使用具有對水解酶抗性的衣殼的vlp的方法
【專利摘要】本發(fā)明描述了新方法和組合物，其使用對水解酶抗性的病毒衣殼蛋白質(zhì)，以制備病毒樣顆粒，以便封入目的靶標貨物分子并且隨后分離且純化目的靶標貨物分子，所述目的靶標貨物分子包括核酸例如siRNA和shRNA以及小肽。
【專利說明】使用具有對水解酶抗性的衣殼的VLP的方法
[0001] 與相關(guān)申請的奪叉參考
[0002] 本專利申請要求于2011年12月21日提交的美國臨時申請?zhí)?1/578, 706、于2012 年3月7日提交的美國臨時申請?zhí)?1/607, 900和于2012年6月19日提交的美國臨時申 請?zhí)?1/661，688的優(yōu)先權(quán)，所述美國臨時申請的完整公開內(nèi)容以引用的方式在此并入。
[0003] 序列表的并入
[0004] "序列表"的紙件拷貝和在軟盤上的計算機可讀形式的序列表的完整內(nèi)容以引用 的方式并入本文，所述軟盤含有命名為450061_SequenceListing_ST25. txt的文件，所述 文件大小為77千字節(jié)并于2012年12月20日創(chuàng)建。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005] 本發(fā)明涉及病毒樣顆粒，且特別涉及使用病毒衣殼作為納米容器的方法和組合 物，所述納米容器用于產(chǎn)生、分離且純化異源核酸和蛋白質(zhì)。

【背景技術(shù)】
[0006] 病毒樣顆粒（VLP)是通過某些病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的表達而部分源自病毒的顆粒，所 述病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)構(gòu)成病毒包膜和/或衣殼，但VLP不含病毒基因組并是非感染性的。VLP 已例如源自乙型肝炎病毒和某些其他病毒，并且已用于研究病毒裝配和疫苗開發(fā)中。
[0007] 病毒衣殼由至少一種蛋白質(zhì)組成，所述蛋白質(zhì)的幾個拷貝裝配形成衣殼。在一些 病毒中，病毒衣殼由病毒包膜覆蓋。此類病毒包膜由病毒糖蛋白和受感染宿主的細胞膜的 部分組成，并且使病毒衣殼與否則與其相互作用的大分子屏蔽。衣殼通常被說成使核酸殼 體化，所述核酸編碼病毒基因組，有時還編碼病毒在天然環(huán)境中的持續(xù)所需的蛋白質(zhì)。為了 病毒的病毒基因組進入新宿主，衣殼必須被拆卸。此類拆卸在通常由宿主用于降解其自身 以及外源組分的條件下發(fā)生，并且最通常涉及蛋白酶解。病毒利用正常宿主過程例如蛋白 酶解降解以激活其周期的關(guān)鍵部分，即衣殼拆卸和基因組釋放。
[0008] 因此并不令人驚訝的是，文獻先前未描述對作用于肽鍵的水解酶抗性的衣殼。其 為較大蛋白質(zhì)的一部分的非常有限數(shù)目的某些特異性肽序列已知略微對某些蛋白酶是抗 性的，但絕大多數(shù)的肽序列則不是。抵抗蛋白酶解的病毒已得到報道，但這些均為有包膜病 毒，其中衣殼由病毒包膜屏蔽。在此類病毒中，衣殼不與所述蛋白酶接觸，即它們被屏蔽免 遭所述蛋白酶作用。因此，病毒衣殼在此類情況下的蛋白酶解穩(wěn)定性的作用（如果存在的 話）是未知的。
[0009] 在重組分子例如蛋白質(zhì)的大規(guī)模制造中，超濾通常在純化步驟中用于去除小于靶 蛋白質(zhì)的分子，從而導致其分離。純化方法也通常涉及沉淀、溶劑萃取和結(jié)晶技術(shù)。這些 分離技術(shù)固有地是簡單和低成本的，因為與色譜法形成對比，它們不是基于表面相互作用， 而是基于本體相互作用。然而，這些技術(shù)通常限制于對簡單系統(tǒng)的應用，并且需要指定用于 每種蛋白質(zhì)和表達系統(tǒng)的不同條件組。另外每種靶標重組蛋白質(zhì)呈現(xiàn)獨特的結(jié)合相互作用 組，由此使得它的分離過程是獨特和復雜的。使用這些簡單分離過程對于重組蛋白質(zhì)的分 離效率因此很低。
[0010] 核酸包括siRNA和miRNA大部分已使用化學合成方法制造。由于所需的大量步 驟和傾向于技術(shù)困難的反應的復雜性以及制造系統(tǒng)的成本，這些方法一般是復雜和高成本 的。另外，涉及的合成試劑是昂貴的，并且因此規(guī)模經(jīng)濟不容易通過簡單增加分批大小來獲 得。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 在一個方面，本公開內(nèi)容提供了病毒樣顆粒（VLP)，其包含封入至少一種異源貨物 (cargo)分子和包裝序列的衣殼。VLP還可包含由衣殼封入的至少一種核酶。異源貨物分 子可包含寡核苷酸或寡核糖核苷酸。VLP可包含一種或多種核酶，并且核酶的側(cè)翼可以是 包裝序列和寡核糖核苷酸，以形成核酸構(gòu)建體。VLP可包含多個核酸構(gòu)建體。在包含寡核 糖核苷酸的VLP中，寡核糖核苷酸可以是選自siRNA、shRNA、sshRNA、IshRNA和miRNA的短 RNA。VLP可包含至少兩種核酶，其中每種核酶選擇為切割短RNA的一個末端。VLP還可包 含由至少1-100個核苷酸組成的接頭，該接頭包含至少40%的A或至少40%的U，其中該接 頭連接寡核糖核苷酸和包裝序列、或寡核糖核苷酸和核酶。核酶可選自例如錘頭狀核酶和 丁型肝炎病毒核酶。錘頭狀核酶可以是具有與寡核糖核苷酸的至少6個連續(xù)核苷酸互補的 連續(xù)核苷酸組的錘頭狀核酶變體。作為另外一種選擇，核酶可以是能夠切割其與寡核糖核 苷酸的連接的突變型丁型肝炎病毒核酶，其速率為野生型丁型肝炎病毒核酶速率的至多約 50%。此類突變型HDV核酶可具有例如選自SEQ ID No :10-18的核酸序列。
[0012] 根據(jù)本公開內(nèi)容的VLP可包括包含野生型病毒衣殼或衣殼蛋白質(zhì)的衣殼，所述 野生型病毒衣殼對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的，所述衣殼蛋白質(zhì)與野 生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列具有至少15%、至少16%、至少 21 %、至少40%、至少41 %、至少45%、至少52%、至少53%、至少56%、至少59%或至少 86%序列同一性，并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。該衣殼可包含具 有SEQ ID N0:3的氨基酸序列的野生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼蛋白質(zhì)。
[0013] 根據(jù)本公開內(nèi)容的VLP可包含包括肽或多肽的異源貨物分子。VLP還可包含偶 聯(lián)異源貨物肽或多肽分子和病毒衣殼的寡核苷酸接頭。寡核苷酸接頭可以是包含核酶序 列的寡核糖核苷酸。作為另外一種選擇，異源貨物分子可包括包含雙功能多核苷酸的雙 分子貨物分子，所述雙功能多核苷酸包含第一適體序列和第二適體序列，所述第一適體序 列特異性結(jié)合具有約l，500Da或更少的分子量的生物活性小分子，所述第二適體序列用 于結(jié)合衣殼的包裝序列。VLP還可包含與第一適體序列結(jié)合的生物活性小分子。生物活 性小分子可包含除草劑或殺蟲劑，所述除草劑或殺蟲劑可選自例如莠去津、啶蟲脒甲拌磷 (acetamipridphorate)、丙溴磷、水胺硫磷和氧樂果（omethoateas)。
[0014] 在另一個方面，本公開內(nèi)容提供了包含核苷酸序列的核酸構(gòu)建體，所述核苷酸序 列編碼短RNA、核酶和包裝序列。短RNA可以例如是siRNA或shRNA。核酸構(gòu)建體還可包含 4-100個核苷酸的連接核苷酸序列，所述核苷酸中至少40 %是A或至少40 %是T，其中該連 接核苷酸序列的側(cè)翼為包裝編碼序列和短RNA編碼序列。核酸構(gòu)建體還可包含4-100個核 苷酸的連接核苷酸序列，所述核苷酸中至少40%是A或至少40%是U，其中該連接核苷酸 序列的側(cè)翼為核酶和短RNA編碼序列。核酶序列的側(cè)翼可以為短RNA和包裝序列。本公開 內(nèi)容還包括包含任何此類核酸構(gòu)建體的載體，和包含此類載體的宿主細胞，以及由此類載 體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的宿主細胞。宿主細胞可以是細菌細胞，例如但不限于大腸桿菌（Escherichia coli)細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、昆蟲細胞、真菌細胞或酵母細胞。宿主細胞還可由第 二載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，所述第二載體包含編碼病毒衣殼的第二核酸序列，所述病毒衣殼對由肽 鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。第二核酸序列可編碼例如編碼病毒衣殼的病 毒蛋白質(zhì)，所述病毒衣殼與野生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼蛋白質(zhì)（SEQ ID NO: 3)的氨基酸 序列具有至少40%序列同一性，并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。如 本文描述的核酸構(gòu)建體還可編碼野生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼蛋白質(zhì)（SEQ ID NO: 3)。此 類核酸構(gòu)建體中的核酶可以是例如錘頭狀核酶、具有與短RNA的至少6個連續(xù)核苷酸互補 的連續(xù)核苷酸組的錘頭狀核酶變體、丁型肝炎病毒核酶、或能夠切割其與短RNA的連接的 突變型丁型肝炎病毒核酶，其速率為野生型丁型肝炎病毒核酶速率的至多50%。非限制性 但示例性突變型HDV核酶具有選自SEQ ID No: 10-18的核酸序列。本公開內(nèi)容還包含經(jīng) 轉(zhuǎn)化以含有本文描述的核酸構(gòu)建體的植物或植物組織，和此類植物或植物組織的種子或后 代，其中該種子或后代包含核酸構(gòu)建體。
[0015] 在另一個方面，本公開內(nèi)容提供了包含下述的組合物：a)各自包含封入至少一種 異源貨物分子的病毒衣殼的多個病毒樣顆粒；和b)對于組合物中存在的每100克衣殼以小 于4克的量存在的一種或多種細胞裂解產(chǎn)物，其中該細胞裂解產(chǎn)物選自蛋白質(zhì)、多肽、肽及 其任何組合。在該組合物中，衣殼例如對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。 衣殼可包含這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其與野生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID N0:3)的氨基 酸序列具有至少15%、至少16%、至少21%、至少40%、至少41%、至少45%、至少52%、 至少53%、至少56%、至少59%或至少86%序列同一性，并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4 催化的水解是抗性的。該衣殼可包含野生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼蛋白質(zhì)（SEQ ID N0:3)。 在該組合物中，異源貨物分子可包含其可以是寡核糖核苷酸的寡核苷酸。寡核糖核苷酸可 例如選自siRNA、shRNA、sshRNA、IshRNA和miRNA。在該組合物中，每個病毒樣顆粒還可包 含至少一種核酶，其中該核酶的側(cè)翼為包裝序列和寡核糖核苷酸，以形成核酸構(gòu)建體，并且 每個病毒樣顆?？砂鄠€核酸構(gòu)建體。在此類組合物的VLP中，核酶可以是例如錘頭狀 核酶、具有與短RNA的至少6個連續(xù)核苷酸互補的連續(xù)核苷酸組的錘頭狀核酶變體、丁型肝 炎病毒核酶、或能夠切割其與短RNA的連接的突變型丁型肝炎病毒核酶，其速率為野生型 丁型肝炎病毒核酶速率的至多50%。非限制性但示例性突變型HDV核酶具有選自SEQ ID No: 10-18的核酸序列。此類組合物中的VLP還可包含4-100個核苷酸的連接核苷酸序列， 所述核苷酸中至少40%是A或至少40%是T，其中該連接核苷酸序列的側(cè)翼為包裝編碼序 列和短RNA編碼序列，或4-100個核苷酸的連接核苷酸序列，所述核苷酸中至少40 %是A或 至少40%是U，其中該連接核苷酸序列的側(cè)翼為核酶和短RNA編碼序列。核酶序列的側(cè)翼 可以為短RNA和包裝序列。此類組合物中的VLP可包含包括肽或多肽的異源貨物分子。組 合物中的此類VLP還可包含偶聯(lián)異源貨物分子和病毒衣殼的寡核苷酸接頭。寡核苷酸接頭 可以是包含核酶序列的寡核糖核苷酸。在此類組合物中，細胞裂解產(chǎn)物可以小于0.5克、小 于0. 2克或小于0. 1克的量存在。
[0016] 在另一個方面，本公開內(nèi)容提供了用于分離和純化靶標貨物分子的方法，該方法 包括：(a)獲得包含多個病毒樣顆粒（VLP)的全細胞裂解物，所述病毒樣顆粒各自包含封入 至少一種靶標貨物分子的衣殼，其中該衣殼對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗 性的；(b)對VLP實施使用肽鍵水解酶類別EC 3. 4的水解，其時間和條件足以切割全細胞 裂解物中存在的但未由衣殼封入的每100個個別多肽中的至少60、至少70、至少80或至少 90個，同時在此類水解前全細胞裂解物中存在的每100個衣殼中的至少60、至少70、至少 80或至少90個在水解后保持完整。在該方法中，衣殼可各自包含這樣的病毒衣殼蛋白質(zhì)， 其與野生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼蛋白質(zhì)（SEQ ID NO:3)的氨基酸序列具有至少15%、至 少16%、至少21 %、至少40%、至少41 %、至少45%、至少52%、至少53%、至少56%、至少 59%或至少86%序列同一性，并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。該 衣殼可各自包含野生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼蛋白質(zhì)（SEQ ID NO:3)。在該方法中，異源 貨物分子可包含其可以是寡核糖核苷酸的寡核苷酸、或肽或多肽。寡核糖核苷酸可例如選 自siRNA、shRNA、sshRNA、lshRNA和miRNA。在該方法中，每個病毒樣顆粒還可包含核酶，其 中該核酶的側(cè)翼為包裝序列和寡核糖核苷酸，以形成核酸構(gòu)建體。該方法還可包括在水解 后純化衣殼。純化可包括液-液萃取步驟、結(jié)晶步驟、分級沉淀步驟和超濾步驟中的至少一 個。本公開內(nèi)容還包含由此類方法產(chǎn)生的組合物。
[0017] 在另一個方面，本公開內(nèi)容提供了在宿主細胞中的細胞內(nèi)生產(chǎn)靶分子后，用于保 護全細胞裂解物中的靶分子不受水解的方法，該方法包括：(a)選擇對由肽鍵水解酶類別 EC 3. 4催化的水解是抗性的病毒衣殼；(b)用第一載體和第二載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染宿主細胞，所 述第一載體包含編碼形成病毒衣殼的病毒蛋白質(zhì)的核酸序列，所述第二載體包括包含核酶 的核酸序列，所述核酶的側(cè)翼為包裝序列和siRNA序列；和（c)使細胞維持在足以使經(jīng)轉(zhuǎn) 化的細胞表達且裝配殼體化核酶的衣殼的時間和條件下，所述核酶的側(cè)翼為包裝序列和 siRNA序列。在該方法中，衣殼可各自包含這樣的病毒衣殼蛋白質(zhì)，其與野生型腸桿菌噬菌 體MS2衣殼蛋白質(zhì)（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列具有至少15%、至少16%、至少21 %、至少 40%、至少41 %、至少45%、至少52%、至少53%、至少56%、至少59%或至少86%序列同 一性，并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。
[0018] 在另一個方面，本公開內(nèi)容提供了用于純化封入至少一種異源貨物分子的VLP的 方法，該方法包括：(a)獲得包含多個VLP的細胞裂解物；(b)使細胞裂解物與蛋白酶接觸 足以水解除VLP外的細胞裂解產(chǎn)物的時間和條件，以形成水解產(chǎn)物；和（c)從水解產(chǎn)物中分 離VLP。步驟（c)可包括（i)執(zhí)行使用硫酸銨的第一沉淀，隨后為第一離心，以獲得第一沉 淀物和第一上清液；和（ii)對第一上清液執(zhí)行使用硫酸銨的第二沉淀，隨后為第二離心， 以獲得第二沉淀物，其中該第二沉淀物包含按重量計至少約70%、80%或90%的VLP。步驟 (c)可包括（i)執(zhí)行使用乙醇的第一沉淀，隨后為第一離心，以獲得第一沉淀物和第一上清 液；和（ii)對第一上清液執(zhí)行使用硫酸銨的第二沉淀，隨后為第二離心，以獲得第二沉淀 物，其中該第二沉淀物包含按重量計至少約70%、80%或90%的VLP。步驟（c)可包括使水 解產(chǎn)物超離心，以獲得包含按重量計至少約70%、80%或90%的VLP的沉淀物。在該方法 中，VLP可各自包含對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的衣殼，所述衣殼可包 含這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其與野生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列具 有至少15 %、至少16 %、至少21 %、至少40 %、至少41 %、至少45 %、至少52 %、至少53 %、 至少56%、至少59 %或至少86 %序列同一性，并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解 是抗性的。VLP可各自包含野生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼蛋白質(zhì)（SEQ ID N0:3)。在該方 法中，步驟（b)可在約37°C下執(zhí)行至少約30分鐘。該過程還可包括在步驟（b)前，使細胞 裂解物與核酸酶、淀粉酶和脂肪酶（lypase)中的至少一種在約37°C下接觸至少約30分鐘。 在該方法中，蛋白酶可以例如是肽鍵水解酶類別EC 3. 4,其可選自例如蛋白酶K、來自灰色 鏈霉菌（Streptomyces griseus)的蛋白酶、來自地衣芽抱桿菌（Bacillus lichenformis) 的蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶。在該方法中，由VLP封入的異源貨物分子可包含其可以 是寡核糖核苷酸的寡核苷酸、或肽或多肽。寡核糖核苷酸可例如選自siRNA、shRNA、 SShRNA、 IshRNA和miRNA。在該方法中，VLP各自還可包含如本文描述的核酶，其側(cè)翼為包裝序列和 寡核糖核苷酸，以形成核酸構(gòu)建體。寡核糖核苷酸和包裝序列可由接頭序列連接，所述接頭 序列具有至少1-100個核苷酸，并且包含超過40%的A、超過40%的U或超過40%的T。該 方法還可包括在步驟（a)前通過下述制備細胞裂解物：在細胞中表達VLP后離心細胞；重 懸浮細胞；裂解細胞且離心細胞裂解物，以獲得上清液，其中該上清液用作步驟（a)的細胞 裂解物。
[0019] 在另一個方面，本公開內(nèi)容提供了 VLP，所述VLP包含封入至少一種異源貨物分子 和包裝序列的衣殼，其中該衣殼包含其為野生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID N0:3)的 變體的衣殼蛋白質(zhì)。衣殼蛋白質(zhì)可以是這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其具有野生型腸桿菌噬菌體MS2 衣殼（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，除了在第1位處的A殘基被缺失，并且對由肽鍵水解酶 類別EC 3.4催化的水解是抗性的之外。衣殼蛋白質(zhì)可以是這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其具有野生 型腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，除了在第1位處的A殘基被缺失和 在第2位處的S殘基被缺失，并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的之外。 衣殼蛋白質(zhì)可以是這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其具有野生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID N0:3) 的氨基酸序列，除了在第1位處的A殘基被缺失、在第2位處的S殘基被缺失和在第3位處 的N殘基被缺失，并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的之外。衣殼蛋白質(zhì) 可以是這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其具有野生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID N0:3)的氨基酸 序列，除了在第129位處的Y殘基被缺失，并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是 抗性的之外。衣殼蛋白質(zhì)可以是這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其具有野生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼 (SEQ ID NO:3)的氨基酸序列，但具有在112-117區(qū)段中的單個（1個）氨基酸缺失，并且對 由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。衣殼蛋白質(zhì)可以是這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其 具有野生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，但具有在112-117區(qū)段 中的單個（1個）氨基酸缺失，并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。衣 殼蛋白質(zhì)可以是這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其具有野生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID N0:3) 的氨基酸序列，但具有在65-83區(qū)段中的1-2個殘基插入，并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4 催化的水解是抗性的。衣殼蛋白質(zhì)可以是這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其具有野生型腸桿菌噬菌體 MS2衣殼（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，但具有在44-55區(qū)段中的1-2個殘基插入，并且對 由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。衣殼蛋白質(zhì)可以是這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其 具有野生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，但具有在33-43區(qū)段中 的單個（1個）殘基插入，并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。衣殼蛋 白質(zhì)可以是這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其具有野生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID N0:3)的氨 基酸序列，但具有在24-30區(qū)段中的1-2個殘基插入，并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催 化的水解是抗性的。衣殼蛋白質(zhì)可以是這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其具有野生型腸桿菌噬菌體MS2 衣殼（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，但具有在10-18區(qū)段中的單個（1個）殘基插入，并且對 由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。衣殼可包含與第二衣殼單體序列串聯(lián)的 衣殼蛋白質(zhì)單體序列，所述衣殼蛋白質(zhì)單體序列裝配成對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化 的水解是抗性的衣殼。該衣殼可包含其C末端由0-6殘基接頭區(qū)段延伸的衣殼蛋白質(zhì)單體 序列，所述接頭區(qū)段的C末端與第二衣殼單體序列串聯(lián)，所有這些裝配成對由肽鍵水解酶 類別EC 3. 4催化的水解是抗性的衣殼。接頭區(qū)段可具有序列例如-(Gly)x，其中X = 0-6， 包括-Gly- ;-Gly_Gly-;和-Gly-Gly-Gly-。接頭區(qū)段可以是選自-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-、 -Gly-Gly-Ser和-Gly-Ser-Gly-的Gly-Ser接頭。該衣殼可包含與第三衣殼單體序列串 聯(lián)的衣殼蛋白質(zhì)，所述衣殼蛋白質(zhì)裝配成對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性 的衣殼。該衣殼可包含其中C末端由0-6殘基接頭區(qū)段延伸的衣殼蛋白質(zhì)，所述接頭區(qū)段 的C末端與第三衣殼單體序列串聯(lián)，所有這些裝配成對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水 解是抗性的衣殼。該衣殼可包含衣殼蛋白質(zhì)，其中該衣殼包含衣殼蛋白質(zhì)，其中一個或兩個 接頭序列是 _(Gly)x，其中 X = 0-6,包括-Gly- ;-Gly_Gly-;和-Gly-Gly-Gly-。接頭區(qū)段 可以是選自-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-、-Gly-Gly-Ser 和-Gly-Ser-Gly-的 Gly-Ser 接頭。
[0020] 此類衣殼蛋白質(zhì)例如裝配成對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的衣 殼。例如，該衣殼可包含其中一個或兩個接頭序列是-(Gly)x-，X = 1的衣殼蛋白質(zhì)，所述 衣殼蛋白質(zhì)裝配成對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的衣殼。該衣殼可包含 其中一個或兩個接頭序列是-(Gly)X-，X = 2的衣殼蛋白質(zhì)，所述衣殼蛋白質(zhì)裝配成對由 肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的衣殼。該衣殼可包含其中一個或兩個接頭序 列是-(Gly)x-，X = 3的衣殼蛋白質(zhì)，所述衣殼蛋白質(zhì)裝配成對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4 催化的水解是抗性的衣殼。該衣殼可包含其N末端截短1-3個殘基的一種或多種外殼蛋白 質(zhì)序列，并且如本文描述的接頭區(qū)段延長缺失的殘基數(shù)目，并且其對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。該衣殼可包含其C末端截短1個殘基的一種或多種外殼蛋白質(zhì) 序列，并且如本文描述的接頭區(qū)段延長一個殘基，其中所述衣殼對由肽鍵水解酶類別EC3. 4 催化的水解是抗性的。該衣殼可包含在串聯(lián)二聚體中其C末端截短1個殘基的第一外殼蛋 白質(zhì)序列，和延長一個殘基的接頭區(qū)段，或其中在串聯(lián)三聚體中的第一和/或第二外殼蛋 白質(zhì)序列C末端截短1個殘基，并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。衣 殼可包含這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其具有N末端和C末端截短，并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4 催化的水解是抗性的。
[0021] 對彩圖的提及
[0022] 申請文件含有至少一張彩色照片。具有彩色照片的本專利申請公開的拷貝將在請 求和支付必要費用由專利局提供。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1是隨著時間過去的光密度（0D ;實心菱形）和pH(空心正方形）的圖，顯示野 生型MS2細菌噬菌體（ATCC編號15597-B1，來自美國典型培養(yǎng)物中心，Rockville, MD)在其 大腸桿菌宿主（ATCC編號15669)中的繁殖。
[0024] 圖2是顯示在大腸桿菌中繁殖且使用蛋白酶K和超濾純化后獲得的MS2細菌噬菌 體樣品的SDS-PAGE分析結(jié)果的凝膠，顯示蛋白酶K純化獲得純化至高于99 %的噬菌體（在 14kDa處的條帶對應于MS2細菌噬菌體外殼蛋白質(zhì)）。
[0025] 圖3是顯示部分純化的MS2的SDS-PAGE分析結(jié)果的凝膠，顯示噬菌體的完全降解 和在裂解物的lx或2x超濾后獲得的結(jié)果（泳道4和6)。
[0026] 圖4是顯示使用超濾和蛋白酶K處理純化的MS2樣品的SDS-PAGE分析結(jié)果的凝 膠。
[0027] 圖5是顯示MS2樣品的SDS-PAGE分析結(jié)果的凝膠，所述MS2樣品使用蛋白酶K處 理、在酸性條件下沉淀、在堿性和酸性條件下使用乙醇沉淀和超濾進行純化。
[0028] 圖6是顯示MS2樣品的UV光譜的圖，所述MS2樣品使用蛋白酶K處理、在酸性條 件下沉淀、在堿性和酸性條件下使用乙醇沉淀和超濾進行純化。
[0029] 圖7是在對于圖5和6描述的純化后，在用溴化乙啶染色的1.5%瓊脂糖 凝膠中進行色譜的得自MS2樣品的PCR產(chǎn)物的色譜圖（1.2kbp對于泳道1中的引物 F1201_1223-R1979_2001，800bp 對于泳道 2 中的引物 F1201_1223-R1979_2001，和 304bp 對 于泳道3中的引物F1401_1426-R1680_1705)，顯示與完整MS2細菌噬菌體基因組的一致性。
[0030] 圖8是在對于圖5和6描述的純化后，用對照樣品（空心菱形）和MS2樣品獲得的 隨著時間過去的光密度（0D;實心菱形）圖，顯示純化的樣品含有保留高感染性的噬菌體。
[0031] 圖9是顯示在殼體化RNA的MS2衣殼表達后，MS2樣品的SDS-PAGE分析結(jié)果的凝 膠，所述RNA編碼附著至外殼特異性19聚體RNA發(fā)夾的外殼蛋白質(zhì)。
[0032] 圖10是在純化后，在用溴化乙啶染色的2%瓊脂糖凝膠中進行色譜的（泳道1中 的304bp ;最左邊的泳道對應于lkb加上來自Life Technologies的梯），來自就MS2衣殼 部分的存在或不存在的MS2樣品的PCR查詢的PCR產(chǎn)物色譜圖，顯示與完整MS2外殼基因 的一致性。
[0033] 圖11是顯示對于MS2病毒樣顆粒（VLP)的純化，在用乙醇簡單沉淀后，MS2樣品 的SDS-PAGE分析結(jié)果的凝膠。
[0034] 圖12是顯示對于MS2 VLP的純化，在使用蛋白酶K(PK)和用乙醇簡單沉淀后，MS2 樣品的SDS-PAGE分析結(jié)果的凝膠。
[0035] 圖13是顯示對于MS2 VLP的純化，在使用組成性水解酶（CH)、用乙醇分級沉淀和 超濾后，MS2樣品的SDS-PAGE分析結(jié)果的凝膠。
[0036] 圖14是顯示對于MS2 VLP的純化，在使用多種水解酶和用硫酸銨分級沉淀后，MS2 樣品的SDS-PAGE分析結(jié)果的凝膠。
[0037] 圖15是顯示得自在MS2衣殼中殼體化的RNA的RNA的PAGE分析結(jié)果的凝膠。
[0038] 圖16是顯示在使用丁型肝炎病毒（HDV)核酶體外轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的RNA產(chǎn)物的PAGE 分析結(jié)果的凝膠。
[0039] 圖17是顯示在使用長側(cè)翼錘頭狀核酶的體外轉(zhuǎn)錄過程中獲得的siRNA產(chǎn)物的 PAGE分析結(jié)果的凝膠。
[0040] 圖18是顯示在VLP純化和從VLP中分離RNA后，得自在VLP中殼體化的RNA的 RNA產(chǎn)物的PAGE分析結(jié)果的凝膠。
[0041] 圖19是顯不在VLP純化和懸浮，以及暴露于多種蛋白酶1小時和4小時溫育后， 包含MS2衣殼的VLP的SDS-PAGE分析結(jié)果的一系列凝膠。
[0042] 圖20是所選腸桿菌噬菌體MS2衣殼蛋白質(zhì)的比對。
[0043] 圖21是從UniProt數(shù)據(jù)庫中檢索，并使用其BLAST多重比對伴隨加權(quán)陣列選擇、 缺口罰分等的缺省值比對的，完全光滑病毒科（leviviridae)病毒外殼蛋白質(zhì)序列的比 對。
[0044] 圖22是1AQ3鏈B(光滑病毒科外殼蛋白質(zhì)單體）與1QBE鏈C(alloleviridae外 殼蛋白質(zhì)單體）的主鏈疊加的圖示說明。
[0045] 圖23是圖22中所示的1AQ3鏈B(光滑病毒科外殼蛋白質(zhì)單體）與1QBE鏈 C(alloleviridae外殼蛋白質(zhì)單體）的主鏈疊加的可替代視圖的圖示說明。
[0046] 圖24是圖22中所示的1AQ3鏈B(光滑病毒科外殼蛋白質(zhì)單體）與1QBE鏈 C(alloleviridae外殼蛋白質(zhì)單體）的主鏈疊加的另一個可替代視圖的圖示說明。
[0047] 圖25是圖22中所示的1AQ3鏈B(光滑病毒科外殼蛋白質(zhì)單體）與1QBE鏈 C(alloleviridae外殼蛋白質(zhì)單體）的主鏈疊加的另一個可替代視圖的圖示說明。
[0048] 圖26是使用jFATCAT剛性的1AQ3、2VTU和1QBE的結(jié)構(gòu)序列比對。
[0049] 圖27是從UniProt數(shù)據(jù)庫中檢索，并使用其BLAST多重比對伴隨加權(quán)陣列選擇、 缺口罰分等的缺省值比對的，完全alloleviviridae病毒外殼蛋白質(zhì)序列的比對。
[0050] 圖28是顯不形成二十面體（isosahedral)光滑病毒科和alloleviviridae衣殼 的180個單體中的另外60個的圖示說明。每個單體的主鏈由不同顏色的色帶表示。主鏈 氫鍵由青色線表示。二十面體三重軸在該圖的中心。單體-單體接觸不填充由連接柔性環(huán) 67-81的尖端的氫鍵描繪輪廓的中心圓圈。
[0051] 圖29是顯示由與二十面體衣殼（色帶代表為褐色和藏青色的單體主鏈）接 觸的單體圍繞的2個MS2單體（色帶代表顏色為黑色和淡藍色的主鏈）的圖示說明。 alloleviviridaeQP具有就光滑病毒科而言在殘基72和73之間（紅色，底部中心）的兩 殘基缺失。中心空隙緊在該缺失位點下（圖5)。缺失引起它輕微擴展。在126處的Qi3缺 失（紅色，中心左側(cè)）去除來自區(qū)段的偏移，而是在基本上使單體容納在原位的鄰近單體片 層之間的廣泛接觸。使用MS2序列編號。
[0052] 圖30是由與二十面體衣殼（色帶代表為褐色和藏青色的單體主鏈）接觸 的單體圍繞的2個MS2單體（色帶代表顏色為黑色和淡藍色的主鏈）的圖示說明。 alloleviviridae 具有就光滑病毒科而言在殘基12和13之間（黃色，左上中心）的一 殘基插入，從外衣殼表面延伸到溶劑內(nèi)的柔性環(huán)；在延伸到內(nèi)部貨物內(nèi)的鏈連接末端處，在 殘基53和54之間（黃色，左下中心）的兩殘基插入；在殘基27和28之間的一殘基插入也 在延伸到衣殼貨物空間內(nèi)的β折疊股（beta-strand)連接體末端處。這些插入無一需要 在單體折疊中或鄰居之間的移動。
[0053] 圖31是由與二十面體衣殼（色帶代表為褐色和藏青色的單體主鏈）接觸 的單體圍繞的2個MS2單體（色帶代表顏色為黑色和淡藍色的主鏈）的圖示說明。 alloleviviridae 具有就光滑病毒科而言在殘基36和37之間（黃色，中心右側(cè)）的一 殘基插入。環(huán)針對鄰近螺旋的末端壓緊，但插入的殘基可延伸到緊下方的柔性環(huán)上方的中 心空間內(nèi)。
[0054] 圖32是在裝配的衣殼中在對稱點周圍壓緊的3個非共價腸桿菌噬菌體MS2非共 價二聚體的主鏈色帶的圖示說明，其中所有Ν末端顏色為綠色，C末端顏色為紅色。

【具體實施方式】
[0055] 如本章節(jié)和本文整個公開內(nèi)容中使用的章節(jié)標題不預期是限制性的。
[0056] A.定義
[0057] 如本文使用的，除非上下文另有明確說明，否則單數(shù)形式"一個"、"一種"和"該/ 所述"包括復數(shù)所指對象。對于本文數(shù)目范圍的敘述，明確考慮具有相同精確度的兩者之 間的每個插入數(shù)目。例如，對于范圍6-9,考慮除6和9之外的數(shù)目7和8,并且對于范圍 6. 0-7. 0,明確考慮數(shù)目 6· 0、6· 1、6· 2、6· 3、6· 4、6· 5、6· 6、6· 7、6· 8、6· 9 和 7. 0。
[0058] 除非另有說明，否則"或"的使用意指"和/或"。此外，術(shù)語"包括"以及其他形式 的使用不是限制性的。
[0059] 除非本文另有定義，否則與本公開內(nèi)容結(jié)合使用的科學和技術(shù)術(shù)語應具有由本領(lǐng) 域普通技術(shù)人員通常理解的含義。例如，與本文描述的動物和細胞解剖學、細胞和組織培 養(yǎng)、生物化學、分子生物學、免疫學和微生物學結(jié)合使用的任何命名法和技術(shù)是本領(lǐng)域眾所 周知和通常使用的那些。術(shù)語的含義和范圍應是明確的；然而，在任何潛在歧義的情況下， 本文提供的定義優(yōu)先于任何字典或外部定義。另外，除非上下文另有要求，否則單數(shù)術(shù)語應 包括復數(shù)，并且復數(shù)術(shù)語應包括單數(shù)。
[0060] 被采用并可用于實踐本文描述的方法和組合物的化學、生物化學、分子生物學和 免疫學中的廣泛范圍的常規(guī)技術(shù)和工具，在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力內(nèi)，并且在文獻中 充分描述。此類技術(shù)和工具包括用于生成和純化VLP的技術(shù)和工具，該VLP包括具有野生 型或重組衣殼連同一種或多種貨物分子的VLP，以及用于轉(zhuǎn)化宿主生物和表達如本文描述 的重組蛋白質(zhì)和核酸的技術(shù)和工具。參見例如，MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL 第 2 版·1989 (Sambrook 等人，Cold Spring Harbor Laboratory Press);和 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel 等人編輯，GreenePubl. Assoc.，Wiley-Inter science，NY) 1995。所述參考文獻各自的公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。
[0061] 如本文使用的，術(shù)語"貨物分子"指由衣殼封入或可由衣殼封入的寡核苷酸、多肽 或肽分子。
[0062] 如本文使用的，術(shù)語"寡核苷酸"指由磷酸二酯鍵連接的至少兩個和不超過約70 個核苷酸、優(yōu)選不超過約55個核苷酸的短聚合物。寡核苷酸可以是寡脫氧核苷酸（DNA)或 寡核糖核苷酸（RNA)，并且包含短RNA分子例如但不限于siRNA、shRNA、sshRNA和miRNA。
[0063] 如本文使用的，術(shù)語"肽"指聚合物分子，其最低限度包括由肽鍵連接的至少兩個 氨基酸單體，并且優(yōu)選具有由肽鍵連接的至少約10、和更優(yōu)選至少約20個氨基酸單體，且 不超過約60個氨基酸單體、優(yōu)選不超過約50個氨基酸單體。例如，該術(shù)語包含具有約10、 約20、約30、約40、約50或約60個氨基酸殘基的聚合物。
[0064] 如本文使用的，術(shù)語"多肽"指包括由肽鍵連接的至少一條氨基酸單體鏈的聚合物 分子，其中該鏈包括至少約70個氨基酸殘基、優(yōu)選至少約80、更優(yōu)選至少約90、且再更優(yōu)選 至少約100個氨基酸殘基。如本文使用的，該術(shù)語包含蛋白質(zhì)，其可包括一條或多條連接的 多肽鏈，所述多肽鏈還可與輔因子或其他蛋白質(zhì)結(jié)合或不結(jié)合。如本文使用的術(shù)語"蛋白 質(zhì)"與術(shù)語"多肽"可互換使用。
[0065] 如本文使用的，術(shù)語就分子而言的"變體"是與天然或野生型分子的序列基本上類 似的序列。就核苷酸序列而言，變體包括這樣的序列，其可關(guān)于一個或多個堿基改變，但由 于遺傳密碼的簡并性，仍編碼天然蛋白質(zhì)的相同氨基酸序列。變體包括天然存在的等位基 因，以及使用分子生物學中眾所周知的技術(shù)例如定點誘變改造并且編碼天然蛋白質(zhì)的核苷 酸序列，以及編碼具有氨基酸置換的多肽的序列。一般地，本發(fā)明的核苷酸序列變體與天然 (內(nèi)源）核苷酸序列具有至少40%、至少50%、至少60%、至少70%或至少80%序列同一 性。本公開內(nèi)容還包含具有至少約85 %序列同一性，至少約90 %序列同一性，至少約85%、 86%、87%、88%、89%、90% 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的核苷酸 序列變體。
[0066] 如本文就給定核苷酸序列而言使用的，術(shù)語"保守變體"指編碼與參考序列的氨基 酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列的核苷酸序列。由于遺傳密碼的簡并性，由此幾乎 始終超過一個密碼子可編碼每個氨基酸，編碼非常緊密相關(guān)的蛋白質(zhì)的核苷酸序列可不共 享高水平的序列同一性。此外，不同生物具有用于許多氨基酸的優(yōu)選密碼子，并且不同生 物或甚至相同生物的不同菌株例如大腸桿菌菌株，可具有用于相同氨基酸的不同優(yōu)選密碼 子。因此，編碼與第二核苷酸序列基本上相同的多肽的第一核苷酸序列視為與第二核苷酸 序列基本上相同，即使它們不共享最低限度百分比的序列同一性，或在嚴格條件下將不彼 此雜交。另外，應當理解在通常為甲硫氨酸的唯一密碼子的ATG的有限例外情況下，任何序 列均可通過標準技術(shù)進行修飾，以獲得功能上相同的分子，并且此類修飾由本公開內(nèi)容包 含。如本文下文描述的，本公開內(nèi)容特別考慮天然蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)變體，其具有氨基酸序 列，所述氨基酸序列與天然核苷酸序列具有至少15%、至少16%、至少21%、至少40%、至 少41%、至少52%、至少53%、至少56%、至少59%或至少86%序列同一性。
[0067] 在分子的限定區(qū)域內(nèi)或跨越全長序列的氨基酸序列或核苷酸序列的序列同一性， 可使用本領(lǐng)域已知和如本文描述的常規(guī)工具和方法容易地測定。例如，兩個氨基酸序列或 兩個核苷酸序列的序列同一性程度使用比對工具容易地測定，所述比對工具例如NCBI基 本局部比對搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool) (BLAST) (Altschul 等人， 1990)，其可容易地得自多個在線源。最佳序列比對的算法是本領(lǐng)域眾所周知且描述的，包 括例如在 Smith 和 Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981) ;Pearson和 Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.)85 :2444(1988)中。序列分析的算法也在程序例如blastp、blastn、 blastx、tblastn和tblastx中可容易獲得。為了本公開內(nèi)容的目的，當兩個核苷酸序列在 嚴格條件下彼此雜交時，它們也可視為"基本上相同的"。嚴格條件包括高雜交溫度和雜交 緩沖液中的低鹽，其僅允許在高度相似的核酸序列之間的雜交。嚴格條件是序列依賴性的， 并且在不同環(huán)境下將是不同的，但通常包括至少約60°C的溫度，其比在限定離子強度和pH 下對于特定序列的熱解鏈溫度（Tm)低約10°C至約15°C。鹽濃度通常為在pH7下約0. 02 摩爾。
[0068] 兩個氨基酸序列之間的序列同一性程度可使用Karlin和Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci.USA87:2264-2268, 1993)的BLASTp算法進行測定。序列同一性百分比通過在 比較窗上比較兩個最佳比對的序列進行測定，其中為了兩個序列的最佳比對，與參考序列 (其不包含添加或缺失）相比較，在比較窗中的氨基酸序列部分可包含添加或缺失（即缺 口）。百分比通過下述進行計算：測定在該處相同氨基酸在兩個序列中存在的位置數(shù)目，以 獲得匹配位置數(shù)目，將匹配位置數(shù)目除以比較窗中的總位置數(shù)目，并且將結(jié)果乘以100,以 獲得序列同一性百分比。
[0069] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到多肽可以是"基本上相似的"，因為氨基酸可由相似氨基 酸殘基置換，而不影響成熟蛋白質(zhì)的功能。其為"基本上相似的"多肽序列共享如上所述的 序列，除了并非相同的殘基位置可具有保守氨基酸改變之外。保守氨基酸置換指具有相似 側(cè)鏈的殘基的可互換性。例如，具有脂肪族側(cè)鏈的一組氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮 氨酸和異亮氨酸；具有脂肪族-羥基側(cè)鏈的一組氨基酸是絲氨酸和蘇氨酸；具有含酰胺側(cè) 鏈的一組氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族側(cè)鏈的一組氨基酸是苯丙氨酸、酪氨 酸和色氨酸；具有堿性側(cè)鏈的一組氨基酸是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；和具有含硫側(cè)鏈的 一組氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸置換組包括：纈氨酸-賴氨酸-異 亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、和天冬酰胺-谷氨酰胺。
[0070] 編碼肽、多肽或蛋白質(zhì)的核酸可通過使用給定蛋白質(zhì)的推導氨基酸序列篩選所選 cDNA或基因組文庫來獲得。使用如例如Sambrook等人中所述的引物延伸操作的常規(guī)操作 可用于檢測前體和加工中間產(chǎn)物。
[0071] 由封入貨物分子的衣殼組成的病毒樣顆粒（VLP)
[0072] 本文描述的方法和組合物是下述理解的部分的結(jié)果：某些病毒衣殼可在新制造和 純化方法中制備和/或使用，以改善核酸的商業(yè)化操作。本文描述的方法使用對可容易獲 得的水解酶抗性的重組病毒衣殼，以封入異源貨物分子例如核酸、肽或多肽包括蛋白質(zhì)。
[0073] 衣殼可以是野生型衣殼或源自野生型衣殼的突變型衣殼，條件是當衣殼與作用于 肽鍵的至少一種水解酶接觸時，衣殼顯示出對由水解酶催化的水解的抗性。如本文可互換 使用的，短語"對水解抗性"和"水解抗性的"指任何衣殼，其當存在于也含有多肽（所述多 肽是細胞裂解產(chǎn)物且不封入衣殼中）的全細胞裂解物中時，并且實施使用肽鍵水解酶類別 EC 3.4的水解，其時間和條件足以切割裂解物（其為細胞裂解產(chǎn)物且不封入衣殼中）中存 在的每100個個別多肽中的至少60、至少70、至少80或至少90個（即所有個別未封入多 肽的至少60%、至少70%、至少80%或至少90%被切割），然而在此類水解前存在的每100 個衣殼中的至少60、至少70、至少80或至少90個在水解后保持完整。水解可進行這樣的 時間段和條件，其足以使水解后來自細胞系的剩余細胞蛋白質(zhì)的平均分子量是水解進行前 的細胞蛋白質(zhì)的平均分子量的小于約三分之二、小于約一半、小于約三分之一、小于約四分 之一、或小于約五分之一。方法還可包括純化水解后剩余的完整衣殼，并且測量衣殼的重量 以及在水解和純化前和后的總干細胞物質(zhì)的重量，其中衣殼重量除以在水解和純化后的總 干細胞物質(zhì)的重量是衣殼重量除以在水解和純化前測量的總干細胞物質(zhì)的重量的至少兩 倍。衣殼重量除以在水解和純化后的總干細胞物質(zhì)的重量是衣殼重量除以在此類水解和純 化前測量的總干細胞物質(zhì)的重量的超過至少10倍、優(yōu)選超過100倍、更優(yōu)選超過1，〇〇〇倍、 且最優(yōu)選超過10, 〇〇〇倍。
[0074] 水解酶是由歐洲委員會（European Commission)分類在身份號EC 3下的催化水 解反應的酶。例如，催化酯鍵水解的酶具有以EC 3.1開始的身份號。催化糖苷鍵水解的酶 具有以EC 3. 2開始的身份號。催化肽鍵水解的酶具有以EC 3. 4開始的身份號。其為催化 蛋白質(zhì)水解的酶的蛋白酶使用以EC 3. 4開始的身份號進行分類，包括但不限于蛋白酶K和 枯草桿菌蛋白酶。例如，蛋白酶K具有身份號EC 3.4. 21.64。本公開內(nèi)容包含其為（在非 限制性例子中）蛋白酶K、來自灰色鏈霉菌的蛋白酶、來自地衣芽孢桿菌的蛋白酶、胃蛋白 酶和木瓜蛋白酶抗性的VLP，以及使用此類VLP的方法和過程。
[0075] 國際生物化學與分子生物學聯(lián)盟命名委員會（Nomenclature Committee of the International Union of biochemistry and Molecular Biology)還推薦通過酶催化的反 應的酶命名和分類。它們的完全推薦是可免費和廣泛獲得的，并且例如尤其可在http:// enzyme, expasy. org 和 www. chem. qmul. ac. uk/iubmb/enzyme/ 處在線訪問。IUBMB 開發(fā)用 于描述每種酶針對其為活性的哪些位點的速記法。無區(qū)別切割的酶被稱為廣泛特異性的。 其他酶的切割模式描述為Xaa|Yaa，其中|代表切割位點，Xaa= {:在切割的N末端側(cè)上由 酶偏好的殘基集合}，并且Yaa= {:在切割的C末端側(cè)上由酶偏好的殘基集合}。一些酶具 有比這更多的結(jié)合需求，使得描述可變得更復雜。對于催化非常特異性的反應的酶，例如將 凝血酶原加工為活性凝血酶的酶，則該活性是切割描述的基礎(chǔ)。在某些情況下，酶的精確活 性可能是不明確的，并且在此類情況下，報道針對標準測試蛋白質(zhì)如B鏈胰島素的切割結(jié) 果。作為使用具有以EC 3. 4開始的身份號的催化肽鍵水解的酶的替代物，可使用廣泛特異 性酶，其具有Xaa | Yaa優(yōu)先，其中該酶已報道P1袋結(jié)合優(yōu)先Xaa，但對結(jié)合ΡΓ袋Yaa無優(yōu) 先，并且相反地，其中該酶已報道P1'袋結(jié)合優(yōu)先Yaa，但對結(jié)合P1袋Xaa無優(yōu)先。
[0076] 衣殼還可這樣選擇和/或制備，使得它們可使用簡單的分離和純化操作進行分離 且純化，如本文進一步詳細描述的。例如，衣殼可選擇或遺傳修飾為具有比如本文描述的周 圍基質(zhì)顯著更高的疏水性，以便選擇性分隔到它們簡單提取到其內(nèi)的非極性與水不混溶的 相內(nèi)。作為另外一種選擇，衣殼可就由溶液選擇性結(jié)晶的改善能力進行選擇或遺傳修飾。
[0077] 使用衣殼的簡單有效純化方法的使用通過下述成為可能：選擇某些野生型衣殼， 或?qū)Π吧鸵職さ牡鞍踪|(zhì)的氨基酸序列的修飾，使得衣殼顯示出對如本文上文描述的 由作用于肽鍵的至少一種水解酶催化的水解的抗性。此類野生型衣殼例如野生型MS2衣殼 可用于純化方法中，其中某些廉價酶例如蛋白酶K或枯草桿菌蛋白酶用于蛋白酶解。非限 制性例子是腸桿菌噬菌體MS2(SEQ ID N0:1，完整MS2野生型基因組；SEQ ID N0:2，MS2野 生型外殼蛋白質(zhì)，DNA序列；和SEQ ID N0:3，MS2野生型外殼蛋白質(zhì)，氨基酸序列。
[0078] (SEQ. ID NO :1)完整MS2基因組，野生型，以粗體表示的外殼蛋白質(zhì)：
[0079] GGGTGGGACCCCTTTCGGGGTCCTGCTCAACTTCCTGTCGAGCTAATGCCATTTTTAATGTCTTTAGCG AGACGCTACCATGGCTATCGCTGTAGGTAGCCGGAATTCCATTCCTAGGAGGTTTGACCTGTGCGAGCTTTTAGTAC CCTTGATAGGGAGAACGAGACCTTCGTCCCCTCCGTTCGCGTTTACGCGGACGGTGAGACTGAAGATAACTCATTCT CTTTAAAATATCGTTCGAACTGGACTCCCGGTCGTTTTAACTCGACTGGGGCCAAAACGAAACAGTGGCACTACCCC TCTCCGTATTCACGGGGGGCGTTAAGTGTCACATCGATAGATCAAGGTGCCTACAAGCGAAGTGGGTCATCGTGGGG TCGCCCGTACGAGGAGAAAGCCGGTTTCGGCTTCTCCCTCGACGCACGCTCCTGCTACAGCCTCTTCCCTGTAAGCC AAAACTTGACTTACATCGAAGTGCCGCAGAACGTTGCGAACCGGGCGTCGACCGAAGTCCTGCAAAAGGTCACCCAG GGTAATTTTAACCTTGGTGTTGCTTTAGCAGAGGCCAGGTCGACAGCCTCACAACTCGCGACGCAAACCATTGCGCT CGTGAAGGCGTACACTGCCGCTCGTCGCGGTAATTGGCGCCAGGCGCTCCGCTACCTTGCCCTAAACGAAGATCGAA AGTTTCGATCAAAACACGTGGCCGGCAGGTGGTTGGAGTTGCAGTTCGGTTGGTTACCACTAATGAGTGATATCCAG GGTGCATATGAGATGCTTACGAAGGTTCACCTTCAAGAGTTTCTTCCTATGAGAGCCGTACGTCAGGTCGGTACTAA CATCAAGTTAGATGGCCGTCTGTCGTATCCAGCTGCAAACTTCCAGACAACGTGCAACATATCGCGACGTATCGTGA TATGGTTTTACATAAACGATGCACGTTTGGCATGGTTGTCGTCTCTAGGTATCTTGAACCCACTAGGTATAGTGTGG GAAAAGGTGCCTTTCTCATTCGTTGTCGACTGGCTCCTACCTGTAGGTAACATGCTCGAGGGCCTTACGGCCCCCGT GGGATGCTCCTACATGTCAGGAACAGTTACTGACGTAATAACGGGTGAGTCCATCATAAGCGTTGACGCTCCCTACG GGTGGACTGTGGAGAGACAGGGCACTGCTAAGGCCCAAATCTCAGCCATGCATCGAGGGGTACAATCCGTATGGCCA ACAACTGGCGCGTACGTAAAGTCTCCTTTCTCGATGGTCCATACCTTAGATGCGTTAGCATTAATCAGGCAACGGCT CTCTAGATAGAGCCCTCAACCGGAGTTTGAAGCATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGG AACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAGCTCTAACTCGCGTTCAC AGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCATCAAAGTCGAGGTGCCT AAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTACTTAAATATGGAACTAAC CATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCTCCTAAAAGATGGAAACC CGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAGACGCCGGCCATTCAAACATGAGGATTACCCATG TCGAAGACAACAAAGAAGTTCAACTCTTTATGTATTGATCTTCCTCGCGATCTTTCTCTCGAAATTTACCAATCAAT TGCTTCTGTCGCTACTGGAAGCGGTGATCCGCACAGTGACGACTTTACAGCAATTGCTTACTTAAGGGACGAATTGC TCACAAAGCATCCGACCTTAGGTTCTGGTAATGACGAGGCGACCCGTCGTACCTTAGCTATCGCTAAGCTACGGGAG GCGAATGGTGATCGCGGTCAGATAAATAGAGAAGGTTTCTTACATGACAAATCCTTGTCATGGGATCCGGATGTTTT ACAAACCAGCATCCGTAGCCTTATTGGCAACCTCCTCTCTGGCTACCGATCGTCGTTGTTTGGGCAATGCACGTTCT CCAACGGTGCTCCTATGGGGCACAAGTTGCAGGATGCAGCGCCTTACAAGAAGTTCGCTGAACAAGCAACCGTTACC CCCCGCGCTCTGAGAGCGGCTCTATTGGTCCGAGACCAATGTGCGCCGTGGATCAGACACGCGGTCCGCTATAACGA GTCATATGAATTTAGGCTCGTTGTAGGGAACGGAGTGTTTACAGTTCCGAAGAATAATAAAATAGATCGGGCTGCCT GTAAGGAGCCTGATATGAATATGTACCTCCAGAAAGGGGTCGGTGCTTTCATCAGACGCCGGCTCAAATCCGTTGGT ATAGACCTGAATGATCAATCGATCAACCAGCGTCTGGCTCAGCAGGGCAGCGTAGATGGTTCGCTTGCGACGATAGA CTTATCGTCTGCATCCGATTCCATCTCCGATCGCCTGGTGTGGAGTTTTCTCCCACCAGAGCTATATTCATATCTCG ATCGTATCCGCTCACACTACGGAATCGTAGATGGCGAGACGATACGATGGGAACTATTTTCCACAATGGGAAATGGG TTCACATTTGAGCTAGAGTCCATGATATTCTGGGCAATAGTCAAAGCGACCCAAATCCATTTTGGTAACGCCGGAAC CATAGGCATCTACGGGGACGATATTATATGTCCCAGTGAGATTGCACCCCGTGTGCTAGAGGCACTTGCCTACTACG GTTTTAAACCGAATCTTCGTAAAACGTTCGTGTCCGGGCTCTTTCGCGAGAGCTGCGGCGCGCACTTTTACCGTGGT GTCGATGTCAAACCGTTTTACATCAAGAAACCTGTTGACAATCTCTTCGCCCTGATGCTGATATTAAATCGGCTAC GGGGTTGGGGAGTTGTCGGAGGTATGTCAGATCCACGCCTCTATAAGGTGTGGGTACGGCTCTCCTCCCAGGTGCCT TCGATGTTCTTCGGTGGGACGGACCTCGCTGCCGACTACTACGTAGTCAGCCCGCCTACGGCAGTCTCGGTATACAC CAAGACTCCGTACGGGCGGCTGCTCGCGGATACCCGTACCTCGGGTTTCCGTCTTGCTCGTATCGCTCGAGAACGCA AGTTCTTCAGCGAAAAGCACGACAGTGGTCGCTACATAGCGTGGTTCCATACTGGAGGTGAAATCACCGACAGCATG AAGTCCGCCGGCGTGCGCGTTATACGCACTTCGGAGTGGCTAACGCCGGTTCCCACATTCCCTCAGGAGTGTGGGCC AGCGAGCTCTCCTCGGTAGCTGACCGAGGGACCCCCGTAAACGGGGTGGGTGTGCTCGAAAGAGCACGGGTGCGAAA GCGGTCCGGCTCCACCGAAAGGTGGGCGGGCTTCGGCCCAGGGACCTCCCCCTAAAGAGAGGACCCGGGATTCTCCC GATTTGGTAACTAGCTGCTTGGCTAGTTACCACCCA
[0080] (SEQ, IDNO: 2)MS2夕卜殼蛋白質(zhì)DNA序列，野生型： ATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGGAA CTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTG AATGGATCAGCTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTA GCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCATCAAAGTCG AGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTG TAGCCGCATGGCGTTCCiTACTTAAATATGCfAACTAACCATTCCAATTTTC GCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCTCC TAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCA TCTACTAATAG (SEQ.IDNO: 3)MS2野生型夕卜殼蛋白質(zhì)，氨基酸序列： MASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVT CSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFA TNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0081] 令人驚訝的是，盡管缺乏包膜，但未經(jīng)修飾的野生型MS2衣殼對多種類別EC 3. 4 水解酶是抗性的，包括但不限于蛋白酶K和枯草桿菌蛋白酶，使得可由全細胞裂解物制備 可含有貨物分子的高度純化的衣殼組合物。相應地，本公開內(nèi)容提供了包含病毒衣殼的 VLP，所述病毒衣殼包含野生型MS2衣殼蛋白質(zhì)、和/或與野生型MS2衣殼蛋白質(zhì)共享同源 性的衣殼蛋白質(zhì)，所述病毒衣殼殼體化貨物分子。貨物分子可包括一種或多種異源核酸、 肽、多肽或蛋白質(zhì)。隨后可使用類別EC3. 4水解酶，在水解步驟后從全細胞裂解物中分離且 純化這些VLP，以產(chǎn)生高純度的VLP組合物，例如按重量計至少60%、至少70%、至少80% 或至少85%的VLP。明確考慮具有按VLP重量計至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97 %和98 %純度的組合物。
[0082] 本公開內(nèi)容包括包含下述的組合物：a)多個病毒樣顆粒，其各自包含野生型病毒 衣殼和封入野生型病毒衣殼中的至少一種靶標異源貨物分子；和b)對于組合物中存在的 每100克衣殼，以小于40克、小于30克、小于20克、小于15克、小于10克，且優(yōu)選小于9、 8、7、6、5、4、3,更優(yōu)選小于2克，且再更優(yōu)選小于1克的量存在的一種或多種細胞裂解產(chǎn)物， 其中該細胞裂解產(chǎn)物選自蛋白質(zhì)、多肽、肽及其任何組合。隨后，貨物分子可從衣殼中容易 地收獲。相應地，此類組合物對于其中需要高純度和/或高生產(chǎn)效率的所有應用均為高度 希望的。
[0083] 如本文描述的水解酶抗性衣殼可用于封入不同類型的貨物分子，以形成病毒樣顆 粒。貨物分子可以是但不限于任何一種或多種寡核苷酸或寡核糖核苷酸（DNA、RNA、LNA、 PNA、siRNA、shRNA、sshRNA、IshRNA或miRNA，或包含任何類型的非天然存在的核酸的任何 寡核苷酸）、任何肽、多肽或蛋白質(zhì)。其為寡核苷酸或寡核糖核苷酸的貨物分子可封入衣殼 中，伴隨或不伴隨接頭的使用。例如可觸發(fā)衣殼，以在核苷酸貨物例如寡核糖核苷酸的存在 下，由衣殼蛋白質(zhì)自裝配。在非限制性例子中，如本文描述的衣殼可封入靶標異源RNA鏈， 例如含有總共1，800-2, 248個核糖核苷酸的靶標異源RNA鏈，包括來自腸桿菌噬菌體MS2 的19聚體包裝位點（packsite)，此類RNA鏈由與編碼衣殼蛋白質(zhì)的質(zhì)粒分離的質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄， 如由 Wei, Y.等人（2008) J. Clin. Microbiol. 46:1734-1740 描述的。
[0084] RNA干擾（RNAi)是由短RNA分子例如siRNA分子介導的現(xiàn)象，所述短RNA分子可 用于靶標目的基因的選擇性抑制，并且具有在生物技術(shù)和醫(yī)學中的多重應用。例如，短RNA 分子可用于靶向生物中的特定目的基因，以獲得希望表型。然而，短RNA分子包括siRNA通 過稱為RNA酶的遍在酶容易地降解。衣殼例如本文描述的衣殼保護殼體化RNA不受酶促降 解。然而，如本文描述的衣殼可封入含有一種或多種核酶的RNA鏈，所述核酶是自切割核酶 (順式作用），或在某些情況下，能夠切割其他RNA中的鍵（反式作用）。例如可包括一種或 多種核酶，以特異性切割一種或多種RNA序列，以產(chǎn)生特別定制的RNA分子，例如但不限于 siRNA分子。例如，錘頭狀和丁型肝炎病毒核酶的變體是已知的，并且可用于切割長RNA序 列。本公開內(nèi)容描述了包含衣殼的新VLP，所述衣殼殼體化附著至如上所述的包裝序列的一 種或多種核酶（即對衣殼的內(nèi)壁具有強親和力的RNA序列），和用于從附著至核酶的包裝序 列切割短RNA序列的核酶。
[0085] 本公開內(nèi)容因此還包含核酶從用于殼體化其的一種或多種包裝序列中分離短或 小RNA序列（例如siRNA、shRNA、sshRNA和miRNA序列）的新用途。應當理解，除非上下文 另有說明，否則術(shù)語短RNA包含具有雙鏈莖和單鏈環(huán)或發(fā)夾的短單鏈和短發(fā)夾（莖環(huán)）RNA 序列。短RNA是具有不超過30個核苷酸、優(yōu)選不超過25個核苷酸和更優(yōu)選不超過22個核 苷酸的任何RNA單鏈；或具有在莖中不超過30個核苷酸堿基對、優(yōu)選不超過25個核苷酸堿 基對和更優(yōu)選不超過22個核苷酸堿基對的莖的發(fā)夾RNA。
[0086] 在使用對從包裝序列中分離此類短RNA序列為高度活性的核酶中的挑戰(zhàn)是核酶 可如此快速工作，以便在實現(xiàn)RNA殼體化前，從包裝序列中釋放短RNA。另外，已發(fā)現(xiàn)短RNA 例如siRNA或發(fā)夾包裝序列的三維結(jié)構(gòu)可干擾核酶的適當功能。這些問題可通過下述克 服：1)使用證實更慢活性速率的核酶突變體，以避免在實現(xiàn)短RNA殼體化前，從包裝序列中 釋放短RNA，和/或2)增加核酶中與短RNA形成沃森-克里克對的核苷酸數(shù)目。另外，反式 作用核酶可有利地用于增加作為短RNA殼體化到VLP內(nèi)的RNA百分比，如果一種或多種短 RNA序列的側(cè)翼不是完全核酶，而是其為反式作用核酶靶標的更短序列，所述更短的序列也 殼體化到相同VLP內(nèi)。
[0087] 一種或多種短RNA序列還可殼體化到或野生型或遺傳修飾的病毒衣殼內(nèi)，所述病 毒衣殼已進行修飾，以插入外部肽標簽，以將蛋白質(zhì)或藥物分子遞送至特定種類的細胞。野 生型衣殼還可遺傳修飾，以插入充當某些表面蛋白質(zhì)細胞受體的配體的外部肽序列，可有 利地用于殼體化旨在誘導特定靶細胞中的RNAi的短RNA序列。此類組合物比目前的短RNA 遞送的替代方案簡單得多、更便宜和更可靠制造。
[0088] 可制備的有用VLP的非限制性例子包括封入RNA鏈的衣殼，所述RNA鏈包含：
[0089] ⑴至少一個包裝序列和側(cè)翼為一個單鏈（非雜交）RNA間隔物的1-100個相同或 不同siRNA，其中每一個單鏈RNA間隔物具有4-40個核苷酸（SEQ ID N0:30);
[0090] (ii) 一個（1個）核酶和一個單鏈（非雜交）RNA序列/siRNA,其中每一個單鏈 RNA序列具有4-40個核苷酸（SEQ ID N0:28;HDV核酶）；
[0091] (iii)兩個（2 個）核酶 /siRNA ;
[0092] (iv) -個（1個）T7起始位點、一個（1個）核酶、一個（1個）包裝位點和一個（1 個）轉(zhuǎn)錄終止位點；或
[0093] (ν) -個⑴Τ7起始位點、一個（1個）包裝位點和一個（1個）轉(zhuǎn)錄終止位點。
[0094] (vi)四個（4 個）核酶/siRNA(SEQ ID Ν0:29)。
[0095] 在包括一種或多種核酶的VLP中，本公開內(nèi)容還考慮在核酶已切割RNA后含有 所得的產(chǎn)物的VLP。包括轉(zhuǎn)錄終止子的VLP可使用例如如下述中所述的T7轉(zhuǎn)錄終止子： Studier FW，Moffatt BA. (1986) J.MolBiol.May5; 189 (1):113-30 ;和 R Sousa，D Patra，EM Lafer (1992) J. Mol. Biol. 224:319-334。例如，下述兩種序列是T7RNA聚合酶的合適轉(zhuǎn)錄終 止子：
[0096] CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTG(SEQ ID NO :4)
[0097] 或
[0098] TAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG(SEQ ID N0:5)。
[0099] 如本文描述的VLP可替代地可封入至少一種靶標肽、多肽或蛋白質(zhì)。當靶標異源 貨物分子是肽、多肽或蛋白質(zhì)時，寡核苷酸接頭可用于偶聯(lián)靶標異源貨物分子和病毒衣殼。 其為肽、多肽或蛋白質(zhì)的貨物分子優(yōu)選使用接頭在衣殼中包裝。包裝過程通過由短RNA適 體序列組成的接頭促進，所述短RNA適體序列形成在外殼蛋白質(zhì)和融合至靶標貨物分子的 膚標簽之間的連接。（參見Fiedler, J.等人，RNA-Directed Packaging of Enzymes within Virus-like Particles, Angew. Chem. Int. Ed. 49 :9648 - 9651 (2010))。寡核苷酸接頭可由 DNA、RNA、LNA、PNA等等組成。接頭是例如50至100聚體，具有在第一末端處對于衣殼外殼 內(nèi)部具有結(jié)合特異性的例如長約20ng的短序列，和在第二相對末端處對于貨物肽、多肽或 蛋白質(zhì)具有結(jié)合特異性的例如長約70nt的另一序列。另外，緩慢核酶可摻入由RNA組成的 接頭內(nèi)。例如，緩慢核酶可摻入包裝序列（與外殼蛋白質(zhì)結(jié)合）和適體（與靶標蛋白質(zhì)的 標簽結(jié)合）之間。在活化后，核酶使外殼蛋白質(zhì)與靶標蛋白質(zhì)分離。作為另外一種選擇，如 本文描述的衣殼可封入在N末端由肽標記的至少一種靶標蛋白質(zhì)，所述肽能夠與含適體和 衣殼包裝序列的RNA鏈非共價結(jié)合，例如如由Fiedler，J.等人（2010)描述的N末端標簽 以及含適體和包裝序列的RNA鏈。
[0100] 貨物分子可以是雙分子貨物分子，并且本文描述的衣殼還可殼體化雙分子貨物分 子，其可包括或不包括一種或多種核酶。雙分子貨物分子可包含連接至雙功能多核苷酸的 適體。適體可具有使用SELEX特異性選擇的序列，以顯示出與生物活性小分子的特異性結(jié) 合，所述生物活性小分子即具有優(yōu)選低于1，500Da的低分子量的分子。雙功能多核苷酸具 有用于結(jié)合低分子量生物活性貨物分子的第一適體活性，和用于結(jié)合衣殼的包裝序列的第 二適體活性兩者。連接至生物活性貨物分子的雙功能多核苷酸形成隨后可連接至貨物的雙 分子貨物分子。此類貨物分子可用于結(jié)合生物活性小分子，并且因此使VLP裝載有小分子。 本公開內(nèi)容因此還包括包含連接至此類合成雙分子貨物分子的衣殼的VLP?？赏ㄟ^與RNA 適體結(jié)合而裝載到VLP內(nèi)的低分子量生物活性劑的例子包括：莠去津（除草劑）、啶蟲脒 甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷和氧樂果（殺昆蟲劑），如由Sett等人（2012)0pen Journal of Applied Biosensor, 1:第 9-19 頁描述的。
[0101] 可通過與RNA適體結(jié)合而裝載到VLP內(nèi)的低分子量生物活性劑的例子包括除 草劑例如2,4-0(2,4-0二氯苯氧乙酸）、麥草畏（(3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸）、百草 枯（N，N'_二甲基-4, 4'-聯(lián)吡啶鎗二氯化物）、氨磺樂靈（4-(二丙基氨基）-3,5-二 硝基苯磺酰胺）、DCMU (3- (3, 4-二氯苯基）-1，1-二甲基脲）、氟樂靈（2, 6-二硝 基-N，N-二丙基-4-(三氟甲基）苯胺）、甲基咪草煙（-甲基-2-[4-甲基-5-氧 代-4-(丙-2-基）-4, 5-二氫-1H-咪唑-2-基]批陡-3-羧酸）、氯氨批陡（Aminopyralid) (4-氨基-3, 6-二氯吡啶-2-羧酸）、二氯吡啶酸（3, 6-二氯-2-吡啶羧酸）、異丙甲草 胺（(RS) -2-氯-N- (2-乙基-6-甲基-苯基）-N- (1-甲氧基丙-2-基）乙酰胺）、二甲戊 靈（3, 4-二甲基-2, 6-二硝基-N-戊-3-基-苯胺）、氨氯吡啶酸（4-氨基-3, 5, 6-三 氯-2-批陡羧酸）、敵稗（N-(3, 4-二氯苯基）丙酰胺）、綠草定（[(3, 5, 6-二氯-2-批陡 基）氧基]乙酸）、和莠去津（2-氯-4-(乙氨基）-6-(異丙基氨基）-s-三嗪），尤其是例 如由 Roberts 等人（1998)Metabolic Pathways of Agrochemicals :Partl :Herbicides and Plant Growth Regulators. Royal Society of Chemistry (Great Britain)(出版） ISBN978-1-84755-138-2列出的。例如，結(jié)合莠去津的RNA適體由Sinha等人（2010)Nature Chemical Biology, 6:ρ· 464-470 描述。
[0102] RNA適體還可以用于結(jié)合殺昆蟲劑例如快螨特（2-(4-叔丁基苯氧基）環(huán)己基 丙-2-炔-1-磺酸鹽）、毒死蜱（0, 0-二乙基0-3, 5, 6-三氯吡啶-2-基硫代磷酸酯）、氯氰 菊酯、亞胺硫磷（2-二甲氧基硫膦基硫代甲基）異吲哚啉-1，3-二酮）、氯菊酯（3-苯氧基芐 基（1RS)-順，反-3-(2, 2-二氯乙烯基）_2, 2-二甲基環(huán)丙燒羧酸酯）、二嗪磷（0, 〇-二乙基 0- [4-甲基-6-(丙-2-基）嘧啶-2-基]硫代磷酸酯）、甲基對硫磷（(0, 0-二甲基0- (4-硝 基苯基）硫代磷酸酯）、和啶蟲脒（N- [ (6-氯-3-吡啶基）甲基]-Ν' -氰基-N-甲基-乙脒）， 和殺真菌劑例如百菌清（2, 4, 5, 6-四氯間苯二甲腈）、克菌丹（(3aR，7aS)-2-[(三氯甲基） 硫燒基]_3a, 4, 7, 7a_四氫-1H-異卩引哚-1，3 (2H)-二酮）、陡醜菌胺（2-氯-N- (4' -氯聯(lián) 苯-2-基）煙酰胺）、異菌脲（3- (3, 5-二氯苯基）-N-異丙基-2, 4-二氧代咪唑烷-1-甲酰 胺）、啼菌酯（(2E) _2_ (2-{[6-(2-氰基苯氧基）啼陡_4_基]氧基}苯基）_3_甲氧基丙烯 酸甲酯）、唑菌胺酯（2-[1-(4-氯苯基）吡唑-3-基氧基甲基]-N-甲氧基苯氨甲酸甲酯）、 嘧菌環(huán)胺（4-環(huán)丙基-6-甲基-N-苯基嘧啶-2-胺），尤其是例如由Roberts等人（1999) Metabolic Pathways of Agrochemicals ：Part2 ：Insecticides and Fungicides. Royal Society of Chemistry(GreatBritain)(出版）ISBN978-l-84755-137_5 列出的。例如，已 描述了結(jié)合啶蟲脒、甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷和氧樂果的適體，如由Sett等人（2012)0pen Journal of Applied Biosensor, 1:第9-19頁例不的，使用SELEX構(gòu)建使用以與RNA適體 相似的方式構(gòu)建的DNA適體。
[0103] 這些除草劑、殺昆蟲劑或殺真菌劑是生物活性小分子，即具有優(yōu)選低于1，500Da 的低分子量的分子。由于其小尺寸，它們可滲透形成本公開內(nèi)容的VLP的衣殼，如由mi 等人(2005)Delivery of antisense oligonucleotides to leukemia cells by RNA bacteriophage capsids, Nanomedicine ：Nanotechnology, Biology and Medicine, 1:第 67-76頁例示的。在此類VLP已形成后，在純化前或后，將這些小生物活性分子加入本公開 內(nèi)容的VLP中，所述VLP殼體化使用SELEX設(shè)計的適體，以結(jié)合小生物活性分子。例如通 過將其加入VLP溶液中，且例如在室溫下溫育30分鐘至10小時的時間，來完成這些小生 物活性分子的添加。這些小生物活性分子通過經(jīng)由在顆粒對稱軸上的孔擴散而進入VLP， 并且由于其與封入適體的結(jié)合而保留在內(nèi)部。用于將小生物活性分子裝載到VLP內(nèi)的 合適溶劑范圍從極性的例如水和水-乙醇摻和物到非極性的例如異辛烷、甲苯、二氯甲烷 或氯仿。使用非極性溶劑用于VLP溶解例如如由Johnson等人（2006)，Solubilization and stabilization of bacteriophage MS2 in organic solvents, Biotechnology and bioengineering，2007. 97 (2):第224-34頁描述的完成，其借助于表面活性劑如氣溶膠0T。 非極性溶劑用于裝載小生物活性分子的用途是優(yōu)選的，因為其在極性溶劑中的溶解度在大 多數(shù)情況下很弱。
[0104] 殼體化siRNA和小生物活性分子兩者的VLP在其中在兩種生物活性成分之間實 現(xiàn)協(xié)同效應的應用中是優(yōu)選的，例如在其中靶向植物、昆蟲或真菌對小生物活性分子是抗 性的情況下。在此類情況下，siRNA設(shè)計為靶向?qū)χ参铩⒗ハx或真菌賦予小生物活性分子抗 性的生物途徑，如由 Sammons 等人，Polynucleotide molecules for gene regulation in plants, US2011/0296556 例示的。
[0105] 作為另外一種選擇，雙功能多核苷酸可編碼至少一種siRNA、shRNA、sshRNA、 IshRNA或miRNA，并且貨物分子可以是小（低分子量）蛋白質(zhì)或肽。相應地，雙分子貨物分 子可以能夠結(jié)合低分子生物活性蛋白質(zhì)或肽。此類雙分子貨物分子可包含生物活性蛋白質(zhì) 或肽，其偶聯(lián)至編碼至少一種miRNA的siRNA或shRNA或sshRNA或IshRNA的多核苷酸，并 且具有用于結(jié)合生物活性蛋白質(zhì)或肽貨物分子的第一適體活性，和用于結(jié)合衣殼的包裝序 列的第二適體活性。多核苷酸連接至蛋白質(zhì)或肽貨物分子，并且能夠連接至衣殼的包裝序 列。
[0106] 如上所述的雙功能多核苷酸可任選包括一種或多種核酶序列。包括雙分子貨物分 子包括如上所述的雙功能多核苷酸的VLP可任選包括一種或多種核酶。在至少一種核酶已 與雙分子貨物分子反應以將貨物分子切割成組成性成分部分包括適體后，本公開內(nèi)容還包 括包含衣殼和雙分子貨物分子的反應產(chǎn)物的VLP。
[0107] 如本文描述的VLP可通過任何一種或多種可用方法裝配，所述方法產(chǎn)生具有裝配 的、水解酶抗性的衣殼的VLP，所述衣殼殼體化一種或多種貨物分子、和任選的任何接頭、包 裝序列、一種或多種核酶或標簽。例如，衣殼和貨物分子可在任何表達系統(tǒng)中共表達。通過 經(jīng)由可用于將此類載體引入特定細胞內(nèi)的任何操作用一種或多種表達載體轉(zhuǎn)染，并且穩(wěn)定 轉(zhuǎn)染細胞以獲得表達一種或多種重組序列的細胞，編碼一種或多種衣殼蛋白質(zhì)、一種或多 種貨物分子和任選的任何接頭、包裝序列、一種或多種核酶或標簽的重組DNA可容易地引 入宿主細胞內(nèi)，例如細菌細胞、植物細胞、酵母細胞、真菌細胞和動物細胞（包括昆蟲和哺 乳動物）。
[0108] 宿主細胞優(yōu)選具有真核起源，例如植物、哺乳動物、昆蟲、酵母或真菌源，但也可使 用非真核宿主細胞。合適的表達系統(tǒng)包括但不限于用含有VLP元件的編碼序列的重組細菌 噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達載體轉(zhuǎn)化的微生物例如細菌（例如大腸桿菌）。在非 限制性例子中，對于使用MS2衣殼蛋白質(zhì)的VLP，在大腸桿菌中的表達是合適的表達系統(tǒng)。
[0109] 本公開內(nèi)容明確考慮這樣的植物細胞，其已使用如本文描述的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化， 并且表達衣殼外殼蛋白質(zhì)、貨物分子和任選的任何接頭、包裝序列、一種或多種核酶或標 簽。用于轉(zhuǎn)化細胞包括植物細胞和制備轉(zhuǎn)基因細胞的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。載體、質(zhì) 粒、粘粒、YAC(酵母人工染色體）和DNA區(qū)段可用于轉(zhuǎn)化細胞，并且如一般公認的將包括啟 動子、增強子和/或多接頭。具體考慮的轉(zhuǎn)基因細胞包括轉(zhuǎn)基因植物細胞，包括但不限于得 自玉米、大豆、小麥、蔬菜、谷物、豆類、果樹等等的細胞，或?qū)@益于如本文描述的VLP引入 的任何植物。還考慮的是得自如本文描述的轉(zhuǎn)化細胞的植物、植物組織，和該植物或植物組 織的種子或后代。
[0110] 裝配的VLP的表達可例如通過構(gòu)建至少一種表達載體來獲得，所述表達載體包括 編碼VLP的所有元件的序列。有時使用兩種載體，包括編碼一種或多種貨物分子和任選的 任何接頭、包裝序列、一種或多種核酶或標簽的序列的第一種；和包括編碼衣殼蛋白質(zhì)的序 列的第二載體。在用于生成示例性VLP包括siRNA的示例性方法中，兩種載體可在宿主細 胞中共表達，用于生成VLP，如實例中進一步詳述的。用于構(gòu)建此類表達載體的方法和工具 是本領(lǐng)域眾所周知的，所述表達載體含有編碼序列以及轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列。一旦構(gòu)建，一 種或多種載體就還使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)轉(zhuǎn)移至宿主細胞，并且細胞隨后維持在培養(yǎng) 條件下足以使VLP表達和裝配發(fā)生的時間，這均使用常規(guī)技術(shù)。本公開內(nèi)容因此包含含有 任何此類載體的宿主細胞，和已通過此類載體轉(zhuǎn)化的細胞，以及含有VLP的細胞。
[0111] 當VLP已在宿主細胞中表達且裝配時，它們可使用本領(lǐng)域已知用于病毒純化的任 何方法進行分離且純化。例如，細胞可使用常規(guī)細胞裂解技術(shù)和試劑進行裂解，并且對細胞 裂解物實施使用至少一種肽鍵水解酶類別EC 3. 4的水解，所述水解酶例如但不限于蛋白 酶K或枯草桿菌蛋白酶。在水解后保留在細胞裂解物中的完整衣殼可使用常規(guī)蛋白質(zhì)分離 技術(shù)取出且純化。
[0112] 衣殼、VLP或蛋白質(zhì)的純化還可包括本領(lǐng)域一般已知的方法。例如，在衣殼表達和 細胞裂解后，可對所得的裂解物實施一個或多個分離或純化步驟。此類步驟可包括例如酶 促脂解、DNA水解和蛋白酶解步驟。蛋白酶解步驟可例如使用內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶的 摻和物進行。例如，在細胞裂解和大多數(shù)細胞組分的水解拆卸后，通過例如萃取到合適的非 極性與水不混溶的溶劑內(nèi)，或通過由合適溶劑結(jié)晶，此類衣殼與其貨物分子可與周圍基質(zhì) 分離。例如，水解和/或蛋白酶解步驟將包含在裂解基質(zhì)中的來自衣殼的污染物轉(zhuǎn)化成小 的水溶性分子。疏水性衣殼隨后可萃取到有機相例如1，3_雙（三氟甲基）苯內(nèi)。衣殼、 VLP或蛋白質(zhì)的純化可包括例如至少一個液-液萃取步驟、至少一個分級沉淀步驟、至少一 個超濾步驟或至少一個結(jié)晶步驟。液-液萃取可包括使用例如不混溶的非水非極性溶劑， 例如但不限于苯、甲苯、己烷、庚烷、辛烷、氯仿、二氯甲烷或四氯化碳。純化可包括至少一 個結(jié)晶步驟。一個或多個水解步驟且尤其是一個或多個蛋白酶解步驟的使用，消除用目前 用于貨物分子的分離方法觀察到的某些問題，其主要起因于大量和不同程度的結(jié)合相互作 用，所述結(jié)合相互作用在貨物分子和源自它們在其中生產(chǎn)的細胞培養(yǎng)的組分之間發(fā)生。本 文描述的衣殼這樣抵抗水解步驟，使得在水解后產(chǎn)生的基質(zhì)包括安全分隔任何貨物分子與 周圍基質(zhì)的完整衣殼，由此中斷干擾目前純化方法的麻煩的結(jié)合相互作用。
[0113] 在純化后，衣殼可打開，以獲得貨物分子，其可以是如本文描述的蛋白質(zhì)或多肽、 肽或核酸分子。衣殼可使用本領(lǐng)域已知的幾種可能操作中的任何一種打開，包括例如在超 過50°C的水溶液中加熱；反復凍融；與變性劑例如甲酰胺一起溫育；與一種或多種蛋白酶 一起溫育；或這些操作中的任一種的組合。
[0114] 對水解酶抗性且可用于根據(jù)本公開內(nèi)容的VLP和方法中的衣殼蛋白質(zhì)也可以是 野生型MS2衣殼蛋白質(zhì)的變體，或源自野生型MS2衣殼蛋白質(zhì)。衣殼蛋白質(zhì)可包含例如相 對于野生型MS2衣殼氨基酸序列的至少一個氨基酸殘基置換、缺失或插入。此類衣殼蛋白 質(zhì)可以是天然存在的變體，或可以通過使用常規(guī)技術(shù)遺傳修飾MS2衣殼蛋白質(zhì)來獲得，條 件是變體或經(jīng)修飾的衣殼蛋白質(zhì)形成無包膜的衣殼，其如本文描述的對由肽鍵水解酶類別 EC3. 4催化的水解是抗性的。
[0115] 通過根據(jù)物理化學和生物化學中的常規(guī)和眾所周知的原理在氨基酸序列中作出 所選修飾，可改造可裝配成如本文描述的對水解抗性的衣殼的遺傳修飾的MS2衣殼蛋白 質(zhì)，以產(chǎn)生如本文和本文下文實例中描述的保持對水解抗性的蛋白質(zhì)。
[0116] 例如功能蛋白質(zhì)的形狀或總體折疊由蛋白質(zhì)的氨基酸序列決定，并且折疊限定 蛋白質(zhì)的功能，這是常識?？傮w折疊由一個或多個折疊結(jié)構(gòu)域組成。當超過一個折疊結(jié) 構(gòu)域存在于總體折疊中時，結(jié)構(gòu)域一般沿結(jié)構(gòu)域界面松散或緊密地結(jié)合在一起。結(jié)構(gòu)域 折疊可分解成緊密包裝的、定義明確的二級結(jié)構(gòu)元件的折疊核心，所述二級結(jié)構(gòu)元件主要 負責結(jié)構(gòu)域的形狀以及一般由轉(zhuǎn)角和環(huán)組成的更易移動的外層，所述轉(zhuǎn)角和環(huán)的構(gòu)象受 與折疊核心的相互作用以及與附近結(jié)構(gòu)域及其他分子包括溶劑及其他蛋白質(zhì)的相互作用 影響。蛋白質(zhì)折疊的廣泛公開域數(shù)據(jù)庫，公眾域中的解決的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分 類（Structural Classification of Proteins) (SC0P)數(shù)據(jù)庫（Alexey G Murzin，Curr Opin Struct Biol (1996)6, 386-394)在線維持在 http://scop, berkeley.edu 處，并且隨 著新的解決結(jié)構(gòu)進入公眾域（蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Protein Data Bank) (F.C.Bernstein，T. F. Koetzle, G. J. Williams, E. E. Meyerjr. , M. D. Brice, J. R. Rodgers, 0. Kennard, T. Shimanouchi，M. Tasumi，"The Protein Data Bank ：A Computer-based Archival File For Macromolecular Structures, ^J. of. Mol. Biol. , 112(1977) ：535), http://www. rcsb.org)數(shù)據(jù)庫而定期擴展。進化上遙遠的、仍具有相同形狀和非常相似的功能的家 族成員通常保留在拓撲學和/或功能上等價的位置處少至30%的相同殘基。在一些家 族中，遙遠成員的序列具有就彼此而言未改變的少至20 %的其殘基，例如光滑病毒科 和alloleviviridae衣殼蛋白質(zhì)。此外，蛋白質(zhì)的折疊和功能顯著地對經(jīng)由定向或隨機 突變改變是耐受的，即使是核心殘基（PeterO. 01 il1S:j:，S. Christopher Bauer，Sarah Braford-Goldberg，Kris Sterbenz,Joseph 0. Polazzi,Maire H. Caparon, Barbara K.Klein,AlanM. Easton, Kumnan Paik，Jon A.Klover,BarrettR. Thiele 和 John P.McKearn (1995)J Biol Chem 270,23754-23760 ;Yiqing Feng，Barbara K.Klein 和 Charles A. Me Wherter(1996)，J Mol Biol 259, 524-541 ;Dale Rennel1，Suzanne E.Bouvier，Larry W. Hardy 和 Anthony R.Poteetel (1991) J Mol Biol222, 67-87)，一個或 多個殘基的插入/缺失（Yiqing Feng，Barbara Κ· Klein和Charles A. Me Wherter(1996)，J Mol Biol 259,524-541)，序列的排列（Multi-functional chimeric hematopoietic fusion proteins between sequence rearranged c-mpl receptor agonists and other hematopoietic factors，US6066318)，經(jīng)由N或C末端或兩者的串聯(lián)（與其自身的拷貝 或其他月太或蛋白質(zhì)）（Multi-functional chimeric hematopoietic fusion proteins between sequence rearranged g-csf receptor agonists and other hematopoietic factors，US20040171115 ;Plevka，P.，Tars，K.，Liljas，L· (2008)ProteinSci. 17 :173)或 共價修飾，例如糖基化、聚乙二醇化、SUMO化或者肽基或非肽基親和標簽的添加，只要對維 持折疊和/或功能關(guān)鍵的殘基是多余的。
[0117] 根據(jù)本公開內(nèi)容以及如方法和過程的任一種中使用的VLP因此包括包含衣殼蛋 白質(zhì)的VLP，所述衣殼蛋白質(zhì)與野生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼蛋白質(zhì)（SEQ ID N0:3)的氨 基酸序列具有至少15%、16%、21%、40%、41%、52%、53%、56%、59%或至少86%序列同 一性，并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。此類VLP包括例如包含衣殼 蛋白質(zhì)的VLP，所述衣殼蛋白質(zhì)與如上所述的SEQ ID N0:3)具有至少52%序列同一性。還 包括的是包含衣殼蛋白質(zhì)的VLP，所述衣殼蛋白質(zhì)與SEQ ID N0:3具有至少53%序列同一 性，其可基本上如上所述獲得，但玉忽略FR衣殼序列，代表與野生型腸桿菌噬菌體MS2衣 殼蛋白質(zhì)（SEQ ID N0:3)的53%序列同一性。還包括的是包含衣殼蛋白質(zhì)的VLP，所述衣 殼蛋白質(zhì)與SEQ ID N0:3具有至少56%序列同一性，這被認為是當結(jié)構(gòu)鑒定為lAQ3(van den Worm, S. Η. , Stonehouse, N. J. , Valegard, K. , Murray, J. B. , Walton, C. , Fridborg, K., Stockley, P. G. ,Liljas, L· (1998)Nucleic Acids Res. 26 ： 1345-1351) UGAV(Tars, K. , Bu ndule, M.，F(xiàn)ridborg, K.，Liljas, L. (1997) J. Mol. Biol. 271 :759-773)、IFRS (Liljas, L.，F(xiàn) ridborg，K.，Valegard, K.，Bundule，M.，Pumpens，P. (1994) J. Mol. Biol. 244 :279-290)和 2VTU(Plevka，P.，Tars, K.，Liljas, L. (2008)ProteinSci. 17 :1731)(上文描述的蛋白質(zhì)數(shù) 據(jù)庫標識符）時，當所有三種序列一起考慮時，僅56%的序列位置具有就主鏈重疊而言的 相同序列和拓撲學等價的位置。還包括的是包含衣殼蛋白質(zhì)的VLP，所述衣殼蛋白質(zhì)與SEQ ID N0:3具有至少59 %序列同一性，這被認為是與GA病毒衣殼蛋白質(zhì)的序列相比較，MS2病 毒衣殼蛋白質(zhì)的序列是59%。還包括的是包含衣殼蛋白質(zhì)的VLP，所述衣殼蛋白質(zhì)與SEQ ID N0:3具有至少86%序列同一性，這被認為是與FR衣殼蛋白質(zhì)的序列相比較，MS2病毒 衣殼蛋白質(zhì)的序列是86%。根據(jù)本公開內(nèi)容的VLP因此包括包含衣殼蛋白質(zhì)的VLP，基于 有效的結(jié)構(gòu)錨定比對，所述衣殼蛋白質(zhì)與野生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID N0:3)的 氨基酸序列具有至少15 %、16 %或21 %序列同一性，并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化 的水解是抗性的。
[0118] VLP因此可包含如本文描述的MS2衣殼蛋白質(zhì)變體中的任一種。與本文描述的衣 殼蛋白質(zhì)一致的遺傳修飾的衣殼蛋白質(zhì)可例如通過下述來產(chǎn)生：構(gòu)建編碼至少一種衣殼蛋 白質(zhì)的至少一種DNA質(zhì)粒，相對于野生型MS2衣殼蛋白質(zhì)的氨基酸序列，所述衣殼蛋白質(zhì)具 有至少一個氨基酸置換、缺失或插入，制備每種質(zhì)粒的多個拷貝，用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細胞系；將細 胞維持在足以使轉(zhuǎn)化的細胞表達且裝配殼體化核酸的衣殼的時間和條件下；裂解細胞以形 成細胞裂解物；對細胞裂解物實施使用至少一種肽鍵水解酶，類別EC 3. 4的水解；且取出 在水解后保留在細胞裂解物中的完整衣殼，以獲得相對于野生型衣殼蛋白質(zhì)對至少一種水 解酶具有增加的抗性的衣殼。在所得的完整衣殼純化后，可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法測定每 種衣殼蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
[0119] 本文描述的專門衣殼可用于研究和開發(fā)以及工業(yè)制造設(shè)施中，以提供改善的得 率，因為在兩種背景下使用的純化方法具有相同的基質(zhì)組成。具有此類相同組成主要取決 于在研究和開發(fā)以及制造方法中使用相同細胞系。然而，在研究和開發(fā)以及制造階段中使 用的蛋白酶解步驟后，由于使用不同細胞系在基質(zhì)組成中的差異極大減少。該特點允許在 兩個階段中使用不同細胞系，伴隨最低限度的制造得率懲罰。
[0120] 實例
[0121] 包括下述非限制性實例以示出本公開內(nèi)容的多個方面。本領(lǐng)域技術(shù)人員應當理 解：在下述實例中公開的技術(shù)代表由 申請人:發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明的實踐中良好起作用的技術(shù)，并 且因此可視為構(gòu)成用于其實踐的優(yōu)選方式。然而，依照本公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應當理 解可在所述具體實例中作出許多改變，同時仍獲得相同或相似結(jié)果，而不背離本發(fā)明的范 圍。因此，實例僅是示例性的，并且不應解釋為以任何方式限制本發(fā)明。在允許且描述本發(fā) 明必需的程度，引用的所有參考文獻均以引用的方式并入本文。
[0122] 實例A :MS2細菌噬菌體的繁殖
[0123] MS2細菌噬菌體（ATCC編號15597-B1，來自美國典型培養(yǎng)物中心， Rockville, MD)及其大腸桿菌宿主（ATCC編號15669)得自ATCC，并且使用由Strauss和 Sinsheimer (1963) J. Mol. Biol7:43-54J. Mol. Biol7:43-54 描述的操作進行繁殖。結(jié)果在圖 1中標繪。在反應過程中跟蹤在600nm下的光密度（0D)和pH。ODi代表緊在用宿主接種后 的0D。感染在2. 3小時完成。Ln (0D/0Di)在左軸上標繪（實心菱形），并且pH在右軸上標 繪（空心正方形）。該實驗在用宿主接種后5. 3小時結(jié)束。獲得的裂解物以2, 000g離心， 并且通過0. 2 μ m膜過濾，以消除剩余細菌和細菌碎片。
[0124] 實例B :使用蛋白酶K和超濾的MS2細菌噬菌體純化
[0125] MS2細菌噬菌體的純化如下進行。在純化過程中獲得樣品，并且對樣品運行SDS PAGE分析。獲得的結(jié)果顯示于圖2中。
[0126] 在實例A結(jié)束時獲得的8mL裂解物（圖2,泳道1中的樣品）通過300kDa膜 (Vivaspin2,來自 Sartorius Stedim, Bohemia, NY)過濾，并且濾液通過 100kDa 膜過濾，由 其獲得lmL滲余物（圖2,泳道2中的樣品）。將該滲余物分成兩個等份。向一個半份（對 照）中，加入以pH = 7.5的206 μ L20mM CaCl2水溶液。向第二個半份（蛋白酶）中，加入 以口!1 = 7.5的溶解于 206 4 1^2〇111]\?^(：12水溶液中的0.1511^蛋白酶1((5丨81^41(11^(*，5七· L〇uis，M0)。兩個管均在37°C下溫育，并且在1小時后，將它們置于冰水浴中。隨后獲得樣 品并分析：在圖2,泳道3中的對照樣品，和在圖2,泳道5中的蛋白酶樣品。隨后用去離子 (DI)水將每種產(chǎn)物稀釋至2mL，并且通過100kDa膜過濾。用DI水將每種滲余物（150 μ L) 稀釋至2mL，并且再次通過相同膜過濾。稀釋和超濾對每種產(chǎn)物再重復一次。隨后獲得每 種滲余物的樣品并分析：在圖2,泳道4中的對照樣品，和在圖2,泳道6中的蛋白酶樣品。 在14kDa處的條帶對應于MS2細菌噬菌體的外殼蛋白質(zhì)。在30kDa處的條帶對應于蛋白酶 K。來自對照實驗的產(chǎn)物獲得高度不純的噬菌體。來自蛋白酶實驗的產(chǎn)物獲得含有具有高 于99%純度的噬菌體的產(chǎn)物。
[0127] 實例C:MS2細菌噬菌體的降解
[0128] MS2細菌噬菌體的處理如下進行。在處理過程中獲得樣品，并且對樣品運行SDS PAGE分析。獲得的結(jié)果顯不于圖3中。如由Strauss & Sinsheimer (1963) J. Mol. Biol 7:43-54描述的，通過使用硫酸銨的沉淀和使用三氯氟甲烷（氟利昂11)的萃取，部分純化 在實例A結(jié)束時獲得的4mL裂解物。獲得在用氟利昂11萃取后的水溶液樣品并分析（圖 3,泳道1中的樣品）。向部分純化的噬菌體溶液（130μ L)中，加入370μ L20mM CaCl2水溶 液。使混合物在37°C下溫育，并且在1小時后，將其置于冰水浴中。隨后獲得樣品并分析： 在圖3,泳道2中的樣品。用去離子（DI)水將溫育產(chǎn)物稀釋至2mL，并且通過100kDa膜過 濾。用DI水將滲余物（150 μ L)稀釋至2mL，并且再次通過相同膜過濾。滲余物的稀釋和超 濾再重復一次。隨后獲得滲余物的樣品并分析：在圖3,泳道3中的樣品。僅觀察到在低于 lOkDa處的弱條帶，指示噬菌體的完全降解。
[0129] 實例D :使用超濾的MS2細菌噬菌體純化。
[0130] MS2細菌噬菌體的純化如下進行。在純化過程中獲得樣品，并且對樣品運行 SDS PAGE分析。獲得的結(jié)果顯示于圖3中。如由Strauss & Sinsheimer(1963)J.Mol. Bi〇17:43-54描述的，通過使用硫酸銨的沉淀和使用三氯氟甲烷（氟利昂11)的萃取，部分 純化在實例A結(jié)束時獲得的4mL裂解物。用去離子水將含有部分純化的噬菌體的水溶液稀 釋至2mL，通過300kDa膜過濾，并且濾液通過lOOkDa膜過濾，由其獲得150 μ L滲余物。隨 后用去離子（DI)水將滲余物稀釋至2mL，并且通過相同lOOkDa膜過濾。滲余物（150μυ 的稀釋和超濾再重復一次。獲得滲余物樣品并分析：圖3,泳道4中的樣品。將370 μ L20mM CaCl2水溶液加入滲余物（130yL)中。使混合物在37°C下溫育，并且在1小時后，將其置于 冰水浴中。隨后獲得樣品并分析：在圖3,泳道5中的樣品。隨后用去離子（DI)水將產(chǎn)物 稀釋至2mL，并且通過100kDa膜過濾。用DI水將滲余物（150 μ L)稀釋至2mL，并且再次通 過相同膜過濾。滲余物的稀釋和超濾再重復一次。隨后獲得滲余物的樣品并分析：在圖3， 泳道6中的樣品。由具有小于100kDa分子量的蛋白質(zhì)滲透其的膜保留的14kDa的MS2外 殼蛋白質(zhì)是明確可見的，指不完整MS2衣殼的存在。獲得的廣物含有具有1?于99 %純度的 噬菌體。
[0131] 實例E :使用蛋白酶K和超濾的MS2細菌噬菌體純化
[0132] MS2細菌噬菌體的純化如下進行。在純化過程中獲得樣品，并且對樣品運行SDS PAGE分析。獲得的結(jié)果顯示于圖4中。
[0133] 如由 Strauss & Sinsheimer (1963) J. Mol. Biol7:43-54 描述的，通過使用硫酸銨 的沉淀和使用三氯氟甲烷（氟利昂11)的萃取，部分純化在實例A結(jié)束時獲得的4mL裂解 物。用去離子水將含有部分純化的噬菌體的水溶液稀釋至2mL，通過100kDa膜過濾，由其獲 得150 μ L滲余物。隨后用去離子（DI)水將滲余物稀釋至2mL，并且通過相同100kDa膜過 濾。滲余物（150 μ L)的稀釋和超濾再重復一次。獲得滲余物樣品并分析：圖4,泳道1中 的樣品。將溶解于370μ?20πιΜΜη2水溶液中的0. 15mg蛋白酶Κ加入滲余物（130μυ中。 使混合物在37°C下溫育，并且在1小時后，將其置于冰水浴中。隨后獲得樣品并分析：在圖 4,泳道2中的樣品。隨后用去離子（DI)水將產(chǎn)物稀釋至2mL，并且通過100kDa膜過濾。用 DI水將滲余物（150 μ L)稀釋至2mL，并且再次通過相同膜過濾。滲余物的稀釋和超濾再重 復一次。隨后獲得滲余物的樣品并分析：在圖4,泳道3中的樣品。獲得的產(chǎn)物含有具有高 于99 %純度的噬菌體。
[0134] 實例F :使用蛋白酶K，在酸性條件下沉淀，在堿性和酸性條件下使用乙醇沉淀和 超濾的MS2細菌噬菌體純化
[0135] MS2細菌噬菌體的純化如下進行。在純化過程中獲得樣品，并且對樣品運行 SDS PAGE分析。獲得的結(jié)果顯示于圖5中。如由Strauss & Sinsheimer(1963)J.Mol. Bi〇17:43-54描述的，通過使用硫酸銨的沉淀和使用三氯氟甲烷（氟利昂11)的萃取， 部分純化在實例A結(jié)束時獲得的50mL裂解物。獲得在用氟利昂11萃取后的水溶液樣 品并分析（圖5,泳道1中的樣品）。向部分純化的噬菌體溶液（1.2mL)中，加入溶解于 1. 24mL20mMCaCl2水溶液中的0. 9mg蛋白酶K。使混合物在37°C下溫育，并且在1小時后， 加入60 μ L0.2M苯甲磺酰氟（PMSF)的乙醇溶液，以滅活蛋白酶K。隨后將混合物置于冰水 浴中。獲得樣品并分析：在圖5,泳道2中的樣品。伴隨劇烈攪動，將0.68mL0.1%磷酸水溶 液緩慢加入冰/水浴中，以使液體的pH達到4。使液體在0°C下保持30分鐘，并且在4°C 下以16, 000g離心30分鐘。允許上清液達到室溫，并且加入130 μ L1 % NaOH，以使液體的 pH達到8。伴隨劇烈攪動，緩慢加入0. 81mL在室溫下的乙醇，以使液體中的乙醇濃度達到 20%。使液體在室溫下保持30分鐘，并且在室溫下以16, 000g離心30分鐘。將上清液置 于冰/水浴中15分鐘，并且伴隨劇烈攪動，緩慢加入1. 3mL在0°C下的1 %乙酸，以使液體 的pH達到4。伴隨劇烈攪動，緩慢加入1. 5mL在0°C下的乙醇，以使液體中的乙醇濃度達到 34%。使液體在0°C下保持30分鐘，并且在4°C下以16, 000g離心30分鐘。將團塊重懸浮 于200 μ L DI水中，并且獲得20 μ L樣品并分析：圖5,泳道3。用DI水將剩余物（180 μ L) 稀釋至2mL，并且通過100kDa膜過濾。用DI水將滲余物（150 μ L)稀釋至2mL，并且再次 通過相同膜過濾。滲余物的稀釋和超濾再重復一次。隨后獲得滲余物的樣品并通過SDS PAGE分析：在圖5,泳道4中的樣品。由具有小于100kDa分子量的蛋白質(zhì)滲透其的膜保留的 14kDa的MS2外殼蛋白質(zhì)是明確可見的，與完整MS2衣殼的存在一致。圖6中顯示了關(guān)于相 同滲余物的 UV 光譜，這與由 G. F. Rohrmann 和 R. G. Krueger, (1970) J. Virol.，6 (3) : 26 對于 純MS2噬菌體公開的結(jié)果一致。使用以pH7. 4的Tris緩沖鹽水和150mMNaCl，對相同滲余 物運行Superdex 200 (GE Healthcare, Piscataway，NJ)尺寸排阻色譜法。它顯示僅在柱的 空體積處的280nm吸光度。對于600kD至2kD的蛋白質(zhì)，在洗脫體積中不存在吸光度。該 測試與完整噬菌體顆粒一致。使用 QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)和 無 DNA試劑盒（Life Technologies, Grand Island, NY),從相同滲余物的另一份樣品中分離 RNA,并且使用 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies)逆 轉(zhuǎn)錄。隨后在PCR實驗中查詢MS2基因組的三個不同區(qū)段的存在或不存在。使用下述引物 對，每種引物由其分別在正向（F)和反向（R)在MS2基因組中的第一個和最后一個堿基的 位置而命名：F1001_1021-R2180_2201、F1201_1223-R1979_2001、F1401_1426-R1680_1705。 Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity(Life Technologies)用于擴增。如圖 9 中所示（1.2kbp對于泳道1中的引物F1201_1223-R1979_2001，800bp對于泳道2中的引 物 F1201_1223-R1979_2001，和 304bp 對于泳道 3 中的引物 F1401_1426-R1680_1705)，在用 溴化乙啶染色的1. 5%瓊脂糖凝膠上進行色譜的PCR產(chǎn)物與完整MS2細菌噬菌體基因組一 致。感染性測試也如下對相同滲余物運行。在細菌培養(yǎng)物達到0W600nm) =0.22的點時， 5 μ L滲余物用于感染如實例A中所述的lmL細菌培養(yǎng)物。如圖7中所示，0D(600nm)在感 染后1小時是〇. 621，并且在另外2小時后降至0. 21，與此同時，對照樣品在感染后1小時 獲得0. 82的OD ^00nm)，并且在另外2小時后獲得1. 2的OD ^00nm)。該測試顯示在滲余 物中高感染性的噬菌體，并且因此證實用于分離其的純化方法不損害其完整性?？傊@得 的產(chǎn)物含有具有高于99%純度的MS2細菌噬菌體。
[0136] 實例G :使用不同外源性蛋白酶和超濾的MS2細菌噬菌體純化
[0137] 基本上如實例E中所述嘗試使用不同外源性蛋白酶的MS2細菌噬菌體純化，除 了使用與蛋白酶K不同的蛋白酶以外。在通過來自地衣芽孢桿菌的蛋白酶（P5380, Sigma Aldrich)促進的蛋白酶解后，成功純化MS2細菌噬菌體。然而，在pH6下使用來自豬胃粘膜 的胃蛋白酶（P6887, Sigma Aldrich)的蛋白酶解反應發(fā)現(xiàn)顯著降解MS2細菌噬菌體。另一 方面，在pH6下使用來自木瓜乳的木瓜蛋白酶（P3125, Sigma Aldrich)的蛋白酶解反應未 廣泛降解MS2細菌噬菌體。
[0138] 實例Η :殼體化RNA的MS2衣殼的生產(chǎn)，所述RNA編碼其附著至其特異性19聚體 RNA發(fā)夾的外殼蛋白質(zhì)
[0139] 如下進行MS2衣殼的生產(chǎn)。在表達過程期間獲得樣品，并且對樣品運行SDS PAGE 分析，以監(jiān)控衣殼生產(chǎn)。獲得的結(jié)果顯示于圖8中。將編碼MS2的外殼蛋白質(zhì)及其特異性 RNA 19聚體PAC位點的下述DNA序列克隆到pDEST14_A252質(zhì)粒（LifeTechnologies)內(nèi)：
[0140] ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAGAAGGAGATATACATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTT CTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAG CTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCA TCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTAC TTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCT CCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAGACGCCGGCCATTCAAA CATGAGGATTACCCATGTACCCAGCT(SEQ ID NO:6)
[0141] 使用此類質(zhì)粒轉(zhuǎn)化One Shot BL21 (DE3)化學感受態(tài)大腸桿菌（Life Technologies)細胞。含有該質(zhì)粒的BL21(DE3)在750mL含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中在 37°C下生長至0D(600nm)等于0.8。隨后獲得誘導前樣品并分析：在圖8,泳道1中的樣品。 隨后加入異丙基β-D-l-硫代半乳批喃糖苷（Sigma-Aldrich)至ImM的終濃度。誘導后四 小時，通過在3, 000g和4°C下離心40分鐘收獲細胞。隨后獲得樣品并分析：在圖8,泳道2 中的樣品。
[0142] 實例I :殼體化RNA的MS2衣殼的純化和表征，所述RNA編碼其附著至其特異性19 聚體RNA發(fā)夾的外殼蛋白質(zhì)
[0143] MS2衣殼的純化如下進行。在純化過程中獲得樣品，并且對樣品運行SDS PAGE分 析。獲得的結(jié)果顯示于圖8中。將等價于115mL培養(yǎng)物的來自實例Η的團塊級分重懸浮于含 有10mM MgC12的20mM Tris-HCl，pH7.5中，并且超聲處理以裂解細胞。通過以16,000g離 心去除細胞碎片。如由Strauss & Sinsheimer (1963) J. Mol. Biol7:43_54描述的，通過使用 硫酸銨的沉淀和使用三氯氟甲烷（氟利昂11)的萃取，部分純化獲得的細胞裂解物。向部分 純化的MS2衣殼溶液（1. 05mL)中，加入溶解于1. 05mL20mM CaC12水溶液中的0. 3mg蛋白酶 K。使混合物在37°C下溫育，并且在2. 5小時后，將其置于冰水浴中。隨后獲得樣品并分析： 在圖8,泳道3中的樣品。十五分鐘后，伴隨劇烈攪動，將0. 14mLl %磷酸水溶液緩慢加入冰 /水浴中，以使液體的pH達到4. 1。使液體在0°C下保持30分鐘，并且在4°C下以16, 000g 離心20分鐘。向保持在0°C下的上清液中，加入100 μ L1 % NaOH，以使液體的pH達到7. 9。 隨后伴隨劇烈攪動，緩慢加入0. 5mL在0°C下的乙醇，以使液體中的乙醇濃度達到20%。使 液體在〇°C下保持30分鐘，并且在4°C下以16, 000g離心20分鐘。在加入1 %乙酸將溶液 的pH調(diào)整至7后，通過Vivaspin2 (Sartorius) 300kDa膜過濾上清液，并且通過100kDa膜 過濾濾液，由其獲得150 μ L滲余物。用磷酸鹽緩沖鹽水將滲余物稀釋至2mL，并且通過相同 100kDa膜過濾。滲余物（150 μ L)的稀釋和超濾再重復四次。隨后獲得滲余物的樣品并通 過SDS PAGE分析：在圖8,泳道4中的樣品。由具有小于100kDa分子量的蛋白質(zhì)滲透其的 膜保留的14kDa的MS2外殼蛋白質(zhì)是明確可見的，與完整MS2衣殼的存在一致。使用QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)和無 DNA 試劑盒（Life Technologies, Grand Island, NY)，從相同滲余物的另一份樣品中分離RNA，并且使用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies)逆轉(zhuǎn)錄。隨后在 PCR 實驗中查詢 MS2 衣 殼區(qū)段的存在或不存在。使用下述引物對，每種引物由其分別在正向（F)和反向（R)在MS2 基因組中的第一個和最后一個堿基的位置而命名：F1401_1426-R1680_1705。Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Life Technologies)用于擴增。如圖 10 中所不（泳道 1 中的304bp ;最左邊的泳道對應于來自Life Technologies的lkb plus梯），在用溴化乙陡 染色的2%瓊脂糖凝膠上進行色譜的PCR產(chǎn)物與完整MS2外殼基因一致?？傊?，獲得的產(chǎn)物 含有具有高于99 %純度的MS2衣殼。
[0144] 實例J :使用乙醇的簡單沉淀用于純化MS2病毒樣顆粒（VLP)
[0145] MS2 VLP的純化如下進行。在純化過程中獲得樣品，并且對樣品運行SDS PAGE分 析。獲得的結(jié)果顯示于圖11中。將得自與實例Η相同的實驗的六分之一團塊重懸浮于含 有10mM MgCl2的20mM Tris-HCl，pH7. 5中，并且超聲處理以裂解細胞。通過以16,000g離 心去除細胞碎片。如由Strauss & Sinsheimer (1963) J. Mol. Biol7:43_54描述的，通過使用 硫酸銨的沉淀和使用三氯氟甲烷（氟利昂11)的萃取，部分純化獲得的細胞裂解物。獲得 樣品并分析：在圖11，泳道1中的樣品。發(fā)現(xiàn)在約14kDa處的強條帶，與MS2噬菌體的外殼 蛋白質(zhì)一致。大多數(shù)具有更高分子量的其他條帶-雜質(zhì)代表約27%的樣品質(zhì)量。向部分 純化的MS2 VLP溶液（1.35mL)中，加入1.36mL20mM CaC12水溶液，并置于冰水浴中。十五 分鐘后，加入50μ L10%乙酸水溶液，以使液體的pH達到4. 1。隨后，在相同溫度下且伴隨 劇烈攪動，緩慢加入1. 44mL乙醇。使液體在0°C下保持30分鐘，并且在4°C下以16, 000g 離心20分鐘。將團塊懸浮于調(diào)整至ρΗ7· 5的由20mM Tris-HCl和10mM MgCl2組成的2mL 水緩沖液中。獲得樣品并通過SDS PAGE分析：在圖11，泳道2中的樣品。該樣品中的雜質(zhì) 代表約24%的樣品重量。通過Vivaspin 2(Sartorius)100kDa膜過濾稀釋樣品，由其獲得 200 μ L滲余物。隨后用相同緩沖液將滲余物稀釋至2mL，并且通過相同100kDa膜過濾。滲 余物（200 μ L)的稀釋和超濾再重復四次。隨后獲得滲余物的樣品并通過SDS PAGE分析： 在圖11，泳道3中的樣品。該樣品中的雜質(zhì)代表約9.7%的樣品重量?？傊?，獲得的產(chǎn)物含 有具有高于99%純度的MS2 VLP。
[0146] 實例K :使用蛋白酶K(PK)和使用乙醇的簡單沉淀用于純化MS2VLP。
[0147] MS2 VLP的純化如下進行。在純化過程中獲得樣品，并且對樣品運行SDS PAGE分 析。獲得的結(jié)果顯示于圖12中。將得自與實例Η相同的實驗的六分之一團塊重懸浮于含 有10mM MgCl2的20mM Tris-HCl，pH7. 5中，并且超聲處理以裂解細胞。通過以16,000g離 心去除細胞碎片。如由Strauss & Sinsheimer (1963) J. Mol. Biol7:43_54描述的，通過使 用硫酸銨的沉淀和使用三氯氟甲烷（氟利昂11)的萃取，部分純化獲得的細胞裂解物。獲 得樣品并分析：在圖12,泳道1中的樣品。發(fā)現(xiàn)在約14kDa處的強條帶，與MS2噬菌體的外 殼蛋白質(zhì)一致。大多數(shù)具有更高分子量的其他條帶-雜質(zhì)代表約26%的樣品質(zhì)量。向部 分純化的MS2 VLP溶液（L 35mL)中，加入溶解于L 36mL20mM CaC12水溶液中的0· 6mg蛋 白酶K。使混合物在37°C下溫育，并且在2. 5小時后，置于冰水浴中。獲得樣品并通過SDS PAGE分析：在圖12,泳道2中的樣品。該樣品中的雜質(zhì)代表約14%的樣品重量。十五分鐘 后，在冰/水浴中加入約50μ?10%乙酸水溶液，以使液體的pH達到4. 1。隨后，在相同溫 度下且伴隨劇烈攪動，緩慢加入1. 54mL乙醇。使液體在0°C下保持30分鐘，并且在4°C下 以16, OOOg離心20分鐘。將團塊懸浮于調(diào)整至ρΗ7· 5的由20mM Tris-HCl和lOmM MgCl2 組成的2mL水緩沖液中。獲得樣品并通過SDS PAGE分析：在圖12,泳道3中的樣品。該樣 品中的雜質(zhì)代表約10%的樣品重量。通過^；^38口；[112(531'1：01'；[118)1001^^膜過濾稀釋的樣 品，由其獲得200 μ L滲余物。隨后用相同緩沖液將滲余物稀釋至2mL，并且通過相同lOOkDa 膜過濾。滲余物（200 μ L)的稀釋和超濾再重復四次。隨后獲得滲余物的樣品并通過SDS PAGE分析：在圖12,泳道4中的樣品。該樣品中的雜質(zhì)代表約5.1%的樣品重量。總之，獲 得的產(chǎn)物含有具有約95%純度的1^2乂1^。
[0148] 實例L :使用組成性水解酶（CH)、用乙醇分級沉淀和超濾用于純化MS2VLP。
[0149] MS2 VLP的純化如下進行。在純化過程中獲得樣品，并且對樣品運行SDS PAGE分 析。獲得的結(jié)果顯示于圖13中。將得自與實例Η相同的實驗的六分之一團塊重懸浮于含 有10禮1%(：1 2的2011111'1^-!1(：1，？!17.5中，并且超聲處理以裂解細胞。通過以16,00(^離 心去除細胞碎片。如由Strauss & Sinsheimer(1963)J.Mol.Biol7:43_54描述的，通過使 用硫酸銨的沉淀和使用三氯氟甲烷（氟利昂11)的萃取，部分純化獲得的細胞裂解物。向 部分純化的MS2 VLP溶液（1.35mL)中，加入1.36mL20mM CaClyK溶液。使混合物在37°C 下在2. 5小時過程中（以允許組成性水解酶作用）溫育，其后置于冰水浴中。獲得樣品并 通過SDS PAGE分析：在圖13,泳道1中的樣品。該樣品中的雜質(zhì)代表約12%的樣品重量。 十五分鐘后，在冰/水浴中加入約120 μ L1 %氫氧化鈉水溶液，以使液體的pH達到7. 86。隨 后，在相同溫度下且伴隨劇烈攪動，緩慢加入0. 81mL乙醇。使液體在0°C下保持30分鐘， 并且在4°C下以16, 000g離心20分鐘。伴隨在冰/水浴中的劇烈攪動，向上清液中緩慢加 入約100μ L10%乙酸水溶液，以使液體的pH達到4. 01。隨后，在相同溫度下且伴隨劇烈攪 動，緩慢加入1. 3mL乙醇。使液體在0°C下保持30分鐘，并且在4°C下以16, 000g離心20 分鐘。將團塊懸浮于調(diào)整至PH7. 5的由20mMTris-HCl和10mMMgCl2組成的2mL水緩沖液 中。通過Vivaspin2(Sartorius)100kDa膜過濾稀釋的樣品，由其獲得200yL滲余物。隨 后用相同緩沖液將滲余物稀釋至2mL，并且通過相同100kDa膜過濾。滲余物（200yL)的稀 釋和超濾再重復四次。隨后獲得滲余物的樣品并通過SDS PAGE分析：在圖13,泳道3中的 樣品。該樣品中的雜質(zhì)代表約4. 7%的樣品重量?？傊@得的產(chǎn)物含有具有高于約95% 純度的MS2 VLP。
[0150] 實例Μ :使用蛋白酶K(PK)、用乙醇分級沉淀和超濾用于純化MS2VLP。
[0151] MS2 VLP的純化如下進行。在純化過程中獲得樣品，并且對樣品運行SDS PAGE分 析。獲得的結(jié)果顯示于圖13中。將得自與實例Η相同的實驗的六分之一團塊重懸浮于含有 10禮1%(：1 2的20111]\11^8-!1(：1，？!17.5中，并且超聲處理以裂解細胞。通過以16,00(^離心去 除細胞碎片。如由Strauss & Sinsheimer (1963) J. Mol. Biol7:43_54描述的，通過使用硫酸 銨的沉淀和使用三氯氟甲烷（氟利昂11)的萃取，部分純化獲得的細胞裂解物。向部分純化 的MS2 VLP溶液（L 35mL)中，加入溶解于L 36mL20mM CaCl2水溶液中的0· 3mg蛋白酶K。 使混合物在37°C下在2. 5小時過程中溫育，其后置于冰水浴中。獲得樣品并通過SDS PAGE 分析：在圖13,泳道2中的樣品。該樣品中的雜質(zhì)代表約8.1%的樣品重量。十五分鐘后， 在冰/水浴中加入約120μ L1%氫氧化鈉水溶液，以使液體的pH達到7. 86。隨后，在相同溫 度下且伴隨劇烈攪動，緩慢加入0. 81mL乙醇。使液體在0°C下保持30分鐘，并且在4°C下 以16, 000g離心20分鐘。在冰/水浴中向上清液中加入約100 μ L10%乙酸水溶液，以使液 體的pH達到4.01。隨后，在相同溫度下且伴隨劇烈攪動，緩慢加入1.3mL乙醇。使液體在 〇°C下保持30分鐘，并且在4°C下以16, 000g離心20分鐘。將團塊懸浮于調(diào)整至pH7. 5的由 20mM Tris-HCl 和 10mM MgCl^lL成的 2mL 水緩沖液中。通過 Vivaspin2(Sartorius)100kDa 膜過濾稀釋的樣品，由其獲得200 μ L滲余物。隨后用相同緩沖液將滲余物稀釋至2mL，并且 通過相同lOOkDa膜過濾。滲余物（200 μ L)的稀釋和超濾再重復四次。隨后獲得滲余物的 樣品并通過SDS PAGE分析：在圖13,泳道4中的樣品。該樣品中的雜質(zhì)代表約0.9%的樣 品重量?？傊?，獲得的產(chǎn)物含有具有高于約99%純度的MS2 VLP。
[0152] 實例N :使用多種水解酶、和用硫酸銨的分級沉淀用于純化MS2VLP。
[0153] MS2 VLP的純化如下進行。在純化過程中獲得樣品，并且對樣品運行SDS PAGE分 析。獲得的結(jié)果顯示于圖14中。將得自與實例Η相同的實驗的六分之一團塊重懸浮于含 有10mM MgC12的20mM Tris-HCl，pH7.5中，并且超聲處理以裂解細胞。通過以16,000g離 心去除細胞碎片。獲得上清液樣品并通過SDS PAGE分析：在圖14,泳道1中的樣品。該樣 品中的雜質(zhì)代表約70%的樣品重量。以相同方式加工得自與實例Η相同的此類實驗的四個 其他相同的團塊級分。
[0154] 獲得的體積各3. 7mL的五個離心的細胞裂解物如下以五種不同方式進行加工。第 一離心的細胞裂解物置于冰水浴中15分鐘，并且加入0. 1克硫酸銨。將混合物渦旋直至 實現(xiàn)硫酸銨的完全溶解。使液體在〇°C下保持2小時，并且在4°C下以16, 000g離心30分 鐘。將0.4克硫酸銨加入上清液中，并且渦旋直至實現(xiàn)硫酸銨的完全溶解。使液體在0°C下 保持2小時，并且在4°C下以16, 000g離心30分鐘。將純化的MS2VLP團塊懸浮于調(diào)整至 pH 7. 5的由20mM Tris-HCl和10mM MgC12組成的0· 2mL水緩沖液中。第二離心的細胞裂 解物在37°C下溫育五小時，置于冰水浴中與第一離心的細胞裂解物相同的時間量，并且隨 后以與第一離心的細胞裂解物相同的方式加工。將〇. 15mg蛋白酶K(Sigma Aldrich，St. Louis，M0)加入第三離心的細胞裂解物。隨后使它在37°C下溫育五小時，置于冰水浴中與 第一離心的細胞裂解物相同的時間量，并且隨后以與第一離心的細胞裂解物相同的方式加 工。使第四離心的細胞裂解物在37°C下溫育兩小時，隨后加入0. 15mg PK。使它在37°C下 溫育另外三小時，置于冰水浴中與第一離心的細胞裂解物相同的時間量，并且隨后以與第 一離心的細胞裂解物相同的方式加工。
[0155] 將 500 單位 Benzonase?:核酸酶（Sigma Aldrich, St. Louis, M0)和 35 單位來 自皺裙假絲酵母（Candida rugosa)的脂肪酶（Sigma Aldrich, St. Louis, M0)加入第五 離心的細胞裂解物，并且在37°C下溫育一小時。隨后加入15單位來自芽孢桿菌屬物種 (Bacillus sp.)的 α -淀粉酶（Sigma Aldrich, St. Louis, M0)，并且在 37°C下溫育另外一 小時。隨后加入〇. 15mgPK。使混合物在37°C下溫育另外三小時，置于冰水浴中與第一離心 的細胞裂解物相同的時間量，并且隨后以與第一離心的細胞裂解物相同的方式加工。
[0156] 在其5小時溫育后獲得第二離心的細胞裂解物的樣品，并通過SDS PAGE分析：在 圖14,泳道2中的樣品。在其5小時溫育后獲得第三離心的細胞裂解物的樣品，并通過SDS PAGE分析：在圖14,泳道3中的樣品。在其5小時溫育后獲得第四離心的細胞裂解物的樣 品，并通過SDS PAGE分析：在圖14,泳道4中的樣品。在其5小時溫育后獲得第五離心的 細胞裂解物的樣品，并通過SDS PAGE分析：在圖14,泳道5中的樣品。
[0157] 對于第一離心的細胞裂解物獲得純化的MS2 VLP懸浮液的樣品，并通過SDS PAGE 分析：在圖14,泳道6中的樣品。獲得的產(chǎn)物含有具有約88%純度的MS2VLP。該樣品的蛋 白質(zhì)濃度（Pierce? BCA Protein Assay Kit, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) 為18. 5mg/mL。該樣品的200:1稀釋度在260nm處在lcm小室中測量的光密度（0D-260nm) 為0. 553,并且0D-280nm為0. 303。這些測量與約9mg/升培養(yǎng)物的RNA得率一致。
[0158] 對于第二離心的細胞裂解物獲得純化的MS2 VLP懸浮液的樣品，并通過SDS PAGE 分析：在圖14,泳道7中的樣品。獲得的產(chǎn)物含有具有約75%純度的MS2 VLP。該樣品的 蛋白質(zhì)濃度為25. 4mg/mL。該樣品的200:1稀釋度在260nm處在lcm小室中測量的光密度 (0D-260nm)為0· 784,并且0D-280nm為0· 453。這些測量與約llmg/升培養(yǎng)物的RNA得率 一致。
[0159] 對于第三離心的細胞裂解物獲得純化的MS2 VLP懸浮液的樣品，并通過SDS PAGE 分析：在圖14,泳道8中的樣品。獲得的產(chǎn)物含有具有約94. 3%純度的MS2 VLP。該樣品 的蛋白質(zhì)濃度為21. Omg/mL。該樣品的200:1稀釋度在260nm處在lcm小室中測量的光密 度（0D-260nm)為(λ 632,并且0D-280nm為(λ 321。這些測量與約10mg/升培養(yǎng)物的RNA得 率一致。
[0160] 對于第四離心的細胞裂解物獲得純化的MS2 VLP懸浮液的樣品，并通過SDS PAGE 分析：在圖14,泳道9中的樣品。獲得的產(chǎn)物含有具有約95. 6%純度的MS2 VLP。該樣品 的蛋白質(zhì)濃度為19. 4mg/mL。該樣品的200:1稀釋度在260nm處在lcm小室中測量的光密 度（0D-260nm)為0. 666,并且0D-280nm為0. 353。這些測量與約llmg/升培養(yǎng)物的RNA得 率一致。
[0161] 對于第五離心的細胞裂解物獲得純化的MS2 VLP懸浮液的樣品，并通過SDS PAGE 分析：在圖14,泳道10中的樣品。獲得的產(chǎn)物含有具有約96%純度的MS2 VLP。該樣品的 蛋白質(zhì)濃度為19. 8mg/mL。該樣品的200:1稀釋度在260nm處在lcm小室中測量的光密度 (0D-260nm)為0. 661，并且0D-280nm為0. 354。這些測量與約llmg/升培養(yǎng)物的RNA得率 一致。
[0162] 實例0 :殼體化shRNA的MS2衣殼的生產(chǎn)，所述shRNA靶向綠色熒光蛋白（GFP)和 附著至MS219聚體RNA發(fā)夾的HDV核酶。
[0163] 如下進行MS2衣殼的生產(chǎn)。將編碼MS2的外殼蛋白質(zhì)的下述DNA序列，序列A(SEQ ID N0:7)克隆到 pDEST14(Life Technologies)質(zhì)粒內(nèi)：
[0164] ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAGAAGGAGATATACATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGT TCTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATC AGCTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACAC CATCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGT ACTTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGG TCTCCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAG 序列 A(SEQ ID NO :7)
[0165] 將下述DNA序列，序列B(SEQ ID N0:8)克隆到質(zhì)粒pACYC184內(nèi)。還將轉(zhuǎn)錄終止 子克隆到序列B(SEQ ID N0:8)的3'末端處（未示出）。序列B(SEQ ID N0:8)編碼shRNA 發(fā)夾，設(shè)計為切割siRNA發(fā)夾的3'末端的丁型肝炎病毒（HDV)核酶，并且將MS2的特異性 RNA 19聚體克隆到質(zhì)粒pACYC184內(nèi)：
[0166] 序列 T7_Rz6
[0167] GGATCCTAATACGACTCACTATAGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCTCAAGAGGAACTTCAGGGTCAGCTT GCCAAGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGGCGAATGGGACCACGCTTCAA ACATGAGGATTACCCATGTCGAAGCGACCATGG(SEQ ID N0:8)。
[0168] 使用各含有序列A(SEQ ID NO: 104)和序列B(SEQ ID NO: 105)的2種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化One Shot BL21(DE3)化學感受態(tài)大腸桿菌（Life Technologies)細胞，選擇氯霉素和氨節(jié)青霉 素抗性轉(zhuǎn)化體。對于衣殼生產(chǎn)，使這些轉(zhuǎn)化體在37°C下在32mL含有氨芐青霉素和氯霉素兩 者的LB培養(yǎng)基中生長。當培養(yǎng)物密度達到0D (600nm) = 0. 8時，隨后加入異丙基β-D-1-硫 代半乳批喃糖苷（Sigma-Aldrich)至ImM的終濃度。誘導后4小時，通過在3, 000g和4°C 下離心40分鐘收獲細胞。如實例Z所述從純化的VLP中提取RNA，并且如實例AA中所述分 析。如圖16中的泳道shRNA中觀察到的，觀察到如對于編碼的shRNA預期的相同分子量的 條帶。
[0169] 實例P :使用編碼siGFP的轉(zhuǎn)錄物生產(chǎn)MS2衣殼，所述siGFP在其5'末端上的側(cè) 翼為長錘頭狀核酶，并且在其3'末端上的側(cè)翼為附著至MS219聚體RNA發(fā)夾的HDV核酶和 第二HDV核酶。
[0170] 如下進行MS2衣殼的生產(chǎn)。將編碼MS2的外殼蛋白質(zhì)的下述DNA序列，序列A(SEQ ID N0:7)克隆到 pDEST14(Life Technologies)質(zhì)粒內(nèi)：
[0171] ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAGAAGGAGATATACATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGT TCTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATC AGCTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACAC CATCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGT ACTTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGG TCTCCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAG 序列 A(SEQ ID NO :7)
[0172] 將下述DNA序列，序列C(SEQ ID N0:9)克隆到質(zhì)粒pACYC184內(nèi)。還將轉(zhuǎn)錄終止 子克隆到序列C(SEQ ID N0:9)的3'末端處（未示出）。序列C(SEQ ID N0:9)編碼T7啟 動子、設(shè)計為切割siRNA發(fā)夾的5'末端的錘頭狀核酶、siRNA發(fā)夾、設(shè)計為切割siRNA發(fā)夾 的3'末端的丁型肝炎病毒（HDV)核酶、和MS2的特異性RNA19聚體，并且將另一種HDV核 酶克隆到質(zhì)粒PACYC184內(nèi)：
[0173] 序列 T7_Rzl2
[0174] GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGATAAATAAATAAATTTGAATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCT GATGAGGCGCTTCGGCGCCGAAACACCCAGTGGTGTCCAAGCTGACCCTGAAGTTCATTCAAGAGATGAACTTCAGG GTCAGCTTGTCGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGGCGAATGGGACCACG CTTCAAACATGAGGATTACCCATGTCGAAGCGAATTTATTTATTTAATTATTATTATTATTATTGGCCGGCATGGTC CCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACACCTTCGGGTGGCGAATGGGACCAAAAAAAAATAATAATAATAATA ATCCATGG(SEQ ID NO :9)
[0175] 使用各含有序列A(SEQ ID NO: 104)和序列C(SEQ ID NO: 106)的2種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化One Shot BL21(DE3)化學感受態(tài)大腸桿菌（Life Technologies)細胞，選擇氯霉素和氨節(jié)青霉 素抗性轉(zhuǎn)化體。對于衣殼生產(chǎn)，使這些轉(zhuǎn)化體在37°C下在32mL含有氨芐青霉素和氯霉素兩 者的LB培養(yǎng)基中生長。當培養(yǎng)物密度達到OD (600nm) = 0. 8時，隨后加入異丙基β-D-1-硫 代半乳批喃糖苷（Sigma-Aldrich)至ImM的終濃度。誘導后4小時，通過在3, 000g和4°C 下離心40分鐘收獲細胞。
[0176] 實例Q :使用轉(zhuǎn)錄物生產(chǎn)MS2衣殼，所述轉(zhuǎn)錄物編碼shRNA和附著至MS2 19聚體 RNA發(fā)夾的緩慢HDV核酶。
[0177] 如實例0中所述進行生產(chǎn)MS2衣殼的幾個實驗，所述MS2衣殼各自殼體化不同貨 物。然而，代替在序列B(SEQ ID N0:8)中包括的HDV核酶序列，在每個實驗中使用以更緩 慢的反應速率常數(shù)切割siRNA的3'末端的突變體。對于每個實驗，使用含有更緩慢HDV核 酶的下述序列代替序列B :
[0178] 序列 G76U:
[0179] TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGT GAACTTCAGGGTCAGCTTGTC GGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAA CATTCGTGGCTAATGGGACCATATATATATACATGAGGATTACCCATGTCCATGG(SEQ ID NO:10)
[0180] 序列 G40U:
[0181] TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGT GAACTTCAGGGTCAGCTTGTC (i(iCC(.GCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGTCAA CATTCGTGGCGAATGGGACCATATATATATACATGAGGATTACCCATGTCCATGG(SEQ ID NO:11)
[0182] 序列 A16G:
[0183] TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGTGAACTTCAGGGTCAGCTTGTCG GCCGGCATGGTCCCGGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGGCGAATGGGACCATATATATATACAT GAGGATTACCCATGTCCATGG(SEQ ID NO:12)
[0184] 序列 G39U:
[0185] TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGTGAACTTCAGGGTCAGCTTGTCG GCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGTGCAACATTCGTGGCGAATGGGACCATATATATATACAT GAGGATTACCCATGTCCATGG(SEQ ID NO:13)
[0186] 序列 A78G:
[0187] TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGTGAACTTCAGGGTCAGCTTGTCG GCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGGCGAGTGGGACCATATATATATACAT GAGGATTACCCATGTCCATGG(SEQ ID NO:14)
[0188] 序列 C21U:
[0189] TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGTGAACTTCAGGGTCAGCTTGTCG GCCGGCATGGTCCCAGCCTTCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGGCGAATGGGACCATATATATATACAT GAGGATTACCCATGTCCATGG(SEQ ID NO:15)
[0190] 序列 G25A:
[0191] TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGTGAACTTCAGGGTCAGCTTGTCG GCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCACTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGGCGAATGGGACCATATATATATACAT GAGGATTACCCATGTCCATGG(SEQ ID NO:16)
[0192] 序列 A78U:
[0193] TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGTGAACTTCAGGGTCAGCTTGTCG GCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGGCGATTGGGACCATATATATATACAT GAGGATTACCCATGTCCATGG(SEQ ID NO:17)
[0194] 序列 G74C:
[0195] TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGTGAACTTCAGGGTCAGCTTGTCG GCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGCCGAATGGGACCATATATATATACAT GAGGATTACCCATGTCCATGG(SEQ ID NO:18)
[0196] 實例R :使用編碼shGFP的轉(zhuǎn)錄物生產(chǎn)MS2衣殼，所述shGFP在其5'末端上的側(cè) 翼為一種長錘頭狀核酶，并且在其3'末端上的側(cè)翼為附著至MS219聚體RNA發(fā)夾的另一種 長錘頭狀核酶和HDV核酶。
[0197] 如下進行MS2衣殼的生產(chǎn)。將編碼MS2的外殼蛋白質(zhì)的下述DNA序列，序列A(SEQ ID N0:7)克隆到 pDEST14(Life Technologies)質(zhì)粒內(nèi)：
[0198] ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAGAAGGAGATATACATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTT CTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAG CTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCA TCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTAC TTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCT CCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAG
[0199] 將下述DNA序列，序列D (SEQ ID NO: 19)克隆到質(zhì)粒pACYC184內(nèi)。還將轉(zhuǎn)錄終止 子克隆到序列D(SEQ ID NO: 19)的3'末端處（未示出）。序列D(SEQ ID NO: 19)編碼T7 啟動子、設(shè)計為切割siRNA發(fā)夾的5'末端的錘頭狀核酶、siRNA發(fā)夾、設(shè)計為切割siRNA發(fā) 夾的3'末端的錘頭狀核酶、MS2的特異性RNA19聚體和HDV核酶：
[0200] 序列 T7-Rzl5:
[0201] GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGACGTTCACGTTGAATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCTGATGA GGCGCTTCGGCGCCGAAACACCCAGTGGTGTCCAAGCTGACCCTGAAGTTCATTCAAGAGATGAACTTCAGGGTCAG CTTGTCACCGGATGTGCTCTCCGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACAAGCTGACCCTGAAGTTCATCCGTGAAC GACGCTTCAAACATGAGGATTACCCATGTCGAAGCGAATATATATATATAGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCT GGCGCCGGCTGGGCAACACCTTCGGGTGGCGAATGGGACCAAAAAAATATATATATATACCATGG(SEQIDN0:19)
[0202] 使用各含有序列A (SEQ ID N0:7)和序列D(SEQ ID N0:19)的2種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化One Shot BL21(DE3)化學感受態(tài)大腸桿菌（Life Technologies)細胞，選擇氯霉素和氨節(jié)青 霉素抗性轉(zhuǎn)化體。對于衣殼生產(chǎn)，使這些轉(zhuǎn)化體在37°C下在750mL含有氨芐青霉素和氯 霉素兩者的LB培養(yǎng)基中生長。當培養(yǎng)物密度達到0W600nm) =0.8時，隨后加入異丙基 β-D-l-硫代半乳批喃糖苷（Sigma-Aldrich)至ImM的終濃度。誘導后4小時，通過在 3, 000g和4°C下離心40分鐘收獲細胞。在誘導前和在收獲時獲得樣品用于分析。
[0203] 實例S :使用轉(zhuǎn)錄物生產(chǎn)MS2衣殼，所述轉(zhuǎn)錄物編碼shRNA和附著至MS2 19聚體 RNA發(fā)夾的長錘頭狀核酶
[0204] 如實例0中所述進行生產(chǎn)MS2衣殼的幾個實驗，所述MS2衣殼各自殼體化不同貨 物。然而，代替在序列B(SEQ ID N0:8)中包括的HDV核酶序列，在每個實驗中使用長錘頭 狀核酶序列，其與siRNA的3'末端雜交且設(shè)計為切割其。對于每個實驗，使用含有長錘頭 狀核酶的下述序列代替序列B(SEQ ID N0:8):
[0205] 序列10MNT (未良好切割）：
[0206] TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGT GAACTTCAGGGTCAGCTTGTCACCGGATGTGCTCTCCGGTCTGATGAG TCCGTGAGGACGAAACAAGCTGACC, ATATATATATACATGAGGATTACC CATGTCCATGG(SEQ ID NO:20)
[0207] 序列15MNT (未良好切割）：
[0208] TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGT GAACTTCAGGGTCAGCTTGTCACCGGATGTGCTCTCCGGTCTGATGAG TCCGTGAGGACGAAACAAGCTGACCCTGAA ATATATATAT ACATGAGGA ITACCCATGT'CCATCiCKSI'Q ID NO:21)
[0209] 序列20MNT (良好切割）：
[0210] TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGT GAACTTCAGGGTCAGCTTGTCACCGGATGTGCTCTCCGGTCTGATGAG TCCGTGAGGACGAAACAAGCTGACCCTGAAGTTCA. ATATATATAT ACAT id \〇:22)
[0211] 序列22MNT (良好切割）：
[0212] TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGT GAACTTCAGGGTCAGCTTGTCACCGGATGTGCTCTCCGGTCTGATGAG TCCGTGAGGACGAAACAAGCTGACCCTGAAGTTCACT. ATATATATAT AC ATQAQ-OAITAGQGAT-QT ccatgg (seq id no : 23)
[0213] 序列25MNT (良好切割）：
[0214] TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGT GAACTTCAGGGTCAGCTTGTCACCGGATGTGCTCTCCGGTCTGATGAG TCCGTGAGGACGAAACAAGCTGACCCTGAAGTTCACTCTT. ATATATATA T ACATGMj.GATTACCCATGT; CCATGG (SEQ ID NO :24)
[0215] 序列27MNT (良好切割）：
[0216] TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGy\GT GAACTTCAGGGTCAGCTTGTCACCGGATGTGCTCTCCGGTCTGATGAG TCCGTGAGGACGAAACAAGCTGACCCTGAAGTTCACTCTTGA Λ 丨 Λ 丨 Λ 丨 Λ ?'Λ?'ACATGAGGATTACCCATGT CCAI'GG (SI-；Q II) NO:25)
[0217] 該實例中所述的實驗數(shù)據(jù)支持下述結(jié)論：根據(jù)本公開內(nèi)容良好切割的RNA鏈是包 括錘頭狀核酶序列的RNA鏈，對于所述錘頭狀核酶序列，核酶序列的適當折疊動力學有利 超過整條鏈的shRNA("發(fā)夾"）區(qū)段的折疊。計算上述序列各自的熱力學參數(shù)，以測定哪些 序列良好切割，并且哪些序列不是。
[0218] 實例T :使用編碼siRNA的轉(zhuǎn)錄物生產(chǎn)MS2衣殼，所述siRNA在其5'末端上的側(cè) 翼為長錘頭狀核酶，并且在其3'末端處的側(cè)翼為附著至MS219聚體RNA發(fā)夾的反式作用的 HDV核酶。
[0219] 如下進行MS2衣殼的生產(chǎn)。將編碼MS2的外殼蛋白質(zhì)的下述DNA序列（序列A ; SEQ ID N0:7)克隆到 pDEST14(Life Technologies)質(zhì)粒內(nèi)：
[0220] ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAGAAGGAGATATACATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTT CTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAG CTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCA TCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTAC TTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCT CCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAG(SEQ ID NO:7)
[0221] 將下述DNA序列，序列E (SEQ ID NO:26)克隆到質(zhì)粒pACYC184內(nèi)。還將轉(zhuǎn)錄終 止子克隆到序列E(SEQ ID NO:26)的3'末端處（未示出）。序列E(SEQ ID NO:26)編碼 BamHI限制位點、T7啟動子和起始序列、設(shè)計為以反式模式切割針對增強型綠色熒光蛋白 的siRNA(siEGPF)的3'末端的HDV核酶、ΑΤΑΤ間隔物、設(shè)計為切割siEGFP發(fā)夾的5'末端 的長錘頭狀核酶、siEGFP發(fā)夾、以反式模式切割siEGFP發(fā)夾的3'末端的HDV核酶的互補 序列、MS2的特異性RNA19聚體和PacI限制位點：
[0222] GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGATCTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTG GCGAATGGGGGATCATATCTTGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCTGATGAGGCGCTTCGGCGCCGAAACACCGTGTC CAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAATGAACTTCAGGGTCAGCTTGTCGGCCGGCATGCATTCAAACATGAGGATT ACCCATGTCGAAGTTAATTAA(SEQ ID NO:26)
[0223] BamHI和Hindlll位點分別在5,末端和3,末端處添加，以促進克隆到pACYC184 內(nèi)（未示出）。
[0224] 使用各含有序列A(SEQ ID N0:104)和序列E(SEQ ID N0:26)的2種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 One Shot BL21(DE3)化學感受態(tài)大腸桿菌（Life Technologies)細胞，選擇氯霉素和氨節(jié) 青霉素抗性轉(zhuǎn)化體。對于衣殼生產(chǎn)，使這些轉(zhuǎn)化體在37°C下在750mL含有氨芐青霉素和 氯霉素兩者的LB培養(yǎng)基中生長。當培養(yǎng)物密度達到0W600nm) =0.8時，隨后加入異丙 基β -D-1-硫代半乳批喃糖苷（Sigma-Aldrich)至ImM的終濃度。誘導后4小時，通過在 3, OOOg和4°C下離心40分鐘收獲細胞。在誘導前和在收獲時獲得樣品用于分析。
[0225] 實例U :使用編碼靶向GFP的3種不同siRNA的轉(zhuǎn)錄物生產(chǎn)MS2衣殼，所述siRNA 的側(cè)翼為附著至MS2 19聚體RNA發(fā)夾的長錘頭狀核酶。
[0226] 如下進行MS2衣殼的生產(chǎn)。將編碼MS2的外殼蛋白質(zhì)的下述DNA序列（序列A ; SEQ ID N0:7)克隆到 pDEST14(Life Technologies)質(zhì)粒內(nèi)：
[0227] ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAGAAGGAGATATACATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTT CTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAG CTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCA TCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTAC TTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCT CCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAG(SEQ ID NO:7)
[0228] 將下述DNA序列，序列F(SEQ ID N0:27)克隆到質(zhì)粒pACYC184內(nèi)。還將轉(zhuǎn)錄終止 子克隆到序列F(SEQ ID N0:27)的3'末端處（未示出）。序列F(SEQ ID N0:27)編碼T7 啟動子和起始序列、設(shè)計為切割針對增強型綠色熒光蛋白的siRNA(siEGPF)的5'末端的3 種錘頭狀核酶、3種不同的siEGFP發(fā)夾、設(shè)計為切割siEGFP發(fā)夾的3'末端的3種長錘頭狀 核酶、MS2的特異性RNA19聚體：
[0229] GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGACTTGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCTGATGAGGCGCTT CGGCGCCGAAACACCCAGTGGTGTCCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAATGAACTTCAGGGTCAGCTTGTCAC CGGATGTGCTCTCCGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACAAGCTGACCCTGAAGTTCATTATATCTTGGCAGA TGAACTTCAGGGTCAGCTGATGAGACTCTTCGGAGTCGAAACACCCAGTGGTGTCCTGACCCTGAAGTTCATCTG CCAAGAGCAGATGAACTTCAGGGTCAGTCACCGGATGTGCTCTCCGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTGA CCCTGAAGTTCATCTGCTATATCTTGTGGTGCAGATGAACTTCAGGGCTGATGAGGCTCTTCGGAGCCGAAACAC CCAGTGGTGTCCCCTGAAGTTCATCTGCACCACAAGATGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCACCGGATGTGCTCTC CGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACCCTGAAGTTCATCTGCACCATACGCCGGCCATTCAAACATGAGGATT ACCCATGTCGAAGTTAATTAA(SEQ ID NO :27)
[0230] 使用各含有序列A (SEQ ID NO :7)及其他序列F (SEQ ID NO :27)的2種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 One Shot BL21(DE3)化學感受態(tài)大腸桿菌（Life Technologies)細胞，選擇氯霉素和氨節(jié) 青霉素抗性轉(zhuǎn)化體。對于衣殼生產(chǎn)，使這些轉(zhuǎn)化體在37°C下在750mL含有氨芐青霉素和 氯霉素兩者的LB培養(yǎng)基中生長。當培養(yǎng)物密度達到0D(600nm) =0.8時，隨后加入異丙 基β-D-l-硫代半乳批喃糖苷（Sigma-Aldrich)至ImM的終濃度。誘導后4小時，通過在 3, 000g和4°C下離心40分鐘收獲細胞。在誘導前和在收獲時獲得樣品用于分析。
[0231] 實例V :使用編碼靶向GFP的3種不同siRNA的轉(zhuǎn)錄物生產(chǎn)MS2衣殼，所述siRNA 的側(cè)翼為位于其5'末端處的間隔物和附著至MS219聚體RNA發(fā)夾、位于其3'末端處的HDV 核酶。
[0232] 如下進行MS2衣殼的生產(chǎn)。將編碼MS2的外殼蛋白質(zhì)的下述DNA序列（序列A ; SEQ ID N0:7)克隆到 pDEST14(Life Technologies)質(zhì)粒內(nèi)：
[0233] ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAGAAGGAGATATACATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTT CTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAG CTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCA TCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTAC TTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCT CCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAG(SEQ ID N07)
[0234] 將下述DNA序列，序列G(SEQ ID N0:28)克隆到質(zhì)粒pACYC184內(nèi)。還將轉(zhuǎn)錄終 止子克隆到序列G(SEQ ID N0:28)的3'末端處（未示出）。序列G(SEQ ID N0:28)編碼 BamHI限制位點、T7啟動子和起始序列、在針對增強型綠色熒光蛋白的siRNA (siEGPF)的5' 末端處的3個間隔物、3種不同的siEGFP發(fā)夾、設(shè)計為切割siEGFP發(fā)夾的3'末端的3種 HDV核酶、MS2的特異性RNA19聚體和PacI限制位點：
[0235] GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGAATATATATACAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAATGAA CTTCAGGGTCAGCTTGTCGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGGCGAATGG GACCAATTAATTACTGACCCTGAAGTTCATCTGCCAAGAGCAGATGAACTTCAGGGTCAGTCGGCCGGCATGGTCCC AGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGGCGAATGGGACCAATAATAATCCCTGAAGTTCATCTGCACC ACAAGATGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTC GTGGCGAATGGGACCCATTCAAACATGAGGATTACCCATGTCGAAGTTAATTAA(SEQ ID NO:28)
[0236] 使用各含有序列A (SEQ ID NO :7)和序列G (SEQ ID NO :28)的2種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化One Shot BL21(DE3)化學感受態(tài)大腸桿菌（Life Technologies)細胞，選擇氯霉素和氨節(jié)青 霉素抗性轉(zhuǎn)化體。對于衣殼生產(chǎn)，使這些轉(zhuǎn)化體在37°C下在750mL含有氨芐青霉素和氯 霉素兩者的LB培養(yǎng)基中生長。當培養(yǎng)物密度達到0W600nm) =0.8時，隨后加入異丙基 β-D-l-硫代半乳批喃糖苷（Sigma-Aldrich)至ImM的終濃度。誘導后4小時，通過在 3, 000g和4°C下離心40分鐘收獲細胞。在誘導前和在收獲時獲得樣品用于分析。
[0237] 實例W :使用編碼靶向GFP的兩條siRNA鏈的轉(zhuǎn)錄物生產(chǎn)MS2衣殼，所述siRNA鏈 各自的側(cè)翼為位于其3'末端處的長錘頭狀核酶和附著至MS219聚體RNA發(fā)夾、位于其5' 末端處的HDV核酶。
[0238] 如下進行MS2衣殼的生產(chǎn)。將編碼MS2的外殼蛋白質(zhì)的下述DNA序列（序列A ; SEQ ID N0:7)克隆到 pDEST14(Life Technologies)質(zhì)粒內(nèi)：
[0239] ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAGAAGGAGATATACATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTT CTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAG CTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCA TCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTAC TTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCT CCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAG(SEQ ID NO:7)
[0240] 將下述DNA序列，序列H(SEQ ID NO: 29)克隆到質(zhì)粒pACYC184內(nèi)。還將轉(zhuǎn)錄終止 子克隆到序列Η的3'末端處（未示出）。
[0241] 序列 T7_Rz8
[0242] GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGAATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCTGATGAGGCGCTTCGGCG CCGAAACACCGTGTCCAAGCTGACCCTGAAGTTCATGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGC AACATTCGTGGCGAATGGGACCATTAGCCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGATGAGACTCCGAATTCGGAGTCGAA ACACGGTAACCGTGTCATGAACTTCAGGGTCAGCTTGGCGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTG GGCAACATTCGTGGCGAATGGGACCCATTCAAACATGAGGATTACCCATGTCGAAGCCATGG(SEQ ID NO:29)
[0243] 使用各含有序列A(SEQ ID NO: 104)和序列H(SEQ ID NO: 126)的2種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 One Shot BL21(DE3)化學感受態(tài)大腸桿菌（Life Technologies)細胞，選擇氯霉素和氨節(jié) 青霉素抗性轉(zhuǎn)化體。對于衣殼生產(chǎn)，使這些轉(zhuǎn)化體在37°C下在750mL含有氨芐青霉素和 氯霉素兩者的LB培養(yǎng)基中生長。當培養(yǎng)物密度達到0W600nm) =0.8時，隨后加入異丙 基β-D-l-硫代半乳批喃糖苷（Sigma-Aldrich)至ImM的終濃度。誘導后4小時，通過在 3, 000g和4°C下離心40分鐘收獲細胞。
[0244] 實例X :使用編碼靶向綠色熒光蛋白（GFP)的2種不同siRNA的轉(zhuǎn)錄物生產(chǎn)MS2 衣殼，所述siRNA的側(cè)翼為位于其3'末端和5'末端處、附著至MS219聚體RNA發(fā)夾的間隔 物。
[0245] 如下進行MS2衣殼的生產(chǎn)。將編碼MS2的外殼蛋白質(zhì)的下述DNA序列（序列A ; SEQ ID N0:7)克隆到 pDEST14(Life Technologies)質(zhì)粒內(nèi)：
[0246] ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAGAAGGAGATATACATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTT CTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAG CTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCA TCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTAC TTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCT CCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAG(SEQ ID NO:7)
[0247] 將下述DNA序列，序列I (SEQ ID NO: 30)克隆到質(zhì)粒pACYC184內(nèi)。還將轉(zhuǎn)錄終止 子克隆到序列I (SEQ ID NO: 30)的3'末端處（未示出）。序列I (SEQ ID NO: 30)編碼T7 啟動子和起始序列、分離針對綠色熒光蛋白的siRNA(siGPF)的末端的3個間隔物、2種不同 的siEGFP發(fā)夾、MS2的特異性RNA19聚體：
[0248] GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAATAATAATCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAATGAA CTTCAGGGTCAGCTTGTCAATAATAATCCGCTACCCCGACCACATGAACAAGATTCATGTGGTCGGGGTAGCGGTCA ATAATAATACGCTTCAAACATGAGGATTACCCATGTCGAAGCGACCATGG(SEQ ID NO:30)
[0249] 使用各含有序列A (SEQ ID NO :7)和序列I (SEQ ID NO :30)的2種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化One Shot BL21(DE3)化學感受態(tài)大腸桿菌（Life Technologies)細胞，選擇氯霉素和氨節(jié)青 霉素抗性轉(zhuǎn)化體。對于衣殼生產(chǎn)，使這些轉(zhuǎn)化體在37°C下在750mL含有氨芐青霉素和氯 霉素兩者的LB培養(yǎng)基中生長。當培養(yǎng)物密度達到0W600nm) =0.8時，隨后加入異丙基 β-D-l-硫代半乳批喃糖苷（Sigma-Aldrich)至ImM的終濃度。誘導后4小時，通過在 3, 000g和4°C下離心40分鐘收獲細胞。在誘導前和在收獲時獲得樣品用于分析。
[0250] 實例Y :實例0至X中獲得的MS2VLP的純化。
[0251] 使用實例N中概述的操作純化實例0至X中獲得的MS2衣殼。
[0252] 實例Z :實例N中獲得的MS2衣殼中殼體化的RNA的分離
[0253] 根據(jù)由制造商（Life Technologies, Grand Island, NY)提供的方案，使 用TRIzol?'試劑，從每個實驗中提取如實例N中所述純化的MS2衣殼中殼體化 的RNA。獲得的RNA通過在95 °C下在甲酰胺中加熱5分鐘進行變性，并且通過在 17.6〇1?38〇]?0.04〇11(1，1^1')凝膠中電泳進行分析，所述凝膠由8%聚丙烯酰胺、8摩爾尿 素、1. 08% Tris堿、0. 55%硼酸和0. 093% EDTA組成。電泳緩沖液具有與凝膠相同濃度的 Tris堿、硼酸和EDTA。功率以約40W遞送。使用在以pH8含有25%甲酰胺、19%異丙醇和 15mM Tris 的含水混合物中的 Stains-All 染料（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)的 0· 025% 溶液將凝膠染色。獲得的結(jié)果顯示于圖15中。圖15中用于RNA電泳的泳道編號指圖14 中用于蛋白質(zhì)電泳的相同泳道編號。在每個泳道中可觀察到單一 RNA條帶，與在每種情況 下回收的高純度RNA-致。
[0254] 實例AA :HDV核酶在體外轉(zhuǎn)錄過程中產(chǎn)生shRNA。
[0255] 構(gòu)建體T7_Rz2用于體外轉(zhuǎn)錄。將該構(gòu)建體克隆到pACYC184質(zhì)粒（New England Biolabs)內(nèi)。使用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化One Shot BL21 (DE3)化學感受態(tài)大腸桿菌（Life Technologies)細胞。含有該質(zhì)粒的BL21(DE3)在37°C下在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng) 基中生長至0D(600nm)等于0. 8。根據(jù)制造商的說明書，使用QIAprep? Spin Miniprep Kit(Qiagen)分離質(zhì)粒。Ncol (New England Biolabs)用于在引入該構(gòu)建體內(nèi)的限制位點 處切割分離的質(zhì)粒。在消化后，模板通過在1. 5 %瓊脂糖凝膠上電泳進行純化，并且根據(jù)制 造商的說明書，使用 PureLink? Quick Gel Extraction Kit(Life Technologies)進行分 離。根據(jù)制造商的說明書，使用MAXIscript?T7試劑盒完成逆轉(zhuǎn)錄。RNA產(chǎn)物在70°C下 運行的Novex?變性15%聚丙烯酰胺TBE-尿素凝膠（Life Technologies)中進行電泳。 使用溴化乙陡（Sigma-Aldrich)顯現(xiàn)RNA條帶。使用Image Lab4.0. 1軟件（Bio-Rad)完 成凝膠成像。
[0256] 模板T7_Rz2如下編碼T7啟動子、shRNA發(fā)夾、設(shè)計為切割shRNA發(fā)夾的3'末端 的HDV核酶、ATATATATAT間隔物和Ncol _曝_魁倍點_ :
[0257] TAATACGACTCACTATAGGCTTGTGATGCTTCAGCCAAATCAAGAGTTTGGCTGAAGCATCACAAGCG GCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGGCGAATGGGACCATATATATATACAT GAGGATTACCCATGTCCATGG(SEQ ID NO:31)
[0258] 結(jié)果顯示HDV核酶切割。頂部條帶是未切割的轉(zhuǎn)錄物，并且兩個較低條帶是預期 切割的RNA小片。
[0259] 圖16中的凝膠顯示在最左邊泳道中的一組RNA標記，在以后泳道中的49核苷酸 shRNA標記，在第三泳道中在37°C下運行1小時的T7-Rz2構(gòu)建體的體外轉(zhuǎn)錄和切割，以及 在第四、最右邊泳道中在37°C下運行1小時并在42°C下溫育另外一小時的T7-Rz2構(gòu)建體 的體外轉(zhuǎn)錄和切割。
[0260] 三個最強烈的條帶中最慢的具有在37處高于在37/42處的強度。另外，兩個更快 速的條帶具有在37/42處高于在37處的強度。在最后一個泳道中的最低分子量條帶運行 略微慢于49nt shRNA標準物，如對于T7Rz2中所得的51核苷酸shRNA預期的?？傊鐖D 16中所示的結(jié)果與HDV核酶在T7-Rz2中切割的假設(shè)一致。
[0261] 實例BB :長側(cè)翼錘頭狀核酶在體外轉(zhuǎn)錄過程中切割至比短側(cè)翼錘頭狀核酶顯著 更高的程度
[0262] 構(gòu)建體T7_Rzl和T7_Rz4用于體外轉(zhuǎn)錄。T7_Rzl包含常見核酶，即具有小于6對 雜交核苷酸的雜交被切割siRNA的莖。T7-Rz4包含具有長度長的莖的側(cè)翼核酶，所述莖雜 交被切割的siRNA，即具有超過6對雜交核苷酸的莖。
[0263] 構(gòu)建體T7_Rzl編碼T7啟動子、具有與siRNA互補的5個核苷酸的設(shè)計為切割 siRNA發(fā)夾的5'末端的錘頭狀（HH)核酶、siRNA發(fā)夾、具有與siRNA互補的5個核苷酸的 設(shè)計為切割siRNA發(fā)夾的3'末端的HH核酶、和Ncol限制位點：
[0264] TAATACGACTCACTATAGGCTCGAGCAAGCCTGATGAGGCGCTTCGGCGCCGAAACACCGTGTCGCTT GTGATGCTTCAGCCAAATCAAGAGTTTGGCTGAAGCATCACAAGCTCACCGGATGTGCTCTCCGGTCTGATGAGTC CGTGAGGACGAAAGCTTGCCATGG(SEQ ID NO :32)
[0265] 構(gòu)建體T7_Rz4編碼siRNA，所述siRNA的側(cè)翼為具有與siRNA雜交的12個核苷 酸、設(shè)計為切割其5'末端的HH核酶，和具有與siRNA雜交的23個核苷酸、設(shè)計為切割其3' 末端的HH核酶：
[0266] TAATACGACTCACTATAGGGAGAACGCCGGCCATTCAAATAGTAAATAATAGAGGGTCAGCTTGCTGAT GAGGCGCTTCGGCGCCGAAACACCGTGTCCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGTGAACTTCAGGGTCAGCTTGT CACCGGATGTGCTCTCCGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACAAGCTGACCCTGAAGTTCACTACGCCGGCCATT CAAACATGAGGATTACCCATGTCCATGG(SEQ ID NO :33)
[0267] 體外轉(zhuǎn)錄實驗和分析以與實例Y中那些相似的方式用這些構(gòu)建體運行。如圖17 中所示，用構(gòu)建體T7-Rzl獲得的結(jié)果與核酶切割至極低程度的假設(shè)一致。圖17中所示的 用構(gòu)建體T7-Rz4獲得的結(jié)果與核酶切割至顯著程度的假設(shè)一致。
[0268] 實例CC :使用編碼針對EGFP的shRNA的轉(zhuǎn)錄物生產(chǎn)MS2衣殼，所述shRNA的側(cè)翼 為在其5'末端處的長錘頭狀核酶和在其3'末端處附著至MS219聚體RNA發(fā)夾的另一種長 錘頭狀核酶。
[0269] 如下進行MS2衣殼的生產(chǎn)。將編碼MS2的外殼蛋白質(zhì)的下述DNA序列（序列A ; SEQ ID N0:7)克隆到 pDEST14(Life Technologies)質(zhì)粒內(nèi)：
[0270] ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAGAAGGAGATATACATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTT CTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAG CTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCA TCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTAC TTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCT CCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAG(SEQ ID N07)
[0271] 將下述DNA序列（構(gòu)建體T7_Rz4)克隆到質(zhì)粒pACYC184內(nèi)。還將轉(zhuǎn)錄終止子克 隆到構(gòu)建體T7-Rz4的3'末端處（未示出）。
[0272] TAATACGACTCACTATAGGGAGAACGCCGGCCATTCAAATAGTAAATAATAGAGGGTCAGCTTGCTGAT GAGGCGCTTCGGCGCCGAAACACCGTGTCCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGTGAACTTCAGGGTCAGCTTGT CACCGGATGTGCTCTCCGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACAAGCTGACCCTGAAGTTCACTACGCCGGCCATT CAAACATGAGGATTACCCATGTCCATGG(SEQ ID NO :33)
[0273] 使用各含有序列A (SEQ ID NO: 7)和構(gòu)建體T7-Rz4 (SEQ ID NO: 33)的2種質(zhì)粒轉(zhuǎn) 化One Shot BL21(DE3)化學感受態(tài)大腸桿菌（Life Technologies)細胞，選擇氯霉素和氨 芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體。對于衣殼生產(chǎn)，使這些轉(zhuǎn)化體在37 °C下在750mL含有氨芐青霉素和 氯霉素兩者的LB培養(yǎng)基中生長。當培養(yǎng)物密度達到0W600nm) =0.8時，隨后加入異丙 基β -D-1-硫代半乳批喃糖苷（Sigma-Aldrich)至ImM的終濃度。誘導后4小時，通過在 3, 000g和4°C下離心40分鐘收獲細胞。在誘導前和在收獲時獲得樣品用于分析。
[0274] 實例DD :實例CC中獲得的病毒樣顆粒的純化。
[0275] 如實例N中進行實例CC中產(chǎn)生的病毒樣顆粒的純化。
[0276] 實例EE :實例DD中獲得的病毒樣顆粒中的RNA的分離
[0277] 根據(jù)由制造商（Life Technologies, Grand Island, NY)提供的方案，使用 TRIzol?試劑，提取如實例DD中所述純化的病毒樣顆粒中殼體化的RNA。獲得的RNA通過 在95°C下在甲酰胺中加熱5分鐘進行變性，并且通過在70°C下運行的Novex?變性15% 聚丙烯酰胺TBE-尿素凝膠（Life Technologies)中電泳進行分析。使用0.5yg溴化乙陡 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) /mL水溶液顯現(xiàn)RNA條帶。獲得的結(jié)果顯示于圖18,泳道3 中。泳道1顯示一組分子標準物。泳道2顯示化學合成的長49個核苷酸的shRNA。
[0278] 實例FF :實例DD中獲得的包含MS2衣殼的病毒樣顆粒對來自白色側(cè)齒霉菌 (Engyodontium album)、地衣芽孢桿菌（licheniformis)的蛋白酶K，來自豬胃粘膜的胃蛋 白酶，和來自木瓜乳的木瓜蛋白酶是抗性的。
[0279] 包含得自250mL培養(yǎng)物且如實例DD中所述純化的MS2衣殼的病毒樣顆粒懸浮于 以 pH = 7. 5 的 400 μ L20mM CaCl2 水溶液中。
[0280] 將66 μ L該懸浮液的等分試樣用以pH = 7. 5的20mM CaCl2水溶液稀釋至0. 25mL， 并且在37°C下溫育。在溫育1小時和4小時后獲得樣品用于蛋白質(zhì)濃度（Pierce? BCA Protein Assay Kit, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)和 SDS PAGE 分析。在這 2 份樣品中的蛋白質(zhì)濃度分別為3086和4656mg/L。SDS PAGE分析分別顯示于圖19,泳道IB 和6中。將相同量的蛋白質(zhì)裝載到每個泳道中（4yg)。該組實驗用作陰性對照。
[0281] 將2 μ g來自灰色鏈霉菌的蛋白酶（Sigma Aldrich, St. Louis, M0)用以pH = 7. 5 的20mMCaCl2水溶液稀釋至0. 25mL，并且在37°C下溫育。在溫育1小時和4小時后獲得樣 品用于蛋白質(zhì)濃度和SDS PAGE分析。在這2份樣品中的蛋白質(zhì)濃度分別為361和324mg/ L。SDS PAGE分析分別顯示于圖19,泳道1和7中。將相同量的蛋白質(zhì)裝載到每個泳道中 (4yg)。該組實驗用作另一種陰性對照。
[0282] 將2 μ g來自灰色鏈霉菌的蛋白酶加入包含MS2衣殼的病毒樣顆粒懸浮液的另一 個66yL等分試樣中，用以pH= 7. 5的20mM CaCl2水溶液稀釋至0. 25mL，并且在37°C下 溫育。在溫育1小時和4小時后獲得樣品用于蛋白質(zhì)濃度和SDS PAGE分析。在這2份樣 品中的蛋白質(zhì)濃度分別為2940和3012mg/L。SDS PAGE分析分別顯示于圖19,泳道2和8 中。將相同量的蛋白質(zhì)裝載到每個泳道中（4yg)。該組實驗用于測試形成病毒樣顆粒的 MS2衣殼針對來自灰色鏈霉菌的蛋白酶的蛋白酶解穩(wěn)定性。觀察到小于10%降解。
[0283] 用以pH = 7. 5的20mM CaCl2水溶液稀釋至0. 25mL、包含MS2衣殼的病毒樣顆粒 懸浮液的另一個66 μ L等分試樣被實施加熱至95°C 10分鐘和在濕冰上冷卻10分鐘的三個 循環(huán)，以實現(xiàn)病毒樣顆粒的拆卸。隨后將2 μ g來自灰色鏈霉囷的蛋白酶加入該懸浮液中， 并且在37°C下溫育。在溫育1小時和4小時后獲得樣品用于蛋白質(zhì)濃度和SDS PAGE分析。 在這2份樣品中的蛋白質(zhì)濃度分別為2601和3033mg/L。SDS PAGE分析分別顯示于圖19， 泳道3和9中。將相同量的蛋白質(zhì)裝載到每個泳道中（4yg)。拆卸的顆粒由來自灰色鏈霉 菌的蛋白酶降解至顯著程度。該組實驗用作陽性對照。
[0284] 將溶解于以pH = 7. 5的0. 002mL20mM CaCl2水溶液中的2 μ g來自灰色鏈霉菌的 蛋白酶加入〇. 248mL細菌細胞裂解物中，所述細菌細胞裂解物得自來自實例CC的41mL細 胞培養(yǎng)物，并且在37°C下溫育。在溫育1小時和4小時后獲得樣品用于蛋白質(zhì)濃度和SDS PAGE分析。在這2份樣品中的蛋白質(zhì)濃度分別為3192和4837mg/L。SDS PAGE分析分別顯 示于圖19,泳道4和10中。標記為L的圖19的最后一個泳道顯示未經(jīng)處理的細菌細胞裂 解物。將相同量的蛋白質(zhì)裝載到每個泳道中（4 μ g)。超過90%的除MS2衣殼蛋白質(zhì)以外 的蛋白質(zhì)由來自灰色鏈霉菌的蛋白酶降解。該組實驗用作另一種陽性對照。
[0285] 該組五個實驗證實形成本公開內(nèi)容的病毒樣顆粒的MS2衣殼對由來自灰色鏈霉 菌的蛋白酶的蛋白酶解是抗性的。
[0286] 將2 μ g來自地衣芽孢桿菌的蛋白酶（Sigma Aldrich, St. Louis, M0)用以pH = 7. 5的lOmM乙酸鈉和5mM乙酸鈣水溶液稀釋至0. 25mL，并且在37°C下溫育。在溫育1小時 和4小時后獲得樣品用于蛋白質(zhì)濃度和SDS PAGE分析。在這2份樣品中的蛋白質(zhì)濃度分 別為976和1003mg/L。SDS PAGE分析分別顯示于圖19,泳道2B和7B中。將相同量的蛋白 質(zhì)裝載到每個泳道中（4 μ g)。該組實驗用作另一種陰性對照。
[0287] 將2 μ g來自地衣芽孢桿菌的蛋白酶加入包含MS2衣殼的病毒樣顆粒懸浮液的另 一個66 μ L等分試樣中，用以pH = 7. 5的10mM乙酸鈉和5mM乙酸鈣水溶液稀釋至0. 25mL， 并且在37°C下溫育。在溫育1小時和4小時后獲得樣品用于蛋白質(zhì)濃度和SDS PAGE分析。 在這2份樣品中的蛋白質(zhì)濃度分別為3144和3727mg/L。SDS PAGE分析分別顯示于圖19， 泳道3B和8B中。將相同量的蛋白質(zhì)裝載到每個泳道中（4yg)。該組實驗用于測試形成病 毒樣顆粒的MS2衣殼針對來自地衣芽孢桿菌的蛋白酶的蛋白酶解穩(wěn)定性。觀察到小于10% 降解
[0288] 用以pH = 7. 5的10mM乙酸鈉和5mM乙酸鈣水溶液稀釋至0. 25mL、包含MS2衣殼 的病毒樣顆粒懸浮液的另一個66 μ L等分試樣被實施加熱至95°C 10分鐘和在濕冰上冷卻 10分鐘的三個循環(huán)，以實現(xiàn)病毒樣顆粒的拆卸。隨后將2 μ g來自地衣芽孢桿菌的蛋白酶 加入該懸浮液中，并且在37°C下溫育。在溫育1小時和4小時后獲得樣品用于蛋白質(zhì)濃度 和SDS PAGE分析。在這2份樣品中的蛋白質(zhì)濃度分別為1769和1785mg/L。SDS PAGE分 析分別顯示于圖19,泳道4B和9B中。將相同量的蛋白質(zhì)裝載到每個泳道中（4yg)。拆卸 的顆粒由來自地衣芽孢桿菌的蛋白酶降解。該組實驗用作陽性對照。
[0289] 將溶解于以pH = 7. 5的0. 002mL 10mM乙酸鈉和5mM乙酸鈣水溶液中的2 μ g來自 地衣芽孢桿菌的蛋白酶加入0. 248mL細菌細胞裂解物中，所述細菌細胞裂解物得自來自實 例CC的41mL細胞培養(yǎng)物，并且在37°C下溫育。在溫育1小時和4小時后獲得樣品用于蛋 白質(zhì)濃度和SDS PAGE分析。在這2份樣品中的蛋白質(zhì)濃度分別為3696和4078mg/L。SDS PAGE分析分別顯示于圖19,泳道6B和10B中。標記為L的圖19的最后一個泳道顯示未經(jīng) 處理的細菌細胞裂解物。將相同量的蛋白質(zhì)裝載到每個泳道中（4 μ g)。超過90%的除MS2 衣殼蛋白質(zhì)以外的蛋白質(zhì)由來自地衣芽孢桿菌的蛋白酶降解。該組實驗用作另一種陽性對 照。
[0290] 該組四個實驗證實形成本公開內(nèi)容的病毒樣顆粒的MS2衣殼對由來自地衣芽孢 桿菌的蛋白酶的蛋白酶解是抗性的。
[0291] 三組另外的等價實驗證實形成本公開內(nèi)容的病毒樣顆粒的MS2衣殼對由下述三 種蛋白酶中的任一種的蛋白酶解是抗性的：來自白色側(cè)齒霉菌的蛋白酶K、來自豬胃粘膜 的胃蛋白酶（CAS編號9001-75-6)、和來自木瓜乳的木瓜蛋白酶（CAS編號9001-73-4) (Sigma-Aldrich，St.Louis，M0)。每種蛋白酶根據(jù)制造商的說明書使用。蛋白酶K在pH = 7. 5下使用，胃蛋白酶在pH = 1. 6下使用，并且木瓜蛋白酶在pH = 6. 6下使用。
[0292] 實例GG :衣殼外殼蛋白質(zhì)變體
[0293] MS2病毒衣殼蛋白質(zhì)（SEQ. ID No. 3)具有單個折疊結(jié)構(gòu)域，并且屬于超家族d. 85 的折疊家族d. 85. 1 (RNA細菌噬菌體衣殼蛋白質(zhì)），所述超家族d. 85包括光滑病毒科和 alloleviviridae衣殼蛋白質(zhì)。該家族中的每個衣殼單體由6鏈β片層隨后為兩個螺旋 (有時描述為具有紐結(jié)的長螺旋）組成。180個單體非共價裝配，以形成二十面體（大致球 形的）病毒衣殼，其中連續(xù)β片層面向衣殼內(nèi)部，并且 α-螺旋在衣殼外部上。關(guān)于均為 d. 85. 1家族光滑病毒科外殼蛋白質(zhì)的腸桿菌噬菌體MS2、GA(UniProt序列標識符Ρ07234) 和FR(UniProt序列標識符P03614)病毒衣殼以及由MS2二聚體（其中一個MS2的一個C 末端已融合至另一個的N末端）形成的MS2衣殼，X射線晶體結(jié)構(gòu)已得到解決并且置于公 眾域中。關(guān)于這些結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫標識符分別為1AQ3(SEQ ID N0:34)、1GAV(SEQ ID N0:35)、1FRS(SEQ ID N0:36)和 2VTU(SEQ ID N0:37)，并且這些的比對顯示于圖 20 中。 在本文描述的所有比對中，殘基編號是序貫殘基編號，例如SEQ ID3以由細胞去除的引導 Met (M)殘基的0開始，如大多數(shù)PDB結(jié)構(gòu)使用的。
[0294] MS2病毒衣殼蛋白質(zhì)相對于GA和FR病毒衣殼蛋白質(zhì)的序列分別為59 %和87 %相 同的。僅56%的序列位置具有相同序列，并且當所有三種序列一起考慮時，就主鏈而言的拓 撲學等價的位置重疊。MS2病毒衣殼蛋白質(zhì)相對于GA和FR病毒衣殼單體的主鏈構(gòu)象的均 方根（rms)偏差在1A下。1AQ3單體A相對于1GAV單體0的主鏈均方根偏差為0. 89埃。 1AQ3單體A相對于1FRS單體A的主鏈均方根偏差為0. 37埃。使用免費軟件實用jFATCAT 剛性（Prlic,等人，Bioinformatics26, 2983-2985 (2010) ;www. rcsb.org/pdb/workbench/ workbench, do ;www. rcsb. org/pdb/workbench/workbench. do)作出比較，所述免費軟件是 在其標準蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)工具工作臺中在RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站處可獲得的結(jié)構(gòu)研究蛋白質(zhì) 從業(yè)者熟悉的工具。這些蛋白質(zhì)的總體折疊是相同的。不存在插入或缺失。獨立精制結(jié) 晶學非對稱單位中的每種蛋白質(zhì)。在非對稱單位內(nèi)的不同的組成上相同蛋白質(zhì)一般主鏈 均方根偏差1?；蚋螅M管核心的拓撲學等價C α原子趨于相差小于約0. 45埃（Cyrus Chothia & Arthur M Lesk(1986)EMB0 J5,823-826)。例如 1AQ3 單體 A 和 1AQ3 單體 B 具 有1. 72A的均方根偏差（jFATCAT剛性），主要是由于Lys66-Trp82區(qū)域中的構(gòu)象差異。
[0295] 如果已鑒定折疊家族的足夠成員，則在家族很少或從未突變的序列內(nèi)保守殘基、 拓撲學等價殘基位置的清晰畫面出現(xiàn)。非保守位置可預期從一個序列到另一個突變，而不 擾亂家族折疊，可能與折疊中的一個或多個空間鄰居的協(xié)調(diào)突變結(jié)合，特別是如果側(cè)鏈針 對空間鄰居的一條或多條側(cè)鏈壓實。保守殘基對于蛋白質(zhì)的折疊穩(wěn)定性、功能或加工例如 蛋白酶解消化可以是關(guān)鍵的。一些可以是一致保守的。GenBank(Dennis A. Benson, Ilene Karsch-Mizrachi, David J.Lipman, James Ostell 和 David L.Wheeler(2005) Nucleic Acids Res 33, D34-D38)目前容納353種光滑病毒科外殼蛋白質(zhì)序列。圖 21中所示的比對表顯示40種完全光滑病毒科外殼蛋白質(zhì)序列的多重比對，所述外殼 蛋白質(zhì)序列從總體蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫UniProt (Universal Protein Resource, (The UniProt Consortium, Reorganizing the protein space at the Universal Protein Resource(UniProt)NucleicAcidsRes. 40 ：D71~D75 (2012)), http://www. uniprot. org) (參見下表1)中檢索，并且用BLAST(閾值=10,自動加權(quán)陣列選擇，無過濾，允許缺口）比 對。除 efl08465 之外的所有序列均得自 UniProt。efl08465 來自 GenBank(www.ncbi.nlm. nih.gov/genbank)。在比對表中，星號〇)指示保守殘基，x基于側(cè)鏈溶劑可接近性、氫鍵 合需求和主鏈構(gòu)象約束計算為可置換的。這些家族成員的序列中的五十七（57)個殘基是 保守的，或45%的序列彼此相同。這些序列中的一些具有在SEQ ID N0:3的C末端Tyrl29 殘基后的另外的殘基，其他具有就SEQ ID N0:3而g從N末端去除的1_2個殘基。在折置 內(nèi)不存在插入或缺失。
[0296] 表1 :從總體蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫UniProt中檢索的40種完全光滑病毒科外殼蛋白 質(zhì)序列列表
[0297] 登記條目名稱_4#_標識符 G4WZU0 G4WZU0_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 ms2 329852 DOU1D6 D0U1D6_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 ms2 12022 C0M2U4 C0M2U4_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 ms2 12022 基因 ms2g2 C0M2S8 C0M2S8_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 ms2 12022 基因 ms2g2 C0M212 C0M212_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 ms2 12022 基因 ms2g2 C0M1M2 C0M1M2_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 ms2 12022 基因 ms2g2 C0M2L4 C0M2L4_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 ms2 12022 基因 ms2g2 C0M220 C0M220_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 ms2 12022 基因 ms2g2 Q2V0S8 Q2VOS8_BPB01116 腸桿菌噬菌體 bol 12014 C0M216 C0M216_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 ms2 12022 基因 ms2g2 C0M1Y0 C0M1Y0_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 ms2 12022 基因 ms2g2 D0U1E4 D0U1E4_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 ms2 12022 基因 ms2g2 C0M309 C0M309_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 ms2 12022 基因 ms2g2 C0M325 C0M325_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 ms2 12022 基因 ms2g2 Q9T丨C7 Q9T丨C7_BPMS2丨丨6腸桿菌噬菌體ms丨2 110679 C0M2Z1 C0M2Z1_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 ms2 12022 基因 ms2g2 C0M1N8 C0M1N8_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 ms2 12022 基因 ms2g2 J9QBW2 J9QBW2_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 ms2 12022 基因 ms2g2 C8XPC9 C8XPC9_BPMS2113 腸桿菌噬菌體 ms2 329852 COM2Y4 COM2Y4_BPMS2115 腸桿菌噬菌體 ms2 12022 基因 ms2g2 P69171 外殼_BPZR115 腸桿菌噬菌體zr 332942 P69170外殼_BPR17116腸桿菌噬菌體rl7 12026 P03612外殼_BPMS2 腸桿菌噬菌體ms2 329852 C0M1L4 C0M1L4_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 ms2 12022 基因 ms2g2 C8XPD7 C8XPD7_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 ms2 329852 基因 cp Q2V0T1 Q2V0T1_BPZR116 腸桿菌噬菌體 zr 332942 Q9MCD7 Q9MCD7_BPJP5 丨 15 腸桿菌噬菌體 jp501 丨 2020 P03611 外殼_BPF2115 腸桿菌噬菌體￡2 12016
[0298] P34700外殼_BPJP3115 腸桿菌噬菌體jp34 12019 Q2V01.J0 Q2V0U0_BPBZ1115 腸桿菌噬菌體 jp500 332939 Q2V0T7 Q2V0T7_BPBZ 1115 腸桿菌噬菌體 sd 332940 Q9MBL2Q9MBL2_BPKU1115 腸桿菌噬菌體 kul 12021 P07234外殼_BPGA115 腸桿菌噬菌體ga 12018 C8YJG7 C8YJG7-BPBZ1115 腸桿菌噬菌體 bzl3 329853 C8YJH1 C8YJH 1_BPBZ丨1丨5 腸桿菌噬菌體 bzl3 329853 C8YJH5 C8YJH5_BPBZ1 丨 15 腸桿菌噬菌體 bzl3 329853 Q2V0T4 Q2V0T4_BPTH 1115 腸桿菌噬菌體 th 1 12029 Q2V0U3 Q2V0U3_BPBZ1116 腸桿菌噬菌體 t丨2 332938 P03614 n*_BPFR116 腸桿菌噬菌體 fr 12017 ef108465 腸桿菌噬菌體rl7 329852
[0299] SEQ ID N0:341AQ3腸桿菌噬菌體MS2外殼蛋白質(zhì)T59S
[0300] ASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYSIKVEVPKVAT QTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0301] SEQ ID N0:351GAV腸桿菌噬菌體GA外殼蛋白質(zhì)A59T G79V
[0302] ATLRSFVLVDNGGTGNVTVVPVSNANGVAEWLSNNSRSQAYRVTASYRASGADKRKYTIKLEVPKIVTQ VVNGVELPGSAWKAYASIDLTIPIFAATDDVTVISKSLAGLFKVGNPIAEAISSQSGFYA
[0303] SEQ ID N0:361FRS腸桿菌噬菌體FR外殼蛋白質(zhì)
[0304] >sp | P03614 |外殼_BPFR外殼蛋白質(zhì)0S =腸桿菌噬菌體frPE = 1 SV = 4
[0305] ASNFEEFVLVDNGGTCDVKVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSANNRKYTVKVEVPKVAT QVQGGVELPVAAWRSYMNMELTIPVFATNDDCALIVKALQGTFKTGNPIATAIAANSGIY
[0306] SEQ ID N0:372VTU腸桿菌噬菌體MS2外殼蛋白質(zhì)共價二聚體
[0307] sp|P03612|外殼_BPMS2外殼蛋白質(zhì)0S =腸桿菌噬菌體MS2PE = 1 SV = 2
[0308] ASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVAT QTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIYANFTQFVLVDNGGTCDV TVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIF ATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0309] SEQ ID N0:38(SEQ ID N0:38)G4WZU0G4WZU0_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 ms2329852
[0310] >sp|P03612|外殼_BPMS2外殼蛋白質(zhì)OS =腸桿菌噬菌體MS2 PE = 1SV = 2
[0311] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNLELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0312] SEQ ID NO :39
[0313] D0U1D6 D0U1D6_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 ms2 12022
[0314] >tr|D0UlD6|D0UlD6_BPMS2 外殼蛋白質(zhì) OS =腸桿菌噬菌體 MS2 PE = 4SV = 1
[0315] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNLELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0316] SEQ ID NO :40
[0317] C0M2U4 C0M2U4_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 ms2 12022 基因 ms2g2
[0318] >tr | C0M2U4 | C0M2U4_BPMS2 外殼蛋白質(zhì) OS =腸桿菌噬菌體 MS2GN = MS2g2PE = 4SV = 1
[0319] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVELPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0320] SEQ ID NO:41
[0321] C0M2S8 C0M2S8_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 ms2 12022 基因 ms2g2
[0322] >tr I C0M2S8 I C0M2S8_BPMS2 外殼蛋白質(zhì) OS =腸桿菌噬菌體 MS2GN = MS2g2PE = 4SV = 1
[0323] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNVELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0324] SEQ ID NO :42
[0325] C0M212 C0M212_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 ms2 12022 基因 ms2g2
[0326] tr I C0M212 I C0M212_BPMS2 外殼蛋白質(zhì) OS =腸桿菌噬菌體 MS2GN = MS2g2PE = 4SV =1
[0327] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNPDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0328] SEQ ID NO :43
[0329] C0M1M2 C0M1M2_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 ms2 12022 基因 ms2g2
[0330] >tr I C0M1M2 I C0M1M2_BPMS2 外殼蛋白質(zhì) OS =腸桿菌噬菌體 MS2GN = MS2g2PE = 4SV = 1
[0331] MASNFTQFVLVDNGGTCDVAVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0332] SEQ ID NO :44
[0333] C0M2L4 C0M2L4_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 ms2 12022 基因 ms2g2
[0334] >tr I C0M2L4 I C0M2L4_BPMS2 外殼蛋白質(zhì) OS =腸桿菌噬菌體 MS2GN = MS2g2PE = 4SV = 1
[0335] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVXQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0336] SEQ ID NO :45
[0337] C0M220 C0M220_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 ms2 12022 基因 ms2g2
[0338] >tr I C0M220 I C0M220_BPMS2 外殼蛋白質(zhì) OS =腸桿菌噬菌體 MS2GN = MS2g2PE = 4SV = 1
[0339] MASNFTXFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0340] SEQ ID NO :46
[0341] Q2V0S8 Q2V0S8_BPB01116 腸桿菌噬菌體 bol 12014
[0342] >tr I Q2V0S8 I Q2V0S8_BPB01 外殼蛋白質(zhì) OS =腸桿菌噬菌體 B01 PE = 4SV = 1
[0343] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGPLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0344] SEQ ID NO :47
[0345] C0M216 C0M216_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 ms2 12022 基因 ms2g2
[0346] >tr|C0M216|C0M216_BPMS2 外殼蛋白質(zhì) OS =腸桿菌噬菌體 MS2GN = MS2g2PE = 4SV = 1
[0347] MASNFTQFVLVDNDGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0348] SEQ ID NO :48
[0349] C0M1Y0 C0M1Y0_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 ms2 12022 基因 ms2g2
[0350] >tr I C0M1Y0 I C0M1Y0_BPMS2 外殼蛋白質(zhì) OS =腸桿菌噬菌體 MS2GN = MS2g2PE = 4SV = 1
[0351] MASNFTQFVLVDNGGTGXVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0352] SEQ ID NO :49
[0353] D0U1E4 D0U1E4_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 ms2 12022 基因 ms2g2
[0354] >tr |D0U1E4|D0U1E4_BPMS2 外殼蛋白質(zhì) OS =腸桿菌噬菌體 MS2 PE = 4SV = 1
[0355] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNLELTIPIFATNPDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0356] SEQ ID NO :50
[0357] C0M309 C0M309_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 ms2 12022 基因 ms2g2
[0358] >tr I C0M309 I C0M309_BPMS2 外殼蛋白質(zhì) OS =腸桿菌噬菌體 MS2GN = MS2g2PE = 4SV = 1
[0359] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPISSAIAANSGIY
[0360] SEQ ID NO:51
[0361] C0M325 C0M325_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 ms2 12022 基因 ms2g2
[0362] >tr|C0M325|C0M325_BPMS2 外殼蛋白質(zhì) OS =腸桿菌噬菌體 MS2GN = MS2g2PE = 4SV = 1
[0363] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNVELTIPIFATNSDCEXIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0364] SEQ ID NO :52
[0365] Q9T1C7 Q9T1C7_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 msl2 110679
[0366] >tr|Q9TlC7|Q9TlC7_BPMS2 外殼蛋白質(zhì) OS =腸桿菌噬菌體 M12 PE = 4SV = 1
[0367] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVXPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCALIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0368] SEQ ID NO :53
[0369] C0M2Z1 C0M2Z1_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 ms2 12022 基因 ms2g2
[0370] >tr|C0M2Zl |C0M2Z1_BPMS2 外殼蛋白質(zhì) OS =腸桿菌噬菌體 MS2GN = MS2g2PE = 4SV = 1
[0371] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNVELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIX
[0372] SEQ ID NO :54
[0373] C0M1N8 C0M1N8_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 ms2 12022 基因 ms2g2
[0374] >tr|C0M2Zl |C0M2Z1_BPMS2 外殼蛋白質(zhì) OS =腸桿菌噬菌體 MS2GN = MS2g2PE = 4SV = 1
[0375] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNVELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIX
[0376] SEQ ID NO :55
[0377] J9QBW2 J9QBW2_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 ms2 12022 基因 ms2g2
[0378] >tr I J9QBW2 I J9QBW2_BPMS2 衣殼蛋白質(zhì) OS =腸桿菌噬菌體 MS2 PE = 4SV = 1
[0379] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVQLPVAAWRSYLNMELTIPIFATNDDCALIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0380] SEQ ID NO :56
[0381] C8XPC9 C8XPC9_BPMS2113 腸桿菌噬菌體 ms2 329852
[0382] >tr I C8XPC9 I C8XPC9_BPMS2 外殼蛋白質(zhì) OS =腸桿菌噬菌體 MS2 PE = 4SV = 1
[0383] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVQLPVAAWRSYLNMELTIPIFATNDDCALIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0384] SEQ ID NO :57
[0385] C0M2Y4 C0M2Y4_BPMS2115 腸桿菌噬菌體 ms2 12022 基因 ms2g2
[0386] >tr I C0M2Y4 I C0M2Y4_BPMS2 外殼蛋白質(zhì)（片段）OS =腸桿菌噬菌體 MS2GN = MS2g2PE = 4SV = 1
[0387] NFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQT VGGVELPVAAWRSYLNVELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0388] SEQ ID NO :58
[0389] P69171 外殼 _BPZR115 腸桿菌噬菌體 zr 332942
[0390] >sp|P6917l|外殼_BPZR外殼蛋白質(zhì)OS =腸桿菌噬菌體ZRPE = 1SV = 1
[0391] ASNFTQFVLVNDGGTGNVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVAT QTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0392] SEQ ID NO :59
[0393] P69170 外殼 _BPR17116 腸桿菌噬菌體 rl7 12026
[0394] >sp|P6917〇|外殼_BPR17外殼蛋白質(zhì)OS =腸桿菌噬菌體R17PE = 1 SV = 1
[0395] ASNFTQFVLVNDGGTGNVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVAT QTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0396] SEQ ID NO :60
[0397] P03612 外殼 _BPMS2 腸桿菌噬菌體 ms2 329852
[0398] >sp|P03612|外殼_BPMS2外殼蛋白質(zhì)OS =腸桿菌噬菌體MS2PE = 1SV = 2
[0399] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0400] SEQ ID NO:61
[0401] C0M1L4 C0M1L4_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 ms212022 基因 ms2g2
[0402] >tr | C0M1L4 | C0M1L4_BPMS2 外殼蛋白質(zhì) OS =腸桿菌噬菌體 MS2GN = MS2g2PE = 2SV = 1
[0403] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0404] SEQ ID NO :62
[0405] C8XPD7 C8XPD7_BPMS2116 腸桿菌噬菌體 ms2 329852 基因 cp
[0406] >tr I C8XPD7 I C8XPD7_BPMS2 外殼蛋白質(zhì) OS =腸桿菌噬菌體 MS2 GN = cpPE = 4SV =1
[0407] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0408] SEQ ID NO :63
[0409] Q2V0T1 Q2V0T1_BPZR116 腸桿菌噬菌體 zr 332942
[0410] >tr|Q2V0Tl|Q2V0Tl_BPZR外殼蛋白質(zhì)0S=腸桿菌噬菌體ZRPE = 4SV=l
[0411] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0412] SEQ ID NO :64
[0413] Q9MCD7 Q9MCD7_BPJP5115 腸桿菌噬菌體 jp501 12020
[0414] >tr | Q9MCD7 | Q9MCD7_BPJP5 外殼蛋白質(zhì) OS =腸桿菌噬菌體 JP501 PE = 4SV = 1
[0415] MASNFTEFVLVDNGETGNVTVAPSNFANGVAEWISSDSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVAVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCALIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0416] SEQ ID NO :65
[0417] P03611 外殼 _BPF2115 腸桿菌噬菌體 f2 12016
[0418] >sp|P0361l|外殼_BPF2外殼蛋白質(zhì)OS =腸桿菌噬菌體f2PE = 1 SV = 1
[0419] ASNFTQFVLVNDGGTGNVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVAT QTVGGVELPVAAWRSYLNLELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0420] SEQ ID NO :66
[0421] P34700 外殼 _BPJP3115 腸桿菌噬菌體 jp34 12019
[0422] >sp |P34700 I外殼_BPJP3外殼蛋白質(zhì)OS =腸桿菌噬菌體JP34PE = 3 SV = 2
[0423] MATLRSFVLVDNGGTCDVTVVPVSNANGVAEWLSNNSRSQAYRVTASYRASGADKRKYTIKLEVPKIVT QVVNGVELPVSAWKAYASIDLTIPIFAATDDVTVISKSLAGLFKVGNPIADAISSQSGFYA
[0424] SEQ ID NO :67
[0425] Q2V0U0 Q2V0U0_BPBZ1115 腸桿菌噬菌體 jp500332939
[0426] >tr I Q2V0U0 I Q2V0U0_BPBZ1 外殼蛋白質(zhì) OS =腸桿菌噬菌體 JP500 PE = 4SV = 1
[0427] MATLRSFVLVDNGGTCDVTWPVSNANGVAEWLSNNSRSQAYRVTASYRASGADKRKYTIKLEVPKIVT QVVNGVELPVSAWKAYASIDLTIPIFAATDDVTVISKSLAGLFKVGNPIADAISSQSGFYA
[0428] SEQ ID NO :68
[0429] Q2V0T7 Q2V0T7_BPBZ1115 腸桿菌噬菌體 sd 332940
[0430] >tr I Q2V0T7 I Q2V0T7_BPBZ1 外殼蛋白質(zhì) OS =腸桿菌噬菌體 SD PE = 4SV = 1
[0431] MATLRSFVLVDNGGTGNVTVVPVSNANGVAEWLSNNSRSQAYRVTASYRASGADKRKYTIKLEVPKIVT QVVNGVELPISAWKAYASIDLTIPIFAATDDVTTISKSLAGLFKVGNPIADAISSQSGFYA
[0432] SEQ ID NO :69
[0433] Q9MBL2 Q9MBL2_BPKU1115 腸桿菌噬菌體 kul 12021
[0434] >tr I Q9MBL2 I Q9MBL2_BPKU1 外殼蛋白質(zhì) OS =腸桿菌噬菌體 KU1 PE = 4SV = 1
[0435] MATLRSFVLVDNGGTGNVTVVPVSNANGVAEWLSNNSRSQAYRVTASYRASGADKRKYTIKLEVPKIVT QSVNGVELPVSAWKAFASIDLTIPIFAATDDVTLISKSLAGLFKIGNPVADAISSQSGFYA
[0436] SEQ ID NO :70
[0437] P07234 外殼 _BPGA115 腸桿菌噬菌體 ga 12018
[0438] >sp|P07234|外殼_BPGA外殼蛋白質(zhì)OS =腸桿菌噬菌體GAPE = 1SV = 3
[0439] MATLRSFVLVDNGGTGNVTVVPVSNANGVAEWLSNNSRSQAYRVTASYRASGADKRKYAIKLEVPKIVT QVVNGVELPGSAWKAYASIDLTIPIFAATDDVTVISKSLAGLFKVGNPIAEAISSQSGFYA
[0440] SEQ ID NO:71
[0441] C8YJG7 C8YJG7_BPBZ1115 腸桿菌噬菌體 bz 13 329853
[0442] >tr I C8YJG7 I C8YJG7_BPBZ1 衣殼蛋白質(zhì) OS =腸桿菌噬菌體 BZ13 PE = 4SV = 1
[0443] MATLRSFVLVDNGGTGNVTVVPVSNANGVAEWLSNNSRSQAYRVTASYRASGADKRKYTIKLEVPKIVT QVVNGVELPVSAWKAYASIDLTIPIFAATDDVTVISKSLAGLFKVGNPIAEAISSQSGFYA
[0444] SEQ ID NO :72
[0445] C8YJH1 C8YJH1_BPBZ1115 腸桿菌噬菌體 bz 13 329853
[0446] >tr I C8YJH11 C8YJH1_BPBZ1 衣殼蛋白質(zhì) OS =腸桿菌噬菌體 BZ 13 PE = 4SV = 1
[0447] MATLRSFVLVDNGGTGNVTVVPVSNANGVAEWLSNNSRSQAYRVTASYRASGADKRKYTIKLEVPKIVT QTVNGVELPVSAWKAYASIDLTIPIFAATDDVTLISKSLAGLFKIGNPVADAISSQSGFYA
[0448] SEQ ID NO :73
[0449] C8YJH5 C8YJH5_BPBZ1115 腸桿菌噬菌體 bz 13 329853
[0450] >tr I C8YJH5 I C8YJH5_BPBZ1 衣殼蛋白質(zhì) OS =腸桿菌噬菌體 BZ13 PE = 4SV = 1
[0451] MATLRSFVLVDNGGTGNVTVVPVSNANGVAEWLSNNSRSQAYRVTASYRASGADKRKYTIKLEVPKIVT QVVNGVELPVSAWKAYASIDLTIPIFAATDDVTVISKSLAGLFKVGDPIADAISSQSGFYA
[0452] SEQ ID NO :74
[0453] Q2V0T4 Q2V0T4_BPTH1115 腸桿菌噬菌體 thl 12029
[0454] >tr I Q2V0T4 I Q2V0T4_BPTH1 外殼蛋白質(zhì) OS =腸桿菌噬菌體 TH1 PE = 4SV = 1
[0455] MATLRSFVLVDNGGTGNVTVVPVSNANGVAEWLSNNSRSQAYRVTASYRASGADKRKYTIKLEVPKIVT QVVNGVELPVSAWKAYASIDLTIPIFAATDDVTVISKSLAGLFKVGNPIADAISSQSGFYA
[0456] SEQ ID NO :75
[0457] Q2V0U3 Q2V0U3_BPBZ1116 腸桿菌噬菌體 tl2 332938
[0458] >tr I Q2V0U3 I Q2V0U3_BPBZ1 外殼蛋白質(zhì) OS =腸桿菌噬菌體 TL2 PE = 4SV = 1
[0459] MATLRSFVLVDNGGTGNVTVVPVSNANGVAEWLSNNSRSQAYRVTASYRASGADKRKYTIKLEVPKIVT QVVNGVELPVSAWKAYASIDLTIPIFAATDDVTVISKSLAGLFKVGNPIADAISSQSGFYA
[0460] SEQ ID NO :76
[0461] P03614 外殼 _BPFR116 腸桿菌噬菌體 fr 12017
[0462] >sp|P03614|外殼_BPFR外殼蛋白質(zhì)OS =腸桿菌噬菌體frPE = 1 SV = 4
[0463] MASNFEEFVLVDNGGTCDVKVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSANNRKYTVKVEVPKVA TQVQGGVELPVAAWRSYMNMELTIPVFATNDDCALIVKALQGTFKTGNPIATAIAANSGIY
[0464] SEQ ID NO :77
[0465] ef 108465 腸桿菌噬菌體 rl7 329852
[0466] gi 1132424616|gb|AB033465. 11 外殼蛋白質(zhì)[腸桿菌噬菌體 MS2]
[0467] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0468] SEQ ID N0:781QBE
[0469] >sp|P03615|外殼_BPQBE外殼蛋白質(zhì)OS =腸桿菌噬菌體QP PE = 1SV = 2
[0470] AKLETVTLGNIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQ NPTACTANGSCDPSVTRQAYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
[0471] 此外，氨基酸殘基通過其側(cè)鏈的特性區(qū)分。它們共享共同主鏈和允許的主鏈構(gòu)象 的共同集合（Kleywegt & Jones, Structure 4 1395-1400 (1996))，除了兩個例外。甘氨酸 可穩(wěn)定折疊成對其他氨基酸不允許的主鏈構(gòu)象，因為它的側(cè)鏈由單個氫原子組成。脯氨酸 側(cè)鏈環(huán)化成剛性環(huán)，其通過消除其酰胺氫而共價結(jié)合至其主鏈氮，從而使脯氨酸約束于就 其他氨基酸而言的主鏈構(gòu)象小子集，并且消除其成為氫鍵供體的能力。
[0472] 用于裝配成衣殼的結(jié)構(gòu)域折疊和結(jié)構(gòu)域結(jié)合（例如SEQ ID N0:3的氨基酸序列 通過下述得到穩(wěn)定：限定其二級結(jié)構(gòu)單位的主鏈氫鍵合模式，側(cè)鏈和一起穩(wěn)定局部結(jié)構(gòu)或 結(jié)合附近二級結(jié)構(gòu)單位（例如螺旋、折疊股、卷曲、環(huán)、轉(zhuǎn)角和柔性末端）的主鏈原子之間 的氫鍵，一起穩(wěn)定局部結(jié)構(gòu)或結(jié)合附近二級結(jié)構(gòu)單位（例如螺旋、折疊股、卷曲、環(huán)、轉(zhuǎn)角和 柔性末端）的不同側(cè)鏈的原子之間的氫鍵，和疏水側(cè)鏈原子的緊密包裝，所述原子作用于 通過范德華相互作用在能量上穩(wěn)定折疊且防止溶劑滲透到折疊內(nèi)，所述溶劑滲透可能導 致失穩(wěn)和局部解折疊。剩余殘基的側(cè)鏈不參與結(jié)構(gòu)域折疊維持或結(jié)構(gòu)域-結(jié)構(gòu)域相互作 用。只要它們的主鏈構(gòu)象不具有僅由Gly或順式Pro滿足的專門需求，以便參與結(jié)構(gòu)域折 疊，這些殘基就可單獨或作為組突變，而基本上不影響最終結(jié)構(gòu)域折疊或其表面的總體拓 撲學，并且可通過下述明確地鑒定為類別：對已知結(jié)構(gòu)執(zhí)行表面可接近性計算（參見例如 Fraczkiewicz&Braun，JMB;MethEnzym;JCompCheml9,319(1998))，隨后為已知結(jié)構(gòu) 的氫鍵分析，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能研究中的所有常規(guī)技術(shù)。
[0473] 使用來自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的兩種MS2衣殼結(jié)構(gòu)用于檢查，由C末端與N末端融 合（以形成單鏈蛋白質(zhì)2結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)）的2個MS2衣殼蛋白質(zhì)單體形成的含有穩(wěn)定 八面體衣殼的RNA和2VTU的二十面體衣殼的1AQ3,鑒定17個殘基（Alai、Ser2、Thr5、 Gln6、Ala21、Ala53、Val67、Thr69、Thr71、Val72、Val75、Ser99、Glul02、Lysll3、Aspll4、 617115、171"129)，其具有高度溶劑化的側(cè)鏈位置（?四〇21^6￥；[02&13四1111服務器111^口:/7 curie, utmb. edu/getarea，使用L 4A溶劑探針，無梯度，2個區(qū)域/能量/殘基）；不參 與和衣殼的其他部分的氫鍵（在廣泛使用的免費軟件可視化軟件包Chimera(ERICF. PETTERSEN, THOMAS D.GODDARD, CONRAD C.HUANG, GREGORY S.COUCH,DANIELM. GREENBLATT, ELAINE C.MENG, THOMAS E.FERRIN(2004 J Comp Chem 25,1605-1612)中計算 的氫鍵，伴隨松弛0. 5A和30度的氫鍵標準）；并且所述主鏈構(gòu)象由除脯氨酸之外的所有氨 基酸殘基允許。當這17個殘基的子集與腸桿菌噬菌體MS2的結(jié)構(gòu)比對相比較時，其中忽視 GA和FR衣殼序列以及在腸桿菌噬菌體GA或FR衣殼序列中已突變的殘基，留下推定對突變 敏感的6個位置，而不影響單體的結(jié)構(gòu)或功能或者其裝配成穩(wěn)定衣殼的能力。這代表與野 生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼蛋白質(zhì)（SEQ ID N0:3)的52%序列同一性。
[0474] 在二級結(jié)構(gòu)元件（螺旋、折疊股、具有限定氫鍵合模式的轉(zhuǎn)角和結(jié)構(gòu)化環(huán)例如Ω 環(huán)）內(nèi)的殘基插入和/或缺失促使這些元件喪失其限定氫鍵合或疏水包裝模式，或迫使其 氫鍵合或疏水包裝模式中的改變，這可改變來自原始蛋白質(zhì)序列的穩(wěn)定性、形狀和/或功 能。這可破壞包裝且影響折疊的總體穩(wěn)定性。另一方面，具有表面暴露但對蛋白質(zhì)折疊的 剩余部分不提供關(guān)鍵穩(wěn)定（通常經(jīng)由側(cè)鏈針對結(jié)構(gòu)化元件的包裝，或者鄰近結(jié)構(gòu)化元件的 相互作用面與溶劑或在衣殼的情況下與貨物的屏蔽）的非結(jié)構(gòu)化環(huán)、無規(guī)卷曲以及N和C 末端是下述的極佳候選物：（1)如果不需要連接的結(jié)構(gòu)化元件的顯著再定位，則殘基缺失， (2)如果殘基的添加不顯著改變折疊中的結(jié)構(gòu)化元件的相對處置，或在蛋白質(zhì)的環(huán)境中由 滿足其與氫鍵供體或受體的氫鍵合能力篩選表面暴露的殘基，則氨基酸殘基的插入，或（3) 天然存在的一種或多種氨基酸突變或?qū)Ψ翘烊粴埢ㄆ淇晒矁r連接至有用部分，例如熒光 團、發(fā)磷光基團、聚乙二醇、親和標簽、報道基團等）的一種或多種突變的摻入。當然，此類 插入、缺失和突變可同時或以任何組合在單個合適元件內(nèi)發(fā)生，并且其摻入可引起具有改 善特征的蛋白質(zhì)。區(qū)分插入和/或缺失的最佳點的簡單方法是就插入和/或缺失掃描緊密 相關(guān)序列的多重比對。除N末端和C末端添加和缺失外，已知光滑病毒科外殼蛋白質(zhì)序列 不具有就彼此而言的插入或缺失。這不意指不發(fā)生插入和/或缺失。只是必須檢查折疊家 族的更遙遠成員的結(jié)構(gòu)/功能。
[0475] 最簡單的多重比對算法通常在公眾域序列和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫處對普通民眾可獲得。 如果序列空間通過從高％同一性例如90 %到低％同一性例如20 %的連續(xù)序列譜填充，則 這些算法可正確比對共享極低％同一性的序列。當這些簇共享低％同一性時，這些算法 趨于未能正確比對具有相同折疊的序列簇；然而，如果每個簇的一個或多個成員的X射 線晶體結(jié)構(gòu)已得到解決且充分精制，則此類簇可成功且明確比對。通過最佳疊加蛋白質(zhì) 結(jié)構(gòu)的二級結(jié)構(gòu)元件的主鏈原子，所述蛋白質(zhì)通過折疊緊密相關(guān)但通過序列遙遠相關(guān)，明 確限定在其序列之間的一對一對應關(guān)系，并且通過簡單序列比對方案成功生成的高％同 一性簇可錨定至起因于主鏈疊加的配對比對，和生成的折疊家族的正確總體序列比對， 從而導致折疊家族成員的拓撲學有意義的比對（Arthur M Lesk, Michael Levitt, Cyrus Chothia(1986), ProtEngl, 77-78)。通過檢查總體序列比對，可查看其中折疊可耐受插入和 /或缺失而不損害其形式或功能的全面畫面。
[0476] alloleviviridae外殼蛋白質(zhì)屬于與光滑病毒科外殼蛋白質(zhì)相同的折疊家族（折 疊家族d. 85. 1)，并且也裝配成由180個單體組成的二十面體衣殼。圖27中的比對表中顯 示了 UniProt中保藏的alloleviviridae外殼蛋白質(zhì)序列的多重比對。百分之六十（60% ) 的alloleviviridae外殼蛋白質(zhì)序列是保守的。光滑病毒科和alloleviviridae的外殼蛋 白質(zhì)均長約130個氨基酸，但因為相同殘基百分比很低，約20%，所以多重序列比對算法通 常未能正確針對光滑病毒科序列比對alloleviviridae。實現(xiàn)這點的簡單方法是使序列逆 轉(zhuǎn)，并且隨后使用相同方案比對逆轉(zhuǎn)序列。序列和逆轉(zhuǎn)序列的多重比對將不一致。這個困難 可通過檢查代表結(jié)構(gòu)得到避免。allolevividae (PDB-ID:1QBE)(SEQ ID N0:78,參見下 文）衣殼的x射線晶體結(jié)構(gòu)已保藏于公眾域數(shù)據(jù)庫RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http://www. rcsb. org)中。使用在RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫處的jFATCAT比較工具，通過使{Ca }原子之間的均方 根偏差降到最低，使獨立精制的1QBE單體擬合至獨立精制的1AQ3單體。均方根偏差在范圍 2. 33-2. 76埃中，這取決于比較哪個獨立精制的單體，主要是由于連接二級結(jié)構(gòu)元件的N末 端殘基1-3以及區(qū)段8-18、26-28、50-55和67-76 (編號參考MS2結(jié)構(gòu)1AQ3中的拓撲學等價 的殘基）的主鏈處置中的差異，如圖22-25中所示和【專利附圖】

【附圖說明】中所述。由于相同區(qū)域中的 構(gòu)象差異，對于1AQ3中的獨立精制的單體，通過jFATCAT測量的主鏈均方根偏差為1. 72A。 拓撲學比對顯示于表中，對于1AQ3指示通過氫鍵合模式的二級結(jié)構(gòu)指定（DSSP，W Wolfgang Kabsch & Christian Sander (1983)，Biopolymers22, 2577-2636)，并且或因為精制的主鏈 構(gòu)象是基本上不同的，或因為區(qū)段太易移動而在精制過程中不能局限于電子密度而顯示極 大偏差的區(qū)段以小寫字母提供。在晶體環(huán)境中顯示主鏈柔性的區(qū)域也是插入和/或缺失的 極佳候選物，如同這些殘基和折疊的剩余部分之間的相互作用對于折疊穩(wěn)定是重要的，其 電子密度將局限化。對2VTU追加相同信息提供最適于適應改變的區(qū)段的進一步了解。這 些比較在圖26中象征性捕獲，所述圖26顯示1AQ3相對于2VTU相對于1QBE的比對。
[0477] 1AQ3和1QBE單體的檢查提供下述了解，如通過參考圖28-31及其各自描述進一步 舉例說明的。所有殘基編號就1AQ3中的單體而言給出。
[0478] 這還意指相對于1QBE腸桿菌噬菌體外殼蛋白質(zhì)Qi3的序列，SEQ ID#3腸 桿菌噬菌體MS2外殼蛋白質(zhì)的折疊保存下至21 %同一性，并且對于此處提及的所有 alloleviviridae外殼蛋白質(zhì)序列，就保守殘基而言為16%同一'I"生。較早計算的高度溶劑 化的側(cè)鏈位置中的僅一個，側(cè)鏈不參與和衣殼的其他部分的氫鍵并且其主鏈構(gòu)象由除脯氨 酸之外的所有氨基酸殘基允許，保持保守，Y129(在SEQ N0 3編號中）。它的主鏈位置和側(cè) 鏈包裝在由融合的MS2二聚體（2VTU)形成的八面體腸桿菌噬菌體MS2衣殼結(jié)構(gòu)中基本上 改變?？紤]該最后改變使閾值氨基酸序列同一性百分比達到15%。參見圖26和圖27中的 比對表（1AQ3相對于2VTU相對于1QBE，以及用于說明的allolevi多重序列比對表）。該 段落中的所有相似性百分比均僅在結(jié)構(gòu)錨定比對的情況下是有效的。
[0479] N末端殘基1-3可滿足其與C末端殘基129和水的氫鍵合潛力，并且反之亦然；因 此，應能夠缺失這些殘基中的一些或全部，并且由截短的蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定VLP。圖32顯示 在裝配的衣殼中圍繞對稱點包裝的3個非共價腸桿菌噬菌體MS2非共價二聚體的主鏈色 帶圖解。所有N末端顏色均為綠色，C末端顏色均為紅色。末端的接近意指單體的序列可 融合成單鏈，以形成共價二聚體，如通過在另一個后追加一個單體對于2VTU完成的，即產(chǎn) 生由（單體殘基1-129-單體殘基1-129)組成的單條蛋白質(zhì)鏈，或通過在單體序列之間添 加另外的連接殘基（單體1-129 -接頭殘基-單體1-129)，只要相對鏈方向（從N末端到 C末端）允許由串聯(lián)單體形成連續(xù)肽鏈。無需添加接頭殘基的單體-單體串聯(lián)得到解決 (PDB-ID:2VTU)。在2VTU中，每個非共價二聚體已改造成單個蛋白質(zhì)；然而，因為殘基2和 129的Ca相隔約6埃，所以勉強足夠緊密以與連接區(qū)段連接，而不擾亂折疊（Ca-Ca距離 約束于約3. 8埃，由于肽單位的共振形式），并且在一些單體中，它們的主鏈彼此氫鍵合。每 個二聚體（共價或非共價）的β片層側(cè)形成衣殼的內(nèi)壁。β片層的幾何學可由片層的曲 率限定（Cyrus Chothia，Jiri Novotny, Robert Bruccoleri, Martin Karplus (1985) J Mol Biol 186,651-663)。2VTU中的緊密偶聯(lián)使β片層約束至較低曲率，從而引起八面體而不 是二十面體衣殼。在單體間摻入0-6個殘基的接頭將提供允許共價二聚體松弛成二十面體 衣殼相同所需的足夠柔性，其中物理性質(zhì)可能與二十面體非共價衣殼結(jié)構(gòu)更緊密相關(guān)。一 般地，接頭將是1-6個殘基。然而，例如，2VTU的共價二聚體實際上具有在第二拷貝中缺失 的Ser2。在此類情況下，接頭長度可以是0。
[0480] 選擇用于接頭的殘基應具有小側(cè)鏈，以避免可由大量原子包裝成相對小體積引起 的立體張力。張力還可通過避免選擇具有更小主鏈構(gòu)象空間的氨基酸殘基例如Pro而降到 最低。避免張力可轉(zhuǎn)變成更快速或更有效折疊的蛋白質(zhì)。特別是在更長環(huán)的中間區(qū)段中的 更龐大的和荷電的側(cè)鏈趨于成為蛋白酶的結(jié)合靶標。含Gly接頭是優(yōu)選的。
[0481] 根據(jù)圖32還明確的是一個單體的C末端可連接至參與附近非共價二聚體的單體 的N末端，并且仍可形成穩(wěn)定的二十面體衣殼，只要接頭具有適當長度和柔性，并且在衣殼 環(huán)境中不含可由蛋白酶接近的潛在切割位點。事實上，三個單體可由適當接頭連接并仍形 成該衣殼區(qū)段。因為圖32的黃褐色、灰色和中藍色單體也是衣殼的不對稱單位。具有適當 連接區(qū)段的末端至末端串聯(lián)的三個單體也應能夠形成穩(wěn)定的二十面體衣殼。
[0482] N末端殘基1-3可滿足其與C末端殘基129和水的氫鍵合潛力，并且反之亦然；因 此，應能夠缺失這些殘基中的一些或全部，并且由截短的蛋白質(zhì)或可替代地由通過串聯(lián)蛋 白質(zhì)中的缺失數(shù)目延長的相應潛在接頭長度，形成穩(wěn)定VLP。
[0483] 相應地，本公開內(nèi)容包括包含衣殼的VLP，所述衣殼包含這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其是 野生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID N0:3)的變體，并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催 化的水解是抗性的。例如，VLP可包含這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其具有野生型腸桿菌噬菌體MS2 衣殼（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，除了在第1位處的A殘基被缺失之外。VLP可包含這樣 的衣殼蛋白質(zhì)，其具有野生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，除了在 第1位處的A殘基被缺失和在第2位處的S殘基被缺失之外。VLP可包含這樣的衣殼蛋白 質(zhì)，其具有野生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，除了在第1位處的 A殘基被缺失、在第2位處的S殘基被缺失和在第3位處的N殘基被缺失之外。VLP可包含 這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其具有野生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，除 了在第129位處的Y殘基被缺失之外。VLP可包含這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其具有野生型腸桿 菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，但具有在112-117區(qū)段中的單個（1個） 氨基酸缺失。VLP可包含這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其具有野生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，但具有在112-117區(qū)段中的單個（1個）氨基酸缺失。VLP可包含這 樣的衣殼蛋白質(zhì)，其具有野生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，但具 有在65-83區(qū)段中的1-2個殘基插入，并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性 的。VLP可包含這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其具有野生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID N0:3)的 氨基酸序列，但具有在44-55區(qū)段中的1-2個殘基插入。VLP可包含這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其 具有野生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，但具有在33-43區(qū)段中 的單個（1個）殘基插入，并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。VLP可 包含這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其具有野生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID N0:3)的氨基酸序 列，但具有在24-30區(qū)段中的1-2個殘基插入。VLP可包含這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其具有野生 型腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID NO:3)的氨基酸序列，但具有在10-18區(qū)段中的單個（1 個）殘基插入。VLP可包含與第二衣殼單體序列串聯(lián)的衣殼蛋白質(zhì)單體序列，所述衣殼蛋白 質(zhì)單體序列裝配成對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的衣殼。VLP可包含其C 末端由0-6殘基接頭區(qū)段延伸的衣殼蛋白質(zhì)單體序列，所述接頭區(qū)段的C末端與第二衣殼 單體序列串聯(lián)，所有這些裝配成對由肽鍵水解酶類別EC 3.4催化的水解是抗性的衣殼。合 適的接頭序列包括但不限于-(Gly) X-，其中X是0-6,或Gly-Ser接頭例如但不限于-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-、-Gly-Gly-Ser 和-Gly-Ser-Gly-。VLP 還可包含與第三衣殼單體序列 串聯(lián)的衣殼蛋白質(zhì)單體序列，所述衣殼蛋白質(zhì)單體序列裝配成對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4 催化的水解是抗性的衣殼。再次，在衣殼蛋白質(zhì)中，C末端可由0-6殘基接頭區(qū)段延伸，所述 接頭區(qū)段的C末端與第三衣殼單體序列串聯(lián)，所有這些裝配成對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4 催化的水解是抗性的衣殼。一種或兩種接頭序列可選自-(Gly)x-，其中X = 0-6,或是選自 -Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-、-Gly-Gly-Ser 和-Gly-Ser-Gly-的 Gly-Ser 接頭。例如，在一 種或兩種接頭序列中，接頭是-(Gly) X-，并且X是1、2或3。VLP可包含其N末端截短1_3 個殘基的一種或多種外殼蛋白質(zhì)序列，其中接頭序列延長缺失的殘基數(shù)目，其中接頭序列 是-(Gly)x-，其中X = 0-6。例如，VLP可包含其C末端截短1個殘基的一種或多種外殼蛋 白質(zhì)序列，并且隨后接頭序列延長1個殘基，其中接頭序列是-(Gly)x-，其中X = 0-6。VLP 可包含兩種外殼蛋白質(zhì)序列，其中在串聯(lián)二聚體中的第一外殼蛋白質(zhì)序列C末端截短1個 殘基，并且接頭序列延長1個殘基，或其中在串聯(lián)三聚體中的第一和/或第二外殼蛋白質(zhì)序 列C末端截短1個殘基，其中接頭序列是-(Gly)x-，其中X = 0-6。
[0484] 本文引用的所有專利和出版物包括下文列出的那些均以引用的方式整體并入本 文。
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[0002] acgaaggttc accttcaaga gtttcttcct atgagagccg tacgtcaggt cggtactaac 840 atcaagttag atggccgtct gtcgtatcca gctgcaaact tccagacaac gtgcaacata 900 tcgcgacgta tcgtgatatg gttttacata aacgatgcac gtttggcatg gttgtcgtct 960 ctaggtatct tgaacccact aggtatagtg tgggaaaagg tgcctttctc attcgttgtc 1020 gactggctcc tacctgtagg taacatgctc gagggcctta cggcccccgt gggatgctcc 1080 tacatgtcag gaacagttac tgacgtaata acgggtgagt ccatcataag cgttgacgct 1140 ccctacgggt ggactgtgga gagacagggc actgctaagg cccaaatctc agccatgcat 1200 cgaggggtac aatccgtatg gccaacaact ggcgcgtacg taaagtctcc tttctcgatg 1260 gtccatacct tagatgcgtt agcattaatc aggcaacggc tctctagata gagccctcaa 1320 ccggagtttg aagcatggct tctaacttta ctcagttcgt tctcgtcgac aatggcggaa 1380 ctggcgacgt gactgtcgcc ccaagcaact tcgctaacgg ggtcgctgaa tggatcagct 1440 ctaactcgcg ttcacaggct tacaaagtaa cctgtagcgt tcgtcagagc tctgcgcaga 1500 atcgcaaata caccatcaaa gtcgaggtgc ctaaagtggc aacccagact gttggtggtg 1560 tagagcttcc tgtagccgca tggcgttcgt acttaaatat ggaactaacc attccaattt 1620 tcgctacgaa ttccgactgc gagcttattg ttaaggcaat gcaaggtctc ctaaaagatg 1680 gaaacccgat tccctcagca atcgcagcaa actccggcat ctactaatag acgccggcca 1740 ttcaaacatg aggattaccc atgtcgaaga caacaaagaa gttcaactct ttatgtattg 1800 atcttcctcg cgatctttct ctcgaaattt accaatcaat tgcttctgtc gctactggaa 1860 gcggtgatcc gcacagtgac gactttacag caattgctta cttaagggac gaattgctca 1920 caaagcatcc gaccttaggt tctggtaatg acgaggcgac ccgtcgtacc ttagctatcg 1980 ctaagctacg ggaggcgaat ggtgatcgcg gtcagataaa tagagaaggt ttcttacatg 2040 acaaatcctt gtcatgggat ccggatgttt tacaaaccag catccgtagc cttattggca 2100 acctcctctc tggctaccga tcgtcgttgt ttgggcaatg cacgttctcc aacggtgctc 2160 ctatggggca eaagttgcag gatgcagcgc cttacaagaa gttcgctgaa caagcaaccg 2220 ttaccccccg cgctctgaga gcggctctat tggtccgaga ccaatgtgcg ccgtggatca 2280 gacacgcggt ccgctataac gagtcatatg aatttaggct cgttgtaggg aacggagtgt 2340 ttacagttcc gaagaataat aaaatagatc gggctgcctg taaggagcct gatatgaata 2400 tgtacctcca gaaaggggtc ggtgctttca tcagacgccg gctcaaatcc gttggtatag 2460
[0003] acctgaatga tcaatcgatc aaccagcgtc tggctcagca gggcagcgta gatggttcgc 2520 ttgcgacgat agacttatcg txtgcatccg attccatctc cgatcgcctg gtgtggagtt 2580 ttctcccacc agagctatat tcatatctcg atcgtatccg ctcacactac ggaatcgtag 2640 atggcgagac gatacgatgg gaactatttt ccacaatggg aaatgggttc acatttgagc 2700 tagagtccat gatattctgg gcaatagtca aagcgaccca. aatccatttt ggtaacgccg 2760 gaaccatagg catctacggg gacgatatta tatgtcccag tgagattgca ccccgtgtgc 2820 tagaggcact tgcctactac ggttttaaac cgaatcttcg taaaacgttc gtgtccgggc 2880 tctttcgcga gagctgcggc gcgcactttt accgtggtgt cgatgtcaaa ccgttttaca 2940 tcaagaaacc tgttgacaat ctcttcgccc tgatgctgat attaaatcgg ctacggggtt 3000 ggggagttgt cggaggtatg tcagatccac gcctctataa ggtgtgggta cggctctcct 3060 cccaggtgcc ttcgatgttc ttcggtggga cggacctcgc tgccgactac tacgtagtca 3120 gcccgcctac ggcagtctcg gtatacacca agactccgta cgggcggctg ctcgcggata 3180 cccgtacctc gggtttccgt cttgctcgta tcgctcgaga acgcaagttc ttcagcgaaa 3240 agcacgacag tggtcgctac atagcgtggt tccatactgg aggtgaaatc accgacagca 3300 tgaagtccgc cggcgtgcgc gttatacgca cttcggagtg gctaacgccg gttcccacat 3360 tccctcagga. gtgtgggcca. gcgagctxtc ctcggtagct gaccgaggga cccccgtaaa. 3420 cggggtgggt gtgctcgaaa gagcacgggt gcgaaagcgg tccggctcca ccgaaaggtg 3480 gKCKggcttc ggcccaggga cctcccccta aagagaggac ccgggattct cccgatttgg 3540 taactagctg cttggctagt taccaccca 3569 <210〉 2 <211> 396 <212〉 DNA <213〉腸桿菌噬菌休MS2 <400〉 2 atggcttcta actttactca gttcgttctc gtcgacaatg gcggaactgg cgacgtgact 60 gtcgccccaa gcaacttcgc taacggggtc gctgaatgga tcagctctaa ctcgcgttca 120 caggcttaca aagtaacctg tagcgttcgt cagagctctg cgcagaatcg caaatacacc 180 atcaaagtcg aggtgcctaa agtggcaacc cagactgttg gtggtgtaga gcttcctgta 240 gccgcatggc gttcgtactt aaatatggaa ctaaccattc caattttcgc tacgaattcc 300 gactgcgagc ttattgttaa ggcaatgcaa ggtctcctaa aagatggaaa cccgattccc 360
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[0007] <210> 11 <2Π > 165 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223〉合成的 <400> 11 taatacgact cactatagca agctgaccct gaagttcatc aagagtgaac ttcagggtca 60 gcttgtcggc cggcatggtc ccagcctcct cgctggcgcc ggctggtcaa cattcgtggc 120 gaatgggacc atatatatat acatgaggat tacccatgtc catgg 165 <210〉 12 <211〉 165 <212> DNA <213〉人工序列 <220> 〈223>合成的 <400> 12 taatacgact cactatagca agctgaccct gaagttcatc aaga.gtgaac ttcagggtca 60 gcttgtcggc cggcatggtc ccggcctcct cgctggcgcc ggctgggcaa cattcgtggc 120 gaatgggacc atatatatat acatgaggat tacccatgtc catgg 165 <210> 13 <211> 165 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成的 <400〉 13 taatacgact cactatagca agctgaccct gaagttcatc aagagtgaac ttcagggtca 60 gcttgtcggc cggcatggtc ccagcctcct cgctggcgcc ggctgtgcaa cattcgtggc 120 gaatgggacc atatatatat acatgaggat tacccatgtc catgg 165 <210〉 14 <211〉 165 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉合成的
[0008] <400> 14 taatacgact cactatagca agctgaccct, gaagttcatc aagagt.gaac ttcagggtca 60 gcttgtcggc cggcatggtc ccagcctcct cgctggcgcc ggctgggcaa cattcgtggc 120 gagtgggacc atatatatat acatgdggat tacccatgtc catgg 165 <210> 15 <211〉 165 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成的 <400〉 15 taatacgact cactatagca agctgaccct. gaagttcatc aagagtgaac ttcagggtca 60 gcttgtcggc cggcatggtc ccagccttct cgctggcgcc ggctgggcaa cattcgtggc 120 gaatgggacc atatatatat acatgaggat tacccatgtc catgg 165 <210〉 16 <211> 165 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成的 <400> 16 taatacgact cactatagca agctgaccct gaagttcatc aagagtgaac ttcagggtca 60 gcttgtcggc cggcatggtc ccagcctcct cactggcgcc ggctgggcaa cattcgtggc 120 gaatgggacc ata,tatatat acatgaggat tacccatgtc catgg 165 <210〉 17 <211〉 165 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成的 <400> 17 taatacgact cactatagca agctgaccct gaagttcatc aagagtgaac ttcagggtca 60 gcttgtcggc cggcatggtc ccagcctcct cgctggcgcc ggctgggcaa cattcgtggc 120 gattgggacc atatatatat acatgaggat tacccatgtc catgg 165 <210> 18
[0009] <211> 165 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成的 <400> 18 taatacgact cactatagca agctgaccct gaagttcatc aagagtgaac ttcagggtca 60 gcttgtcggc cggcatggtc ccagcctcct cgctggcgcc ggctgggcaa cattcgtgcc 120 gaatgggacc atatatatat acatgaggat tacccatgtc catgg 165 <210〉 19 <211> 365 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成的 <400 19 ggatcctaat acgactcact atagggagac gttcacgttg aatgaacttc agggtcagct 60 tgctgatgag gcgcttcggc gccgaaacac ccagtggtgt ccaagctgac cctgaagttc 120 attcaagaga tgaacttcag ggtcagcttg tcaccggatg tgctctccgg tctgatgagt 180 ccgtgaggac gaaacaagct gaccctgaag ttcatccgtg aacgacgctt caaacatgag 240 gattacccat gtcgaagcga atatatatat ataggccggc atggtcccag cctcctcgct 300 ggcgccggct gggcaacacc ttcgggtggc gaatgggacc aaaaaaatat atatatatac 360 catgg 365 <210〉 20 <211> 154 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成的 <400〉 20 taatacgact cactatagca agctgaccct gaagttcatc aagagtgaac ttcagggtca 60 gcttgtcacc ggatgtgctc tccggtctga tgagtccgtg aggacgaaac aagctgacca 120 tatatatata catgaggatt acccatgtcc atgg 154 <210〉 21 <211〉 159
[0010] <212> DNA 〈213>人工序列 <220> <223〉合成的 <400> 21 taatacgact cactatagca agctgaccct gaagttcatc aagagtgaac ttcagggtca 60 gc.ttgtcacc ggatgtgctc tccggtctga tgagtccgtg aggacgaaac aagctgaccc 120 tgaaatatat atatacatga ggattaccca tgtccatgg 159 <210〉 22 <211〉 164 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成的 <400 22 taatacgact cactatagca agctgaccct gaagttcatc aagagtgaac ttcagggtca 60 gcttgtcacc ggatgtgctc tccggtctga tgagtccgtg aggacgaaac aagctgaccc 120 tgaagttcaa tatatatata catgaggatt acccatgtcc atgg 164 <210〉 23 <211〉 166 <212> DNA <213〉人丄序列 <220〉 <223〉合成的 <400> 23 taatacgact cactatagca agctgaccct gaagttcatc aagagtgaac ttcagggtca 60 gcttgtcacc ggatgtgctc tccggtctga tgagtccgtg aggacgaaac aagctgaccc 120 tgaagttcac tatatatata tacatgagga ttacccatgt ccatgg 166 <210> 24 <211〉 169 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 〈223>合成的 <400〉 24 taatacgact cactatagca agctgaccct gaagttcatc aagagtgaac ttcagggtca 60
[0011] gcttgtcacc ggatgtgctc tccggtctga tgagtccgtg aggacgaaac aagctgaccc 120 tgaagttcac tcttatatat atatacatga ggattaccca tgtccatgg 169 <210> 25 <211> 171 <212〉 DNA 〈213〉人工序列 <220〉 <223〉合成的 <400> 2δ taatacgact cactatagca agctgaccct gaagttcatc aagagtgaac ttcagggtca 60 gcttgtcacc ggatgtgctc tccggtctga tgagtccgtg aggacgaaac aagctgaccc 12U tgaagttcac tcttgaatat atatatacat gaggattacc catgtccatg g 171 <210〉 26 <211> 244 <212〉 DNA <213〉人工序列 /oon\ <223^合成的 <400> 26 ggatcctaat acgactcact atagggatct cccagcctcc tcgctggcgc cggctgggca 60 acattcgtgg cgaatggggg atcatatctt gatgaacttc agggtcagct tgctgatgag 120 gcgcttcggc gccgaaacac cgtgtccaag ctgaccctga agttcatcaa gaatgaactt 180 cagggtcagc ttgtcggccg gcatgcattc aaacatgagg attacccatg tcgaagttaa 240 ttaa 241 <210〉 27 <211> 615 <212> DNA 〈213>人工序列 <220〉 <223〉合成的 <400〉 27 ggatcctaat acgactcact atagggagac ttgatgaact tcagggtcag cttgctgatg 60 aggcgcttcg gcgccgaaac acccagtggt gtccaagctg accctgaagt tcatcaagaa 120 tgaacttcag ggtcagcttg tcaccggatg tgctctccgg tctgatgagt ccgtgaggac 180 gaaacaagct gaccctgaag ttcattatat cttggcagat gaacttcagg gtcagctgat 240
[0012] gagactcttc ggagtcgaaa cacccagtgg tgtcctgacc ctgaagttca tctgccaaga 300 gcagatgaac ttcagggtca gtcaccggat gtgctctccg gtctgatgag tccgtgagga 360 cgaaactgac cctgaagttc atctgctata tcttgtggtg cagatgaact tcagggctga 420 tgaggctctt cggagccgaa acacccagtg gtgtcccctg aagttcatct gcaccacaag 480 atggtgcaga tgaacttcag ggtcaccgga tgtgctctcc ggtctgatga gtccgtgagg 540 acgaaaccct gaagttcatc tgcaccatac gccggccatt caaacatgag gattacccat 600 gtcgaagtta attaa 615 <210> 28 <211> 431 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成的 <400〉 28 ggatcctaat acgactcact atagggagaa tatatataca agctgaccct gaagttcatc 60 aagaatgaac ttcagggtca gcttgtcggc cggcatggtc ccagcctcct cgctggcgcc 120 ggctgggcaa cattcgtggc gaatgggacc aattaattac tgaccctgaa gttcatctgc 180 caagagcaga tgaacttcag ggtcagtcgg ccggcatggt cccagcctcc tcgctggcgc 240 cggctgggca acattcgtgg cgaatgggac caataataat ccctgaagtt catctgcacc 300 acaagatggt gcagatgaac ttcagggtcg gccggcatgg tcccagcctc ctcgctggcg 360 ccggctgggc aacattcgtg gcgaatggga cccattcaaa catgaggatt acccatgtcg 420 aagttaatta a 431 <210〉 29 <211〉 362 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成的 <400> 29 ggatcctaat acgactcact atagggagaa tgaacttcag ggtcagcttg ctgatgaggc 60 gcttcggcgc cgaaacaccg tgtccaagct gaccctgaag ttcatggccg gcatggtccc 120 agcctcctcg ctggcgccgg ctgggcaaca ttcgtggcga atgggaccat tagccaagct 180
[0013] gaccctgaag ttcatctgat gagactccga attcggagtc gaaacacggt aaccgtgtca 240 tgaacttcag ggtcagcttg gcggccggca tggtcccagc ctcctcgctg gcgccggctg 300 ggcaacattc gtggcgaatg ggacccattc aaacatgagg attacccatg tcgaagccat 360 gg 362 <210〉 30 <211〉 196 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成的 <400〉 30 ggatcctaat acgactcact atagggagaa ataataatca agctgaccct gaagttcatc 60 aagaatgaac ttcagggtca gcttgtcaat aataatccgc taccccgacc acatgaacaa 120 gattcatgtg gtcggggtag cggtcaataa taatacgctt caaacatgag gattacccat 180 gtcgaagcga ccatgg 196 <210〉 31 <211〉 165 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <M3>合成的 <400> 31 taatacgact cactataggc ttgtgatgct tcagccaaat caagagtttg gctgaagcat 60 cacaagcggc cggcatggtc ccagcctcct cgctggcgcc ggctgggcaa cattcgtggc 120 gaatgggacc atatatatat acatgaggat tacccatgtc catgg 165 <210〉 32 <211〉 168 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>合成的 <400> 32 taatacgact cactataggc tcgagcaagc ctgatgaggc gcttcggcgc cgaaacaccg 60 tgtcgcttgt gatgcttcag ccaaatcaag agtttggctg aagcatcaca. agctcaccgg 120 at.gtgctctc cggtctgatg agtccgtgag gacgaaagct tgccatgg 168
[0014] <210> 33 <211> 251 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223〉合成的 <400> 33 taatacgact cactataggg agaacgccgg ccattcaaat agtaaataat agagggtcag 60 cttgctgatg aggcgcttcg gcgccgaaac accgtgtcca agctgaccct gaagttcatc 120 aagagtgaac ttcagggtca gcttgtcacc ggatgtgctc tccggtctga tgagtccgtg 180 aggacgaaac aagctgaccc tgaagttcac tacgccggcc attcaaacat gaggattacc 240 catgtccatg g 251 <210〉 34 <211> 129 <212〉 PRT <213〉腸桿菌噬菌體MS2 <400〉 34 Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly 15 10 15 Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp 20 25 30 lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val 35 40 45 Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Ser lie Lys Val Glu Val 50 55 60 Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala 65 70 75 80 Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe Ala 85 90 95 Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu Leu 100 105 110
[0015] Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly lie 115 120 125 Tyr <210〉 35 <211〉 129 <212〉 PRT <213〉腸桿菌噬菌體GA <400〉 35 Ala Thr Leu Arg Ser Pbe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly Asn 15 10 15 Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp Leu 20 25 30 Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr Arg 35 40 45 Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Thr lie Lvs Leu Glu Val Pro 50 55 60 Lys lie Val Thr Gin Val Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Gly Ser Ala 65 70 75 80 Trp Lys Ala Tyr Ala Ser lie Asp Leu Thr lie Pro lie Phe Ala Ala 85 90 95 Thr Asp Asp Val Thr Val lie Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe Lys 100 105 110 Val Gly Asn Pro lie Ala Glu Ala lie Ser Ser Gin Ser Gly Phe Tyr 115 120 125 Ala <210〉 36 <211〉 129 <212> PRT <213〉腸桿菌噬菌體FR <400〉 36
[0016] Ala Ser Asn Phe Glu Glu Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly 1 5 10 15 Asp Val Lys Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Yal Ala Glu Trp 20 25 30 lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Yal 35 40 45 Arg Gin Ser Ser Ala Asn Asn Arg Lys Tyr Thr Val Lys Val Glu Val 50 55 60 Pro Lya Val Ala Thr Gin Val Gin Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala 65 70 75 80 Ala Trp Arg Ser Tvr Met Asn Met Glu Leu Thr lie Pro Val Phe Ala 85 90 95 Thr Asn Asp Asp Cys Ala Leu lie Val Lys Ala Leu Gin Gly Thr Phe 100 105 110 Lys Thr Gly Asn Pro lie Ala Thr Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly He 115 120 125 Tyr <210〉 37 <211〉 257 <212〉 PRT <213〉腸桿菌噬菌體MS2 <400> 37 Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly 15 10 15 Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp 20 25 30 lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val 35 40 45 Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu Val
[0017] 50 55 60 Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala 65 70 75 80 Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe Ala 85 90 95 Thr Asn Scr Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu Leu 100 105 110 Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly lie 115 120 125 Tyr Ala Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly 130 135 14-0 Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp 145 150 155 160 lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val 165 170 175 Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Va] Glu Val 180 185 190 Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala 195 200 205 Aia Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met G丄ii Leu Thr 丄丄e Pro 丄丄e Phe Ala 210 215 220 Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu Leu 225 230 235 240 Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly lie 245 250 255 Tyr <210〉 38 <211〉 130
[0018] Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 15 10 15 <212〉 PRT <213〉腸桿菌噬菌體MS2 <400> 38 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr Tie Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala --ρ Arg Ser Tyr Leu Asn Leu Glu Leu Thr 丄丄e Pro 丄丄e Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210〉 39 <211〉 120 <212〉 PRT <213〉腸桿菌噬菌體MS2 <400> 39 Met Ala Scr Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Glv Gly Thr 1 5 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser
[0019] 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Leu Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro 115 120 <210> 40 <211〉 130 <212〉 PRT 〈213〉腸桿菌噬菌體MS2 <400> 40 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 1 5 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu 50 55 60 Leu Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Glv Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110
[0020] Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210> 41 <211> 130 <212〉 PRT <213〉腸桿菌噬菌體MS2 <400〉 41 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 1 5 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Yal Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr He Lys Val Glu 50 55 60 Yal Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Yal Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Yal Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210〉 42 <211> 130 <212〉 PRT <213〉腸桿菌噬菌體MS2
[0021] Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 1 5 10 15 <400> 42 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Pro Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210〉 43 <211〉 130 <212> PRT <213〉腸桿菌噬菌體MS2 <400> 43 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 15 10 15 Gly Asp Val Ala Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Yal Thr Cys Ser 35 40 45
[0022] ￥al Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Glv Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210〉 44 <211> 130 <212〉 PRT <213〉腸桿菌噬菌體MS2 <220> <221> misc-feature <222> (50)..(50) <223〉Xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸 <400> 44 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 15 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Xaa Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80
[0023] Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210〉 45 <211〉 130 <212> PRT <213〉腸桿菌噬菌體MS2 <220〉 <221> misc feature <222> (7) (7) <223〉Xaa^j以是任何天然發(fā)生的氨基酸 <400> 45 Met Ala Ser Asn Phe Thr Xaa Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Glv Thr 15 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Glv Leu 100 105 110
[0024] Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210> 46 <211〉 130 <212> PRT <213〉腸桿菌噬菌體B01 <400〉 46 Met Ala vSer Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 15 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Yal Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Vai bys Aia Met Gin Gly Pro 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210〉 47 <211〉 130 <212> PRT <213〉腸桿菌噬菌體MS2 <400> 47
[0025] Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Asp Gly Thr 15 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly VaJ Ala C Lu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Yal Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Vai Ala Thr Gin Thr Vai Gly Gly Val Glu Leu Pro Vai 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu He Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Scr Ala lie Ala Ala Asn Scr Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210> 48 〈211〉 130 <212〉 PRT <213〉腸桿菌噬菌體MS2 <220> <221> misc-feature <222〉 (18)7. (18) <223〉Xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸 <400> 48 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 15 10 15 Gly Xaa Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30
[0026] Trp He Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210〉 49 <211〉 130 <212> PRT <213〉腸桿菌噬茼體MS2 <400> 49 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 15 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Scr Asn Sdr Arg Scr Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Scr 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Leu Glu Leu Thr lie Pro lie Phe
[0027] 85 90 95 Ala Thr Asn Pro Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110 Leu I.ys Asp Gly Asn Pro Tie Pro Ser Ala ile Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210〉 50 <211〉 130 <212〉 PRT <213〉腸桿菌噬菌體MS2 <400> 50 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 15 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Aia G丄n Asn Arg Lys Tyr Thr 丄ie Lys Vai Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Scr Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Ser Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 Ile Tyr 130
[0028] <210> 51 <211〉 130 <212> PRT <213〉腸桿菌噬菌體MS2 <220〉 <221> misc-feature <222> (1047.. (104) <223〉Xaa可以是仟何天然發(fā)牛的氨基酸 <400〉 51 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 15 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Val Glu Leu Thr lie Pro He Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Xaa lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210〉 52 <211〉 130 <212> PRT <213〉腸桿菌噬菌體MS12 <220〉
[0029] <221> misc-feature <222> (22) (22) <223〉Xaa可?以甚任何天然發(fā)生的氨基酸 <400〉 52 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 15 10 15 Gly Asp Val Thr Val Xaa Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala G_Lu 20 25 30 Trp Tie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Ala G]n Asn Arg Lys Tyr Thr He Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tvr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cvs Ala Leu lie Val Lys Ala Met Gin Glv Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro 丄le Pro Ser Ala He A_La Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210> 53 <211〉 130 <212> PRT <213〉腸桿菌噬菌體MS2 <220〉 <221> misc_feature <222〉 （130)-.. (130) <223> Xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸 <400> 53 Met, Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Glv Thr 15 10 15
[0030] Gly Asp ￥al Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gin Sor Scr Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Val Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Glv Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Xaa 130 <210> 54 <211〉 130 <212> PRT <213〉腸桿菌噬菌體MS2 <220> <221> misc-feature (?ηΥ (} <223丨1船可^是任何天然發(fā)生的氨基酸 <400> 54 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Glv Thr 15 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Yal Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45
[0031] Val Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Val Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Xaa 130 <210> 55 <211〉 130 <212〉 PRT <213〉腸桿菌噬菌體MS2 <400〉 55 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 15 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Gin Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95
[0032] Ala Thr Asn Asp Asp Cys Ala Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210〉 56 <211〉 130 <212> PRT <213〉腸桿菌噬菌體MS2 <400> 56 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Glv Gly Thr 15 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala, Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lvs Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu 50 55 60 Yal Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Gin Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Asp Asp Cys Ala Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210〉 57 <211> 127
[0033] Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Yal Asp Asn Gly Gly Thr Gly Asp Val 1 5 10 15 <212> PRT <213〉腸桿菌噬菌體MS2 <400> 57 Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala, Glu Trp lie Ser 20 25 30 Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val Arg Gin 35 40 45 Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu Val Pro Lvs 50 55 60 Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala Ala Trp 65 70 75 80 Arg Ser Tyr Leu Asn Val Glu Leu Thr lie Pro lie Phe Ala Thr Asn 85 90 95 Ser Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu Leu Lys Asp 100 105 110 Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Glv lie Tyr 115 120 125 <210〉 58 <211〉 129 <212> PRT <213〉腸桿菌噬菌體ZR <400> 58 Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly 15 10 15 Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp 20 25 30 He Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val 35 40 45 Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu Val
[0034] 50 55 60 Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr ￥al Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala 65 70 75 80 Ala Trp Arg Ser Tvr Leu Asn Met Glu f,eu Thr Tie Pro Tie Phe Ala 85 90 95 Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu Leu 100 105 110 Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly lie 115 120 125 Tyr <210〉 59 <211> 129 <212〉 PRT <213〉腸桿菌噬菌體R17 <400> 59 Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Va] Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly 15 10 15 Asn Vai 1'hr Va_L Aia Pro Ser Asn Phe Asn G丄y Vai Ala Glu Trp 20 25 30 lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val 35 40 45 Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu Va] 50 55 60 Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala 65 70 75 80 Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr He Pro lie Phe Ala 85 90 95 Thr Asn Ser Asp Cvs Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu Leu 100 105 110
[0035] Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly lie 115 120 125 Tyr <210> 60 <211> 130 <212〉 PRT <213〉腸桿菌噬菌體MS2 <400〉 60 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 1 5 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Yal Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr He Lys Val Glu 50 55 60 Yal Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Yal Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210〉 61 <211> 130 <212〉 PRT <213〉腸桿菌噬菌體MS2
[0036] <400> 61 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 1 5 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210〉 62 <211〉 130 <212> PRT <213〉腸桿菌噬菌體MS2 <400〉 62 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 15 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45
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[0039] Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asn Asp Glv Gly Thr Gly 15 10 15 <400> 65 Asn Val Thr ￥al Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp 20 25 30 lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val 35 40 45 Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu Val 50 55 60 Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Cily Val Glu Leu Pro Val Ala 65 70 75 80 Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Leu Glu Leu Thr lie Pro lie Phe Ala 85 90 95 Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Yal Lys Ala Met Gin Gly Leu Leu 100 105 110 Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly lie 115 120 125 Tyr <210> 66 <211> 130 <212> PRT <213〉腸桿菌噬菌體JP34 <400> 66 Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly 15 10 15 Asp Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly VaL Ala Glu Trp 20 25 30
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[0042] Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly 15 10 15 <213〉腸桿菌噬菌體KU1 <400> 69 Asn Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp 20 25 30 Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr 35 40 45 Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Thr lie Lys Leu Glu Val 50 55 60 Pro Lys lie Val Thr Gin Ser Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Val Ser 65 70 75 80 Ala Trp Lys Ala Phc Ala Sor lie Asp Leu Thr lie Pro lie Phc Ala 85 90 95 Ala Thr Asp Asp Val Thr Leu lie Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe 100 105 110 ],ys Tie Gly Asn Pro Val Ala Asp Ala Tie vSer Ser Gin Ser Gly Phe 115 120 125 Tyr Ala 130 <210〉 70 <211〉 130 <212> PRT <213〉腸桿菌噬菌體GA <400〉 70 Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Val Leu Val Asp Aan Gly Gly Thr Gly 1 5 10 lo Asn Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp 20 25 30 Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr 35 40 45
[0043] Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Ala lie Lys Leu Glu Val 50 55 60 Pro Lys lie Val Thr Gin Val Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Gly Ser 65 70 75 80 Ala Trp Lys Ala Tyr Ala Ser lie Asp Leu Thr lie Pro lie Phe Ala 85 90 95 Ala Thr Asp Asp Val Thr Val lie Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe 100 105 110 Lys Val Gly Asn Pro lie Ala Glu Ala lie Ser Ser Gin Ser Gly Phe 115 120 125 Tyr Ala 130 <210> 71 <211> 130 <212> PRT <213〉腸桿菌噬菌體BZ13 <400〉 71 Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly 15 10 15 Asn Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp 20 25 30 Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr 35 40 45 Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Thr lie Lys Leu Glu Val 50 55 60 Pro Lys lie Val Thr Gin Val Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Val Ser 65 70 75 80 Ala Trp Lys Ala Tyr Ala Ser lie Asp Leu Thr lie Pro lie Phe Ala 85 90 95
[0044] Ala Thr Asp Asp Val Thr Val lie Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe 100 105 110 Lys Val Gly Asn Pro lie Ala Glu Ala lie Ser Ser Gin Ser Gly Phe 115 120 125 Tyr A丄a 130 <210〉 72 <211〉 130 <212> PRT <213〉腸桿菌噬菌體BZ13 <400> 72 Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly 15 10 15 Asn Vai Thr Vai Va丄 Pro Val Ser Asn Ala Asn Giv Vai Aia G_Lu Trp 20 25 30 Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr 35 40 45 Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Thr lie Lys Leu Glu Val 50 55 60 Pro Lys lie Val Thr Gin Thr Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Val Ser 65 70 75 80 Ala Trp Lys Ala Tyr Ala Ser lie Asp Leu Thr lie Pro lie Phe Ala 85 90 95 Ala Thr Asp Asp Val Thr Leu lie Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe 100 105 110 Lys lie Gly Asn Pro Val Ala Asp Ala lie Ser Ser Gin Ser Gly Phe 115 120 125 Tyr Ala 130 <210〉 73 <211> 130
[0045] Met Ala Thr Leu Arg vSer Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly 15 10 15 <212> PRT <213〉腸桿菌噬菌體BZ13 <400〉 73 Asn Val Thr Yal Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp 20 25 30 Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr 35 40 45 Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Thr lie Lvs Leu Glu Val 50 55 60 Pro Lys lie Val Thr Gin Val Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Val Ser 65 70 75 80 A丄a Trp Lys A丄a Tyr Ala Ser .lie Asp Leu Thr 丄丄e Pro lie Phe Aia 85 90 95 Ala Thr Asp Asp Val Thr Val lie Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe 100 105 110 Lys Val Gly Asp Pro lie Ala Asp Ala lie Ser Ser Gin Ser Gly Phe 115 120 125 Tyr Ala 130 <210〉 74 <211> 130 <212〉 PRT <213〉腸桿菌噬菌體TH1 <400〉 74 Met Ala Thr Leu Arg Scr Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly 15 10 15 Asn Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp 20 25 30 Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr
[0046] 35 40 45 Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Thr lie Lys Leu Glu Val 50 55 60 Pro Lys lie Val Thr Gin Val Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Val Ser 65 70 75 80 Ala Trp Lys Ala Tyr Ala Ser lie Asp Leu Thr lie Pro lie Phe Ala 85 90 95 Ala Thr Asp Asp Val Thr Val lie Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe 100 105 110 Lys Val Gly Asn Pro lie Ala Asp Ala lie Ser Ser Gin Ser Gly Phe 115 120 125 Tyr Ala 130 <210〉 75 <211〉 130 <212〉 PRT <213〉腸桿菌噬菌體T12 <400〉 75 Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Val Leu Val Asp Asn Glv Gly Thr Gly 15 10 15 Asn Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp 20 25 30 Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr 35 40 45 Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Thr lie Lys Leu Glu Val 50 55 60 Pro Lys lie Val Thr Gin Val Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Val Ser 65 70 75 80 Ala Trp Lys Ala Tyr Ala Ser lie Asp Leu Thr lie Pro lie Phe Ala 85 90 95
[0047] Ala Thr Asp Asp Val Thr Val lie Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe 100 105 110 Lys Val Gly Asn Pro lie Ala Asp Ala lie Ser Ser Gin Ser Gly Phe 115 120 125 Tyr Ala 130 <210〉 76 <211〉 130 <212〉 PRT <213〉腸桿菌噬菌體FR <400> 76 Met Ala Ser Asn Phe Glu Glu Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 15 10 15 Gly Asp Val Lys Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys ￥al Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Ala Asn Asn Arg Lys Tyr Thr Val Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Val Gin Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Met Asn Met Glu Leu Thr lie Pro Val Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Asp Asp Cys Ala Leu lie Val Lys Ala Leu Gin Gly Thr 100 105 110 Phe Lys Thr Gly Asn Pro lie Ala Thr Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210> 77
[0048] <211〉 130 <212> PRT <213〉腸桿菌噬菌體R17 <400〉 77 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 1 5 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Scr Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210〉 78 <211〉 132 <212〉 PRT <213〉腸桿菌噬菌體Qbeta <400> 78 Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn lie Gly Lys Asp Gly Lys 15 10 15 Gin Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val 20 25 30
[0049] Ala Ser Leu Ser Gin Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val 35 40 45 Thr Val Ser Val Ser Gin Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val 50 55 60 Gin Val Lys lie Gin Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys 65 70 75 80 Asp Pro Ser Val Thr Arg Gin Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe 85 90 95 Thr Gin Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu 100 105 110 Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu lie Asp Ala lie Asp Gin Leu 115 120 125 Asn Pro Ala Tyr 130
【權(quán)利要求】
1. 一種病毒樣顆粒（VLP)，所述病毒樣顆粒包含封入至少一種異源貨物分子和包裝序 列的衣殼。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，所述VLP還包含由所述衣殼封入的至少一種核酶。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的VLP，其中所述異源貨物分子包含寡核苷酸。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的VLP，其中所述異源貨物分子包含寡核糖核苷酸。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的VLP，其中所述核酶的側(cè)翼為所述包裝序列和所述寡核糖核 苷酸，以形成核酸構(gòu)建體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的VLP，所述VLP包含多個所述核酸構(gòu)建體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的VLP，其中所述寡核糖核苷酸是選自siRNA、shRNA、sshRNA、 IshRNA 和 miRNA 的短 RNA。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的VLP，所述VLP包含至少兩種核酶，其中每種核酶選擇為切割 所述短RNA的一個末端。
9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的VLP，所述VLP還包含由至少1-100個核苷酸組成的接頭，所 述接頭包含至少40%的A或至少40 %的U，其中所述接頭連接所述寡核糖核苷酸和所述包 裝序列、或所述寡核糖核苷酸和所述核酶。
10. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的VLP，其中所述核酶選自錘頭狀核酶和丁型肝炎病毒核酶。
11. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的VLP，其中所述核酶是具有與所述寡核糖核苷酸的至少6個 連續(xù)核苷酸互補的連續(xù)核苷酸組的錘頭狀核酶變體。
12. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的VLP，其中所述核酶是能夠切割其與所述寡核糖核苷酸的連 接的突變型丁型肝炎病毒核酶，其速率為野生型丁型肝炎病毒核酶速率的至多約50%。
13. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的VLP，其中所述核酶是具有選自SEQ ID No :10-18的核酸序 列的突變型HDV核酶。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中所述衣殼包含野生型病毒衣殼，其對由肽鍵水解 酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中所述衣殼包含這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其與野生型腸 桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列具有至少40%序列同一性，并且對由肽 鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中所述衣殼包含這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其與野生型腸 桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID NO: 3)的氨基酸序列具有至少41 %序列同一性，并且對由肽 鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中所述衣殼包含這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其與野生型腸 桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列具有至少45%序列同一性，并且對由肽 鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中所述衣殼包含這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其與野生型腸 桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列具有至少52%序列同一性，并且對由肽 鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中所述衣殼包含這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其與野生型腸 桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID NO: 3)的氨基酸序列具有至少53%序列同一性，并且對由肽 鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中所述衣殼包含這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其與野生型腸 桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID NO:3)的氨基酸序列具有至少56%序列同一性，并且對由肽 鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。
21. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中所述衣殼包含這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其與野生型腸 桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID NO:3)的氨基酸序列具有至少59%序列同一性，并且對由肽 鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。
22. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中所述衣殼包含這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其與野生型腸 桿菌噬菌體MS2衣殼蛋白質(zhì)（SEQ ID NO:3)的氨基酸序列具有至少86%序列同一性，并且 對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。
23. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中所述衣殼包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的 野生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼蛋白質(zhì)。
24. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中所述衣殼包含這樣的衣殼蛋白質(zhì)，基于有效的 結(jié)構(gòu)錨定比對，其與野生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID NO: 3)的氨基酸序列具有至少 15%序列同一性，并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。
25. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中所述衣殼包含這樣的衣殼蛋白質(zhì)，基于有效的 結(jié)構(gòu)錨定比對，其與野生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID NO: 3)的氨基酸序列具有至少 16%序列同一性，并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。
26. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中所述衣殼包含這樣的衣殼蛋白質(zhì)，基于有效的 結(jié)構(gòu)錨定比對，其與野生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID NO: 3)的氨基酸序列具有至少 21%序列同一性，并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。
27. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中所述異源貨物分子包括肽或多肽。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的VLP，所述VLP還包含偶聯(lián)所述異源貨物分子和所述病毒 衣殼的寡核苷酸接頭。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的VLP，其中所述寡核苷酸接頭是包含核酶序列的寡核糖核 苷酸。
30. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中所述異源貨物分子包括包含雙功能多核苷酸的雙 分子貨物分子，所述雙功能多核苷酸包含第一適體序列和第二適體序列，所述第一適體序 列特異性結(jié)合具有約1，500Da或更少的分子量的生物活性小分子，所述第二適體序列用于 結(jié)合所述衣殼的包裝序列。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的VLP，所述VLP還包含與所述第一適體序列結(jié)合的所述生 物活性小分子。
32. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的VLP，其中所述生物活性小分子包含除草劑或殺蟲劑。
33. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的VLP，其中所述生物活性小分子選自：莠去津、啶蟲脒甲拌 憐、丙漠憐、水胺硫憐和氧樂果。
34. -種核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含編碼短RNA、核酶和包裝序列的核苷酸序 列。
35. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的核酸構(gòu)建體，其中所述短RNA是siRNA或shRNA。
36. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體還包含4-100個核苷酸的連 接核苷酸序列，所述核苷酸中至少40%是A，至少40%是T或至少40%是U，其中所述連接 核苷酸序列的側(cè)翼為所述包裝編碼序列和所述siRNA編碼序列。
37. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的核酸構(gòu)建體，其中所述核酶的側(cè)翼為所述短RNA和所述包 裝序列。
38. 根據(jù)權(quán)利要求37所述的核酸構(gòu)建體，其中所述短RNA是siRNA或shRNA。
39. -種載體，所述載體包含根據(jù)權(quán)利要求34所述的核酸構(gòu)建體。
40. -種宿主細胞，所述宿主細胞包含根據(jù)權(quán)利要求39所述的載體。
41. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞由所述載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。
42. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的宿主細胞，所述宿主細胞是細菌細胞。
43. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的宿主細胞，所述宿主細胞是大腸桿菌細胞。
44. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的宿主細胞，所述宿主細胞是植物細胞。
45. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的宿主細胞，所述宿主細胞是哺乳動物細胞。
46. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的宿主細胞，所述宿主細胞是真菌細胞。
47. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的宿主細胞，所述宿主細胞是酵母細胞。
48. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞還由第二載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，所 述第二載體包含編碼病毒衣殼的第二核酸序列，所述病毒衣殼對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4 催化的水解是抗性的。
49. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的宿主細胞，其中所述第二核酸序列編碼編碼病毒衣殼的病 毒蛋白質(zhì)，所述病毒衣殼與野生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼蛋白質(zhì)（SEQ ID NO:3)的氨基酸 序列具有至少40%序列同一性，并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。
50. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的宿主細胞，其中所述核酸序列編碼野生型腸桿菌噬菌體 MS2衣殼蛋白質(zhì)（SEQ ID NO:3)。
51. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的核酸構(gòu)建體，其中所述核酶是錘頭狀核酶。
52. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的核酸構(gòu)建體，其中所述核酶是具有與所述短RNA的至少6 個連續(xù)核苷酸互補的連續(xù)核苷酸組的錘頭狀核酶變體。
53. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的核酸構(gòu)建體，其中所述核酶是丁型肝炎病毒核酶。
54. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的核酸構(gòu)建體，其中所述核酶是能夠切割其與所述短RNA的 連接的突變型丁型肝炎病毒核酶，其速率為野生型丁型肝炎病毒核酶速率的至多50 %，或 是具有選自SEQ ID No: 10-18的核酸序列的突變型HDV核酶。
55. -種植物或植物組織，所述植物或植物組織被轉(zhuǎn)化以含有根據(jù)權(quán)利要求34所述的 核酸構(gòu)建體。
56. 根據(jù)權(quán)利要求55所述的植物或植物組織的種子或后代，其中所述種子或后代包含 所述核酸構(gòu)建體。
57. -種組合物，所述組合物包含：a)各自包含封入至少一種異源貨物分子的病毒衣 殼的多個病毒樣顆粒；和b)對于所述組合物中存在的每100克衣殼以小于4克的量存在的 一種或多種細胞裂解產(chǎn)物，其中所述細胞裂解產(chǎn)物選自蛋白質(zhì)、多肽、肽及其任何組合。
58. 根據(jù)權(quán)利要求57所述的組合物，其中所述衣殼對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的 水解是抗性的。
59. 根據(jù)權(quán)利要求57所述的組合物，其中所述衣殼包含這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其與野生 型腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列具有至少40%序列同一性，并且對 由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。
60. 根據(jù)權(quán)利要求57所述的組合物，其中所述衣殼包含野生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼 蛋白質(zhì)（SEQ ID NO:3)。
61. 根據(jù)權(quán)利要求57所述的組合物，其中所述異源貨物分子包含寡核苷酸。
62. 根據(jù)權(quán)利要求57所述的組合物，其中所述異源貨物分子包含選自siRNA、shRNA、 sshRNA、IshRNA和miRNA的寡核糖核苷酸。
63. 根據(jù)權(quán)利要求62所述的組合物，其中每個病毒樣顆粒還包含至少一種核酶，其中 所述核酶的側(cè)翼為所述包裝序列和所述寡核糖核苷酸，以形成核酸構(gòu)建體。
64. 根據(jù)權(quán)利要求63所述的組合物，其中每個病毒樣顆粒包含多個所述核酸構(gòu)建體。
65. 根據(jù)權(quán)利要求63所述的組合物，其中所述核酶選自錘頭狀核酶和丁型肝炎病毒核 酶。
66. 根據(jù)權(quán)利要求63所述的組合物，其中所述核酶是具有與所述寡核糖核苷酸的至少 6個連續(xù)核苷酸互補的連續(xù)核苷酸組的錘頭狀核酶變體。
67. 根據(jù)權(quán)利要求63所述的組合物，其中所述核酶是能夠切割其與所述寡核糖核苷 酸的連接的突變型丁型肝炎病毒核酶，其速率為野生型丁型肝炎病毒核酶速率的至多約 50%，或是具有選自SEQ ID NO: 10-18的核酸序列的突變型HDV核酶。
68. 根據(jù)權(quán)利要求63所述的組合物，其中所述寡核糖核苷酸和所述包裝序列由長度為 1-100個核苷酸的核苷酸序列連接，此類連接序列包含超過40%的A或超過40%的U。
69. 根據(jù)權(quán)利要求57所述的組合物，其中所述異源貨物分子包括肽或多肽。
70. 根據(jù)權(quán)利要求69所述的組合物，所述組合物還包含偶聯(lián)所述異源貨物分子和所述 病毒衣殼的寡核苷酸接頭。
71. 根據(jù)權(quán)利要求70所述的組合物，其中所述寡核苷酸接頭是包含核酶序列的寡核糖 核苷酸。
72. 根據(jù)權(quán)利要求57所述的組合物，其中所述細胞裂解產(chǎn)物以小于0. 5克的量存在。
73. 根據(jù)權(quán)利要求57所述的組合物，其中所述細胞裂解產(chǎn)物以小于0. 2克的量存在。
74. 根據(jù)權(quán)利要求57所述的組合物，其中所述細胞裂解產(chǎn)物以小于0. 1克的量存在。
75. -種用于分離和純化靶標貨物分子的方法，所述方法包括：(a)獲得包含多個病毒 樣顆粒（VLP)的全細胞裂解物，所述多個病毒樣顆粒各自包含封入至少一種靶標貨物分子 的衣殼，其中所述衣殼對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的；(b)對所述VLP 實施使用肽鍵水解酶類別EC 3. 4的水解，其時間和條件足以切割所述全細胞裂解物中存 在的但未由所述衣殼封入的每100個個別多肽中的至少60、至少70、至少80或至少90個， 同時在此類水解前所述全細胞裂解物中存在的每100個衣殼中的至少60、至少70、至少80 或至少90個在所述水解后保持完整。
76. 根據(jù)權(quán)利要求75所述的方法，其中所述衣殼各自包含這樣的病毒衣殼蛋白質(zhì)，其 與野生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼蛋白質(zhì)（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列具有至少40%序列同 一性，并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。
77. 根據(jù)權(quán)利要求75所述的方法，其中所述衣殼各自包含野生型腸桿菌噬菌體MS2衣 殼蛋白質(zhì)（SEQ ID NO:3)。
78. 根據(jù)權(quán)利要求75所述的方法，其中所述靶標貨物分子包含寡核苷酸。
79. 根據(jù)權(quán)利要求75所述的方法，其中所述靶標貨物分子包含選自siRNA、shRNA、 sshRNA、IshRNA和miRNA的寡核糖核苷酸。
80. 根據(jù)權(quán)利要求75所述的方法，其中每個病毒樣顆粒還包含核酶，其中所述核酶的 側(cè)翼為所述包裝序列和所述寡核糖核苷酸，以形成核酸構(gòu)建體。
81. 根據(jù)權(quán)利要求75所述的方法，所述方法還包括在水解后純化所述衣殼。
82. 根據(jù)權(quán)利要求81所述的方法，其中純化包括液-液萃取步驟、結(jié)晶步驟、分級沉淀 步驟和超濾步驟中的至少一個。
83. 根據(jù)權(quán)利要求75所述的方法，其中所述靶標貨物分子包括肽或多肽。
84. -種組合物，所述組合物通過根據(jù)權(quán)利要求75所述的方法產(chǎn)生。
85. -種在宿主細胞中的細胞內(nèi)生產(chǎn)靶分子后，用于保護全細胞裂解物中的所述靶分 子不受水解的方法，所述方法包括：(a)選擇對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗 性的病毒衣殼；(b)用第一載體和第二載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染所述宿主細胞，所述第一載體包含編 碼形成所述病毒衣殼的病毒蛋白質(zhì)的核酸序列，所述第二載體包括包含核酶的核酸序列， 所述核酶的側(cè)翼為包裝序列和siRNA序列；和（c)使所述細胞維持在足以使所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的 細胞表達且裝配殼體化所述核酶的衣殼的時間和條件下，所述核酶的側(cè)翼為所述包裝序列 和所述siRNA序列。
86. -種用于純化封入至少一種異源貨物分子的VLP的方法，所述方法包括：（a)獲 得包含多個所述VLP的細胞裂解物；(b)使所述細胞裂解物與蛋白酶接觸足以水解除所述 VLP外的細胞裂解產(chǎn)物的時間和條件，以形成水解產(chǎn)物；和（c)從所述水解產(chǎn)物中分離所述 VLP。
87. 根據(jù)權(quán)利要求86所述的方法，其中步驟（c)包括（i)執(zhí)行使用硫酸銨的第一沉淀， 隨后為第一離心，以獲得第一沉淀物和第一上清液；和（ii)對所述第一上清液執(zhí)行使用硫 酸銨的第二沉淀，隨后為第二離心，以獲得第二沉淀物，其中所述第二沉淀物包含按重量計 至少約90%的所述VLP。
88. 根據(jù)權(quán)利要求86所述的方法，其中步驟（c)包括（i)執(zhí)行使用乙醇的第一沉淀，隨 后為第一離心，以獲得第一沉淀物和第一上清液；和（ii)對所述第一上清液執(zhí)行使用硫酸 銨的第二沉淀，隨后為第二離心，以獲得第二沉淀物，其中所述第二沉淀物包含按重量計至 少約90%的所述VLP。
89. 根據(jù)權(quán)利要求86所述的方法，其中步驟（c)包括使所述水解產(chǎn)物超離心，以獲得包 含按重量計至少約90%的所述VLP的沉淀物。
90. 根據(jù)權(quán)利要求86所述的方法，其中所述VLP各自包含對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4 催化的水解是抗性的衣殼。
91. 根據(jù)權(quán)利要求86所述的方法，其中所述VLP各自包括包含衣殼蛋白質(zhì)的衣殼，所述 衣殼蛋白質(zhì)與野生型腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID NO:3)的氨基酸序列具有至少40%序 列同一性，并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。
92. 根據(jù)權(quán)利要求86所述的方法，其中所述VLP各自包含野生型腸桿菌噬菌體MS2衣 殼蛋白質(zhì)（SEQ ID NO:3)。
93. 根據(jù)權(quán)利要求86所述的方法，其中步驟（b)在約37°C下執(zhí)行至少約30分鐘。
94. 根據(jù)權(quán)利要求86所述的方法，所述方法還包括在步驟（b)前，使所述細胞裂解物與 核酸酶、淀粉酶和脂肪酶中的至少一種在約37°C下接觸至少約30分鐘。
95. 根據(jù)權(quán)利要求86所述的方法，其中所述蛋白酶是肽鍵水解酶類別EC 3.4。
96. 根據(jù)權(quán)利要求86所述的方法，其中所述蛋白酶選自蛋白酶K、來自灰色鏈霉菌的蛋 白酶、和來自地衣芽孢桿菌的蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶。
97. 根據(jù)權(quán)利要求86所述的方法，其中所述異源貨物分子包含寡核苷酸。
98. 根據(jù)權(quán)利要求86所述的方法，其中所述異源貨物分子包含寡核糖核苷酸。
99. 根據(jù)權(quán)利要求98所述的方法，其中所述寡核糖核苷酸是選自siRNA、shRNA、 sshRNA、IshRNA 和 miRNA 的短 RNA。
100. 根據(jù)權(quán)利要求86所述的方法，其中所述VLP各自還包含側(cè)翼為包裝序列和所述寡 核糖核苷酸的核酶，以形成核酸構(gòu)建體。
101. 根據(jù)權(quán)利要求1〇〇所述的方法，其中所述核酶選自錘頭狀核酶和丁型肝炎病毒核 酶。
102. 根據(jù)權(quán)利要求100所述的方法，其中所述核酶是具有與所述寡核糖核苷酸的至少 6個連續(xù)核苷酸互補的連續(xù)核苷酸組的錘頭狀核酶變體。
103. 根據(jù)權(quán)利要求100所述的方法，其中所述核酶是能夠切割其與所述寡核糖核苷 酸的連接的突變型丁型肝炎病毒核酶，其速率為野生型丁型肝炎病毒核酶速率的至多約 50%。
104. 根據(jù)權(quán)利要求100所述的方法，其中所述核酶是具有選自SEQ ID No:10-18的核 酸序列的突變型HDV核酶。
105. 根據(jù)權(quán)利要求100所述的方法，其中所述寡核糖核苷酸和所述包裝序列由接頭序 列連接，所述接頭序列具有至少1-100個核苷酸，并且包含超過40 %的A或超過40 %的U。
106. 根據(jù)權(quán)利要求86所述的方法，其中所述異源貨物分子包括肽或多肽。
107. 根據(jù)權(quán)利要求106所述的方法，其中所述VLP各自還包含偶聯(lián)所述異源貨物分子 和所述病毒衣殼的寡核苷酸接頭。
108. 根據(jù)權(quán)利要求107所述的方法，其中所述寡核苷酸接頭是包含核酶序列的寡核糖 核苷酸。
109. 根據(jù)權(quán)利要求86所述的方法，所述方法還包括在步驟（a)前通過下述制備所述細 胞裂解物：在所述細胞中表達所述VLP后離心細胞；重懸浮所述細胞；裂解所述細胞且離心 所述細胞裂解物，以獲得上清液，其中所述上清液用作步驟（a)的細胞裂解物。
110. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中所述衣殼包含這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其具有野生型 腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID NO: 3)的氨基酸序列，除了在第1位處的A殘基被缺失，并 且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的之外。
111. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中所述衣殼包含這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其具有野生型 腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID NO: 3)的氨基酸序列，除了在第1位處的A殘基被缺失和 在第2位處的S殘基被缺失，并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的之外。
112. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中所述衣殼包含這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其具有野生型 腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID NO: 3)的氨基酸序列，除了在第1位處的A殘基被缺失、在 第2位處的S殘基被缺失和在第3位處的N殘基被缺失，并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4 催化的水解是抗性的之外。
113. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中所述衣殼包含這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其具有野生型 腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，除了在第129位處的Y殘基被缺失， 并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的之外。
114. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中所述衣殼包含這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其具有野生 型腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，具有在112-117區(qū)段中的單個（1 個）氨基酸缺失，并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。
115. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中所述衣殼包含這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其具有野生 型腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，具有在112-117區(qū)段中的單個（1 個）氨基酸缺失，并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。
116. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中所述衣殼包含這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其具有野生型 腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，具有在65-83區(qū)段中的1-2個殘基 插入，并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。
117. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中所述衣殼包含這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其具有野生型 腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，具有在44-55區(qū)段中的1-2個殘基 插入，并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。
118. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中所述衣殼包含這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其具有野生型 腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，具有在33-43區(qū)段中的單個（1個） 殘基插入，并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。
119. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中所述衣殼包含這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其具有野生型 腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，具有在24-30區(qū)段中的1-2個殘基 插入，并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。
120. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中所述衣殼包含這樣的衣殼蛋白質(zhì)，其具有野生型 腸桿菌噬菌體MS2衣殼（SEQ ID NO:3)的氨基酸序列，具有在10-18區(qū)段中的單個（1個） 殘基插入，并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。
121. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中所述衣殼包含與第二衣殼單體序列串聯(lián)的衣殼 蛋白質(zhì)單體序列，所述衣殼蛋白質(zhì)單體序列裝配成對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水 解是抗性的衣殼。
122. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中所述衣殼包含其C末端由0-6殘基接頭區(qū)段延 伸的衣殼蛋白質(zhì)單體序列，所述接頭區(qū)段的C末端與第二衣殼單體序列串聯(lián)，所有這些裝 配成對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的衣殼。
123. 根據(jù)權(quán)利要求122所述的VLP，其中所述接頭序列是_(Gly)x_，其中X = 0-6,或 是選自 _Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-、-Gly-Gly-Ser 和-Gly-Ser-Gly-的 Gly-Ser 接頭。
124. 根據(jù)權(quán)利要求122所述的VLP，其中所述衣殼包含與第三衣殼單體序列串聯(lián)的衣 殼蛋白質(zhì)，所述衣殼蛋白質(zhì)裝配成對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的衣殼。
125. 根據(jù)權(quán)利要求122所述的VLP，其中所述衣殼包含其中所述C末端由0-6殘基接 頭區(qū)段延伸的衣殼蛋白質(zhì)，所述接頭區(qū)段的C末端與第三衣殼單體序列串聯(lián)，所有這些裝 配成對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的衣殼。
126. 根據(jù)權(quán)利要求125所述的VLP，其中所述衣殼包含衣殼蛋白質(zhì)，其中一個或兩個 接頭序列是-(Gly)x-，其中 X = 0-6,或是選自-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-、-Gly-Gly-Ser 和-Gly-Ser-Gly-的Gly-Ser接頭，所述衣殼蛋白質(zhì)裝配成對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4 催化的水解是抗性的衣殼。
127. 根據(jù)權(quán)利要求125所述的VLP，其中所述衣殼包含其中一個或兩個接頭序列 是-(Gly)x-，X = 1的衣殼蛋白質(zhì)，所述衣殼蛋白質(zhì)裝配成對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催 化的水解是抗性的衣殼。
128. 根據(jù)權(quán)利要求125所述的VLP，其中所述衣殼包含其中一個或兩個接頭序列 是-(Gly)x-，X = 2的衣殼蛋白質(zhì)，所述衣殼蛋白質(zhì)裝配成對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催 化的水解是抗性的衣殼。
129. 根據(jù)權(quán)利要求134所述的VLP，其中所述衣殼包含其中一個或兩個接頭序列 是-(Gly)x-，X = 3的衣殼蛋白質(zhì)，所述衣殼蛋白質(zhì)裝配成對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催 化的水解是抗性的衣殼。
130. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中一種或多種外殼蛋白質(zhì)序列N末端截短1-3個 殘基，并且接頭序列延長缺失的殘基數(shù)目，并且其對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解 是抗性的，其中所述接頭序列是_(Gly)x-，其中X = 0-6。
131. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中一種或多種外殼蛋白質(zhì)序列C末端截短1個 殘基，并且接頭序列延長一個殘基，并且其對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性 的，其中所述接頭序列是-(Gly)x_，其中X = 0-6。
132. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，其中在串聯(lián)二聚體中的第一外殼蛋白質(zhì)序列C末端 截短1個殘基，并且接頭序列延長一個殘基，或其中在串聯(lián)三聚體中的所述第一和/或第二 外殼蛋白質(zhì)序列C末端截短1個殘基，并且對由肽鍵水解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性 的，其中所述接頭序列是-(Gly)x_，其中X = 0-6。
133. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的VLP，所述VLP包含N末端和C末端截短，并且對由肽鍵水 解酶類別EC 3. 4催化的水解是抗性的。
【文檔編號】C07H21/00GK104114696SQ201280062447
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2012年12月21日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月21日
【發(fā)明者】胡安·彼得羅·亨伯圖·阿漢塞特, 胡安·P·阿漢塞特, 金伯利·德萊尼, 凱思琳·B·霍爾, 尼納·薩默斯 申請人:阿普斯有限責任公司