到10小時)，那么它可以有必要每天給予一個或多個劑量?？商娲?，如果抗體分子具有長的半衰期(例如2到15天)，那么它可以僅需每天一次、每周一次或甚至每I或2個月一次給予一個劑量。
[0135]醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑本身不應(yīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生對接受組合物的個體有害的抗體并且不應(yīng)有毒。適合的載劑可以為大的、代謝緩慢的大分子，如蛋白、多肽、脂質(zhì)體、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物以及失活的病毒粒子。
[0136]可以使用醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽，例如無機酸鹽，如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽以及硫酸鹽，或者有機酸鹽，如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽以及苯甲酸鹽。
[0137]治療組合物中的醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑可以另外地包含液體，如水、鹽水、甘油以及乙醇。另外，輔助物質(zhì)如潤濕劑或乳化劑或pH緩沖物質(zhì)，可以存在于這類組合物中。這些載劑使醫(yī)藥組合物能夠配制為片劑、丸劑、糖錠劑、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液以及懸浮液，用于被患者攝取。
[0138]用于投藥的適合形式包括適于胃腸外投藥的形式，例如通過注射或輸注，例如通過快速注射或持續(xù)輸注。當(dāng)產(chǎn)品用于注射或輸注時，它可以采取在油性或水性媒劑中的懸浮液、溶液或乳液的形式，并且它可以包含配制劑，如助懸劑、防腐劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?？商娲?，該抗體分子可以呈干燥的形式，用于使用前用適當(dāng)無菌液體復(fù)原。
[0139] 一旦配制，本發(fā)明的組合物即可以直接投與受試者。待治療的受試者可以是動物。然而，在一個或多個實施例中，組合物適合投與人受試者。
[0140]適當(dāng)?shù)?，在根?jù)本披露的配制品中，最終配制品的pH值不類似于抗體或片段的等電點的值，舉例來說，如果配制品的PH值是7，那么pi值為從8-9或更高可以為適當(dāng)?shù)?。盡管不希望受理論所約束，但據(jù)認為這可能最終提供具有改進的穩(wěn)定性的最終配制品，例如抗體或片段保持在溶液中。
[0141]在一個方面中，有利地，本披露的融合分子不具有對應(yīng)于整個中性分子的pi值。這使分子變得更不易于聚集。
[0142]本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可以通過許多途徑投與，包括(但不限于)口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、髓內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、透皮、經(jīng)皮(例如參見W098/20734)、皮下、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、腸內(nèi)、局部、舌下、陰道內(nèi)或直腸途徑。皮下注射器也可以用于投與本發(fā)明的醫(yī)藥組合物。典型地，這些治療組合物可以制備為可注射劑，即或者作為液體溶液或者懸浮液。也可以制備在注射前適于溶于或懸浮于液體媒劑中的固體形式。
[0143]組合物的直接遞送總體上將通過皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射或者遞送到組織的間質(zhì)間隙來實現(xiàn)。組合物還可以投與到病灶內(nèi)。劑量治療可以是單劑量方案或多劑量方案。
[0144]應(yīng)了解，組合物中的活性成分將是抗體分子。因此，它將易于在胃腸道中降解。因此，如果組合物待通過使用胃腸道的途徑投與，那么組合物將需要包含以下藥劑，它們保護抗體免受降解，但一旦它們從胃腸道吸收就釋放抗體。
[0145]醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑的全面論述在《雷明登氏制藥科學(xué)》(Remington’sPharmaceutical Sciences)(馬克出版公司(Mack Publishing Company)，新澤西州(N.J.)1991)中是可獲得的。
[0146]在一個實施例中，配制品作為用于包括吸入在內(nèi)的局部投藥的配制品提供。
[0147]適合的可吸入制劑包括可吸入粉劑、包含推進劑氣體的計量氣霧劑或不含推進劑氣體的可吸入溶液。包含活性物質(zhì)的根據(jù)本披露的可吸入粉劑可以僅由上述活性物質(zhì)或上述活性物質(zhì)與生理學(xué)上可接受的賦形劑的混合物組成。
[0148]這些可吸入粉劑可以包括單糖(例如葡萄糖或阿拉伯糖)、二糖(例如乳糖、蔗糖、麥芽糖)、寡聚糖和多糖(例如葡聚糖)、多元醇(例如山梨醇、甘露糖醇、木糖醇)、鹽(例如氯化鈉、碳酸鈣)或這些彼此的混合物。適合使用單糖或二糖，使用乳糖或葡萄糖，尤其但非獨占地以其水合物的形式。
[0149]用于肺中沉積的粒子要求粒度小于10微米,如1-9微米,例如從0.1到5 μ m,特別地從I到5 μ m。活性成分(如抗體或片段)的粒度是首要重要的。
[0150]可以用于制備可吸入氣霧劑的推進劑氣體為本領(lǐng)域中已知。適合的推進劑氣體是選自以下各項中:烴，如正丙烷、正丁烷或異丁烷，和鹵代烴，如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、環(huán)丙烷或環(huán)丁烷的氯化和/或氟化衍生物。上述推進劑氣體可以單獨使用或以其混合物使用。
[0151]具體來說，適合的推進劑氣體為選自以下各項中的鹵代烷烴衍生物:TG11、TG12、TG134a以及TG227。在上述鹵代烴中，TG134a(l，1，1，2-四氟乙烷)和TG227(1, I, I, 2，3，3，3-七氟丙烷)和其混合物是特別適合的。
[0152]包含推進劑氣體的可吸入氣霧劑還可以包含其他成分，如共溶劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑(表面活性物質(zhì))、抗氧化劑、潤滑劑以及用于調(diào)節(jié)PH值的工具。所有這些成分均為本領(lǐng)域已知。
[0153]根據(jù)本發(fā)明的包含推進劑氣體的可吸入氣霧劑可以包含最多5重量％的活性物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的氣霧劑包含例如0.002重量％到5重量％、0.0I重量％到3重量％、0.015
重量％到2重量％、0.1重量％到2重量％、0.5重量％到2重量％或0.5重量％到I重量％的活性成分。
[0154]可替代地，對肺的局部投藥還可以通過液體溶液或懸浮液配制品投與，例如采用如噴霧器例如連接到壓縮器的噴霧器(例如連接到弗吉尼亞州里奇蒙的帕里呼吸設(shè)備公司(Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va.)生產(chǎn)的 Pari Master (R)壓縮器的Pari LC-Jet Plus(R)噴霧器)的裝置。[0155]本發(fā)明的抗體融合蛋白可以分散于溶劑中例如以溶液或懸浮液的形式遞送。它可以懸浮于適當(dāng)生理溶液例如鹽水或其他藥理學(xué)上可接受的溶劑或緩沖溶液。本領(lǐng)域中已知的緩沖溶液每ImL水可以包含0.05mg到0.15mg乙二胺四乙酸二鈉、8.0mg到9.0mg NaCl>0.15mg到0.25mg聚山梨醇酯、0.25mg到0.30mg無水檸檬酸以及0.45mg到0.55mg梓檬酸鈉，以便實現(xiàn)約4.0到5.0的pH值。懸浮液可以采用例如凍干抗體。
[0156]治療性懸浮液或溶液配制品還可以包含一種或多種賦形劑。賦形劑為本領(lǐng)域熟知，并且包括緩沖液(例如檸檬酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液以及碳酸氫鹽緩沖液)、氨基酸、尿素、醇、抗壞血酸、磷脂、蛋白(例如血清白蛋白)、EDTA、氯化鈉、脂質(zhì)體、甘露糖醇、山梨糖醇以及甘油。溶液或懸浮液可以囊封在脂質(zhì)體或生物可降解微球體內(nèi)。配制品總體上將采用無菌生產(chǎn)工藝以實質(zhì)上無菌的形式提供。
[0157]這可以包括通過以下方式產(chǎn)生和滅菌:利用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟悉的方法，過濾用于配制品(無菌緩沖溶劑溶液中抗體的無菌懸浮液)的緩沖溶劑/溶液，并且將該配制品分配到無菌容器中。
[0158]可以提供根據(jù)本披露的可霧化配制品，例如作為包裝于箔包封中的單一劑量單位(例如密封的塑料容器或小瓶)。每個小瓶在例如2mL溶劑/溶液緩沖液的體積中包含單位劑量。
[0159]在此披露的抗體融合蛋白可以適用于經(jīng)由霧化遞送。
[0160]還考慮的是，本發(fā)明的抗體可以通過使用基因療法投與。為了實現(xiàn)此目的，將在適當(dāng)DNA組分的控制下編碼抗體分子的重鏈和輕鏈的DNA序列引入患者中，使得抗體鏈從DNA序列中表達出來并在原位裝配。
[0161]本發(fā)明還提供了一種用于控制炎性疾病(例如急性或慢性炎性疾病)的抗體融合分子(或包括它的組合物)。適當(dāng)?shù)?，抗體分子(或包括其的組合物)可以用于減少炎癥過程或預(yù)防炎癥過程。在一個實施例中，提供了活化T細胞的體內(nèi)減少、特別是涉及不當(dāng)炎癥免疫應(yīng)答的那些，例如募集到這類應(yīng)答的附近/部位。
[0162]如在此所用的活化T細胞的減少可以為與治療前或未治療相比減少10、20、30、40、50、60、70、80、90或更多百分比。有利地，用根據(jù)本發(fā)明的抗體、片段或組合物治療可以允許活化T細胞的水平的降低，而不降低患者T細胞的一般水平(未活化T細胞)。這可以引起更少的副作用，并且可能預(yù)防患者的T細胞耗竭。
[0163]本發(fā)明還提供了本發(fā)明的抗體融合分子用于治療或防治由0X40介導(dǎo)或與0X40水平提高相關(guān)的病理性病癥。該病理性病況可以例如選自下組，該組由以下各項組成:感染(病毒性、細菌性、真菌性以及寄生蟲性)、與感染相關(guān)的內(nèi)毒素休克、關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、C0PD、盆腔炎癥性疾病、阿爾茨海默氏病、炎性腸病、克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、佩羅尼病、腹部疾病、膽囊疾病、藏毛病、腹膜炎、牛皮癬、血管炎、外科粘連、中風(fēng)、I型糖尿病、萊姆病、關(guān)節(jié)炎、腦膜腦炎、自體免疫葡萄膜炎、免疫介導(dǎo)的中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的炎性病癥如多發(fā)性硬化、狼瘡(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡和狼瘡腎炎)和格-巴綜合征、特應(yīng)性皮炎、自體免疫肝炎、纖維化肺泡炎、格雷氏病、IgA腎病變、特發(fā)性血小板減少性紫癜、梅尼埃病、天皰瘡、原發(fā)性膽汁性肝硬化、類肉瘤病、硬皮癥、韋格納氏肉芽腫病、其他自體免疫病癥、胰臟炎、外傷(手術(shù))、移植物抗宿主疾病、移植排斥、心臟病包括缺血性疾病如心肌梗塞以及動脈粥樣硬化、血管內(nèi)凝血、骨吸收、骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、牙周炎以及胃酸過少。 [0164]在一個實施例中，根據(jù)本發(fā)明的抗體融合蛋白用于治療過敏、COPD,自體免疫疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、移植物抗宿主疾病、克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、I型糖尿病、多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡腎炎、重癥肌無力、格雷氏病、移植排斥、韋格納氏肉芽腫病、亨-舍二氏紫癜、系統(tǒng)性硬化或病毒誘發(fā)的肺部炎癥。
[0165]在一個實施例中，根據(jù)本發(fā)明的抗體融合蛋白用于治療一種選自下組的疾病，該組由以下各項組成:過敏、C0PD、自體免疫疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、移植物抗宿主疾病、克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、I型糖尿病、多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡腎炎、重癥肌無力、格雷氏病、移植排斥、韋格納氏肉芽腫病、亨-舍二氏紫癜、系統(tǒng)性硬化以及病毒誘發(fā)的肺部炎癥。
[0166]本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明的抗體融合分子用于治療或防治疼痛，特別是與炎癥相關(guān)的疼痛。
[0167]在一個實施例中，本披露的融合分子起作用所通過的機制包括以下各項中的一者或多者:T細胞增殖或存活的抑制、TReg產(chǎn)生的增強、減少的B細胞的分化和/或減少的細胞因子產(chǎn)生。
[0168]本發(fā)明進一步提供了根據(jù)本發(fā)明的抗體融合分子或組合物在制造用于治療或防治由0X40介導(dǎo)或與0X40水平提高相關(guān)的病理性病癥的藥物中的用途，具體來說該病理性病癥為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘或COPD。
[0169]本發(fā)明進一步提供了根據(jù)本發(fā)明的抗體分子、片段或組合物在制造用于治療或防治一種或多種在此所述的醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥的藥物中的用途。
[0170]本發(fā)明的抗體融合分子或組合物可以用于任何其中所希望的是減少0X40在人或動物身體中的作用的療法中。0X40可以在身體中循環(huán)或者可以按不希望的高水平集中位于身體的特定部位例如炎癥部位。
[0171]在一個實施例中，將本發(fā)明的抗體融合分子或包括其的組合物用于控制炎性疾病，例如在此所述的。
[0172]本發(fā)明還提供了一種治療罹患由0X40介導(dǎo)的病癥或處于由0X40介導(dǎo)的病癥的風(fēng)險的人或動物受試者的方法，該方法包括投與該受試者有效量的本發(fā)明的抗體融合分子或包括其的組合物。[0173]在一個實施例中，提供了一種結(jié)合人0X40和人血清白蛋白的純化的雙特異性抗體融合蛋白，以實質(zhì)上純化的形式，特別是不含或?qū)嵸|(zhì)上不含內(nèi)毒素和/或宿主細胞蛋白或 DNA。
[0174]如上文所用的純化的形式打算指至少90%的純度，如91%、92%、93%、94%、95%,96%,97%,98%,99% w/w 或更純。
[0175]實質(zhì)上不含內(nèi)毒素總體上打算指每mg抗體產(chǎn)物的內(nèi)毒素含量為IEU或更少，如每mg 產(chǎn)物 0.5 或 0.1EU。
[0176]實質(zhì)上不含宿主細胞蛋白或DNA總體上打算指每mg抗體產(chǎn)物的宿主細胞蛋白和/或DNA含量為400 μ g或更少,如100 μ g/mg或更少,特別是適當(dāng)時20 μ g/mg。
[0177]本發(fā)明的抗體融合分子還可以用于診斷，例如涉及0X40的疾病狀態(tài)的體內(nèi)診斷和成像。
[0178]有利的是，本發(fā)明融合分子被認為對于按適當(dāng)治療劑量投與人來說是安全的，具體來說因為它們并不是超激動劑并且不太可能引起細胞因子風(fēng)暴。
[0179]如在此所用的超激動劑是指在不存在TCR銜接下擴增T細胞的抗體。
[0180]在一個實施例中，A26Fab_Fv減小分裂指數(shù)指示了群體中更少的細胞致力于分裂；這一作用推測由表達0X40的NK細胞所介導(dǎo)。分裂指數(shù)代表了原始群體中的細胞已經(jīng)歷的細胞分裂的平均數(shù)并且包括未分裂的細胞。
[0181]增殖指數(shù)反映了 僅應(yīng)答群體的增殖，并且在一個實施例中使用這一量度的A26Fab-Fv的抑制作用相對地降低。
[0182]在本說明書的內(nèi)容中包含打算意指包括。
[0183]當(dāng)技術(shù)上適當(dāng)時，本發(fā)明的實施例可以組合。
[0184]實施例在此描述為包括某些特征/要素。本披露還延伸到分開由所述特征/要素組成或基本由所述特征/要素組成的實施例。
[0185]本發(fā)明在以下實例中通過僅闡述的方式進一步描述，這些實例是指附圖，在這些附圖中:
[0186]實例
[0187]圖式詳解:
[0188]圖1:一種本發(fā)明的雙特異性抗體融合蛋白，稱為Fab-dsFv。
[0189]圖2:
[0190]a)抗體 A26 的輕鏈 V 區(qū)(SEQ ID NO: 7)
[0191]b)抗體 A26 的重鏈 V 區(qū)(SEQ ID NO:8)
[0192]c)抗體A26的CDRHl(SEQ ID NO:1)、CDRH2 (SEQ ID NO: 2)、CDRH3 (SEQ ID NO: 3),CDRLl (SEQ ID NO: 4)、CDRL2 (SEQ ID NO:5)以及 CDRL3(SEQ ID NO: 6)。
[0193]d)抗體 A26Fab 組分的輕鏈(SEQ ID NO:9)
[0194]e)抗體 A26Fab 組分的重鏈(SEQ ID NO: 10)
[0195]圖3
[0196]a)抗白蛋白 Fv 組分 645gH5 的重鏈(SEQ ID NO: 11)
[0197]b)抗白蛋白 Fv 組分 645gL4 的輕鏈(SEQ ID NO: 12)
[0198]c)連接子 I (SEQ ID NO: 13)[0199]d)連接子 2 (SEQ ID NO: 14)
[0200]e)Fab_dsFv 重鏈(SEQ ID NO: 15)
[0201]f)Fab-dsFv 輕鏈(SEQ ID NO: 16)
[0202]圖4
[0203]a)645gl 重鏈可變域(SEQ ID NO: 17)
[0204]b)645gl 輕鏈可變域(SEQ ID NO: 18)
[0205]c)A26Fab-dsFv645gHl(SEQ ID NO:19)
[0206]d)A26Fab-dsFv645gLl(SEQ ID NO:20)
[0207]圖5
[0208]a)編碼包括OmpA前導(dǎo)子的Fab-dsFv的重鏈的DNA(SEQ ID NO: 21)
[0209]b)編碼不具有OmpA前導(dǎo)子的Fab-dsFv的重鏈的DNA(SEQ ID NO: 22)
[0210]圖6
[0211]a)編碼包括OmpA前導(dǎo)子的Fab-dsFv的輕鏈的DNA(SEQ ID NO: 23)
[0212]b)編碼不具有OmpA前導(dǎo)子的Fab-dsFv的輕鏈的DNA(SEQ ID NO: 24)
[0213]圖7
[0214]a)編碼包括B72.3前導(dǎo)子的Fab-dsFv的重鏈的DNA(SEQ ID NO: 25)
[0215]b)編碼不具有B72.3前導(dǎo)子的Fab-dsFv的重鏈的DNA(SEQ ID NO:26)
[0216]圖8
[0217]a)編碼包括B72.3前導(dǎo)子的Fab-dsFv的輕鏈的DNA(SEQ ID NO: 27)
[0218]b)編碼不具有B72.3前導(dǎo)子的Fab-dsFv的輕鏈的DNA(SEQ ID NO:28)
[0219]圖9a 不出了 AlexaFluor488 標記的 A26Fab_dsFv 與活化的人 CD4+0X40+T 細胞的
結(jié)合?
[0220]圖9b示出了在5 % HSA存在下在活化的人CD4+、0X40+T細胞上的A26Fab’、A26Fab-Fv 以及 A26Fab’ -PEG 的結(jié)合。
[0221]圖1Oa示出了 A26Fab_dsFv對來自暴露于屋塵螨過敏性提取物的PBMC的細胞因子產(chǎn)生的作用。
[0222]圖1Ob示出了 A26Fab_dsFv在Hu-NSG小鼠模型中抑制CD4+和CD8+T細胞增殖的能力。
[0223]圖1la示出了 A26Fab_dsFv對0X40L結(jié)合于人活化的CD4+0X40+T細胞的抑制。
[0224]圖1lb 示出了 A26Fab’、A26Fab_dsFv、A26Fab’ -PEG 以及兩種對照對 0X40L 結(jié)合于人活化的⑶4+0X40+T細胞的抑制。
[0225]圖12a示出了 A26Fab_Fv抑制人混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)。
[0226]圖12b示出了 A26Fab_Fv在人MLR的過程中抑制IFN- Y產(chǎn)生。
[0227]圖13示出了在使用屋塵螨過敏原提取物進行二級抗原再刺激之后A26Fab_Fv減小活化的(⑶25+)⑶4+T細胞的百分比。
[0228]圖14示出了在細胞轉(zhuǎn)移之前投與的Fab-Fv和Fab-PEG在Hu-NSG模型中劑量依賴性地抑制⑶4+和⑶8+T細胞增殖。
[0229]DNA操作和一般方法
[0230]將感受態(tài)大腸桿菌菌株用于轉(zhuǎn)化和常規(guī)培養(yǎng)生長。DNA限制和修飾酶是獲自羅氏診斷有限公司(Roche Diagnostics Ltd.)和新英格蘭生物實驗室(New EnglandBiolabs)。質(zhì)粒制備使用Maxi Plasmid純化試劑盒(凱杰公司(QIAGEN),目錄號12165)進行。DNA測序反應(yīng)使用ABI Prism Big Dye終止子測序試劑盒(目錄號4304149)進行并且在ABI3100自動測序儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems))上運行。數(shù)據(jù)使用程序Sequencher(基因密碼公司(Genecodes))分析。寡核苷酸是獲自西瑪公司(Simga)或英杰公司(Invitrogen)。編碼初始V區(qū)序列的基因由DNA2.0公司(DNA2.0)通過自動合成方法構(gòu)建，并且通過寡核苷酸定向誘變修飾以產(chǎn)生移植的版本。Fab-Fv的濃度利用基于蛋白質(zhì)G的HPLC方法測定。
[0231]實例I
[0232]A26Fab~645dsFv中645的不同人源化移棺物的產(chǎn)牛和分析
[0233]我們先前已在 W02010/035012中描述了 Fab-dsFv抗體形式(圖1)(在此有時簡稱為Fab-Fv)和稱為‘645gHlgLl’的人源化抗白蛋白抗體。我們先前還已在W02010/096418中描述了稱為‘A26’的人源化拮抗性抗0X40抗體和其聚乙二醇化Fab’片段的產(chǎn)生。此處，我們描述了一種稱為645dsgH5gL4的抗體‘645’的新的改進的人源化移植物的產(chǎn)生以及在Fv組分中并入該移植物并且在Fab組分中并入‘A26’可變區(qū)的Fab-dsFv抗體分子的產(chǎn)生。A26的可變區(qū)在圖2a和b (SEQ ID N07和8)中給出。
[0234]所組合的A26的可變區(qū)和恒定區(qū)序列在圖2d和e (SEQ ID N09和10)中給出。
[0235]645gHl 和 gLl 的序列在圖 4(a)和(b) (SEQ ID N017 和 18)中給出。
[0236]其中使用了術(shù)語？&13’^^6或426?313’^^6，這是指在冊2010/096418中描述的A26Fab-40K PEG’ 。
[0237]1.1.A26Fab-645dsFv (gHlgLl)和 A26Fab_645dsFv (gH5gL4) G4S 連接子質(zhì)粒的構(gòu)建
[0238]將A26Fab-645dsFv(gLl)輕鏈(SEQ ID NO: 20)的全部編碼區(qū)克隆到在 HCMV-MIE啟動子和SV40E polyA序列控制下的UCB哺乳動物表達載體中。645dsFv(gLl)的輕鏈可變區(qū)(SEQ ID NO: 18)利用重疊 PCR 方法突變成 645dsFv(gL4) (SEQ ID N0:12)。將A26Fab-645dsFv(gHl)重鏈(SEQ ID NO: 19的全部編碼區(qū)克隆到在HCMV-MIE啟動子和SV40E polyA序列控制下的UCB哺乳動物表達載體中。645dsFv(gHl)的重鏈可變區(qū)(SEQID NO: 17)利用重疊PCR方法突變成645dsFv(gH5) (SEQ ID N0:11)。這些構(gòu)建體通過測序進行驗證。兩種構(gòu)建體包含在SEQ ID N0:14(圖3(d))中給出的3xG4S連接子。
[0239]1.2A26Fab-645dsFv (gHlgLl)和 A26Fab_645dsFv (gH5gL4)的哺乳動物表達
[0240]HEK293細胞使用英杰公司的293fectin轉(zhuǎn)染試劑根據(jù)制造商的說明書用重鏈和輕鏈質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。簡言之，將25 μ g重鏈質(zhì)粒和25 μ g輕鏈質(zhì)粒與100μ 1293fectin和1700 μ I Optipro培養(yǎng)基一起在室溫下孵育20分鐘。該混合物接著被添加到處于50ml懸浮液中的50 X IO6個HEK293細胞中并且在37°C下在振蕩下孵育6天。6天后，上清液通過在1500 X g下離心10分鐘來收集，從而移除細胞并且接著進行0.22 μ m無菌過濾。
[0241]1.3A26Fab_645dsFv(gHlgLl)和 A26Fab_645dsFv(gH5gL4)的蛋白質(zhì) G 純化
[0242]約50ml的0.22 μ m過濾的上清液利用具有IOkDa分子量截斷膜的AmiconUltra-15濃縮器和在4000 Xg下在甩開轉(zhuǎn)子中的離心而濃縮成約2ml。將1.8ml濃縮的上清液以lml/min施加到在20mM憐酸鹽、40mM NaCl pH7.4中平衡的Iml Gammabind PlusSepharose (通用電氣醫(yī)療集團(GE Healthcare))柱上。該柱用20mM磷酸鹽、40mM NaClpH7.4洗滌，并且結(jié)合的物質(zhì)用0.1M甘氨酸/HCl pH2.7洗脫。收集洗脫峰，并且用2M Tris/HCl ρΗ8.5將pH值調(diào)整到約pH7。利用具有IOkDa分子量截斷膜的Amicon Ultra-15濃縮器和在4000 X g下在甩開轉(zhuǎn)子中的離心，將經(jīng)pH值調(diào)整的洗脫物濃縮并且透濾到20mM磷酸鹽、150mM NaCl ρΗ7.4中，達到約0.3ml的最終體積。
[0243]1.4 尺寸排阻分析 A26Fab_645dsFv (gHlgLl)和 A26Fab_645dsFv (gH5gL4)
[0244]蛋白質(zhì)G純化的樣品通過尺寸排阻HPLC分析。這些樣品在用等度梯度的PBSρΗ7.4以lml/min沖洗的Superdex20010/300GL Tricorn柱(通用電氣醫(yī)療集團)上分離。峰檢測是在280nm下，并且表觀分子量通過與已知分子量蛋白質(zhì)對洗脫體積的標準曲線比較來計算。645dsFv的人源化移植物從gHlgLl改變成gH5gL4引起表達的A26Fab_645dsFv的單體百分比從59%增加到71% (增加12%)，并且在dsfv的熱穩(wěn)定性(數(shù)據(jù)未示出)方面或在dsFv對HSA的結(jié)合親和力(數(shù)據(jù)未示出)方面無任何變化。
[0245]實例2
[0246]2.lA26Fab-dsFv (645gH5gL4)結(jié)合 0X40 的 BIAcore 動力學(xué)
[0247]在這個和所有后續(xù)實例中，A26Fab-dsFv645gH5gL4具有在SEQ ID N0:15(圖3(e))中給出的重鏈序列和在SEQ ID N0:16(圖3(f))中給出的輕鏈序列，即重鏈包含在SEQ ID N0:13(圖 3(c))中給出的 G4S、G4T、G4S 連接子。
[0248]BIA (生物分子相互作用分析)使用BIAcore T200 (通用電氣醫(yī)療集團)進行。將親和純(Affinipure)F(ab’)2片段山羊抗人IgG(F(ab’)2片段特異性的；杰克遜免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch))經(jīng)由胺偶聯(lián)化學(xué)固定于CM5傳感器芯片上達到5000個反應(yīng)單位(RU)的捕獲水平。HBS -EP 緩沖液(IOmMHEPES pH7.4,0.15M NaCl, 3mM EDTA.0.05%表面活性劑P20，通用電氣醫(yī)療集團)被用作流速為10 μ L/min的運行緩沖液。注射10 μ L白勺0.5 μ g/mL的A26Fab’或I μ g/mL的A26Fab_dsFv用于通過固定的抗人IgG-F (ab，)2的捕獲。人0X40以不同濃度(25nM到1.5625nM)以30 μ L/min的流速用捕獲的A26進行滴定。通過以10 μ L/min的流速注射2 X 10 μ L的50mM HCl、接著注射5 μ L的5mM NaOH來再生表面。本底扣除的結(jié)合曲線按照標準程序使用T200evaluation軟件(1.0版本)分析。動力學(xué)參數(shù)由擬合算法測定。
[0249]1......樣品 Fjca.......(Ι/Ms)ω......( i/%)KD.......(M).............1 K—(pM)—I
|TaF........................................|；00""Ε.05....................................................................................................................................................................................................................Fab-Fv 2.55 土 0.35 Ε+05 1.04 Ε-05 4.12Ε-11 41.2L025°J I Fab1 PEG I 2.33 土 0.46 Ε+05 1.12 E-OS_ 4.84Ε-11 | 48.4 [
[0251]4次測定的平均值
[0252]表1
[0253]2.2.A26Fab-dsFv(645gH5gL4)結(jié)合白蛋白的 BIAcore 動力學(xué)
[0254]BIA (生物分子相互作用分析)使用BIAcore T200 (通用電氣醫(yī)療集團)進行。將親和純(Affinipure)F(ab’)2片段山羊抗人IgG(F(ab’)2片段特異性的；杰克遜免疫研究公司)經(jīng)由胺偶聯(lián)化學(xué)固定于CM5傳感器芯片上達到5000個反應(yīng)單位(RU)的捕獲水平。HBS-EP緩沖液(IOmM HEPES pH7.4,0.15MNaCl,3mM EDTA、0.05%表面活性劑P20，通用電氣醫(yī)療集團)被用作流速為10 μ L/min的運行緩沖液。注射10 μ L的0.75 μ g/mL的Fab-Fv用于通過固定的抗人IgG-F(ab’)J9捕獲。人血清白蛋白(HSA)、小鼠血清白蛋白(MSA)以及食蟹獼猴血清白蛋白(CSA)以不同濃度(50nM到6.25nM)以30 μ L/min的流速用捕獲的Fab-Fv進行滴定。通過以10 μ L/min的流速注射2 X 10 μ L的50mM HCl、接著注射5 μ L的5mM NaOH來再生表面。本底扣除的結(jié)合曲線按照標準程序使用T200eValuation軟件(1.0版本)分析。動力學(xué)參數(shù)由擬合算法測定。
[0255]表2
樣品 fka (I/Ms) — ^kd (I/s)KD (M) 'IK (nM)l
[0256]
【權(quán)利要求】
1.一種結(jié)合人0X40和人血清白蛋白的雙特異性抗體融合蛋白，包括: 重鏈，從N端依序包括第一重鏈可變域(VhI)、CHl域以及第二重鏈可變域(Vh2)， 輕鏈，從N端依序包括第一輕鏈可變域('I)、CL域以及第二輕鏈可變域(VJ)， 其中所述重鏈和輕鏈被對齊，使得VHl和VLl形成一個第一抗原結(jié)合位點并且VH2和VL2形成一個第二抗原結(jié)合位點， 其中由該第一抗原結(jié)合位點結(jié)合的抗原是人0X40，并且由該第二抗原結(jié)合位點結(jié)合的抗原是人血清白蛋白， 其中該重鏈的第一可變域(VhI)包括針對⑶R-Hl在SEQ ID NO:1中給出的序列、針對CDR-H2在SEQ ID NO: 2中給出的序列以及針對CDR-H3在SEQ ID NO: 3中給出的序列，并且該輕鏈的第一可變域('I)包括針對⑶R-Ll在SEQ ID NO:4中給出的序列、針對⑶R-L2在SEQ ID N0:5中給出的序列以及針對CDR-L3在SEQ ID N0:6中給出的序列， 其中該第二重鏈可變域(Vh2)具有在SEQ ID NOill中給出的序列，并且該第二輕鏈可變域(Vl2)具有在SEQ ID NO: 12中給出的序列，并且 該第二重鏈可變域(Vh2)和該第二輕鏈可變域(VJ)是由二硫鍵連接的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙特異性抗體融合蛋白，它拮抗0X40與0X40L的結(jié)合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雙特異性抗體融合蛋白，其中該CHl域與該第二重鏈可變域(Vh2)之間存在肽連接子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任何一項所述的雙特異性抗體融合蛋白，其中該CL域與該第二輕鏈可變域('I)之間存在肽連接子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4中任何一項所述的抗體融合蛋白，其中該第一重鏈可變域(VhI)包括在SEQ ID N0:8中給出的序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到5中任何一項所述的抗體融合蛋白，其中該第一輕鏈可變域(八1)包括在SEQ ID N0:7中給出的序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1到6中任何一項所述的抗體融合蛋白，其中該重鏈包括在SEQIDNO: 15中給出的序列或由其組成。
8.根據(jù)權(quán)利要求1到7中任何一項所述的抗體融合蛋白，其中該輕鏈包括在SEQIDNO: 16中給出的序列或由其組成。
9.一種結(jié)合人0X40和人血清白蛋白的雙特異性抗體融合蛋白，具有重鏈和輕鏈，該重鏈包括在SEQ ID NO: 15中給出的序列，該輕鏈包括在SEQ ID NO: 16中給出的序列。
10.一種分離的DNA序列，編碼根據(jù)權(quán)利要求1到9中任何一項所述的抗體融合蛋白的一條或多條重鏈和/或輕鏈。
11.一種克隆或表達載體，包括一個或多個根據(jù)權(quán)利要求10所述的DNA序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的載體，其中該載體包括在SEQID N0:22和SEQ ID NO:24中給出的序列。
13.—種宿主細胞,包括一個或多個根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的克隆或表達載體。
14.一種用于產(chǎn)生如權(quán)利要求1到9中任何一項所述的抗體融合蛋白的方法，包括培養(yǎng)如權(quán)利要求13所述的宿主細胞以及分離該抗體融合蛋白。
15.一種醫(yī)藥組合物，包括根據(jù)權(quán)利要求1到9中任何一項所述的雙特異性抗體融合蛋白，連同醫(yī)藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載劑中的一者或多者。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的醫(yī)藥組合物，另外地包括其他活性成分。
17.根據(jù)權(quán)利要求1到9中任何一項所述的雙特異性抗體融合蛋白或根據(jù)權(quán)利要求15或權(quán)利要求16所述的醫(yī)藥組合物，用于在療法中使用。
18.根據(jù)權(quán)利要求1到9中任何一項所述的雙特異性抗體融合蛋白或根據(jù)權(quán)利要求15或權(quán)利要求16所述的醫(yī)藥組合物，用于在治療或防治由0X40介導(dǎo)或與0X40水平提高相關(guān)的病理性病癥中使用。
19.一種根據(jù)權(quán)利要求1到9中任何一項所述的雙特異性抗體融合蛋白在制造用于治療或防治由0X40介導(dǎo)或與0X40水平提高相關(guān)的病理性病癥的藥物中的用途。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的用途，其中該病理性病癥是一種選自下組的疾病，該組由以下各項組成:過敏、C0PD、自體免疫疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、移植物抗宿主疾病、克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、1型糖尿病、多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡腎炎、重癥肌無力、格雷氏病、移植排斥、韋格納氏肉芽腫病、亨-舍二氏紫癜、系統(tǒng)性硬化以及病毒誘發(fā)的肺部炎癥。
【文檔編號】C07K16/28GK103946240SQ201280055398
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月11日
【發(fā)明者】R·亞當(dāng)斯, P·巴塔, S·P·海伍德, D·P·漢弗萊斯 申請人:Ucb醫(yī)藥有限公司