新型抗人ctgf抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供與以往的抗人CTGF抗體相比在結(jié)合活性和/或中和活性方面優(yōu)良的抗人CTGF抗體、以及使用該抗人CTGF抗體的包括慢性腎病、糖尿病性腎病等腎疾病的人CTGF參與病態(tài)形成的各種疾病的預(yù)防或治療手段。一種抗人CTGF抗體，其包含由序列號(hào)10所示的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈可變區(qū)和由序列號(hào)4所示的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈可變區(qū)。
【專利說明】新型抗人CTGF抗體
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及新型抗人CTGF抗體。詳細(xì)而言，本發(fā)明的新型抗人CTGF抗體是與以往的抗人CTGF抗體相比在結(jié)合活性和/或中和活性方面優(yōu)良的抗人CTGF抗體。
【背景技術(shù)】
[0002]CTGF (結(jié)締組織生長因子)是屬于CCN家族的分子量約36~38kDa的富含半胱氨酸殘基的分泌蛋白質(zhì)(非專利文獻(xiàn)I)，以往，已知由被認(rèn)為是對(duì)纖維化最重要的增殖因子的TGF- β誘導(dǎo)(非專利文獻(xiàn)2)。因此，推測TGF- β誘導(dǎo)CTGF，誘導(dǎo)出的CTGF促進(jìn)器官、組織的纖維化，CTGF被認(rèn)為對(duì)纖維化、細(xì)胞的增殖、細(xì)胞外基質(zhì)的代謝、血管形成、動(dòng)脈硬化等發(fā)揮重要的作用(非專利文獻(xiàn)3)。
[0003]已知CTGF中存在多個(gè)結(jié)構(gòu)域，并且與其他因子相互作用。其中，已經(jīng)揭示出CTGF通過血管性血友病因子C結(jié)構(gòu)域與TGF-β或ΒΜΡ4直接結(jié)合，引起TGF-β信號(hào)傳遞的促進(jìn)或BMP信號(hào)傳遞的抑制(非專利文獻(xiàn)4)。
[0004]CTGF在各種腎病(例如，慢性腎病、糖尿病性腎病、腎小球硬化癥、IgA腎病、局灶節(jié)段性腎小球硬化癥、ANCA相關(guān)性腎炎、急進(jìn)性腎小球腎炎、慢性移植腎病、腎病綜合征、狼瘡腎炎、膜增生性腎小球腎炎)中表達(dá)亢進(jìn)(非專利文獻(xiàn)5)，有報(bào)道稱其與纖維化密切相關(guān)(非專利文獻(xiàn)6)。
[0005]另外，報(bào)道了CTGF與各種纖維化病(硬皮病、間質(zhì)性肺病、特發(fā)性肺纖維化等肺纖維化病、由慢性B型或C型肝炎產(chǎn)生的纖維化病、放射線誘導(dǎo)性纖維化病、由創(chuàng)傷愈合產(chǎn)生的纖維化病、以及心臟的肥大和纖維化病)、血管增生性疾病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、癌癥等相關(guān)，將其視為新的治療標(biāo)靶(非專利文獻(xiàn)7、8)。
[0006]因此，如果能夠開發(fā)具有與CTGF特異性地結(jié)合而阻礙CTGF所帶來的各種作用的活性的單克隆抗體，則可望用于CTGF參與病態(tài)形成的各種疾病的診斷、預(yù)防或治療。
[0007]作為到目前為止進(jìn)行了研究的對(duì)人CTGF顯示功能抑制作用的抗體，報(bào)道了作為人單克隆抗體的Μ84和Μ320(專利文獻(xiàn)I)、CLNl (專利文獻(xiàn)2)、作為小鼠單克隆抗體的CTGF-m2-l (專利文獻(xiàn)3)等。其中，對(duì)CLNl進(jìn)行了最詳細(xì)的研究，在間質(zhì)性肺纖維化模型、由單側(cè)輸尿管結(jié)扎導(dǎo)致的腎間質(zhì)纖維化模型中，其效果明確。CLNl目前作為FG-3019正處于臨床試驗(yàn)(II期)階段。
[0008]但是，以往的抗體對(duì)CTGF的結(jié)合活性稱不上充分，從治療有效性的觀點(diǎn)考慮，對(duì)CTGF的中和活性稱不上足夠強(qiáng)。
[0009]作為規(guī)定抗體藥物的有效給藥量的主要因素，一般可以列舉抗體所具有的對(duì)抗原的結(jié)合活性和中和活性、體內(nèi)存在的抗原的量，提高結(jié)合活性或中和活性使給藥量降低，結(jié)果會(huì)降低患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和醫(yī)療成本，可以說是極為有益的改良。
[0010]鑒于上述情況，獲得結(jié)合活性、中和活性比以往的抗體強(qiáng)的抗人CTGF抗體對(duì)用于CTGF參與病態(tài)形成的各種疾病的預(yù)防或治療是必不可缺的。
[0011]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)[0012]專利文獻(xiàn)
[0013]專利文獻(xiàn)1:日本特開2000-232884
[0014]專利文獻(xiàn)2:TO2004/108764
[0015]專利文獻(xiàn)3:W02007/066823
[0016]非專利文獻(xiàn)
[0017]非專利文獻(xiàn)I:D.M.Bradhamet al, J.Cell Biol.114:1285-1294(1991)
[0018]非專利文獻(xiàn)2:A.1garashi et al’Mol.Biol.Cell4:637_645 (1993)
[0019]非專利文獻(xiàn)3:Blom IE et al, Matrix Biol.21(6): 473-82 (2002)
[0020]非專利文獻(xiàn)4:Abreu, et al.Nat.Cell.Biol.4，599-604 (2002)
[0021]非專利文獻(xiàn)5:1to Y et al.: Kidney Int.53 (4) 853-61，(1998)
[0022]非專利文獻(xiàn)6:Phanish MK et al, Nephron Exp Nephrol.114 (3) e83_92, (2010)
[0023]非專利文獻(xiàn)7:Sh1-ffen X et al, Cytokine Growth Factor Rev.19(2): 133-44.(2008)
[0024]非專利文獻(xiàn)8: Jun JI et al, Nat Rev Drug Discov.10 (12):945-63 (2011)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0025]發(fā)明所要解決的問題
[0026]本發(fā)明的課題在于提供與以往的抗人CTGF抗體相比在結(jié)合活性和/或中和活性上優(yōu)良的抗人CTGF抗體。
[0027]用于解決問題的方法
[0028]本發(fā)明包含以下的發(fā)明作為醫(yī)學(xué)上或產(chǎn)業(yè)上有用的物質(zhì)/方法。
[0029][I] 一種抗人CTGF抗體，其包含由序列號(hào)10所示的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈可變區(qū)和由序列號(hào)4所示的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈可變區(qū)。
[0030][2]如[I]所述的抗人CTGF抗體，其中，上述抗體的重鏈恒定區(qū)為人IgY I恒定區(qū)。
[0031][3]如[I]所述的抗人CTGF抗體，其中，上述抗體的輕鏈恒定區(qū)為人Ig K恒定區(qū)。
[0032][4]如[I]所述的抗人CTGF抗體，其中，上述抗體的重鏈恒定區(qū)為人IgY I恒定區(qū)，上述抗體的輕鏈恒定區(qū)為人IgK恒定區(qū)。
[0033][5]如[I]所述的抗人CTGF抗體，其包含由序列號(hào)12所示的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈和由序列號(hào)8所示的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈。
[0034][6] 一種多核苷酸,其包含編碼[I]~[5]中任一項(xiàng)所述的抗體的重鏈可變區(qū)的序列。
[0035][7] 一種多核苷酸，其包含編碼[I]~[5]中任一項(xiàng)所述的抗體的輕鏈可變區(qū)的序列。
[0036][8] 一種表達(dá)載體，其包含[6]和/或[7]所述的多核苷酸。
[0037][9] 一種經(jīng)[8]所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
[0038][10]如[9]所述的宿主細(xì)胞，其選自由以下的(a)和(b)組成的組:
[0039] (a)經(jīng)含有包含編碼[I]~[5]中任一項(xiàng)所述的抗體的重鏈可變區(qū)的序列的多核苷酸和包含編碼該抗體的輕鏈可變區(qū)的序列的多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；和[0040](b)經(jīng)含有包含編碼[I]~[5]中任一項(xiàng)所述的抗體的的重鏈可變區(qū)的序列的多核苷酸的表達(dá)載體和含有包含編碼該抗體的輕鏈可變區(qū)的序列的多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
[0041][11] 一種生產(chǎn)[I]~[5]中任一項(xiàng)所述的抗人CTGF抗體的方法，其包含對(duì)[9]或
[10]所述的宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)以使其表達(dá)抗人CTGF抗體的步驟。
[0042][12] 一種人CTGF參與病態(tài)形成的疾病的治療藥，其包含[I]~[5]中任一項(xiàng)所述的抗體。
[0043][13]如[12]所述的治療藥，其中，上述疾病為腎疾病。
[0044][14]如[13]所述的治療藥，其中，上述腎疾病為慢性腎病或糖尿病性腎病。
[0045][15] 一種用于預(yù)防或處置人CTGF參與病態(tài)形成的疾病的方法，其包含施用[I]~
[5]中任一項(xiàng)所述的抗體的步驟。
[0046][16]如[15]所述的方法，其中，上述疾病為腎疾病。
[0047][17]如[16]所述的方法，其中，上述腎疾病為慢性腎病或糖尿病性腎病。
[0048][18]用于在人CTGF參與病態(tài)形成的疾病的預(yù)防或處置中使用的、[I]~[5]中任一項(xiàng)所述的抗體。 [0049][19]如[18]所述的抗體，其中，上述疾病為腎疾病。
[0050][20]如[19]所述的抗體，其中，上述腎疾病為慢性腎病或糖尿病性腎病。
[0051]發(fā)明效果
[0052]根據(jù)本發(fā)明，提供與以往的抗人CTGF抗體相比在結(jié)合活性和/或中和活性上優(yōu)良的抗人CTGF抗體。本發(fā)明的抗人CTGF抗體通過抑制人CTGF的功能而具有強(qiáng)力的抗纖維化作用，對(duì)于人CTGF參與病態(tài)形成的各種疾病的預(yù)防或治療有用。而且，這種本發(fā)明的抗人CTGF抗體帶來給藥量的降低、給藥間隔的擴(kuò)大、給藥方法的改善(例如，皮下注射劑)等臨床應(yīng)用上的優(yōu)良改善，大大有助于改善治療有效性和患者依從性。
【具體實(shí)施方式】
[0053]以下，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳述。
[0054]本發(fā)明人對(duì)抗人CTGF抗體的制作進(jìn)行了大量的創(chuàng)意研究，結(jié)果成功地制作了與以往的抗人CTGF抗體相比結(jié)合活性得到改善、中和活性優(yōu)良的抗人CTGF抗體。
[0055]抗體分子的基本結(jié)構(gòu)在各類中是共通的，由分子量5萬~7萬的重鏈和2~3萬的輕鏈構(gòu)成。重鏈通常由含有約440個(gè)氨基酸的多肽鏈構(gòu)成，在各類中具有特征性的結(jié)構(gòu)，與IgG、IgM、IgA、IgD、IgE相對(duì)應(yīng)被稱為Y鏈、μ鏈、α鏈、δ鏈、ε鏈。而且IgG中存在1861、1862、1863、1864，分別被稱為y、Y 2、Y 3、Y 4。輕鏈通常由含有約220個(gè)氨基酸的多肽鏈構(gòu)成，已知有L型和K型兩種，分別被稱為λ鏈、κ鏈。抗體分子的基本結(jié)構(gòu)的肽構(gòu)成由各自相同的2條重鏈和2條輕鏈通過二硫鍵(S-S鍵)和非共價(jià)鍵結(jié)合而成，分子量為15萬~19萬。2種輕鏈與任一種重鏈均能夠成對(duì)。各個(gè)抗體分子常常由相同的2條輕鏈和相同的2條重鏈形成。
[0056]鏈內(nèi)S-S鍵在重鏈中有四個(gè)(μ、ε鏈中有五個(gè))，在輕鏈中有兩個(gè)，每100~110個(gè)氨基酸殘基形成一個(gè)環(huán)，該立體結(jié)構(gòu)在各環(huán)間類似，被稱為結(jié)構(gòu)單元或結(jié)構(gòu)域。對(duì)于在重鏈、輕鏈中均位于N末端的結(jié)構(gòu)域而言，即使是來自于同種動(dòng)物的同一類(亞類)的標(biāo)準(zhǔn)品，其氨基酸序列也不固定，被稱為可變區(qū)，各結(jié)構(gòu)域分別被稱為重鏈可變區(qū)(Vh)和輕鏈可變區(qū)(')。比可變區(qū)更靠C末端側(cè)的氨基酸序列在各類或亞類中基本固定，被稱為恒定區(qū)(各結(jié)構(gòu)域分別表示為CH1、Ch2、Ch3或CJ。
[0057]抗體的抗原決定部位由Vh和\構(gòu)成，結(jié)合的特異性由該部位的氨基酸序列決定。另一方面，與補(bǔ)體或各種細(xì)胞的結(jié)合等生物學(xué)活性反映出各類Ig的恒定區(qū)的結(jié)構(gòu)的差異。已知輕鏈和重鏈的可變區(qū)的可變性基本限定在任一種鏈中均存在的3個(gè)小的超變區(qū)內(nèi)，將這些區(qū)域稱為互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R ;從N末端側(cè)起分別為⑶R1、⑶R2、⑶R3)。可變區(qū)的其余部分被稱為框架區(qū)(FR)，比較恒定。
[0058]本發(fā)明人成功制作的本發(fā)明的抗人CTGF抗體為具有以下特征的抗人CTGF抗體。
[0059]一種抗人CTGF抗體，其包含由序列號(hào)10所示的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈可變區(qū)和由序列號(hào)4所示的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈可變區(qū)。
[0060]具體而言，本發(fā)明人使用人單克隆抗體開發(fā)技術(shù)“Veloclmmune” (VelocImmuneantibody technology ；Regeneron公司(美國專利6596541號(hào)))小鼠制作抗體，通過使用各種生物學(xué)活性試驗(yàn)和物性試驗(yàn)的抗體的篩選，成功地鑒定了本發(fā)明的抗人CTGF抗體。在Ve1cImmune技術(shù)中，將內(nèi)源性的免疫球蛋白重鏈和輕鏈的可變區(qū)由對(duì)應(yīng)的人可變區(qū)置換的轉(zhuǎn)基因小鼠用目標(biāo)抗原(例如，人CTGF)免疫后，獲得表達(dá)抗體的小鼠的淋巴系細(xì)胞，與小鼠骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，由此制作雜交瘤。接著，就是否產(chǎn)生與目標(biāo)抗原特異性地結(jié)合的抗體對(duì)該雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選。在此產(chǎn)生的抗體為具有人抗體的可變區(qū)和小鼠抗體的恒定區(qū)的抗體(也稱為嵌合抗體)。接著，在鑒定出與目標(biāo)抗原特異性地結(jié)合的抗體的情況下，從該雜交瘤細(xì)胞中分離編碼抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)的DNA，將該DNA與編碼期望類別的人抗體重鏈和輕鏈的恒定區(qū)的DNA連接。使如此得到的編碼重鏈和輕鏈的基因在細(xì)胞內(nèi)(例如，CHO細(xì)胞)表達(dá)，產(chǎn)生抗體分子。通過該方法制作的抗體的重鏈和輕鏈為來源于人免疫球蛋白基因的“完全人型”抗體的重鏈和輕鏈。
[0061]本發(fā)明的抗人CTGF抗體可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員基于本申請(qǐng)說明書中公開的、其重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的序列信息，使用該領(lǐng)域中公知的方法容易地制作。本發(fā)明的抗人CTGF抗體可以優(yōu)選將其重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)與人抗體的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)分別連接而以完全人型抗體的形式進(jìn)行制作。具體而言，制作具有編碼本發(fā)明的抗體的重鏈可變區(qū)氨基酸(序列號(hào)10)的堿基序列的重鏈可變區(qū)基因片段和具有編碼本發(fā)明的抗體的輕鏈可變區(qū)氨基酸(序列號(hào)4)的堿基序列的輕鏈可變區(qū)基因片段。然后，將該可變區(qū)基因與人抗體的適當(dāng)類別的恒定區(qū)基因連接而制作完全人型抗體基因。接著，將該抗體基因與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體連接，導(dǎo)入培養(yǎng)細(xì)胞中。最后，對(duì)該培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，可以從培養(yǎng)上清中得到單克隆抗體。
[0062]編碼本發(fā)明的抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基酸的基因片段例如可以基于依據(jù)該重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列而設(shè)計(jì)的堿基序列，利用該領(lǐng)域中公知的基因合成方法進(jìn)行合成。作為這樣的基因合成方法，可以使用W090/07861中記載的抗體基因的合成方法等本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種方法。
[0063]接著，將上述的可變區(qū)基因片段與人抗體的恒定區(qū)基因連接而制作完全人型抗體基因。使用的人抗體的恒定區(qū)可以選擇任何一種亞類的恒定區(qū)(例如，作為重鏈的Y1、Y 2、y3或Y 4、作為輕鏈的λ鏈或K鏈的恒定區(qū))，作為重鏈恒定區(qū)，可以優(yōu)選使用人Igy I，另外，作為輕鏈恒定區(qū)，可以優(yōu)選使用人IgK。
[0064]對(duì)于在該完全人型抗體基因的制作之后的抗體基因向表達(dá)載體中的導(dǎo)入、表達(dá)載體向培養(yǎng)細(xì)胞中的導(dǎo)入、培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)、抗體的純化等，可以使用該領(lǐng)域中公知的各種方法進(jìn)行。
[0065]作為與如上所述得到的抗體基因連接的表達(dá)載體，可以列舉例如GS載體pEE6.4、pEE12.4(Lonza Biologies公司)，只要是能夠表達(dá)抗體基因的表達(dá)載體，則沒有特別限制。另外，也可以利用AG-Y 1、AG-κ (例如，參考W094/20632)等預(yù)先具有人Ig恒定區(qū)基因的表達(dá)載體。
[0066]上述的表達(dá)載體通過例如磷酸鈣法、電穿孔法等被導(dǎo)入培養(yǎng)細(xì)胞中。
[0067]作為導(dǎo)入表達(dá)載體的培養(yǎng)細(xì)胞，可以使用例如CHO-KlSV細(xì)胞、CH0-DG44細(xì)胞、293細(xì)胞等培養(yǎng)細(xì)胞，將其通過常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)即可。
[0068]上述培養(yǎng)后，蓄積在培養(yǎng)上清中的抗體可以通過各種柱層析、例如使用蛋白A柱或蛋白G柱的各種層析進(jìn)行純化。
[0069]本發(fā)明的抗人CTGF抗體為與人CTGF結(jié)合的抗體。作為測定所得到的抗人CTGF抗體對(duì)人CTGF的結(jié)合活性的方法，有ELISA、表面等離子共振(SPR)分析等方法。例如，在使用ELISA的情況下，將人CTGF(序列號(hào)14)固定在ELISA板上，向其中添加抗人CTGF抗體使其反應(yīng)后，使用辣根過氧化物酶(HRP)等酶標(biāo)記的抗IgG抗體等二次抗體進(jìn)行反應(yīng)，清洗后，加入顯色底物(例如，HRP標(biāo)記的情況下為TMB顯色試劑)，測定吸光度。另外，可以利用SPR分析，更詳細(xì)地測定對(duì)人CTGF的結(jié)合活性。在進(jìn)行SPR分析的情況下，例如，可以通過使用Biacore系統(tǒng)測定抗人CTGF抗體與人CTGF的結(jié)合速率常數(shù)(ka)和解離速率常數(shù)(kd)，由2個(gè)常數(shù)的比算出解離常數(shù)(KD)。本發(fā)明的抗人CTGF抗體中也包括與來源于其它動(dòng)物的CTGF(例如，小鼠CTGF)結(jié)合的抗體，也可以測定對(duì)這些蛋白質(zhì)的結(jié)合活性。
[0070]另外，本發(fā)明的抗人CTGF抗體對(duì)人CTGF具有中和活性。在本說明書中使用的情況下，抗體的“中和活性”是指通過與CTGF結(jié)合，抑制介由CTGF所帶來的任意生物活性的活性，可以將CTGF的I個(gè)或多個(gè)生物活性作為指標(biāo)來進(jìn)行評(píng)價(jià)。作為這樣的中和活性，可以列舉例如腎來源的成纖維細(xì)胞中的膠原蛋白合成抑制(纖維化抑制)作用，可以通過使用后述實(shí)施例中記載的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。
[0071]為了更詳細(xì)地評(píng)價(jià)本發(fā)明的抗人CTGF抗體的效果，也可以使用抗體的體內(nèi)藥效試驗(yàn)。例如，可以通過后述實(shí)施例中記載的使用小鼠慢性腎病模型、大鼠腎炎模型的腎功能評(píng)價(jià)來評(píng)價(jià)抗體在體內(nèi)的藥效。
[0072]此外，作為評(píng)價(jià)本發(fā)明的抗人CTGF抗體的各種穩(wěn)定性(例如，熱穩(wěn)定性、長期保存穩(wěn)定性、高濃度穩(wěn)定性)的方法，可以列舉例如利用差示掃描量熱測定、保存中凝集體形成測定的方法。
[0073]本發(fā)明的抗人CTGF抗體可以優(yōu)選通過如下方法容易地獲得:使用該領(lǐng)域中公知的方法，合成包含編碼序列號(hào)10所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列的堿基序列的DNA和包含編碼序列號(hào)4所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列的堿基序列的DNA，將這些DNA與適當(dāng)類別的人抗體恒定區(qū)基因、對(duì)于重鏈而言優(yōu)選人Ig Y I恒定區(qū)基因、對(duì)于輕鏈而言優(yōu)選人IgK恒定區(qū)基因連接，構(gòu)建完全人型抗體基因，使用該領(lǐng)域中公知的各種方法，將該完全人型抗體基因?qū)氡磉_(dá)載體，將該表 達(dá)載體導(dǎo)入培養(yǎng)細(xì)胞并對(duì)該培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，從所得到的培養(yǎng)物中純化抗體。包含編碼序列號(hào)10所示的重鏈可變區(qū)氨基酸序列的堿基序列的DNA優(yōu)選包含序列號(hào)9所示的堿基序列。包含編碼序列號(hào)4所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列的堿基序列的DNA優(yōu)選包含序列號(hào)3所示的堿基序列。
[0074]包含序列號(hào)10所示的重鏈可變區(qū)和人Ig Y I恒定區(qū)的本發(fā)明的優(yōu)選的抗人CTGF抗體重鏈為由序列號(hào)12所示的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈。包含序列號(hào)4所示的輕鏈可變區(qū)和人Ig K恒定區(qū)的本發(fā)明的優(yōu)選的抗人CTGF抗體輕鏈為由序列號(hào)8所示的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈。包含編碼由序列號(hào)12所示的氨基酸序列構(gòu)成的抗人CTGF抗體重鏈的堿基序列的DNA優(yōu)選包含序列號(hào)11所示的堿基序列。包含編碼由序列號(hào)8所示的氨基酸序列構(gòu)成的抗人CTGF抗體輕鏈的堿基序列的DNA優(yōu)選包含序列號(hào)7所示的堿基序列。作為包含由序列號(hào)12所示的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈和由序列號(hào)8所示的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈的本發(fā)明的抗人CTGF抗體，可以列舉后述實(shí)施例中記載的完全人型37-45-MH1。
[0075]本發(fā)明也包括含有包含由序列號(hào)10的第31~35位的氨基酸序列構(gòu)成的⑶R1、由序列號(hào)10的第50~66位的氨基酸序列構(gòu)成的⑶R2、由序列號(hào)10的第99~108位的氨基酸序列構(gòu)成的CDR3的重鏈可變區(qū)和包含由序列號(hào)4的第24~35位的氨基酸序列構(gòu)成的⑶R1、由序列號(hào)4的第51~57位的氨基酸序列構(gòu)成的⑶R2、由序列號(hào)4的第90~98位的氨基酸序列構(gòu)成的CDR3的輕鏈可變區(qū)的抗人CTGF抗體。這樣的抗人CTGF抗體也可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員按照前述的步驟容易地制作。
[0076]本發(fā)明也包含含有本發(fā)明的抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)且保持活性的單鏈可變區(qū)片段(scFv)、Fab、Fab’、F(ab’)2等抗人CTGF抗體片段。另外,本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以基于本發(fā)明制作該抗人CTGF抗體或抗體片段與其他肽或蛋白質(zhì)的融合抗體，或者制作結(jié)合有修飾劑的修飾抗體。用于融合的其他肽或蛋白質(zhì)只要不會(huì)使抗體的結(jié)合活性降低，則沒有特別限定，可 以列舉例如:人血清白蛋白、各種標(biāo)簽肽、人工螺旋基序肽、麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、各種毒素、其他能夠促進(jìn)多聚體化的肽或蛋白質(zhì)等。用于修飾的修飾劑只要不會(huì)使抗體的結(jié)合活性降低，則沒有特別限定，可以列舉例如:聚乙二醇、糖鏈、磷脂、核糖體、低分子化合物等。
[0077]如此得到的本發(fā)明的抗人CTGF抗體根據(jù)需要純化后，按照常規(guī)方法制劑化，可以用于慢性腎病、糖尿病性腎病等腎疾病、血管增生性疾病、心肌病、肝臟的纖維增生疾病、肺纖維化病、皮膚纖維化疾病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、癌癥等CTGF參與病態(tài)形成的疾病的預(yù)防、治療。
[0078]本發(fā)明的抗人CTGF抗體可以優(yōu)選作為腎疾病治療劑使用，更優(yōu)選作為慢性腎病或糖尿病性腎病的治療劑使用。作為這些治療劑等的劑型的例子，可以為注射劑、點(diǎn)滴用劑等非口服制劑，優(yōu)選通過靜脈內(nèi)給藥、皮下給藥等進(jìn)行給藥。另外，制劑化時(shí)，可以在藥學(xué)上允許的范圍內(nèi)使用與這些劑型相應(yīng)的載體、添加劑。
[0079]上述制劑化時(shí)的本發(fā)明的抗人CTGF抗體的添加量根據(jù)患者的癥狀的程度和年齡、使用的制劑的劑型或抗體的結(jié)合效價(jià)等而異，例如，可以使用約0.00 lmg/kg至約100mg/kg。
[0080]本發(fā)明還提供包含編碼本發(fā)明的抗人CTGF抗體的序列的多核苷酸和包含該多核苷酸的表達(dá)載體。本發(fā)明還提供包含編碼本發(fā)明的抗人CTGF抗體的重鏈可變區(qū)的序列的多核苷酸、包含編碼本發(fā)明的抗CTGF抗體的輕鏈可變區(qū)的序列的多核苷酸、以及包含這些多核苷酸中的任意一者或兩者的表達(dá)載體。本發(fā)明的表達(dá)載體只要能夠在原核細(xì)胞和/或真核細(xì)胞的各種宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼本發(fā)明的抗體或其重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)的基因并且能夠產(chǎn)生這些多肽，則沒有特別限制?？梢粤信e例如:質(zhì)粒載體、病毒載體(例如，腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒)等。本發(fā)明的表達(dá)載體優(yōu)選含有上述的包含編碼本發(fā)明的抗體的重鏈或輕鏈的序列的多核苷酸，或者含有包含編碼本發(fā)明的抗體的重鏈的序列的多核苷酸和包含編碼本發(fā)明的抗體的輕鏈的序列的多核苷酸這兩者。
[0081 ] 本發(fā)明的表達(dá)載體可以含有以能夠工作的方式與編碼本發(fā)明的抗人CTGF抗體或其重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)的基因連接的啟動(dòng)子。作為用于在細(xì)菌中表達(dá)編碼本發(fā)明的抗體或其重鏈 可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)的基因的啟動(dòng)子，在宿主為埃希氏菌屬菌的情況下，可以列舉例如:Trp啟動(dòng)子、Iac啟動(dòng)子、recA啟動(dòng)子、λ PL啟動(dòng)子、Ipp啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子等。作為用于在酵母中表達(dá)的啟動(dòng)子，可以列舉例如:PH05啟動(dòng)子、PGK啟動(dòng)子、GAP啟動(dòng)子、ADH啟動(dòng)子，作為用于在芽孢桿菌屬菌中表達(dá)的啟動(dòng)子，可以列舉:SL01啟動(dòng)子、SP02啟動(dòng)子、penP啟動(dòng)子等。另外，在宿主為哺乳動(dòng)物細(xì)胞等真核細(xì)胞的情況下，可以列舉:來源于SV40的啟動(dòng)子、逆轉(zhuǎn)錄病毒的啟動(dòng)子、熱休克啟動(dòng)子等。
[0082]在使用細(xì)菌、特別是大腸桿菌作為宿主細(xì)胞的情況下，本發(fā)明的表達(dá)載體可以進(jìn)一步包含起始密碼子、終止密碼子、終止子區(qū)和可復(fù)制單元。另一方面，在使用酵母、動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞作為宿主的情況下，本發(fā)明的表達(dá)載體可以包含開始密碼子、終止密碼子。另外，該情況下，可以包含增強(qiáng)子序列、編碼本發(fā)明的抗體或其重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的基因的5’側(cè)和3’側(cè)的非翻譯區(qū)、分泌信號(hào)序列、剪接部、多聚腺苷酸化位點(diǎn)或可復(fù)制單元等。另外，根據(jù)目的，可以包含通常使用的選擇標(biāo)記(例如，四環(huán)素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因、二氫葉酸還原酶基因)。
[0083]本發(fā)明還提供導(dǎo)入了編碼本發(fā)明的抗體或其重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)的基因的轉(zhuǎn)化體。這樣的轉(zhuǎn)化體例如可以通過使用本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞而制作。作為用于制作轉(zhuǎn)化體的宿主細(xì)胞，只要適合上述的表達(dá)載體且能夠被轉(zhuǎn)化，則沒有特別限定，可以例示本發(fā)明的【技術(shù)領(lǐng)域】中通常使用的天然細(xì)胞或人工建立的細(xì)胞等各種細(xì)胞(例如，細(xì)菌(埃希氏菌屬菌、芽孢桿菌屬菌)、酵母(酵母屬、畢赤酵母屬等)、動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞(例如，Sf9)等)。轉(zhuǎn)化可以通過本身公知的方法進(jìn)行。
[0084]本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體優(yōu)選為使用含有包含編碼本發(fā)明的抗體的重鏈可變區(qū)的序列的多核苷酸和包含編碼本發(fā)明的抗體的輕鏈可變區(qū)的序列的多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞，或者使用含有包含編碼本發(fā)明的抗體的重鏈可變區(qū)的序列的多核苷酸的表達(dá)載體和含有包含編碼本發(fā)明的抗體的輕鏈可變區(qū)的序列的多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體更優(yōu)選為使用含有上述的包含編碼本發(fā)明的抗體的重鏈的序列的多核苷酸和包含編碼本發(fā)明的抗體的輕鏈的序列的多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化后宿主細(xì)胞，或者使用含有上述的包含編碼本發(fā)明的抗體的重鏈的序列的多核苷酸的表達(dá)載體和含有包含編碼本發(fā)明的抗體的輕鏈的序列的多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞。
[0085]本發(fā)明還提供包括使編碼本發(fā)明的抗體或其重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)的基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的步驟，即，使用這種轉(zhuǎn)化體的步驟的本發(fā)明的抗人CTGF抗體的生產(chǎn)方法。在該方法中使用的宿主細(xì)胞優(yōu)選為使用上述的本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞，該表達(dá)載體可以分開或同時(shí)含有包含編碼本發(fā)明的抗體的重鏈可變區(qū)的序列的多核苷酸和包含編碼本發(fā)明的抗體的輕鏈可變區(qū)的序列的多核苷酸。
[0086]在本發(fā)明的抗人CTGF抗體的生產(chǎn)中，轉(zhuǎn)化體可以在營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。營養(yǎng)培養(yǎng)基優(yōu)選含有轉(zhuǎn)化體的生長所需的碳源、無機(jī)氮源或有機(jī)氮源。作為碳源，可以例示例如:葡萄糖、右旋糖酐、可溶性淀粉、蔗糖等，作為無機(jī)氮源或有機(jī)氮源，可以例示例如:銨鹽類、硝酸鹽類、氨基酸、玉米浸液、蛋白胨、酪蛋白、肉浸膏、大豆柏、馬鈴薯提取液等。另外，可以根據(jù)期望含有其他營養(yǎng)素(例如，無機(jī)鹽(例如，氯化鈣、磷酸二氫鈉、氯化鎂)、維生素類、抗生素(例如，四環(huán)素、新霉素、氨芐青霉素、卡那霉素等)等)。
[0087]轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)可以通過本身公知的方法進(jìn)行。適當(dāng)選擇培養(yǎng)條件，例如溫度、培養(yǎng)基的PH和培養(yǎng)時(shí)間。例如，在宿主為動(dòng)物細(xì)胞的情況下，作為培養(yǎng)基，可以使用含有約5~20 %的胎牛血清的MEM培養(yǎng)基(Science, Vol.122，p.501, 1952)、DMEM 培養(yǎng)基(Virology, Vol.8，p.396，1959)、RPMI1640 培養(yǎng)基(J.Am.Med.Assoc.，Vol.199，p.519，1967)、199 培養(yǎng)基(proc.Soc.Exp.Biol.Med.，Vol.73，p.1, 1950)等。培養(yǎng)基的pH優(yōu)選為約6~約8，培養(yǎng)通常在約30°C~約40°C進(jìn)行約15小時(shí)~約72小時(shí)，根據(jù)需要也可以進(jìn)行通氣或攪拌。在宿主為昆蟲細(xì)胞的情況下，可以列舉例如含有胎牛血清的 Grace’ s 培養(yǎng)基(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, Vol.82, p.8404, 1985)等，其 pH 優(yōu)選為約5~約8。培養(yǎng)通常在約20°C~約40°C進(jìn)行15~100小時(shí)，根據(jù)需要也可以進(jìn)行通氣或攪拌。在宿主為細(xì)菌、放線菌、酵母、絲狀菌的情況下，例如，含有上述營養(yǎng)源的液體培養(yǎng)基是適當(dāng)?shù)?。?yōu)選PH為5~8的培養(yǎng)基。在宿主為大腸桿菌的情況下，作為優(yōu)選的培養(yǎng)基，可以例不 LB 培養(yǎng)基、M9 培養(yǎng)基(Miller 等、Exp.Mol.Genet, Cold Spring HarborLaboratory, p.431, 1972)等。在該情況下，培養(yǎng)可以根據(jù)需要在通氣、攪拌的同時(shí),通常在14~43°C進(jìn)行約3小時(shí)~約24小時(shí)。在宿主為芽孢桿菌屬菌的情況下，可以根據(jù)需要在通氣、攪拌的同時(shí)，通常在30~40°C進(jìn)行約16小時(shí)~約96小時(shí)。在宿主為酵母的情況下，作為培養(yǎng)基，可以列舉例如Burkholder基本培養(yǎng)基(Bostian, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, Vol.77，p.4505, 1980)，優(yōu)選pH為5~8。培養(yǎng)通常在約20°C~約35°C進(jìn)行約14小時(shí)~約144小時(shí)，根據(jù)需要也可以進(jìn)行通氣或攪拌。
[0088]本發(fā)明的抗人CTGF抗體可以通過對(duì)上述的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)而從該轉(zhuǎn)化體中回收，優(yōu)選進(jìn)行分離、純化。作為分離、純化方法，可以列舉例如:鹽析、溶劑沉淀法等利用溶解度的方法、透析、超速過濾、凝膠過濾、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳等利用分子量差異的方法、離子交換色譜、羥磷灰石色譜等利用帶電的方法、親和色譜等利用特異親和性的方法、反相高效液相色譜等利用疏水性差異的方法、等電點(diǎn)電泳等利用等電點(diǎn)差異的方法等。
[0089]對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了全面記載，為了獲得進(jìn)一步的理解，在此提供參考的特定實(shí)施例，但這些實(shí)施例的目的在于例示，并不用于限定本發(fā)明。
[0090]實(shí)施例
[0091]對(duì)于使用市售的試劑盒或試劑等的部分，若無特別說明，則按照附屬的操作說明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0092](實(shí)施例1:各種來源的CTGF蛋白質(zhì)的獲得)
[0093] 本發(fā)明人獲得了人CTGF蛋白質(zhì)作為用于制作抗CTGF抗體的抗原。將人CTGF的全長基因(序列號(hào)13)整合入表達(dá)載體(pcDNA3.1 ;Invitrogen公司)中，將制成的載體使用作為基因?qū)朐噭┑?FreeStyle MAX Reagent (Invitrogen 公司)對(duì) FreeStyle293細(xì)胞(Invitrogen公司)進(jìn)行基因?qū)?。將該?xì)胞在使用FreeStyle293表達(dá)培養(yǎng)基(Invitrogen公司)的無血清培養(yǎng)體系中培養(yǎng)后，獲得了含有人CTGF蛋白質(zhì)的培養(yǎng)上清。使用HiTrap肝素柱和CM柱(GE醫(yī)療日本公司)從獲得的培養(yǎng)上清中純化蛋白質(zhì)，將其用于以下的實(shí)驗(yàn)。對(duì)于小鼠、大鼠和猴CTGF蛋白質(zhì)，也使用同樣的方法獲得。
[0094](實(shí)施例2:對(duì)VelocImmune小鼠的免疫)
[0095]通過對(duì)Veloclmmune小鼠進(jìn)行免疫，獲得抗人CTGF的抗體。為了提高所得到的抗體的多樣性，本發(fā)明人對(duì)多種免疫方法、給藥途徑、佐劑、免疫期間等進(jìn)行了研究。作為免疫原，使用純化的人CTGF，與佐劑混合后進(jìn)行免疫。作為給藥途徑，對(duì)足底給藥和腹腔內(nèi)給藥進(jìn)行了研究。作為佐劑，對(duì)TiterMax Gold(CytRx公司)、完全弗氏佐劑(Sigma公司)和不完全弗氏佐劑(Sigma公司)進(jìn)行了研究。作為進(jìn)一步添加的免疫激活劑，對(duì)CpG寡核苷酸和磷酸鋁凝膠(BRENNTAG公司)進(jìn)行了研究。作為免疫期間，對(duì)3周~14周進(jìn)行了研究。數(shù)次免疫后，從小鼠尾靜脈進(jìn)行采血，監(jiān)測效價(jià)，由此進(jìn)行產(chǎn)生與人CTGF結(jié)合的抗體的VelocImmune小鼠的選擇。
[0096]效價(jià)測定使用以下的標(biāo)準(zhǔn)ELISA方法進(jìn)行測定。向Maxisorp384孔板(Nunc公司)中添加20 μ L人CTGF的磷酸緩沖生理鹽水(PBS)溶液(I μ g/mL)，在4°C孵育過夜進(jìn)行固相化。次日，使用100 μ L清洗液(TBST:含有0.05% Tween-20的Tris緩沖液)將板清洗I次后，添加100 μ L封閉劑(含有I % BSA的PBS)，在室溫靜置I小時(shí)。使用100 μ L TBST清洗液清洗I次后，制作采血得到的血漿的稀釋系列并添加。在室溫孵育I小時(shí)后，使用100 μ L TBST清洗液清洗3次，添加20 μ L使用含有0.1 % BSA的TBST清洗液稀釋5000倍的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體(HRP-goat ant1-mouse IgG antibody ；Zymed公司)。在室溫孵育I小 時(shí)后，使用100 μ L TBST清洗液清洗3次。加入40 μ L TMB顯色試劑(住友酚醛塑料株式會(huì)社)，在室溫靜置10分鐘后，加入40 μ L終止液(2mol/L硫酸)使反應(yīng)停止，測定450nm的吸光度。
[0097](實(shí)施例3:產(chǎn)生抗人CTGF抗體的雜交瘤的制作)
[0098]對(duì)確認(rèn)抗體效價(jià)的上升后選擇出的小鼠進(jìn)行最終免疫(抗原的靜脈內(nèi)施用或腹腔內(nèi)施用)。按照常規(guī)方法，摘除免疫后的小鼠的脾臟、淋巴結(jié)等，收集淋巴細(xì)胞，將其與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合，由此制作雜交瘤。對(duì)雜交瘤進(jìn)行有限稀釋，在得到單一克隆的基礎(chǔ)上，使用蛋白A或蛋白G柱(GE醫(yī)療日本公司)從上清中純化抗體。
[0099](實(shí)施例4=ELISA檢測)
[0100]本發(fā)明人使用ELISA方法對(duì)抗體與CTGF的結(jié)合特異性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。向Maxisorp384孔板(Nunc公司)中添加20 μ L人CTGF的PBS溶液(I μ g/mL)，在4°C孵育過夜進(jìn)行固相化。次日，使用100 μ L清洗液(TPBS:含有0.05% Tween-20的PBS)將板清洗I次后，添加100 μ L封閉劑(含有I % BSA的PBS)，在室溫靜置I小時(shí)。使用100 μ L TBST清洗液清洗I次后，將純化抗體樣品制成適當(dāng)稀釋系列并添加。在室溫孵育I小時(shí)后，使用100 μ L TBST清洗液清洗3次，添加20 μ L使用含有0.1 % BSA的TBST清洗液稀釋5000倍的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體(HRP-goat ant1-mouse IgG antibody ；Zymed公司)。在室溫孵育I小時(shí)后，使用100 μ L TBST清洗液清洗3次。加入40 μ L TMB顯色試劑(住友酚醛塑料株式會(huì)社)，在室溫靜置10分鐘后，加入40 μ L終止液(2mol/L硫酸)使反應(yīng)停止,測定450nm的吸光度。使用復(fù)孔對(duì)各抗體進(jìn)行試驗(yàn),通過曲線擬合分析EC50。
[0101]其結(jié)果，確認(rèn)命名為37-45的抗體具有高結(jié)合活性(EC50:1.6ng/ml)。
[0102](實(shí)施例5:抗體的序列確定)
[0103]對(duì)于鑒定出的抗體37-45，本發(fā)明人從雜交瘤中克隆了編碼抗體的重鏈和輕鏈的基因。從雜交瘤中提取RNA，使用cDNA擴(kuò)增試劑盒(SMARTer RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒；Clontech公司)制作cDNA。接著，使用PCR，對(duì)重鏈和輕鏈的可變區(qū)進(jìn)行延伸和擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物重組入pCR3.1-TOPOdnvitrogen公司)等PCR產(chǎn)物亞克隆用載體后，使用測序儀(ABI PRISM3100 ;應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)鑒定基因序列。
[0104]將鑒定的37-45的重鏈可變區(qū)的堿基序列示于序列號(hào)I中，將氨基酸序列示于序列號(hào)2中，將37-45的輕鏈可變區(qū)的堿基序列示于序列號(hào)3中，將氨基酸序列示于序列號(hào)4中。
[0105](實(shí)施例6:完全人型抗體的制作)
[0106]上述抗體為可變區(qū)來源于人、恒定區(qū)來源于小鼠的抗體。因此，本發(fā)明人將來源于小鼠的恒定區(qū)置換成來源于人的恒定區(qū)，制作成完全人型抗體(完全人型37-45)。具體而言，在抗體的重鏈可變區(qū)基因的5’側(cè)連接信號(hào)序列，然后在3’側(cè)連接人Ig Y I的恒定區(qū)基因(Man Sung Co 等，(1992) J Immunol.Vol.148(4): 1149-1154)，將該重鏈基因插入 GS 載體(Lonza Biologies公司)pEE6.4中。插入時(shí)，將基因中的限制酶BbvCI識(shí)別位點(diǎn)改變成對(duì)抗體的氨基酸序列沒有影響的DNA序列。另外，在抗體的輕鏈可變區(qū)基因的5’側(cè)連接信號(hào)序列，然后在3’側(cè)連接人K鏈的恒定區(qū)基因(Man Sung Co等，出處同上)，將該輕鏈基因插入GS載體ρΕΕ12.4中。
[0107]將制成的完全人型37-45的重鏈的堿基序列示于序列號(hào)5中，將氨基酸序列示于序列號(hào)6中，將該抗體的輕鏈的堿基序列示于序列號(hào)7中，將氨基酸序列示于序列號(hào)8中。
[0108](實(shí)施例7:可變區(qū)的糖鏈修飾位點(diǎn)的突變體制作)
[0109]上述的完全人型37-45的重鏈可變區(qū)氨基酸包含N-X-(T/S)的N型糖鏈修飾基序序列。具體而言，序列號(hào)2所示的重鏈可變區(qū)中的、基于Kabat編號(hào)的58位的Asn相當(dāng)于糖鏈修飾位點(diǎn)。如果存在糖鏈修飾位點(diǎn)，則在細(xì)胞培養(yǎng)期間產(chǎn)生向抗體上的糖鏈的添加，已知糖鏈的添加依賴于培養(yǎng)條件、表達(dá)的宿主。即，即使是已建立的同一抗體產(chǎn)生細(xì)胞，糖鏈添加的程度也可能隨培養(yǎng)條件(培養(yǎng)基、細(xì)胞密度等)而改變，可能難以獲得質(zhì)量均勻的抗體藥品。因此，本發(fā)明人制作了在完全人型37-45的重鏈可變區(qū)導(dǎo)入有突變的完全人型抗體(完全人型37-45-MH1)。
[0110]將制成的完全人型37-45-MH1的重鏈可變區(qū)的堿基序列示于序列號(hào)9中，將氨基酸序列示于序列號(hào)10中。將制成的完全人型37-45-MH1的重鏈的堿基序列示于序列號(hào)11中，將氨基酸序列示于序列號(hào)12中。完全人型37-45-MH1的輕鏈與完全人型37-45的輕鏈相同。
[0111]完全人型37-45-MH1抗體的重鏈可變區(qū)的⑶Rl、⑶R2和⑶R3分別為基于Kabat編號(hào)的重鏈可變區(qū)的31~35位、50~65位和95~102位的區(qū)域，分別由序列號(hào)10的31~35位、50~66位和99~108位的氨基酸序列構(gòu)成。完全人型37-45-MH1抗體的輕鏈可變區(qū)的⑶R1XDR2和⑶R3分別 為基于Kabat編號(hào)的輕鏈可變區(qū)的24~34位、50~56位和89~97位的區(qū)域,分別由序列號(hào)4的24~35位、51~57位和90~98位的氨基酸序列構(gòu)成。
[0112](實(shí)施例8:完全人型抗體的表達(dá)和純化)
[0113]將分別插入有上述各抗體(完全人型37-45和完全人型37-45-MH1)的重鏈和輕鏈的基因的上述GS載體使用NotI和PvuI進(jìn)行限制酶切割，使用Ligation-Convenience試劑盒(NIPPONGENE公司)或Ligation-high(東洋紡公司)進(jìn)行連接，構(gòu)建插入有重鏈和輕鏈兩種基因的GS載體。該載體編碼全長的重鏈、輕鏈和谷氨酰胺合成酶(Glutaminesynthetase)，通過轉(zhuǎn)染到CHO-KlSV細(xì)胞中使其表達(dá)抗體。使用蛋白A或蛋白G柱(GE醫(yī)療日本公司)純化培養(yǎng)上清，得到各完全人型抗體的純化抗體。
[0114](實(shí)施例9:完全人型抗體的ELISA檢測)
[0115]本發(fā)明人使用ELISA方法對(duì)上述實(shí)施例中制作的完全人型37-45和完全人型37-45-MH1與人、小鼠、大鼠和猴CTGF的結(jié)合特異性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。在此，使用與實(shí)施例4所述的方法同樣的方法，但作為二次抗體，使用以含有0.1 % BSA的TBST清洗液稀釋5000倍的辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗人IgG抗體(HRP-rabbit ant1-human IgG antibody ;丹科公司)。使用復(fù)孔對(duì)各抗體進(jìn)行試驗(yàn)，通過曲線擬合分析EC50。
[0116]其結(jié)果可知，任何一種完全人型抗體對(duì)人、小鼠、大鼠和猴CTGF均具有相同程度的結(jié)合能力。
[0117]表1:完全人型抗體對(duì)各種CTGF的結(jié)合活性
[0118]
【權(quán)利要求】
1.一種抗人CTGF抗體，其包含由序列號(hào)10所示的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈可變區(qū)和由序列號(hào)4所示的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈可變區(qū)。
2.如權(quán)利要求1所述的抗人CTGF抗體，其中，所述抗體的重鏈恒定區(qū)為人IgY I恒定區(qū)。
3.如權(quán)利要求1所述的抗人CTGF抗體，其中，所述抗體的輕鏈恒定區(qū)為人IgK恒定區(qū)。
4.如權(quán)利要求1所述的抗人CTGF抗體，其中，所述抗體的重鏈恒定區(qū)為人IgYI恒定區(qū)，所述抗體的輕鏈恒定區(qū)為人IgK恒定區(qū)。
5.如權(quán)利要求1所述的抗人CTGF抗體，其包含由序列號(hào)12所示的氨基酸序列構(gòu)成的重鏈和由序列號(hào)8所示的氨基酸序列構(gòu)成的輕鏈。
6.一種多核苷酸，其包含編碼權(quán)利要求1所述的抗體的重鏈可變區(qū)的序列。
7.一種多核苷酸，其包含編碼權(quán)利要求1所述的抗體的輕鏈可變區(qū)的序列。
8.—種表達(dá)載體,其包含權(quán)利要求6和/或7所述的多核苷酸。
9.一種經(jīng)權(quán)利要求8所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求9所述的宿主細(xì)胞，其選自由以下的(a)和(b)組成的組: (a)經(jīng)含有包含編碼權(quán)利要求1所述的抗體的重鏈可變區(qū)的序列的多核苷酸和包含編碼該抗體的輕鏈可變區(qū)的序列的多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；和 (b)經(jīng)含有包含編碼權(quán)利 要求1所述的抗體的重鏈可變區(qū)的序列的多核苷酸的表達(dá)載體和含有包含編碼該抗體的輕鏈可變區(qū)的序列的多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
11.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1所述的抗人CTGF抗體的方法，其包含對(duì)權(quán)利要求9或10所述的宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)以使其表達(dá)抗人CTGF抗體的步驟。
【文檔編號(hào)】C07K16/22GK104011206SQ201280063995
【公開日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2012年12月21日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月22日
【發(fā)明者】巖崎正司, 守屋隆一, 吉野正康, 高倉浩二 申請(qǐng)人:安斯泰來制藥株式會(huì)社