陽(yáng)離子性脂質(zhì)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種使得能容易地將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的陽(yáng)離子性脂質(zhì)、含有該陽(yáng)離子性脂質(zhì)及核酸的組合物、使用含有該陽(yáng)離子性脂質(zhì)及核酸的組合物將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的方法等，所述陽(yáng)離子性脂質(zhì)由式(I)表示，式中，R1及R2相同或不同，為鏈烯基等，X1及X2為氫原子、或者連接在一起形成單鍵或亞烷基，X3不存在或者為烷基等，Y不存在或者為陰離子，a及b相同或不同，為0～3，L3為單鍵等，R3為烷基等，L1及L2為-O-、-CO-O-或者-O-CO-。
【專利說(shuō)明】陽(yáng)離子性脂質(zhì)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及使得能容易地將核酸導(dǎo)入例如細(xì)胞內(nèi)等的新型陽(yáng)離子性脂質(zhì)及含有 該陽(yáng)離子性脂質(zhì)的新型組合物等。

【背景技術(shù)】
[0002] 所謂陽(yáng)離子性脂質(zhì)，為下述兩親性分子，具有含有一個(gè)或者多個(gè)烴基的脂質(zhì)親和 性區(qū)域、和含有至少帶一個(gè)正電的極性頭基（headgroup)的親水性區(qū)域。陽(yáng)離子性脂質(zhì)與 核酸等巨大分子通過(guò)形成以總電荷計(jì)帶正電的復(fù)合體，使得核酸等巨大分子容易通過(guò)細(xì)胞 的原生質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，因此陽(yáng)離子性脂質(zhì)是有用的。能夠在體外及體內(nèi)進(jìn)行的該過(guò)程作 為轉(zhuǎn)染被人們知曉。
[0003] 典型地，陽(yáng)離子性脂質(zhì)單獨(dú)使用或者與磷脂等中性脂質(zhì)組合。已知陽(yáng)離子性脂質(zhì) 與中性脂質(zhì)組合，能夠容易地形成含有整齊排列的脂雙層膜的小泡，因此這樣的組合是有 用的。陽(yáng)離子性脂質(zhì)單獨(dú)或者與中性脂質(zhì)組合形成的小泡、或者脂質(zhì)體在表面具有多個(gè)正 電荷，通過(guò)該電荷，能夠與多核苷酸或者帶負(fù)電的蛋白質(zhì)等其他陰離子性分子形成復(fù)合體。 通過(guò)多核苷酸/陽(yáng)離子性脂質(zhì)/中性脂質(zhì)復(fù)合體的表面上殘留的總陽(yáng)離子電荷，能夠與細(xì) 胞膜表面的主要的負(fù)電荷引起很強(qiáng)的相互反應(yīng)。
[0004] 大量的不同種類的陽(yáng)離子性脂質(zhì)為了用于轉(zhuǎn)染而被合成，目前已有市售。上述陽(yáng) 離子性脂質(zhì)包括例如 Lipofectin、Lipofectin ACE、Lipofect AMINE、Transfeactam、D0TAP 等。
[0005] 專利文獻(xiàn)1中公開的、N-[l-(2,3-二油基氧基）丙基]-N，N，N-三甲基氯化 銨（D0TMA)等為當(dāng)初開發(fā)的陽(yáng)離子性脂質(zhì)之一。D0TMA等的特征在于，向分子賦予陽(yáng)離 子部位的、具有季氮的丙銨基（propanaminium group)及與分子的丙基骨架形成醚鍵的 一對(duì)高級(jí)烴。季氮被甲基等鏈比較短的烷基鏈三取代。結(jié)構(gòu)上類似的陽(yáng)離子性脂質(zhì)、 N-(2,3-二-(9-(Z)_十八碳烯?；趸?丙烷-1-基-N，N，N-三甲基氯化銨（D0TAP)不 含形成了醚鍵的烷基，而含有?；?。
[0006] 專利文獻(xiàn)2及3中公開的、例如N-[l-(2, 3-二油基氧基丙基）]-N，N_二甲 基-N-羥基乙基溴化銨（D0RIE)、2, 3-二油基氧基-N-[2-(精胺羧基酰胺）乙基]-N，N-二 甲基-1-丙銨基三氟乙酸（D0SPA)等的特征在于，向分子賦予陽(yáng)離子部位的、具有季氮的丙 銨基及與分子的丙基骨架形成醚鍵的一對(duì)高級(jí)烴，并且特征在于，季氮被甲基等鏈比較短 的烷基鏈和羥基烷基三取代。
[0007] 專利文獻(xiàn)4中公開了例如1,2-二亞油基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷（DLinDMA) 等。DLinDMA等的特征在于，出于開發(fā)更柔軟的陽(yáng)離子性脂質(zhì)、并且由此提高脂質(zhì)體等的膜 流動(dòng)性的目的，使結(jié)構(gòu)上類似的陽(yáng)離子性脂質(zhì)即D0TAP及D0TMA的高級(jí)烷基為至少具有2 處不飽和部位的高級(jí)烷基。另外，專利文獻(xiàn)5中公開了例如2, 2-二亞油基-4-二甲基氨基 甲基-[1，3]_ 二氧戊環(huán)（DLin-K-DMA)等。
[0008] 專利文獻(xiàn)1 :日本特開昭61-161246號(hào)公報(bào)（美國(guó)專利5049386號(hào)說(shuō)明書）
[0009] 專利文獻(xiàn)2 :國(guó)際公開第91/16024號(hào)小冊(cè)子 [0010] 專利文獻(xiàn)3 :國(guó)際公開第97/019675號(hào)小冊(cè)子 [0011] 專利文獻(xiàn)4 :國(guó)際公開第2005/121348號(hào)小冊(cè)子
[0012] 專利文獻(xiàn)5 :國(guó)際公開第2009/086558號(hào)小冊(cè)子


【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明的目的在于提供一種將核酸容易地導(dǎo)入例如細(xì)胞內(nèi)等的新型陽(yáng)離子性脂 質(zhì)及含有該陽(yáng)離子性脂質(zhì)的新型組合物等。
[0014] 本發(fā)明涉及以下⑴?（27)。
[0015] ⑴式⑴表示的陽(yáng)離子性脂質(zhì)
[0016]

【權(quán)利要求】
1.式（I)表示的陽(yáng)離子性脂質(zhì)，
式中，R1及R2相同或不同，為碳原子數(shù)12?24的直鏈狀或支鏈狀的烷基、鏈烯基或者 炔基，或者R1及R2連接在一起形成二烷基亞甲基、二鏈烯基亞甲基、二炔基亞甲基或烷基鏈 稀基亞甲基， X1及X2為氫原子，或者連接在一起形成單鍵或亞烷基， X3不存在，或者為碳原子數(shù)1?6的烷基或者碳原子數(shù)3?6的鏈烯基， X3不存在時(shí)， Y也不存在，a及b為0, L3為單鍵，R3為碳原子數(shù)1?6的烷基、碳原子數(shù)3?6的鏈 烯基、吡咯烷-3-基、哌啶-3-基、哌啶-4-基或者被相同或不同的1?3個(gè)氨基、單烷基氨 基、二烷基氨基、三烷基銨基、羥基、烷氧基、氨基甲?；?、單烷基氨基甲?；?、二烷基氨基甲 ?；?、吡咯烷基、哌啶基或嗎啉基取代的碳原子數(shù)1?6的烷基或碳原子數(shù)3?6的鏈烯基， L1及L2為-0-,或者 Y也不存在，a及b相同或不同為0?3,并且a和b不同時(shí)為0, L3為單鍵，R3為碳原 子數(shù)1?6的烷基、碳原子數(shù)3?6的鏈烯基、吡咯烷-3-基、哌啶-3-基、哌啶-4-基或者 被相同或不同的1?3個(gè)氨基、單烷基氨基、二烷基氨基、三烷基銨基、羥基、烷氧基、氨基甲 ?；?、單烷基氨基甲酰基、二烷基氨基甲?；?、吡咯烷基、哌啶基或嗎啉基取代的碳原子數(shù) 1?6的烷基或碳原子數(shù)3?6的鏈烯基，L 1及L2相同或不同，為-〇-、-〇)-〇-或者-0-C0-， 或者 Y也不存在，a及b相同或不同為0?3, L3為單鍵，R3為氫原子，L1及L2相同或不同， 為-〇-、-co-ο-或者-0-C0-，或者 Y也不存在，a及b相同或不同，為0?3, L3為-C0-或者-C0-0-，R3為吡咯烷-2-基、 吡咯烷-3-基、哌啶-2-基、哌啶-3-基、哌啶-4-基、嗎啉-2-基、嗎啉-3-基或者被相同或 不同的1?3個(gè)氨基、單烷基氨基、二烷基氨基、三烷基銨基、羥基、烷氧基、氨基甲酰基、單 烷基氨基甲?；?、二烷基氨基甲?；?、吡咯烷基、哌啶基或嗎啉基取代的碳原子數(shù)1?6的 烷基或碳原子數(shù)3?6的鏈烯基，該取代基的至少一個(gè)為氨基、單烷基氨基、二烷基氨基、三 烷基銨基、吡咯烷基、哌啶基或者嗎啉基，L 1及L2相同或不同，為-〇-、-〇)-〇-或者-0-C0-， X3為碳原子數(shù)1?6的烷基或者碳原子數(shù)3?6的鏈烯基時(shí)， Y為制藥上能允許的陰離子，a及b相同或不同，為0?3, L3為單鍵，R3為碳原子數(shù)1? 6的烷基、碳原子數(shù)3?6的鏈烯基、吡咯烷-3-基、哌啶-3-基、哌啶-4-基或者被相同或 不同的1?3個(gè)氨基、單烷基氨基、二烷基氨基、三烷基銨基、羥基、烷氧基、氨基甲酰基、單 烷基氨基甲酰基、二烷基氨基甲酰基、吡咯烷基、哌啶基或嗎啉基取代的碳原子數(shù)1?6的 烷基或碳原子數(shù)3?6的鏈烯基，L 1及L2相同或不同，為-0-、-C0-0-或者-0-C0-。
2. 如權(quán)利要求1所述的陽(yáng)離子性脂質(zhì)，其中，L1及L2為-0-或者-O-CO-，R1及R 2為 十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、二十烷基、二十二烷基、二十四烷基、（Z)_十四 燒 -9_烯基、（Z)-十六燒_9_烯基、（Z)-十八燒_6_烯基、（Z)-十八燒_9_烯基、(E)-十八 烷-9-烯基、（Z)-十八烷-11-烯基、（9Z，12Z)-十八烷-9, 12-二烯基、（9Z，12Z，15Z)-十八 烷-9, 12, 15-三烯基、（Z)-二十烷-11-烯基、（11Z，14Z)-二十烷-11，14-二烯基、 3, 7, 11-三甲基十二烷-2, 6, 10-三烯基或3, 7, 11，15-四甲基十六烷-2-烯基。
3. 如權(quán)利要求1所述的陽(yáng)離子性脂質(zhì)，其中，L1及L2為-C0-0-，R1及R 2為十三烷基、 十五烷基、十七烷基、十九烷基、二i^一烷基、二十三烷基、（Z)-十三烷-8-烯基、（Z)-十五 燒 -8_烯基、（Z)-十七燒_5_烯基、（Z)-十七燒_8_烯基、（E)-十七燒_8_烯基、（Z)-十七 烷-10-烯基、（8Z，11Z)-十七烷-8, 11-二烯基、（8Z，11Z，14Z)-十八烷-8, 11，14-三烯基、 (Z)-十九烷-10-烯基、（10Z，13Z)-十九烷-10, 13-二烯基、（11Z，14Z)-二十烷-11，14-二 烯基、2, 6, 10-三甲基i^一烷-1，5, 9-三烯基或2, 6, 10, 14-四甲基十五烷-1-烯基。
4. 如權(quán)利要求1?3中任一項(xiàng)所述的陽(yáng)離子性脂質(zhì)，其中，a及b同時(shí)為0或者1。
5. 如權(quán)利要求1、2及4中任一項(xiàng)所述的陽(yáng)離子性脂質(zhì)，其中，L3為單鍵，R3為氫原子、 甲基、吡咯烷-3-基、哌啶-3-基、哌啶-4-基或者被相同或不同的1?3個(gè)氨基、單烷基氨 基、二烷基氨基、三烷基銨基、羥基、烷氧基、氨基甲?；?、單烷基氨基甲?；?、二烷基氨基甲 ?；⑦量┩榛?、哌啶基或嗎啉基取代的碳原子數(shù)1?6的烷基或碳原子數(shù)3?6的鏈烯基， L1 及 L2 為-〇_。
6. 如權(quán)利要求1?4中任一項(xiàng)所述的陽(yáng)離子性脂質(zhì)，其中，L3為-C0-或者-C0-0-，R3 為吡咯烷-3-基、哌啶-3-基、哌啶-4-基或者被相同或不同的1?3個(gè)氨基、單烷基氨基、 二烷基氨基、三烷基銨基、羥基、烷氧基、氨基甲?；瓮榛被柞；?、二烷基氨基甲酰 基、吡咯烷基、哌啶基或嗎啉基取代的碳原子數(shù)1?6的烷基或碳原子數(shù)3?6的鏈烯基， 該取代基的至少一個(gè)為氨基、單烷基氨基、二烷基氨基、三烷基銨基、吡咯烷基、哌啶基或嗎 琳基，L 1及L2為相同的-C〇-〇-或者-〇_C〇-。
7. 如權(quán)利要求1?6中任一項(xiàng)所述的陽(yáng)離子性脂質(zhì)，其中，X1及X2連接在一起，形成單 鍵或亞烷基。
8. 如權(quán)利要求1?5中任一項(xiàng)所述的陽(yáng)離子性脂質(zhì)，其中，X1及X2連接在一起形成單 鍵或亞烷基，R 3為氫原子、甲基或者被相同或不同的1?3個(gè)氨基、羥基或氨基甲?；〈?的碳原子數(shù)1?6的烷基或碳原子數(shù)3?6的鏈烯基。
9. 如權(quán)利要求1?5中任一項(xiàng)所述的陽(yáng)離子性脂質(zhì)，其中，X1及X2為氫原子，R3為氫 原子、甲基或者被相同或不同的1?3個(gè)氨基、羥基或氨基甲酰基取代的碳原子數(shù)1?6的 烷基或碳原子數(shù)3?6的鏈烯基。
10. 如權(quán)利要求6所述的陽(yáng)離子性脂質(zhì)，其中，X1及X2連接在一起形成單鍵或亞烷基， R3為被相同或不同的1?3個(gè)氨基、羥基或氨基甲酰基取代的碳原子數(shù)1?6的烷基或碳 原子數(shù)3?6的鏈烯基。
11. 如權(quán)利要求6所述的陽(yáng)離子性脂質(zhì)，其中，X1及X2為氫原子，R3為被相同或不同的 1?3個(gè)氨基、羥基或氨基甲酰基取代的碳原子數(shù)1?6的烷基或碳原子數(shù)3?6的鏈烯 基。
12. 如權(quán)利要求1?11中任一項(xiàng)所述的陽(yáng)離子性脂質(zhì)，其中，X3不存在，或者為甲基。
13. -種組合物，含有權(quán)利要求1?12中任一項(xiàng)所述的陽(yáng)離子性脂質(zhì)及核酸。
14. 如權(quán)利要求13所述的組合物，其中，陽(yáng)離子性脂質(zhì)與該核酸形成復(fù)合體，或者陽(yáng)離 子性脂質(zhì)與中性脂質(zhì)及/或高分子組合得到的產(chǎn)物與該核酸形成復(fù)合體。
15. 如權(quán)利要求13所述的組合物，其中，陽(yáng)離子性脂質(zhì)形成與該核酸的復(fù)合體，或者陽(yáng) 離子性脂質(zhì)與中性脂質(zhì)及/或高分子組合得到的產(chǎn)物與該核酸形成復(fù)合體，所述組合物含 有所述復(fù)合體及封入了所述復(fù)合體的脂質(zhì)膜。
16. 如權(quán)利要求13?15中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，核酸為具有利用了 RNA干擾 (RNAi)的革巴基因的表達(dá)抑制作用的核酸。
17. 如權(quán)利要求16所述的組合物，其中，靶基因?yàn)榕c腫瘤或者炎癥相關(guān)的基因。
18. -種使用權(quán)利要求14?17中任一項(xiàng)所述的組合物將所述核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的方法。
19. 如權(quán)利要求18所述的方法，其中，細(xì)胞為哺乳類的腫瘤或者炎癥部位中的細(xì)胞。
20. 如權(quán)利要求18或者19所述的方法，其中，細(xì)胞為哺乳類的肝臟、肺、腎臟或者脾臟 中的細(xì)胞。
21. 如權(quán)利要求19或者20所述的方法，其中，向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入的方法是通過(guò)靜脈內(nèi)給予 向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入的方法。
22. -種癌或者炎癥疾病的治療方法，將權(quán)利要求17所述的組合物給予至哺乳動(dòng)物。
23. 如權(quán)利要求22所述的方法，其中，給與方法是靜脈內(nèi)給予。
24. -種藥物，含有權(quán)利要求16所述的組合物，用于治療疾病。
25. 如權(quán)利要求24所述的藥物，其中，給予方法是靜脈內(nèi)給予。
26. -種癌或者炎癥疾病的治療劑，含有權(quán)利要求17所述的組合物，用于治療癌或者 炎癥疾病。
27. 如權(quán)利要求26所述的癌或者炎癥疾病的治療劑，其中，給予方法是靜脈內(nèi)給予。
【文檔編號(hào)】C07C217/08GK104066712SQ201280065699
【公開日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2012年11月2日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月2日
【發(fā)明者】洼山剛之, 江良公宏, 直井智幸, 八木信宏 申請(qǐng)人:協(xié)和發(fā)酵麒麟株式會(huì)社