專利名稱：制備恩拉霉素抗原的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備恩拉霉素抗原的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
恩拉霉素，又名安來霉素和持久霉素，該藥于1966年日本武田藥品研究所由土壤中分離出來的放線菌(Streptomyces fungicidiousNO. B5477)經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的一種由不飽和脂肪酸和十二種氨基酸結(jié)合而成的多肽類(Polypepide)抗生素，其主要成分是恩拉霉素 A =C107H138N26O31C12 R=CH3 和恩拉霉素 B :C1Q8H14QN26031C12R=C2H50H。該藥因具有很強(qiáng)的抗 G+菌的作用，用作飼料添加劑能促進(jìn)畜禽生長和提高飼料效率，且長期使用不易產(chǎn)生耐藥性， 與其它抗生素亦無交叉耐藥，化學(xué)性能穩(wěn)定，無致突、致畸、致癌作用，不易被吸收，殘留極少，適口性好等優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已成為當(dāng)前最具發(fā)展前景的獸用抗生素添加劑。
目前，免疫分析法因其較傳統(tǒng)的微生物檢測法、理化檢測法具有簡潔、快速、廉價(jià)、 特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被國內(nèi)外廣泛地應(yīng)用于獸藥殘留的檢測中，但至今國內(nèi)外尚無有關(guān)恩拉霉素酶免疫檢測技術(shù)報(bào)道，僅日本厚生省對(duì)該項(xiàng)殘留物質(zhì)有畜、水產(chǎn)性食品有常規(guī)檢測技術(shù)報(bào)道。因此開發(fā)我國自主產(chǎn)權(quán)的Enramycin殘留檢測方法非常必要，要建立相關(guān)免疫學(xué)分析方法，制備出特異性強(qiáng)、效價(jià)高的Er抗體非常關(guān)鍵，必須將其與蛋白質(zhì)載體等大分子載體偶聯(lián)形成人工合成的完全抗原進(jìn)而制備相應(yīng)抗體，這也是建立免疫分析過程的如提和關(guān)鍵所在。
申請(qǐng)?zhí)枮镃N201010556432. 2，發(fā)明名稱為“一種恩拉霉素完全抗原的合成方法”的專利申請(qǐng)中公開了一種恩拉霉素完全抗原的合成方法，但是該方法制備的恩拉霉素抗原的偶聯(lián)比率較低，恩拉霉素抗原的效價(jià)較低。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種偶聯(lián)比率更高的制備恩拉霉素抗原的方法。
本發(fā)明制備恩拉霉素抗原的方法包括如下步驟
a、取牛血清白蛋白，加入PBS溶液(B卩磷酸鹽緩沖溶液，下同)使牛血清白蛋白溶解；
b、于a步驟所得的溶液中 加入恩拉霉素，并使恩拉霉素溶解；其中，恩拉霉素與牛血清白蛋白的質(zhì)量比為1:1. 2 1.5 ;
C、恩拉霉素溶解后，在加入1，4-二氧六環(huán)，混勻；其中，所加入的1，4-二氧六環(huán)與 PBS溶液的體積比為1:1.1 1. 2 ;
d、c步驟混勻后的溶液于25 30°C反應(yīng)3 5h，并加入體積濃度為O. 25%的戊二醛溶液；其中，加入的戊二醛溶液與1，4-二氧六環(huán)溶液的體積比為O. 35 O. 45:1，反應(yīng)時(shí)的PH值控制在7. 5 7. 9 (通過PBS溶液控制pH值)；
e、透析，干燥后得到恩拉霉素抗原。
本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過實(shí)驗(yàn)研究分析，發(fā)現(xiàn)影響恩拉霉素抗原的偶聯(lián)比率的因素較多，其中，恩拉霉素與牛血清白蛋白的質(zhì)量比、1，4-二氧六環(huán)與PBS溶液的體積比、戊二醛溶液的加入量、反應(yīng)時(shí)的PH值和反應(yīng)溫度為最主要的因素。按照上述方法制備的恩拉霉素抗原，其偶聯(lián)比率較高，相比申請(qǐng)?zhí)枮镃N201010556432. 2的方法，其偶聯(lián)比率大幅提高，取得了意料不到的技術(shù)效果。
其中，上述的牛血清白蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量優(yōu)選為67000。
進(jìn)一步的，作為更優(yōu)的技術(shù)方案，上述b步驟中所述的恩拉霉素與牛血清白蛋白的質(zhì)量比優(yōu)選為1:1.3。
進(jìn)一步的，作為更優(yōu)的技術(shù)方案，上述c步驟中的1，4_ 二氧六環(huán)與PBS溶液的體積比優(yōu)選為1:1. 15。
進(jìn)一步的，作為更優(yōu)的技術(shù)方案，上述c步驟混勻后的溶液于28°C反應(yīng)4h，并加入體積濃度為O. 25%的戊二醛溶液；其中，加入的戊二醛溶液與1，4- 二氧六環(huán)溶液的體積比為O. 4:1，反應(yīng)時(shí)的pH值控制在7. 7。
本發(fā)明方法相比現(xiàn)有方法，大幅提高了恩拉霉素抗原的偶聯(lián)比率，有利于更加精確的檢測肉制品中恩拉霉素的殘留含量，本發(fā)明具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1是實(shí)施例2制備的恩拉霉素抗原的紫外光譜鑒定結(jié)果圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明制備恩拉霉素抗原的方法包括如下步驟
a、取牛血清白蛋白，加入PBS溶液(B卩磷酸鹽緩沖溶液，下同)使牛血清白蛋白溶解；
b、于a步驟所得的溶液中加入恩拉霉素，并使恩拉霉素溶解；其中，恩拉霉素與牛血清白蛋白的質(zhì)量比為1:1. 2 1.5 ;
C、恩拉霉素溶解后，在加入1，4-二氧六環(huán)，混勻；其中，所加入的1，4-二氧六環(huán)與 PBS溶液的體積比為1:1.1 1. 2 ;
d、c步驟混勻后的溶液于25 30°C反應(yīng)3 5h，并加入體積濃度為O. 25%的戊二醛溶液；其中，加入的戊二醛溶液與1，4-二氧六環(huán)溶液的體積比為O. 35 O. 45:1，反應(yīng)時(shí)的PH值控制在7. 5 7. 9 (通過PBS溶液控制pH值)；
e、透析，干燥后得到恩拉霉素抗原。
本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過實(shí)驗(yàn)研究分析，發(fā)現(xiàn)影響恩拉霉素抗原的偶聯(lián)比率的因素較多，其中，恩拉霉素與牛血清白蛋白的質(zhì)量比、1，4-二氧六環(huán)與PBS溶液的體積比、戊二醛溶液的加入量、反應(yīng)時(shí)的PH值和反應(yīng)溫度為最主要的因素。按照上述方法制備的恩拉霉素抗原， 其偶聯(lián)比率較高，相比申請(qǐng)?zhí)枮镃N201010556432. 2的方法，其偶聯(lián)比率大幅提高，取得了意料不到的技術(shù)效果。
其中，上述的牛血清白蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量優(yōu)選為67000。
進(jìn)一步的，作為更優(yōu)的技術(shù)方案，上述b步驟中所述的恩拉霉素與牛血清白蛋白的質(zhì)量比優(yōu)選為1:1.3。
進(jìn)一步的，作為更優(yōu)的技術(shù)方案，上述c步驟中的1，4- 二氧六環(huán)與PBS溶液的體積比優(yōu)選為1:1. 15。
進(jìn)一步的，作為更優(yōu)的技術(shù)方案，上述c步驟混勻后的溶液于28V反應(yīng)4h，并加入體積濃度為O. 25%的戊二醛溶液；其中，加入的戊二醛溶液與1，4- 二氧六環(huán)溶液的體積比為O. 4:1，反應(yīng)時(shí)的pH值控制在7. 7。
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
做進(jìn)一步的描述，并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。
實(shí)施例所用的主要試劑和主要儀器如下
1、主要試劑
恩拉霉素(純度彡98%)、牛血清白蛋白(BSA，相對(duì)分子質(zhì)量67000，上海博奧生物科技公司)、卵清蛋白(0VA，相對(duì)分子量45000，上?；巧锟萍脊?、弗氏完全佐劑 (FCA)、弗氏不完全佐劑(FICA)，均購于Sigma公司、透析袋(截留分子量14000), (Sigma 公司)、戊二醛(成都金山化學(xué)試劑公司)、1，4-二氧六環(huán)(成都科龍化工試劑廠)，以上化學(xué)試劑均為分析純。
2、主要儀器
UV2501-PC型紫外掃描儀(日本島津Shimadzu公司)；BS124S型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);BS100S型分析天平北京賽多利斯有限公司；ULT1386-3-V38 型低溫冰箱(美國REVCO公司);DCD-172K型常規(guī)冰箱(美國伊萊克斯公司);Freeze6型冷凍干燥機(jī)(Labconco公司)；DF_101S型智能集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(河南省予華儀器有限公司)。
實(shí)施例1采用本發(fā)明方法制備恩拉霉素抗原
配制PBS溶液(ρΗ7· 6):取磷酸二氫鉀27. 22g，加水使溶解成IOOOml，取50ml，加O.2mol/L氫氧化鈉溶液42. 4ml，再加水稀釋至200ml，即得。
稱取恩拉霉素20mg盛于IOOmL錐形瓶中，稱取牛血清蛋白(BSA)24mg于5號(hào)試管中。向試管中加入PBS溶液約3mL，待牛血清蛋白(BSA)完全溶解后轉(zhuǎn)移到有恩拉霉素的錐形瓶中，再用PBS溶液洗滌試管，將牛血清蛋白(BSA)完全移入錐形瓶，共用PBS溶液llmL。 待恩拉霉素基本溶解后，向錐形瓶中加入1，4-二氧六環(huán)10mL，混勻。將磁力攪拌器放入反應(yīng)器后把錐形瓶放在一個(gè)含少量水的大燒杯中，再將燒瓶置于25°C水浴，開啟攪拌器，約 5min后，保持?jǐn)嚢锠顟B(tài)，向反應(yīng)器內(nèi)逐滴加入體積濃度為O. 25%的戊二醛溶液3. 5mL,滴加完畢后仍保持?jǐn)嚢锠顟B(tài)，反應(yīng)4h，反應(yīng)時(shí)的pH值控制在7. 6 (通過PBS溶液控制pH值);即得恩拉霉素完全抗原混合液。
配制A液配制含碳酸鈉(Na2CO3) 10g/L及乙二胺四乙酸二鈉(EDTA) lmol/L的堿性EDTA溶液，置于4°C下保存，以備處理透析袋
透析袋前處理取20cm的透析袋，將其置于A溶液中，于沸水中煮沸30min，稍冷后用蒸餾水沖洗3min將其洗凈，另取IOOcm長的棉線一根，用其一端將透析袋的一端扎緊， 保證不會(huì)漏液，保存在4°C去離子水中備用；
透析取15cm的三角漏斗一個(gè)，將其下部插于透析袋的未封口端，將恩拉霉素完全抗原混合液由漏斗口轉(zhuǎn)移至透析袋內(nèi)，轉(zhuǎn)移完畢，利用棉線的另一端將透析袋封口。以一個(gè)小鑷子作為梁將裝好的透析袋懸于盛有適量蒸餾水的大燒杯中，保證燒杯內(nèi)的水將透析袋內(nèi)的液體完全浸沒，將該裝置于4°C冰箱內(nèi)開始透析，透析72h，每天換水2次，最后使用冷凍干燥法將透析袋中的液體制成粉末，即得到恩拉霉素抗原恩拉霉素-牛血清白蛋白。
實(shí)施例2采用本發(fā)明方法制備恩拉霉素抗原
配制PBS 溶液(ρΗ7· 8)
甲液取磷酸氫二鈉35. 9g，加水溶解，并稀釋至500ml ；
乙液取磷酸二氫鈉2. 76g，加水溶解，并稀釋至IOOml ；
取上述甲液91. 5ml與乙液8. 5ml混合，搖勻，即得。
稱取恩拉霉素20mg盛于IOOmL錐形瓶中，稱取牛血清蛋白(BSA) 26mg于5號(hào)試管中。向試管中加入PBS溶液約3mL，待牛血清蛋白(BSA)完全溶解后轉(zhuǎn)移到有恩拉霉素的錐形瓶中，再用PBS溶液洗滌試管，將牛血清蛋白(BSA)完全移入錐形瓶，共用PBS溶液11.5mL。待恩拉霉素基本溶解后，向錐形瓶中加入1，4-二氧六環(huán)10mL，混勻。將磁力攪拌器放入反應(yīng)器后把錐形瓶放在一個(gè)含少量水的大燒杯中，再將燒瓶置于28°C水浴，開啟攪拌器，約5min后，保持?jǐn)嚢锠顟B(tài)，向反應(yīng)器內(nèi)逐滴加入體積濃度為O. 25%的戊二醛溶液4mL，滴加完畢后仍保持?jǐn)嚢锠顟B(tài)，反應(yīng)4h，反應(yīng)時(shí)的pH值控制在7. 8 (通過PBS溶液控制pH值)； 即得恩拉霉素完全抗原混合液。
按實(shí)施例1的方法透析、干燥，得到恩拉霉素抗原。
實(shí)施例3采用本發(fā) 明方法制備恩拉霉素抗原
配制PBS溶液(ρΗ7· 8 8. O):取磷酸氫二鉀5. 59g與磷酸二氫鉀O. 41g,加水使溶解成1000ml，即得。
稱取恩拉霉素20mg盛于IOOmL錐形瓶中，稱取牛血清蛋白(BSA) 30mg于5號(hào)試管中。向試管中加入PBS溶液約3mL，待牛血清蛋白(BSA)完全溶解后轉(zhuǎn)移到有恩拉霉素的錐形瓶中，再用PBS溶液洗滌試管，將牛血清蛋白(BSA)完全移入錐形瓶，共用PBS溶液 12mL。待恩拉霉素基本溶解后，向錐形瓶中加入1，4-二氧六環(huán)10mL，混勻。將磁力攪拌器放入反應(yīng)器后把錐形瓶放在一個(gè)含少量水的大燒杯中，再將燒瓶置于30°C水浴，開啟攪拌器，約5min后，保持?jǐn)嚢锠顟B(tài)，向反應(yīng)器內(nèi)逐滴加入體積濃度為O. 25%的戊二醛溶液5mL，滴加完畢后仍保持?jǐn)嚢锠顟B(tài)，反應(yīng)4h，反應(yīng)時(shí)的pH值控制在7. 9 (通過PBS溶液控制pH值)； 即得恩拉霉素完全抗原混合液。
按實(shí)施例1的方法透析、干燥，得到恩拉霉素抗原。
試驗(yàn)例I恩拉霉素抗原的紫外光譜鑒定
采用UV2501-PC型紫外掃描儀對(duì)恩拉霉素、BSA和實(shí)施例1_3制備的恩拉霉素抗原進(jìn)行紫外全波段掃描，波長范圍在200nm-400nm之間。結(jié)果得出，恩拉霉素標(biāo)準(zhǔn)品紫外最大吸收波長為279nm，BSA紫外最大吸收波長為278nm。當(dāng)恩拉霉素與BSA偶聯(lián)形成免疫抗原后，其紫外最大吸收波長偏移至恩拉霉素和BSA特征峰之間，提示實(shí)施例1-3均偶聯(lián)成功且得到了恩拉霉素與BSA偶聯(lián)的免疫抗原Er-BSA，其中，實(shí)施例2制備的恩拉霉素抗原的紫外光譜鑒定結(jié)果如圖1所示。
試驗(yàn)例2偶聯(lián)比率測定
偶聯(lián)比測定是估算偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子的比率(偶聯(lián)比率)的方法，雖然測定方法種類很多，但都是依據(jù)檢測偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子含量(或相對(duì)含量)的原理建立起來的。分光光度法是利用物質(zhì)對(duì)光的吸收與其濃度呈比例關(guān)系的原理分別測定被偶聯(lián)的兩種分子濃度.在大分子與小分子偶聯(lián)物中，兩種分子均有各自不同的紫外掃描光譜,并表現(xiàn)出光譜圖迭加的性質(zhì)。
摩爾吸光系數(shù)ε :配制恩拉霉素濃度為0，10，20，3(^8*111171，？!1=7.2的？83溶液， 通過紫外掃描可知恩拉霉素的最大吸收波長為278nm，在278nm處測吸光值，每個(gè)濃度做平行樣.摩爾吸光系數(shù)計(jì)算為ε =吸光值/摩爾濃度。本實(shí)驗(yàn)計(jì)算得ε =9264L · mL'
偶聯(lián)物蛋白濃度測定配制濃度為0，40，60，80，100 μ g · mL—1的牛血清蛋白溶液1.5mL,加入5mL考馬斯亮藍(lán)染色液，立即混勻，30°C水浴溫?zé)?分鐘，每個(gè)濃度做平行樣， 在595nm處測吸光值，繪制蛋白濃度與吸光值的關(guān)系曲線。將抗原溶液按一定比例稀釋，在 595nm處測定抗原溶液的吸光值，從曲線上得到抗原溶液的相應(yīng)的蛋白濃度。
偶聯(lián)比測定配制150 μ g ^mI/1牛血清蛋白的pH=7. 2的PBS溶液，將偶聯(lián)產(chǎn)物完全抗原用pH=7. 2的PBS稀釋至IJ 150 μ g ·πι Λ在278nm處測吸光值，以pH=7. 2的PBS為空白， 測出牛血清蛋白溶液的吸光值為Al，偶聯(lián)產(chǎn)物的吸光值為A2，則偶聯(lián)比率r為[(A1-A2)/ ε ]/(150Χ10_3/67000)。
其中ε為摩爾吸光系數(shù)(1^111011,67000為牛血清蛋白的分子量，150Χ10_3為牛血清蛋白濃度(μ g · ml/1)。
經(jīng)測定，實(shí)施例1、2、3制備的恩拉霉素抗原的偶聯(lián)比率r分別為:25.60,30. 15，26.01。
另外，采用申請(qǐng)?zhí)枮镃N201010556432. 2，發(fā)明名稱為“一種恩拉霉素完全抗原的合成方法”的專利申請(qǐng)中公開的方法制備恩拉霉素抗原，并采用上述方法測定其偶聯(lián)比率，其偶聯(lián)比率約為22。
從上述結(jié)果可以看出，本發(fā)明方法制備的恩拉霉素抗原的偶聯(lián)比率均高于現(xiàn)有方法，尤其是實(shí)施例2的方法制備的恩拉霉素抗原最好。`
權(quán)利要求
1.制備恩拉霉素抗原的方法，其特征在于包括如下步驟a、取牛血清白蛋白，加入PBS溶液使牛血清白蛋白溶解；b、于a步驟所得的溶液中加入恩拉霉素，并使恩拉霉素溶解；其中，恩拉霉素與牛血清白蛋白的質(zhì)量比為1:1. 2 1.5 ;C、恩拉霉素溶解后，在加入1,4-二氧六環(huán)，混勻；其中，所加入的1,4-二氧六環(huán)與PBS 溶液的體積比為1:1.1 1.2 ;d、c步驟混勻后的溶液于25 30°C反應(yīng)3 5h，并加入體積濃度為O.25%的戊二醛溶液；其中，加入的戊二醛溶液與1，4- 二氧六環(huán)溶液的體積比為O. 35 O. 45:1，反應(yīng)時(shí)的 pH值控制在7. 5 7. 9 ;e、透析，干燥后得到恩拉霉素抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備恩拉霉素抗原的方法，其特征在于所述的牛血清白蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為67000。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備恩拉霉素抗原的方法，其特征在于b步驟中所述的恩拉霉素與牛血清白蛋白的質(zhì)量比為1:1.3。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的制備恩拉霉素抗原的方法，其特征在于c步驟中的1，4- 二氧六環(huán)與PBS溶液的體積比為1:1. 15。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4任一項(xiàng)所述的制備恩拉霉素抗原的方法，其特征在于c步驟混勻后的溶液于28°C反應(yīng)4h，并加入體積濃度為O. 25%的戊二醛溶液；其中，加入的戊二醛溶液與1，4- 二氧六環(huán)溶液的體積比為O. 4:1，反應(yīng)時(shí)的pH值控制在7. 7。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備恩拉霉素抗原的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是提供了一種偶聯(lián)比率更高的制備恩拉霉素抗原的方法。本發(fā)明制備恩拉霉素抗原的方法包括如下步驟a、取牛血清白蛋白，加入PBS溶液使牛血清白蛋白溶解；b、于a步驟所得的溶液中加入恩拉霉素，并使恩拉霉素溶解；c、恩拉霉素溶解后，在加入1,4-二氧六環(huán)，混勻；d、c步驟混勻后的溶液于25～30℃反應(yīng)3～5h，并加入體積濃度為0.25%的戊二醛溶液；其中，加入的戊二醛溶液與1,4-二氧六環(huán)溶液的體積比為0.35～0.45:1，反應(yīng)時(shí)的pH值控制在7.5～7.9；e、透析，干燥后得到恩拉霉素抗原。
文檔編號(hào)C07K1/107GK103059143SQ20131000760
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2013年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月9日
發(fā)明者余華, 嚴(yán)玉寶, 葉健強(qiáng), 廖黨金, 胡娟, 謝晶, 崔鵬博, 周岷江 申請(qǐng)人:中華人民共和國四川出入境檢驗(yàn)檢疫局, 四川省畜牧科學(xué)研究院