專利名稱：一種縮宮素溶液的提取工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥用原料縮宮素的生物提取方法，屬于生物工程領(lǐng)域，具體是一種縮宮素溶液的提取工藝。
背景技術(shù)：
縮宮素又名 催產(chǎn)素，是一種有胎盤哺乳類動物體內(nèi)的九肽神經(jīng)內(nèi)分泌激素，主要由下丘腦催產(chǎn)素神經(jīng)元合成，沿其軸突運輸并貯存到垂體后葉，在適當?shù)拇碳は乱悦}沖方式釋放，對動物體具有多種生理效應(yīng)，現(xiàn)主要被用于催產(chǎn)、引產(chǎn)和防止產(chǎn)后出血。催產(chǎn)素由9個氨基酸組成，其中2個半胱氨酸在1，6位組成I個二硫鍵，相對分子量為1007，等電點7.7，易溶于水，溶于丙酮、丁醇和稀醋酸，不溶于乙醚和石油醚，pH3.8 4.4的酸性溶液中較穩(wěn)定，堿性溶液中不穩(wěn)定，在血液循環(huán)中以自由肽的形式存在。自從Vigneaud等在1953年首次合成出催產(chǎn)素以來，目前全球范圍的縮宮素原料藥的生產(chǎn)以化學(xué)合成為主，少數(shù)從動物腦垂體后葉提取。但多年來的臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，化學(xué)合成縮宮素的使用個體差異較大，藥物半衰期短，預(yù)防產(chǎn)后出血國內(nèi)多用10 20U化學(xué)合成縮宮素肌注或靜脈注射，但仍有部分產(chǎn)婦對此無效。夏紅衛(wèi)等研究了“天然縮宮素與合成縮宮素預(yù)防產(chǎn)后出血的比較”發(fā)現(xiàn)天然縮宮素促子宮收縮、預(yù)防產(chǎn)后出血的作用優(yōu)于化學(xué)縮宮素。與化學(xué)合成法相比，生物提取法不會引入多種縮宮素的結(jié)構(gòu)類似物，如二聚體、非對映異構(gòu)體、斷裂肽、開環(huán)肽等。但生物原料成份復(fù)雜，縮宮素的含量較低一直成為制約其應(yīng)用的瓶頸，若能開發(fā)一種有限去除雜組分，提高縮宮素的提取率的工藝必將推動生物提取法的發(fā)展，應(yīng)用前景廣泛。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了縮短了生產(chǎn)周期、降低了生產(chǎn)成本并簡化了純化工藝而提出了一種采用膜分離技術(shù)和樹脂純化組合的一種縮宮素溶液的提取工藝。不發(fā)明的技術(shù)方案為:一種縮宮素溶液的提取工藝，其具體步驟如下:(1)向豬腦垂體中加入有機溶劑,浸泡20 24小時后,去除上清液,再加入有機溶劑重新浸泡16 20小時,取出腦垂體濾干；(2)將步驟(I)中濾干的腦垂體切取垂體后葉，干燥后粉碎，得垂體后葉干粉；(3)將步驟(2)中得到的垂體后葉干粉加入到醋酸溶液中，機械攪拌，過濾得濾液A和濾餅；(4)將步驟(3)中得到的濾餅加入到醋酸溶液中，機械攪拌，過濾得濾液B ；(5)合并濾液A和濾液B后，通過超濾膜得濾液C，將濾液C減壓濃縮4 6倍，得濃縮液；(6)將步驟(5)中的濃縮液用酸調(diào)pH為3.5 6.0，通過平衡好的弱酸型離子交換樹脂柱進行洗脫，間隔收集洗脫液；(7)將步驟(6)中的洗脫液在280nm下進行紫外檢測，當吸光度小于0.2時停止洗脫，合并吸光度不小于0.2的洗脫液；(8)把步驟(7)中合并的洗脫液減壓濃縮8 10倍，得縮宮素溶液。優(yōu)選步驟(1)中的有機溶劑為丙酮、乙醇或乙酸；有機溶劑每次的加入量為6 8mL/g豬腦垂體量。優(yōu)選步驟(2)中干燥條件為60 80°C真空干燥6 12小時；所得的垂體干粉全部過60 120目篩。優(yōu)選步驟(3)和(4)的醋酸溶液量均為6 12mL/g垂體后葉干粉量；醋酸溶液的體積百分濃度為0.1 0.2%;機械攪拌的速率為150 300rpm，時間為I 2小時。優(yōu)選步驟(5)中所用的超濾膜截留分子量為1200 1600Da，超濾過程的壓力為0.02 0.04Mpa，溫度為 30 40°C，流速為 1.0 2.0mL/s。優(yōu)選步驟(6)中調(diào)節(jié)pH值所用的酸為鹽酸、硫酸或醋酸；弱酸型離子交換樹脂為D113，724或111，柱的徑高比為1:8 10 ;以體積百分濃度4 6%醋酸鈉溶液洗脫，流速為4 6mL/min,每30 50min收集一次。優(yōu)選步驟(5)和(8)中的減壓濃縮過程:轉(zhuǎn)速均為50 90rpm，溫度均為50 60°C，真空度均為0.07 0.1OMPa0有益效果:(1)本發(fā)明采用生物提取法提取縮宮素，生產(chǎn)周期比化學(xué)合成法縮短30%，僅用到一種有機試劑，減少了環(huán)境污染。(2)本發(fā)明采用膜技術(shù)與樹脂純化相結(jié)合的方法純化縮宮素，縮宮素的純度達到90%,提取率達85%以上，并且未檢測到縮宮素結(jié)構(gòu)類似物加壓素，達到目前生物提取法的最聞水平。
具體實施例方式以下結(jié)合實例來進一步解釋本發(fā)明，但實施案例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。實施例1稱取豬腦垂體2kg,加入12L丙酮，浸泡24小時后，去除上清液，再加入12L丙酮，浸泡20小時后，取出腦垂體濾干。切取濾干腦垂體的垂體后葉，80°C真空干燥12小時后粉碎，所得的垂體干粉全部過60目篩，稱量垂體干粉質(zhì)量為122g。向垂體干粉中加入732ml體積濃度為0.2%醋酸溶液，300rpm下機械攪拌2小時，過濾得濾液A和濾餅。將濾餅加入到732ml體積濃度為0.2%醋酸溶液中，300rpm下機械攪拌2小時，過濾得濾液B。合并濾液A和濾液B后，通過截留分子量為1600Da超濾膜，在壓力為0.04Mpa，溫度為40°C，流速為2.0mL/s，超濾收集濾液C共計1450ml，將濾液C在轉(zhuǎn)速為90rpm，溫度為60°C，真空度為0.099MPa下減壓濃縮，得濃縮液量取共計290ml。將濃縮液用鹽酸調(diào)pH為3.5，通過平衡好的D113弱酸型離子交換樹脂柱，柱的徑高比為1:10，以體積濃度6%醋酸鈉溶液洗脫，流速為6mL/min,每30min收集一瓶。將洗脫液在280nm下進行紫外檢測，當吸光度小于0.2時停止洗脫，合并吸光度不小于0.2的洗脫液。把合并的洗脫液在轉(zhuǎn)速為90rpm，溫度為60°C，真空度為0.099MPa下減壓濃縮10倍，得縮宮素溶液，檢測其純度為90.3%。實施例2
稱取豬腦垂體1.5kg,加入10.5L乙醇，浸泡22小時后，去除上清液，再加入10.5L乙醇，浸泡18小時后，取出腦垂體濾干。切取濾干腦垂體的垂體后葉，70°C真空干燥8小時后粉碎，所得的垂體干粉全部過80目篩，稱量垂體干粉質(zhì)量為87g。向垂體干粉中加入1044ml體積濃度為0.15%醋酸溶液，200rpm下機械攪拌1.5小時，過濾得濾液A和濾餅。將濾餅加入到1044ml體積濃度為0.15%醋酸溶液中，200rpm下機械攪拌1.5小時，過濾得濾液B。合并濾液A和濾液B后，通過截留分子量為1400Da超濾膜，在壓力為0.03Mpa，溫度為35°C，流速為1.5mL/s，超濾收集濾液C共計2100ml，將濾液C在轉(zhuǎn)速為70rpm，溫度為55°C，真空度為0.08MPa下減壓濃縮，得濃縮液量取共計350ml。將濃縮液用硫酸調(diào)pH為
4.5，通過平衡好的724弱酸型離子交換樹脂柱，柱的徑高比為1:9，以體積濃度5%醋酸鈉溶液洗脫，流速為5mL/min,每40min收集一瓶。將洗脫液在280nm下進行紫外檢測，當吸光度小于0.2時停止洗脫，合并吸光度不小于0.2的洗脫液。把合并的洗脫液在轉(zhuǎn)速為70rpm，溫度為55°C，真空度為0.08MPa下減壓濃縮9倍，得縮宮素溶液，檢測其純度為93.4%。實施例3
稱取豬腦垂體Ikg,加入8L醋酸，浸泡20小時后，去除上清液，再加入8L醋酸，浸泡16小時后，取出腦垂體濾干。切取濾干腦垂體的垂體后葉，60°C真空干燥6小時后粉碎，所得的垂體干粉全部過120目篩，稱量垂體干粉質(zhì)量為53g。向垂體干粉中加入420ml體積濃度為0.1%醋酸溶液，150rpm下機械攪拌I小時，過濾得濾液A和濾餅。將濾餅加入到420ml體積濃度為0.1%醋酸溶液中，150rpm下機械攪拌I小時，過濾得濾液B。合并濾液A和濾液B后，通過截留分子量為1200Da超濾膜，在壓力為0.02Mpa，溫度為30°C，流速為1.0mL/s，超濾收集濾液C共計800ml，將濾液C在轉(zhuǎn)速為50rpm，溫度為50°C，真空度為
0.07MPa下減壓濃縮，得濃縮液量取共計198ml。將濃縮液用醋酸調(diào)pH為6.0，通過平衡好的111弱酸型離子交換樹脂柱，柱的徑高比為1:8，以體積濃度4%醋酸鈉溶液洗脫，流速為4mL/min,每50min收集一瓶。將洗脫液在280nm下進行紫外檢測，當吸光度小于0.2時停止洗脫，合并吸光度不小于0.2的洗脫液。把合并的洗脫液在轉(zhuǎn)速為50rpm，溫度為50°C，真空度為0.07MPa下減壓濃縮8倍，得縮宮素溶液，檢測其純度為93.7%。
權(quán)利要求
1.一種縮宮素溶液的提取工藝，其具體步驟如下: (1)向豬腦垂體中加入有機溶劑，浸泡20 24小時后,去除上清液,再加入有機溶劑重新浸泡16 20小時，取出腦垂體濾干； (2)將步驟(I)中濾干的腦垂體切取垂體后葉，干燥后粉碎，得垂體后葉干粉； (3)將步驟(2)中得到的垂體后葉干粉加入到醋酸溶液中，機械攪拌，過濾得濾液A和濾餅； (4)將步驟(3)中得到的濾餅加入到醋酸溶液中，機械攪拌，過濾得濾液B; (5)合并濾液A和濾液B后，通過超濾膜得濾液C，將濾液C減壓濃縮4 6倍，得濃縮液； (6)將步驟(5)中的濃縮液用酸調(diào)pH為3.5 6.0，通過平衡好的弱酸型離子交換樹脂柱進行洗脫，間隔收集洗脫液； (7)將步驟(6)中的洗脫液在280nm下進行紫外檢測，當吸光度小于0.2時停止洗脫，合并吸光度不小于0.2的洗脫液； (8)把步驟(7)中合并的洗脫液減壓濃縮8 10倍，得縮宮素溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種縮宮素溶液的提取工藝，其特征在于步驟(I)中的有機溶劑為丙酮、乙醇或乙酸，有機溶劑每次的加入量為6 8mL/g豬腦垂體量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種縮宮素溶液的提取工藝，其特征在于步驟(2)中干燥條件為60 80°C干燥6 12小時；所得的垂體干粉過60 120目篩。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種縮宮素溶液的提取工藝，其特征在于步驟(3)和(4)中醋酸溶液的體積百分濃度均為0.1 0.2% ;醋酸溶液量均為6 12mL/g垂體后葉干粉量；機械攪拌的速率為150 300rpm，時間為I 2小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種縮宮素溶液的提取工藝，其特征在于步驟(5)中所用的超濾膜截留分子量為1200 1600Da，超濾過程的壓力為0.02 0.04Mpa，溫度為30 40°C，流速為 1.0 2.0mL/s。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種縮宮素溶液的提取工藝，其特征在于步驟(6)中調(diào)節(jié)pH值所用的酸為鹽酸、硫酸或醋酸；弱酸型離子交換樹脂為D113，724或111，柱的徑高比為1:8 10 ;以體積百分濃度4 6%醋酸鈉溶液洗脫，流速為4 6mL/min，每30 50min收集一次。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種縮宮素溶液的提取工藝，其特征在于步驟(5)和(8)中的減壓濃縮過程:轉(zhuǎn)速均為50 90rpm，溫度均為50 60°C， 真空度均為0.07 0.1OMPa0
全文摘要
本發(fā)明公開了一種縮宮素溶液的提取工藝。主要包括原料的處理、高溫提取、超濾、濃縮、離子交換樹脂純化等。該工藝是從動物垂體中直接分離提取縮宮素，克服了化學(xué)合成縮宮素工藝過程復(fù)雜、生物活性低、半衰期短、成本高等問題，高溫提取有效的使原料液中的蛋白質(zhì)變性，并通過超濾和離子交換樹脂純化除去變性蛋白、雜質(zhì)及縮宮素類似物，縮短了生產(chǎn)周期、節(jié)約了成本、工藝簡單、易操作、適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C07K1/18GK103087152SQ201310017410
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月17日
發(fā)明者沈飛, 胡永紅, 于輝, 李棟蕓, 李佼佼, 馮旌, 朱文俊, 楊文革 申請人:南京新百藥業(yè)有限公司, 南京工業(yè)大學(xué)