5-甲氧基，3’-oh未阻斷，可快速光切割的終止核苷酸以及用于核酸測序的方法
【專利摘要】本發(fā)明總體而言涉及具有基于5-甲氧基-取代之硝基芐基的光可切割終止基團(tuán)的標(biāo)記和未標(biāo)記的3′-OH未阻斷核苷酸和核苷，其可用于與DNA和RNA測序和分析相關(guān)的方法和系統(tǒng)。這些化合物可用作可逆終止劑，因其表現(xiàn)出快速的核苷酸摻入動(dòng)力學(xué)，單堿基終止，高核苷酸選擇性，及導(dǎo)致天然存在之核苷酸的快速的終止基團(tuán)切割。
【專利說明】5-甲氧基，3’-OH未阻斷，可快速光切割的終止核苷酸以及
用于核酸測序的方法
【背景技術(shù)】
[0001]本申請要求美國臨時(shí)專利申請N0.61/627，211和61/534，347 (分別于2011年10月7日和2011年9月13日提交)的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容通過引用而并入本文。
1.【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明總體而言涉及用于DNA測序和其他類型DNA分析的組合物和方法。更特別地，本發(fā)明部分涉及具有快速光化學(xué)可切割基團(tuán)的3’ -OH未阻斷核苷酸和核苷，以及將其用于多種DNA測序法中的方法，包括其在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用。
[0003]II現(xiàn)有技術(shù)描述
[0004]快速DNA測序的方法已經(jīng)成為分析人群中疾病和突變以及開發(fā)療法的需求(Metzker，2010，通過引用并入本文)。通常觀察到的人類序列變異形式為單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)，其在基因組序列的約每300至1000個(gè)喊基對中發(fā)生I處，和結(jié)構(gòu)變體(structual variant, SV)(包括塊的替換、插入/缺失、倒位、區(qū)段重復(fù))，以及拷貝數(shù)變體。結(jié)構(gòu)變體可占所有變異事件的22%，比SNP導(dǎo)致的變體堿基更多(Levy等,2007,通過引用并入本文)。這一發(fā)現(xiàn)與Scherer、Hurles及其同事用基于微陣列的方法分析270名個(gè)體所得結(jié)論一致(Redon等，2006，通過引用并入本文)?；谌祟惢蚪M全序列，正努力 過SNP和SV作圖或直接關(guān)聯(lián)來鑒定與常見疾病和癌癥背后的遺傳聯(lián)系。致力于快速、高通量且低成本DNA測序的技術(shù)發(fā)展將促進(jìn)對遺傳信息(如SNP和SV)的理解和其在應(yīng)用醫(yī)學(xué)中的使用。
[0005]一般地，10%至15%的SNP會(huì)通過改變特定的氨基酸殘基而影響蛋白質(zhì)功能，通過改變剪接機(jī)制而影響基因的正確加工，或是通過改變調(diào)節(jié)機(jī)制而影響基因或蛋白質(zhì)的正常表達(dá)水平。SV還可在人類生物學(xué)和疾病中發(fā)揮重要作用(Iafrate等，2004 ;Sebat等，2004 ；Tuzun等，2005 ；Stranger等，2007，通過引用并入本文)。人們設(shè)想，對信息性SNP和SV的鑒定會(huì)導(dǎo)致對遺傳性疾病更準(zhǔn)確的診斷，對風(fēng)險(xiǎn)易感性更好的預(yù)后，或是對組織中偶發(fā)突變的鑒定。個(gè)體SNP和SV譜的一個(gè)應(yīng)用將是通過預(yù)防性藥物治療來顯著地推遲疾病的發(fā)生或發(fā)展。此外，藥物代謝基因的SNP和SV譜可用于制定特定的用藥方案，以提供更安全和更有效的結(jié)果。為實(shí)現(xiàn)這些遠(yuǎn)大的目標(biāo)，基因組測序?qū)⑦M(jìn)入有潛力對大部分人口進(jìn)行部分測序的再測序階段，這將涉及對分布在整個(gè)人類基因組中的特定區(qū)域進(jìn)行并行測序，以獲得給定復(fù)雜疾病的SNP和SV譜。
[0006]大多數(shù)常見疾病中內(nèi)在的序列變異很可能涉及多個(gè)SNP、SV及其多種組合，它們散布于相關(guān)基因中并以低頻率存在。因此，相比于僅以已知SNP為靶標(biāo)的技術(shù)，采用從頭測序策略的DNA測序技術(shù)更有可能檢測和/或發(fā)現(xiàn)這些罕見的、廣泛分布的變體。
[0007]一種NGS技術(shù)可被用于檢測SNP、SV和單核酸變體(single nucleotide variant,SNV)以及它們的各種組合的實(shí)例是癌癥的診斷。這些檢測方法傳統(tǒng)上采用單一標(biāo)記物、單一分析的手段，最近逐漸向在一個(gè)實(shí)驗(yàn)里分析多個(gè)標(biāo)記物的手段演變。然而，每一種癌癥在基因上都是復(fù)雜的，經(jīng)常在許多基因上同時(shí)產(chǎn)生多個(gè)突變。因此，傳統(tǒng)的手段導(dǎo)致檢測昂貴且費(fèi)時(shí)，而且只能提供有選擇的一些已知序列變種的信息。近來NGS技術(shù)的進(jìn)展已經(jīng)允許對著重于與多種癌癥類型相關(guān)并且可以進(jìn)行醫(yī)學(xué)干預(yù)的基因靶標(biāo)采用針對性的手段(參見Su等，2011 ;Beadling等2012)。由于最近測序方面工作的成功，例如癌癥基因組圖(The Cancer Genome Atlas, TCGA)計(jì)劃、國際癌癥基因組聯(lián)盟(International CancerGenome Consortium, ICGC)計(jì)劃和癌癥體細(xì)胞突變目錄(Catalogue of Somatic Mutationsin Cancer, COSMIC)數(shù)據(jù)庫，提供了關(guān)于這些基因靶標(biāo)在許多癌癥類型中的知識(shí)以及含有這些突變的癌癥的治療效果的大量匯編(參見Futreal等2004)。另一些工作(一部分是兒童癌癥基因組計(jì)劃的結(jié)果)已經(jīng)表明兒童癌癥的獨(dú)特的基因特征在于突變的數(shù)目很少并且突變主要存在于非常規(guī)分子途徑中(參見Wu等，2012;Meldrum等，2011)。目前癌癥診斷最大的未滿足之需要是具有所需精確性和靈敏性的快速高通量早期檢測技術(shù)來鑒定屬于正在形成癌變的有限亞群細(xì)胞的稀有序列變種。
[0008]傳統(tǒng)上，DNA測序通過“Sanger”或“雙脫氧(dideoxy) ”法來實(shí)現(xiàn)，所述方法涉及通過用DNA聚合酶摻入2’，3’ -雙脫氧核苷酸(ddNTP)對DNA合成進(jìn)行鏈終止(Mataker等，2005，通過引用并入本文)。自2005年起，采用全自動(dòng)Sanger測序技術(shù)來進(jìn)行基因組分析已基本不是主流。下一代測序(next-generation sequencing, NGS)技術(shù)的優(yōu)勢包括能夠便宜地產(chǎn)生龐大的數(shù)據(jù)容量，在一些情況下每次儀器運(yùn)行讀出超過一億短序列。許多這些方法被統(tǒng)稱為合成測序(sequencing-by-synthesis, SBS),這不能清晰地描述不同的DNA測序機(jī)制(Metzker，2010 ;Metzker，2005，通過引用并入本文)。DNA聚合酶依賴性策略已被分為循環(huán)可逆終止(cyclic reversible termination, CRT)、單核苷酸添加(singlenucleotide addition, SNA,如焦磷酸測序)和實(shí)時(shí)測序。用DNA連接酶替代DNA聚合酶的方法被稱為連接測序 (sequencing-by-ligation, SBL)。Metzker (2010)已描述了這些方法，其通過引用并入本文。
[0009]測序技術(shù)包括許多方法，大致分為(a)模板制備，(b)測序和成像，和(C)數(shù)據(jù)分析。各種具體試驗(yàn)方案的獨(dú)特組合將各種技術(shù)彼此區(qū)分開并且決定了每種平臺(tái)所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)類型。這些數(shù)據(jù)上的差異給基于數(shù)據(jù)質(zhì)量和花費(fèi)來比較各種平臺(tái)帶來挑戰(zhàn)。雖然每個(gè)制造廠家都會(huì)提供質(zhì)量評分和精確度估計(jì)，對于出自一個(gè)技術(shù)平臺(tái)的“達(dá)標(biāo)的堿基”是否等同于另一個(gè)平臺(tái)的“達(dá)標(biāo)的堿基”還是有不同的看法。
[0010]制備下一代測序(NGS)反應(yīng)模板的方法有兩種，包括:源自單個(gè)DNA分子經(jīng)過克隆倍增的模板和單個(gè)DNA分子的模板。利用DNA聚合酶的測序方法分為循環(huán)可逆終止(cyclicreversible termination, CRT)、單核苷酸添加(single nucleotide addition, SNA)和實(shí)時(shí)測序(參見 Metzker, 2010)。連接測序(seq uencing-by-ligation, SBL),即用 DNA 連接酶替代DNA聚合酶的方法,也已被用于NGS技術(shù)(參見如Shendure等,2005 ；Valouev等，2008)。這些測序策略所使用的成像方法涵蓋測量生物性發(fā)光的信號至對單分子事件的四色成像。由這些NGS平臺(tái)產(chǎn)生的巨量數(shù)據(jù)在數(shù)據(jù)儲(chǔ)存、跟蹤和質(zhì)量控制方面對信息技術(shù)有很大的需求(參見Pop和Salzberg, 2008)。
[0011]對從所研究的基因組提出具有代表性、沒有偏差的核酸材料源的可靠方法的需要仍然是一個(gè)重要的目標(biāo)。目前的各種方法總的來說是將基因組DNA隨機(jī)破碎成較小的尺寸，然后從中產(chǎn)生片段模板或伴侶配對的模板。各種NGS技術(shù)的一個(gè)共同之處在于模板是被連接或固定在固體表面或載體上。這種不同模板位點(diǎn)在空間上隔開的固定方式使得數(shù)千到數(shù)十億測序反應(yīng)得以同時(shí)進(jìn)行。
[0012]雖然克隆倍增方法在有些方面優(yōu)于細(xì)菌克隆，有些實(shí)驗(yàn)方案操作起來非常繁瑣而且需要大量的基因組DNA材料(3至20 μ g)。單分子模板的制備更為直接而且需要起始材料更少(〈lug)。更進(jìn)一步的是，這些方法不需要PCR，因PCR會(huì)在克隆倍增的模板上產(chǎn)生突變而被誤認(rèn)為序列變種。富含AT和GC的靶序列也會(huì)在產(chǎn)物收率上呈現(xiàn)倍增偏差，這樣一來使這些系列在基因組比對和組裝時(shí)代表性下降。定量應(yīng)用(如RNA-測序(RNA-seq，參見Wang等，2009))，如果使用非倍增的模板來源，會(huì)更有效地進(jìn)行，因?yàn)檫@樣不會(huì)改變mRNA分子的代表性豐度。
[0013]循環(huán)可逆終止(CRT)方法的重要方面是可逆終止劑，其分為兩種類型:3’ -O-阻斷和3’ -OH未阻斷(Metzker，2010)。ddNTP作為Sanger測序的鏈終止劑的應(yīng)用，為最初開發(fā)連接至核苷酸3'-端的可逆阻斷基團(tuán)提供了基礎(chǔ)(Metzker等，1994 ;Canard和Sarfati, 1994)。諸如3’ -O-烯丙基-dNTP的阻斷基團(tuán)(Metzker等，1994 ;美國專利6，664，079 Ju 等，2006 ;美國專利 7，057，026 ;美國專利 7，345，159 ;美國專利 7，635，578 ；美國專利7, 713，698)和3 ' _0_疊氮甲基-dNTP (美國專利7，057，026 ；Guo等，2008 ；Bentley等，2008 ;美國專利7,414, 116 ;美國專利7，541,444 ;美國專利7，592, 435 ;美國專利7，556，537 ;美國專利7，771，973)已被應(yīng)用于CRT。3，-O-阻斷終止劑需要裂解兩個(gè)化學(xué)鍵來從堿基上除去熒光基團(tuán)并恢復(fù)3’ -羥基。使用這些可逆終止劑的缺點(diǎn)是連接至3'-端的阻斷基團(tuán)通常造成DNA聚合酶摻入的偏差。經(jīng)常需要對DNA聚合酶的突變誘發(fā)來促進(jìn)3’-0_阻斷終止劑的摻入。大量基因工程改造的DNA聚合酶需要通過含有一個(gè)或更多個(gè)氨基酸替代、插入和/或消除的定位突變或者隨機(jī)突變來產(chǎn)生，隨后經(jīng)過高通量篩選進(jìn)行鑒別，達(dá)到更高效地?fù)饺?’ -O-阻斷之核苷酸的目的。
[0014]通過從巨大的突變DNA聚合酶庫中篩選來鑒別能夠高效地?fù)饺?’ -O-阻斷終止劑的經(jīng)過修飾的酶有很大難度，這導(dǎo)致了 3’ -未阻斷的可逆終止劑的開發(fā)。已證實(shí)，連接至3’ -OH未阻斷核苷酸之堿基的小的光可裂解基團(tuán)可以作為有效的可逆終止劑并且可被野生型 DNA 聚合酶高效地慘入(Wu 等，2007 ；Metzker, 2010 ;Litosh 等，2011 ;Gardner 等，2012 ;美國專利 7，897，737,7, 964，352 和 8，148，503，美國專利申請公布 2011/0287427)。例如，5-羥甲基-2'-脫氧尿苷(HOMedU)被發(fā)現(xiàn)天然存在于許多噬菌體和低等真核生物的基因組中(Gommers-Ampt, 1995,通過引用并入本文)。其輕甲基可以作為連接小的光可裂解終止基團(tuán)的分子把柄(molecular handle)。其他天然存在的可被進(jìn)一步修飾以發(fā)揮可逆終止劑功能的高度修飾堿基包括5-羥甲基-2'-脫氧胞苷(HOMedC)，其被發(fā)現(xiàn)天然存在于T2、T4和T6噬菌體的基因組中(Wyatt和Cohen, 1953 ；Gommers-Ampt, 1995)和哺乳動(dòng)物基因組中(Kriaucionis 和 Heintz, 2009 ；Tahiliani 等，2009 ；Itoi 等，2010)。吡咯并喃唳環(huán)結(jié)構(gòu)(7-脫氮嘌呤)也被發(fā)現(xiàn)天然存在于核苷抗生素(Carrasco和Vdzquez, 1984,通過引用并入本文)和tRNA堿基(Limbach等，1994，通過引用并入本文)中，而且化合物7-脫氮-7-羥甲基-2'-脫氧腺苷(C7-HOMedA) (Rockhill等，1997)和7-脫氮-7-羥甲基-2'-脫氧鳥苷(C7-HOMedG) (McDougall等，2001)已被報(bào)道過。
[0015]本專利的一方面是與羥甲基核苷和核苷酸之堿基相連接的經(jīng)修飾的2-硝基芐基的用途。半個(gè)世紀(jì)前就已被批露，2-硝基甲苯(Wettermark, 1962)和它的衍生物(Wettermark, 1962 ;Hardwick 等，1960 ;Mosher 等，1960;Sousa 和 Weinstein, 1962 ;Weinstein等，1966)被報(bào)道表現(xiàn)出光致變色的性能,這個(gè)現(xiàn)象被認(rèn)為是瞬時(shí)生成酸硝基(ac1-nitro)陰離子中間體的結(jié)果(Weinstein等，1966 ;Morrison, 1969)。不受理論的局限，硝基吸收光子后導(dǎo)致從α _碳奪去氫(Mosher等，1960 ;Berson和Brown, 1955 ；De Mayo,1960)，生成酸硝基陰離子中間體，隨后釋放“籠住的”效應(yīng)分子并生成亞硝羰基副產(chǎn)物(Corrie, 2005),此過程被普遍接受。這些早期研究表明，芐基碳的α -取代(Wettermark,1962)或苯環(huán)4位上給電子基團(tuán)(Sousa和Weinsteinl962 ;Weinstein等1966)的取代增加了光致變色效應(yīng)的速率。這些發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致了對光敏感的2-硝基芐基保護(hù)基團(tuán)的開發(fā)(Barltrop 等，1966 ；Patchornik, 1968 ；Patchornik 等，1970)。然而，光化學(xué)裂解速率的改變程度通常取決于許多因素，已經(jīng)報(bào)道的包括芐基碳的取代(Walker等，1986 ;Hasan等，1997 ;Giegrich 等，1998)、苯環(huán)上的官能團(tuán)(Wootton 和 Trentham, 1989 ;Hasan 等，1997 ；Giegrich 等，1998)和離去基團(tuán)(Walker 等，1986),以及 pH (McCray 等，1980 ;Walker 等，1986 ；ffootton 和 Trentham, 1989)、溶劑(Sousa 和 Weinstein, 1962 ；McGall 等，1997 ；Giegrich等，1998)和光強(qiáng)度(McCray等，1980 ；McGall等，1997)。然而有一個(gè)尚未研究的性質(zhì)是立體化學(xué)，這是因?yàn)?-硝基芐基的芐基取代或α-碳取代會(huì)形成手性中心。對于核苷酸合成的情形，與α -取代的2-硝基芐醇外消旋體的結(jié)合會(huì)生成兩個(gè)非對映異構(gòu)體，它們的唯一區(qū)別就在于芐基碳的絕對構(gòu)型(R或S)。
[0016]另一類3’ -OH-未阻斷核苷酸也已被Mitra等(2003)和Turcatti等(2008)描述過，所述化合物依賴于比較大的突光基團(tuán)(dye group)的空間位阻來阻止加入第一個(gè)核苷酸之后的摻入。需要注明的是，由Wu等(2007)、Litosh等(2011)和Gardner等(2012)描述的取代2-硝基芐基核苷酸類似物不需要體積大的取代基(如熒光團(tuán)(fluorescentdye))來導(dǎo)致DNA合成的 終止。另一類3’-未阻斷核苷酸已被Helicos Biosciences描述。這些核苷酸利用第二核苷或核苷酸類似物作為DNA合成的抑制劑(Bowers等，2009 ;美國專利7，476，734)。觀察到本發(fā)明的化合物與那些由Bowers描述的化合物相比，終止性能有顯著差別。例如，Bowers等描述了采用雙堿基同聚物模板的預(yù)穩(wěn)態(tài)(pre_steady_state)動(dòng)力學(xué)，其中測量了他們所有的3’ -OH未阻斷的“實(shí)質(zhì)性”終止劑的kp()1(+2)速度。Bowers等所作的終止實(shí)驗(yàn)中核苷酸濃度低于微摩爾級(即100至250nM)。與此相對應(yīng)，本發(fā)明的幾個(gè)化合物是以10 μ M和0.5到20分鐘的時(shí)間進(jìn)程進(jìn)行的。兩個(gè)化合物，dU.V和dU.VI，均被迅速地在第一個(gè)堿基位置摻入(2分鐘時(shí)達(dá)100%)，然后在那個(gè)位置終止DNA的合成。即便孵育長達(dá)20分鐘，在預(yù)料的第二堿基位置檢測不到任何明顯的信號。詳情參見Gardner等，2012。
[0017]3’ -OH未阻斷的可逆終止劑相對3’ -O-阻斷核苷酸通常有幾個(gè)優(yōu)勢。例如，對于許多3’ -OH未阻斷的可逆終止劑而言只需一個(gè)化學(xué)鍵的裂解就可從堿基上同時(shí)除去終止基團(tuán)和熒光基團(tuán)。這進(jìn)而導(dǎo)致更高效地將核苷酸復(fù)原以便進(jìn)入下一個(gè)CRT循環(huán)的策略。3’ -OH未阻斷的可逆終止劑的第二個(gè)優(yōu)勢在于許多這些化合物都容易被酶摻入，而且在一些情形下，當(dāng)采用野生型DNA聚合酶時(shí)，可以如天然核苷酸一樣有效地?fù)饺?Wu等，2007 ；Litosh 等，2011 ；Gardner 等，2012 ;美國專利 7，897，737 ;美國專利 7，964，352 ;美國專利8，148，503 ;美國專利申請公布2011/0287427)，盡管在另一些情形下并沒有觀察到這種效率(Bowers等，2009 ;美國專利7，476，734)。3’_0H未阻斷的終止劑面臨的一個(gè)挑戰(zhàn)是產(chǎn)生合適的堿基修飾來導(dǎo)致?lián)饺胍粋€(gè)堿基后終止DNA合成。這一點(diǎn)很重要，因?yàn)槲醋钄嗟?’-OH基團(tuán)是摻入下一個(gè)要進(jìn)來的核苷酸的天然底物。
[0018]下一代測序(NGS)技術(shù)已經(jīng)促進(jìn)了很多重要的生物醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)，然而因下面多種原因仍然需要化學(xué)上的改進(jìn)，包括降低錯(cuò)誤率，縮短較慢的循環(huán)時(shí)間。如要有效地在NGS方法中應(yīng)用，通常期望可逆終止劑表現(xiàn)出多種理想性質(zhì)，包括例如快速的核苷酸摻入動(dòng)力學(xué)、單堿基終止、高核苷酸選擇性和/或終止基團(tuán)的迅速裂解。因此，需要開發(fā)新的核苷和核苷酸來迎接這些挑戰(zhàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0019]在一些方面中，本公開內(nèi)容提供了可用于在高通量測序反應(yīng)中對基因組信息進(jìn)行高效測序的新化合物和組合物。在另一方面中，提供了可高效且經(jīng)濟(jì)地提供基因組信息的試劑和試劑組合。在另一些方面中，本發(fā)明提供了用于診斷方法和用于針對個(gè)體開發(fā)靶向療法的試劑庫和陣列。
[0020]在一些方面中，本公開內(nèi)容提供了可用于DNA測序的新化合物。例如，本公開內(nèi)容提供了下式的化 合物:
[0021]
【權(quán)利要求】
1.下式的化合物:
2.權(quán)利要求1的化合物，其進(jìn)一步定義為式I的化合物。
3.權(quán)利要求1的化合物，其進(jìn)一步定義為式II的化合物。
4.權(quán)利要求1的化合物，其進(jìn)一步定義為式III的化合物。
5.權(quán)利要求1的化合物，其進(jìn)一步定義為式IV的化合物。
6.權(quán)利要求1的化合物，其進(jìn)一步定義為式V的化合物。
7.權(quán)利要求1的化合物，其進(jìn)一步定義為式VI的化合物。
8.權(quán)利要求1的化合物，其進(jìn)一步定義為式VII的化合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的化合物，其中R1為羥基。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的化合物，其中R1為一磷酸酯基。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的化合物，其中R1為二磷酸酯基。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的化合物，其中R1為三磷酸酯基。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的化合物，其中R1為α-硫代三磷酸酯基。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的化合物，其中R1為多磷酸酯基。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)的化合物，其中R2為氫。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)的化合物，其中R2為羥基。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)的化合物，其中R3為烷基(。<8)。
18.權(quán)利要求17的化合物，其中R3為烷基(。3_4)。
19.權(quán)利要求18的化合物，其中R3為異丙基。
20.權(quán)利要求18的化合物，其中R3為叔丁基。
21.根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)的化合物，其中R4為氫。
22.根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)的化合物，其中R4為硝基。
23.根據(jù)權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)的化合物，其中R5為氫。
24.根據(jù)權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)的化合物，其中R5為碘。
25.根據(jù)權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)的化合物，其中R5為為烷氧基(。<6)。
26.權(quán)利要求25的化合物，其中R5為甲氧基。
27.根據(jù)權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)的化合物，其中R5為下式的基團(tuán):
28.權(quán)利要求27的化合物，其中X為亞炔基(。2_8)。
29.權(quán)利要求28的化合物，其中又為-C三C-。
30.根據(jù)權(quán)利要求27至29中任一項(xiàng)的化合物，其中η為O。
31.根據(jù)權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)的化合物，其中R5為下式的基團(tuán):
32.權(quán)利要求31的化合物，其中X為亞炔基(。2_8)。
33.權(quán)利要求32的化合物，其中又為-C三C-。
34.根據(jù)權(quán)利要求31至33中任一項(xiàng)的化合物，其中Y為-CH2-。
35.根據(jù)權(quán)利要求31至34中任一項(xiàng)的化合物，其中η為O。
36.根據(jù)權(quán)利要求31至35中任一項(xiàng)的化合物，其中m為O。
37.根據(jù)權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)的化合物，其中R5為-接頭-報(bào)告基團(tuán)。
38.權(quán)利要求37的化合物，其中所述接頭為:
39.權(quán)利要求38的化合物，其中X為亞炔基(C2_8)。
40.權(quán)利要求39的化合物，其中又為-C三C-。
41.根據(jù)權(quán)利要求38至40中任一項(xiàng)的化合物，其中η為O。
42.權(quán)利要求37的化合物，其中所述接頭為:


43.權(quán)利要求42的化合物，其中X為亞炔基(C2_8)。
44.權(quán)利要求43的化合物，其中又為-C三C-。
45.根據(jù)權(quán)利要求42至44中任一項(xiàng)的化合物，其中Y為-CH2-。
46.根據(jù)權(quán)利要求42至45中任一項(xiàng)的化合物，其中η為O。
47.根據(jù)權(quán)利要求42至46中任一項(xiàng)的化合物，其中m為O。
48.根據(jù)權(quán)利要求37至47中任一項(xiàng)的化合物，其中所述報(bào)告基團(tuán)是基于染料的報(bào)告基團(tuán)，其中所述染料為咕噸、熒光素、羅丹明、BODIPY、花菁、香豆素、芘、酞菁、藻膽蛋白、或方酸菁染料。
49.根據(jù)權(quán)利要求37至47中任一項(xiàng)的化合物，其中所述報(bào)告基團(tuán)為:
50.根據(jù)權(quán)利要求1至49中任一項(xiàng)的化合物，其中R6為氫。
51.根據(jù)權(quán)利要求1至50中任一項(xiàng)的化合物，其中帶星號的碳原子為S構(gòu)型。
52.根據(jù)權(quán)利要求1至50中任一項(xiàng)的化合物，其中帶星號的碳原子為R構(gòu)型。
53.權(quán)利要求1的化合物，其進(jìn)一步定義為:
54.權(quán)利要求1的化合物，其進(jìn)一步定義為:
55.權(quán)利要求1的化合物，其進(jìn)一步定義為:
56.權(quán)利要求1的化合物，其進(jìn)一步定義為:
57.一種對靶核酸進(jìn)行測序的方法，其包括如下步驟: (i)使引物的5’端附著于固體表面；(ii)使靶核酸與附著于所述固體表面的所述引物雜交以形成引物/靶核酸雜交復(fù)合物； (iii)得到聚合酶和根據(jù)權(quán)利要求1至56中任一項(xiàng)所述的一種或更多種化合物，前提是不同的式I至VII化合物具有不同的熒光團(tuán)； (iv)使所述引物/靶核酸雜交復(fù)合物與步驟(iii)的聚合酶和一種或更多種化合物反應(yīng)，以通過聚合酶反應(yīng)形成增長中的引物鏈；(v)通過對所述增長中的引物鏈成像，以通過其熒光團(tuán)鑒定步驟(iv)所摻入的所述化合物； (Vi)將具有所述增長中的引物鏈的所述固體表面暴露于光源以除去下式中的光可切割終止部分:
58.權(quán)利要求57的方法，其中步驟(vi)在疊氮化鈉的存在下進(jìn)行。
59.權(quán)利要求58的方法，其中疊氮化鈉的濃度為0.1mM至IOmM之間。
60.權(quán)利要求59的方法，其中疊氮化鈉的濃度為約ImM。
61.權(quán)利要求57的方法，其中步驟(vi)在醋酸鈉的存在下進(jìn)行。
62.權(quán)利要求61的方法，其中醋酸鈉的濃度為0.1mM至10mM。
63.權(quán)利要求61的方法，其中醋酸鈉的濃度為約ImM。
64.根據(jù)權(quán)利要求57至63中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(V)或(vi)在硫脲的存在下進(jìn)行。
65.權(quán)利要求64的方法，其中硫脲的濃度為IOmM至500mM。
66.權(quán)利要求64的方法，其中硫脲的濃度為約lOOmM。
67.權(quán)利要求58的方法，其中步驟(vi)在二硫蘇糖醇(DTT)的存在下進(jìn)行。
68.一種對靶核酸進(jìn)行測序的方法，其包括如下步驟: (i)使核酸的5’端附著于固體表面； (ii)使引物與附著于所述固體表面的所述核酸雜交以形成引物/靶核酸雜交復(fù)合物； (iii)得到聚合酶和根據(jù)權(quán)利要求1至56中任一項(xiàng)所述的一種或更多種化合物，前提是不同的式I至VII化合物具有不同的熒光團(tuán)； (iv)使所述引物/靶核酸雜交復(fù)合物與步驟(iii)所述聚合酶和一種或更多種化合物反應(yīng)，以通過聚合酶反應(yīng)形成增長中的引物鏈； (v)通過對所述增長中的引物鏈光學(xué)成像，以通過其熒光團(tuán)鑒定步驟(iv)所摻入的所述化合物； (vi)將具有所述增長中的引物鏈的所述固體表面暴露于光源以除去下式的光可切割終止部分:
69.權(quán)利要求68的方法，其中步驟(vi)在疊氮化鈉的存在下進(jìn)行。
70.權(quán)利要求69的方法，其中步驟(vi)在二硫蘇糖醇(DTT)的存在下進(jìn)行。
71.根據(jù)權(quán)利要求57和68中任一項(xiàng)的方法，其中根據(jù)步驟(iv)摻入至少一種化合物以其天然核苷酸對應(yīng)物摻入效率的約70%至約100%發(fā)生。
72.權(quán)利要求71的方法，其中摻入效率為約85%至約100%。
73.根據(jù)權(quán)利要求57和68中任一項(xiàng)的方法，其中所述聚合酶選自逆轉(zhuǎn)錄酶、末端轉(zhuǎn)移酶和DNA聚合酶。
74.根據(jù)權(quán)利要求57和68中任一項(xiàng)的方法，其中約85%至約100%的光可切割終止部分通過在步驟(vi)中暴露于光源而去除。
75.根據(jù)權(quán)利要求57和68中任一項(xiàng)的方法，其中根據(jù)步驟(iv)摻入至少一種化合物后，以約90%至約100%的效率鏈終止增長。
76.根據(jù)權(quán)利要求57和68中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(V)中使用脈沖多線激發(fā)檢測器進(jìn)行成像。
77.根據(jù)權(quán)利要求57和68中任一項(xiàng)的方法，其還包括在步驟(iv)之后清洗所述增長中的引物鏈。
78.根據(jù)權(quán)利要求57和68中任一項(xiàng)的方法，其還包括在步驟(vi)之后清洗所述延伸引物。
79.根據(jù)權(quán)利要求57和68中任一項(xiàng)的方法，其還包括在步驟(iv)之前對任何沒有在步驟(iv)中反應(yīng)的引物或增長中的引物鏈加帽。
80.根據(jù)權(quán)利要求57和68中任一項(xiàng)的方法，其還包括同步對多個(gè)靶核酸進(jìn)行測序。
81.一種將核酸分子中的非天然組分轉(zhuǎn)化為天然組分的方法，其包括: (i)摻入根據(jù)權(quán)利要求1至56中任一項(xiàng)的化合物； (ii)將所產(chǎn)生的核酸暴露于光源以從所述核酸除去下式的光可切割終止部分:
82.權(quán)利要求81的方法，其還包括同步將多個(gè)核酸分子中的非天然組分轉(zhuǎn)變?yōu)樘烊唤M分。
83.權(quán)利要求82的方法，其還包括同步終止多個(gè)核酸合成。
84.—種終止核酸合成的方法，其包括以下步驟:將根據(jù)權(quán)利要求1的3’-OH未阻斷的核苷酸或核苷放置在聚合酶的環(huán)境中，使所述3’ -OH未阻斷的核苷酸或核苷摻入核酸分子中。
85.權(quán)利要求84的方法，其中摻入所述3’-OH未阻斷的核苷酸或核苷后，終止DNA合成的效率為約90%至約100%。
86.權(quán)利要求84的方法,其中與摻入同所述3’-OH未阻斷的核苷酸或核苷具有同樣堿基的天然核苷酸或核苷的效率相比，摻入所述3’ -OH未阻斷的核苷酸或核苷的效率為約70% 至約 100%。
87.—種進(jìn)行Sanger測序或Sanger型測序的方法,其包括使用根據(jù)權(quán)利要求1至56中任一項(xiàng)的化合物作為終止核苷酸類似物。
88.根據(jù)權(quán)利要求57、68、81、84和87中任一項(xiàng)的方法，其中所述化合物進(jìn)一步定義為式⑴的化合物。
89.根據(jù)權(quán)利要求57、68、81、84和87中任一項(xiàng)的方法，其中所述化合物進(jìn)一步定義為式(II)的化合物。
90.根據(jù)權(quán)利要求57、68、81、84和87中任一項(xiàng)的方法，其中所述化合物進(jìn)一步定義為式(III)的化合物。
91.根據(jù)權(quán)利要求57、68、81、84和87中任一項(xiàng)的方法，其中所述化合物進(jìn)一步定義為式(IV)的化合物。
92.根據(jù)權(quán)利要求57、68、81、84和87中任一項(xiàng)的方法，其中所述化合物進(jìn)一步定義為式(V)的化合物。
93.根據(jù)權(quán)利要求57、68、81、84和87中任一項(xiàng)的方法，其中所述化合物進(jìn)一步定義為式(VI)的化合物。
94.根據(jù)權(quán)利要求57、68、81、84和87中任一項(xiàng)的方法，其中所述化合物進(jìn)一步定義為式(VII)的化合物。
95.—種測定祀核酸序列的方法,其包括: (i)將祀核酸加入Sanger測序或Sanger型測序儀中； (ii)將根據(jù)權(quán)利要求1至56中任一項(xiàng)的一種或更多種化合物加入所述測序儀中，前提是當(dāng)存在多于一種堿基類型時(shí)，每種堿基與不同的熒光團(tuán)相連接； (iii)加入互補(bǔ)的引物和聚合酶；(iv)進(jìn)行聚合酶反應(yīng)以將至少一種步驟(ii)所述的化合物摻入增長中的核酸鏈，以及 (V)利用熒光測序儀器或通過脈沖多線激發(fā)熒光分析Sanger測序反應(yīng)的結(jié)果， 其中步驟⑴至(iii)可以任意順序進(jìn)行。
96.權(quán)利要求95的方法，其中根據(jù)步驟(iv)摻入至少一種化合物后，以約90%至約100%的效率終止鏈增長。
97.權(quán)利要求95的方法，其中在聚合酶反應(yīng)中，與摻入具有相同堿基的天然底物的效率相比，根據(jù)步驟(iv)摻入至少一種化合物的效率為約70%至約100%。
98.權(quán)利要求97的方法，其中摻入效率為約85%至約100%。
99.權(quán)利要求95的方法，其中所述聚合酶選自逆轉(zhuǎn)錄酶、末端轉(zhuǎn)移酶和DNA聚合酶。
100.一種將非天然組分摻入核酸的方法，其包括: (i)將靶核酸加入測序儀中； (ii)將根據(jù)權(quán)利要求1的一種或更多種化合物加入所述測序儀中，前提是當(dāng)存在多于一種堿基類型時(shí)，每種堿基與不同的熒光團(tuán)相連接； (iii)加入聚合酶；以及 (iv)進(jìn)行聚合酶反應(yīng)以將至少一種步驟(ii)所述的化合物摻入增長中的核酸鏈， 其中步驟⑴至(iii)可以任意順序進(jìn)行。
101.權(quán)利要求100的方法，其還包括 (v)分析摻入至少一種來自步驟(ii)的化合物之聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的結(jié)果。
102.權(quán)利要求100的方法，其中根據(jù)步驟(iv)摻入至少一種化合物后，以約90%至約100%的效率終止鏈增長。
103.權(quán)利要求100的方法，其中在所述聚合酶反應(yīng)中，與摻入具有相同堿基的天然底物的效率相比，根據(jù)步驟(iv)摻入至少一種化合物的效率為約70%至約100%。
104.一種進(jìn)行微測序或微測序型測序的方法，其包括將根據(jù)權(quán)利要求1的化合物加入微測序或微測序型測序方法。
105.根據(jù)權(quán)利要求95、100和104中任一項(xiàng)的方法，其中所述化合物進(jìn)一步定義為式(I)的化合物。
106.根據(jù)權(quán)利要求95、100和104中任一項(xiàng)的方法，其中所述化合物進(jìn)一步定義為式(II)的化合物。
107.根據(jù)權(quán)利要求95、100和104中任一項(xiàng)的方法，其中所述化合物進(jìn)一步定義為式(III)的化合物。
108.根據(jù)權(quán)利要求95、100和104中任一項(xiàng)的方法，其中所述化合物進(jìn)一步定義為式(IV)的化合物。
109.根據(jù)權(quán)利要求95、100和104中任一項(xiàng)的方法，其中所述化合物進(jìn)一步定義為式(V)的化合物。
110.根據(jù)權(quán)利要求95、100和104中任一項(xiàng)的方法，其中所述化合物進(jìn)一步定義為式(VI)的化合物。
111.根據(jù)權(quán)利要求95、100和104中任一項(xiàng)的方法，其中所述化合物進(jìn)一步定義為式(VII)的化合物。
112.—種系統(tǒng)，其包含: 含有多個(gè)珠的流通池，其中: 每個(gè)珠與DNA分子相連接，其中已使用聚合酶將根據(jù)權(quán)利要求1至56中任一項(xiàng)的化合物摻入；并且所述流通池至少部分對可見光和紫外光透明； 成像裝置，其配置成采集所述流通池的圖像； 濾光器轉(zhuǎn)盤，其包含至少四個(gè)光譜濾光器，其中所述濾光器轉(zhuǎn)盤配置成在每個(gè)濾光器之間循環(huán)； 燈，其配置成產(chǎn)生從所述流通池通過所述濾光器轉(zhuǎn)盤中的濾光器至所述成像裝置的光路；和 紫外光源，其配置成向所述流通池上的所述DNA分子提供紫外光。
113.權(quán)利要求112中的系統(tǒng)，其中所述流通池為微流體流通池。
114.權(quán)利要求112中的系統(tǒng)，其還包含所述濾光器轉(zhuǎn)盤與所述流通池之間的物鏡。
115.權(quán)利要求112中的系統(tǒng)，其還包含配置成將所述光路導(dǎo)引至所述成像裝置的反光鏡。
【文檔編號】C07H19/20GK104024269SQ201280056158
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2012年9月13日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月13日
【發(fā)明者】布賴恩·菲利普·斯圖皮, 李紅, 吳衛(wèi)東, 梅根·N·赫什, 大衛(wèi)·赫佐格, 西德尼·E·莫里斯, 邁克爾·L·梅茨克 申請人:激光基因公司