專利名稱：一種胃癌靶向重組毒素及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是利用基因工程制備胃癌靶向重組毒素。
背景技術(shù)：
胃癌在全世界范圍內(nèi)是發(fā)病率最高的癌癥之一，是中國的第二大常見腫瘤。手術(shù)是目前唯一根治胃癌的方法，但只有不足1/3的人能夠進(jìn)行手術(shù)治療，對于中晚期病人除進(jìn)行手術(shù)治療外常配合化療、放療等治療手段；但化療和放療副作用太大，往往嚴(yán)重破壞患者的免疫系統(tǒng)。40年前，Moolten FL等提出的免疫毒素概念為癌癥的治療帶來一片光明；免疫毒素的策略是利用抗原-抗體、細(xì)胞因子-受體的特異性結(jié)合，基于腫瘤細(xì)胞表面的特殊標(biāo)志物或特異的受體或與正常細(xì)胞受體數(shù)量的巨大差異，以其作為靶向使毒素集中于腫瘤細(xì)胞周圍，最終將腫瘤細(xì)胞殺死而對正常細(xì)胞無損害。目前許多重組毒素已進(jìn)入臨床試驗。美國已有I種藥物(DT-1L2，0NTAK)上市，另有15種進(jìn)入I期以上的臨床試驗，國內(nèi)朱平領(lǐng)導(dǎo)的研究小組研制的LHRH-PE40重組毒素正在進(jìn)行II期臨床試驗。在血液腫瘤方面，Ant1-Tac(scFv)-PE38 (LMB-2)可靶向殺傷 CD25 (IL-2R)陽性細(xì)胞，在臨床I期試驗中對35例的白血病淋巴瘤、霍奇金病患者使用，I例完全緩解，7例部分緩解；RFB4(dsFv)PE38 (BL22)可靶向殺傷⑶22陽性的淋巴瘤細(xì)胞，16例白血病患者中 11 例完全緩解，2 例部分緩解；IL6(23)-PE40KDEL 和 IL6 (D24)-linker_PE40KDEL 是兩種新型重組毒素，可選擇性殺傷高表達(dá)IL-6受體的白血病細(xì)胞；抗0064分子的單鏈抗體片段(m22)與ETA融合形成m22(SCFv)-ETA’可特異性殺傷表達(dá)CD64的急性髓性白血病母細(xì)胞；TH69與PE融合形成的重組毒素能夠誘導(dǎo)⑶7陽性的白血病T淋巴細(xì)胞凋亡。在實體瘤方面，B3 (scFv) -PE38 (LMB-7)、B3 (dsFv) -PE38 (LMB-9)能識別表達(dá) LeY 抗原的乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等腫瘤細(xì)胞；e23(dsFv)-PE38(Erb38)、e23(scFv)-PE38KDEL (AR209)都是針對在乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌中過量表達(dá)的Erb-B2的重組毒素；TGFa -PE40的衍生物TGF a -PE40-8cys目前已經(jīng)用于膀胱癌的臨床I期試驗；IGF-1_PE40靶向癌細(xì)胞表面的胰島素樣生長因子(IGF-1)，能殺傷乳腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞；IL13-PE38QQR已進(jìn)入臨床試驗，適應(yīng)癥為腎癌。作為活性單元的毒素分子,最常用的為白喉毒素(Diphtheria Toxin, DT)、綠膿桿菌外毒素(Pseudomonas Exotoxin, PE),然而由于成人體內(nèi)大都預(yù)存有DT的抗體，因此DT的應(yīng)用受到一定限制。PE的高毒性及細(xì)胞殺傷機(jī)制已得到詳細(xì)闡述，是制備免疫毒素的一種理想毒素分子:PE是分子量為66kDa的單鏈蛋白，由613個氨基酸殘基組成。PE分三個功能區(qū)，即 Domain I>Domain II 和 Domain III, Domain I 由 Ia 和 Ib 組成，Ia 區(qū)(l_252aa)是受體結(jié)合區(qū)，引導(dǎo)PE與靶細(xì)胞膜上的受體識別并結(jié)合；11區(qū)(253-364aa)是跨膜轉(zhuǎn)位區(qū)，它由7個α螺旋組成；111區(qū)(400_613aa)是酶活性區(qū)，具有ADP-核糖基化的酶學(xué)活性。PE通過以下步驟 殺傷細(xì)胞:㈠G17取代Ia區(qū)與CCK-BR或AnnexinII結(jié)合將重組毒素聚集到靶細(xì)胞表面，II區(qū)使其內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；㈡內(nèi)化后的PE38KDEL在第279-280位氨基酸處被哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的Furin蛋白酶裂解，游離出37kDa的片段；曰維系毒素結(jié)構(gòu)的位于第265位和第287位半胱氨酸之間的二硫鍵被還原；㈣第280-313位氨基酸對毒素在胞液中的轉(zhuǎn)位起調(diào)節(jié)作用，毒素轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并轉(zhuǎn)運(yùn)到胞液中，毒素羧基端KDEL結(jié)合至胞內(nèi)選擇性受體上，第400-602位氨基酸發(fā)揮ADP核糖基化活性，使eEF_2失活，阻止肽鏈延伸而抑制蛋白質(zhì)的合成。PE還可以通過其他途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，當(dāng)阻斷PE對eEF-2的作用后，PE融合毒素仍表現(xiàn)出較強(qiáng)的誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡的功能。PE毒素分子被修飾和改造出現(xiàn)了幾種衍生物，主要是缺失Ia區(qū)使其失去細(xì)胞結(jié)合能力，同時使用KDEL序列替換REDLKJI加其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)親和性，其細(xì)胞毒性增加6倍以上，目前最常用結(jié)構(gòu)有PE40KDEL和PE38KDEL，目的在于減少其分子量、增加細(xì)胞毒性、增加分子穿透力和降低體內(nèi)免疫學(xué)反應(yīng)的副作用。利用反向翻譯的胃泌素17肽作為導(dǎo)向單元，主要根據(jù)CCK-BR在胃癌細(xì)胞中過表達(dá)，表達(dá)程度還與腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)及靜脈侵犯、是否有肝轉(zhuǎn)移有關(guān)這一事實；CCK-BR陽性的腫瘤患者預(yù)后較差，提示CCK-BR與胃癌的進(jìn)展有關(guān)。臨床上100%的胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌有CCK-BR表達(dá)，85.0%的導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀胰腺癌及65.8%的浸潤性導(dǎo)管胰腺癌表達(dá)CCK-BR，膽管癌CCK-BR陽性率為82.5%，而正常胰腺不表達(dá)或微弱表達(dá)；腫瘤呈浸潤性生長時比膨脹性生長時表達(dá)更多的CCK-BR，纖維化程度越重CCK-BR的表達(dá)越高。64%的膽囊腺癌有CCK-BR表達(dá)，94%的乳頭狀膽囊腺癌表達(dá)CCK-BR。CCK-BR主要存在于胃壁細(xì)胞上，調(diào)節(jié)胃酸分泌，對胃泌素和CCK的親和力相似。對胃癌及臨近粘膜表達(dá)胃泌素受體差異的研究顯示，胃癌較周圍粘膜易于表達(dá)高含量的胃泌素受體，其表達(dá)量與腫瘤的部位和分期相關(guān)，胃泌素受體在晚期胃癌中高表達(dá)。胃癌細(xì)胞以表達(dá)高親和力受體為主，含量達(dá)(39.54±14.43) fmol/mg蛋白，而周圍和正常細(xì)胞以表達(dá)低親和力受體為主，含量為(6.03±2.83) fmol/mg 蛋白。總之，作為導(dǎo)向的結(jié)合 單元，其受體在腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞上表達(dá)數(shù)量的差別是其準(zhǔn)確殺傷腫瘤細(xì)胞而不損傷正常細(xì)胞的關(guān)鍵因素。Watson SA證實每個MKN45細(xì)胞含有
3X IO3個CCK-BR，正常胃細(xì)胞上的CCK-BR受體數(shù)極少，胃癌及胰腺癌細(xì)胞高表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種胃癌靶向重組毒素及其制備方法，目的是提供一種靶向胃癌的具有高度選擇殺傷活性重組毒素及其制備方法。本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:胃癌靶向重組毒素的氨基酸序列是SEQ N0.1。本發(fā)明所述胃癌靶向重組毒素的制備方法包括下列步驟:
根據(jù)表達(dá)宿主密碼子的偏愛性，優(yōu)化基因并進(jìn)行人工合成，將該基因進(jìn)行Xba I與EcoRI雙酶切，插入pET_28a載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3),得到重組菌株Rosetta(DE3)(pET-rG17PE38)，該重組菌株經(jīng)異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)，目的蛋白獲得高效表達(dá)。本發(fā)明所述基因的核苷酸序列如SEQ N0.2所述。本發(fā)明所述誘導(dǎo)條件是:S0B培養(yǎng)基，1%接種量接種，160rpm 37°C搖培2h后加入終濃度為1.0 mM的異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷IPTG，180rpm 30°C繼續(xù)4.5h。本發(fā)明胃癌靶向重組毒素的制備方法中還包括蛋白純化方法:
對所獲得的目的蛋白，超聲300W破碎5min，離心取上清；45%的硫酸銨沉淀后，0.4M硫酸銨、20mM Tris、pH7.4的緩沖液重懸，過濾后進(jìn)行Phenyl FF線性純化；目標(biāo)蛋白峰收集液上DEAE Sepharose FF柱純化，20mM TrisUM NaCl、pH7.4緩沖液線性洗脫；目標(biāo)蛋白峰收集液上Superdex75分子篩柱,最后收集目標(biāo)蛋白峰。本發(fā)明胃癌靶向重組毒素在制備抗胃癌的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明利用人胃泌素G17與綠膿桿菌外毒素A衍生的重組毒素PE38KDEL連接形成的具有胃癌靶向的重組毒素，特別是利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的反向翻譯的G17作為導(dǎo)向單元，通過基因工程表達(dá)制備該重組毒素；并建立其獨(dú)特的規(guī)?；a(chǎn)可溶性蛋白的發(fā)酵條件。CCK-BR在胃腸道腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)，以CCK-BR為靶標(biāo)制備診斷試劑或治療藥物的思路已獲得廣泛認(rèn)同。因此本專利選擇CCK-BR為靶標(biāo)具有廣泛堅實的理論基礎(chǔ)和可行性報道。CCK8-NH2與G17_NH2同為CCK-BR的天然配體激素，親和力相似，二者共有的C末端酰胺化五肽是識別CCK-BR的關(guān)鍵位點(diǎn)，因此二者均具有作為導(dǎo)向單元的潛能，但Sosabowski等認(rèn)為酰胺化8肽膽囊收縮素及截斷的酰胺化胃泌素片段較全長G17_NH2具有更高的腎臟毒性、且腫瘤靶向性降低；因此本專利選擇全長17肽胃泌素作為導(dǎo)向單元。PE毒素的細(xì)胞殺傷機(jī)制已得到了詳細(xì)闡明，是一種理想的毒素分子；美國國家癌癥中心對其進(jìn)行了數(shù)十年的研究，已有20多種PE類重組毒素進(jìn)入臨床試驗。考慮到殺傷實體瘤需要較高的穿透效率、高活性需要提高其胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)速度，所以本專利選擇PE38KDEL作為毒素單元，分子量較小具有較高的穿透率、KDEL趨向定位序列提高胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)效率。酰胺化17肽胃泌素的受體結(jié)合位點(diǎn)在C末端，PE38的殺細(xì)胞活性位點(diǎn)也在C末端，因此常規(guī)串聯(lián)融合表達(dá)的方式不能得到有效重組毒素；其它形式的胃泌素(甘氨酸延伸性胃泌素、胃泌素原等)有各自特異識別的受體蛋白(胃泌素原特異識別Annexin II，甘氨酸延伸性胃泌素的受體尚未實驗闡明)；這一問題可能是至今沒有CCK-BR靶向重組毒素的原因，本專利通過反向表達(dá)17肽胃泌素并結(jié)合甲酰甲硫氨酸構(gòu)建的導(dǎo)向單元(rG17)可高效識別胃癌細(xì)胞表面的CCK-BR受體，抗體識別、細(xì)胞定位免疫熒光、細(xì)胞殺傷等實驗充分證明了其導(dǎo)向特異性。天然PE毒素基因含有大量大腸桿菌稀有密碼子，在大腸桿菌中表達(dá)量極低；相關(guān)PE類重組毒素的研究集中在美國國家癌癥中心，主要以包涵體表達(dá)，而PE蛋白的復(fù)性條件極為苛刻。因此本專利通過密碼子優(yōu)化得到高表達(dá)菌株:表達(dá)產(chǎn)物占全菌總蛋白的40%以上，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基及誘導(dǎo)條件使rG17PE38上清可溶表達(dá)，既保護(hù)了 rG17PE38的生物學(xué)活性，又能高效快速的獲得大量目的蛋白。


圖1是經(jīng)密碼子優(yōu)化的基因在大腸桿菌中的表達(dá)效果圖；圖中:
M:低分子量蛋白Marker ；
I,2:未經(jīng)誘導(dǎo)的 Rosetta (DE3) (pET_rG17PE38)菌體裂解液；
3-8:經(jīng) ImM IPTG 誘導(dǎo)的 Rosetta(DE3) (pET_rG17PE38)菌體裂解液；
圖2是大腸桿菌表達(dá)重組毒素在細(xì)菌中的分布圖；圖中:M:低分子量蛋白Marker ；1:未經(jīng)誘導(dǎo)的Rosetta (DE3) (pET_rG17PE38)菌體裂解液；
2:經(jīng) ImM IPTG 誘導(dǎo)的 Rosetta(DE3) (pET_rG17PE38)菌體裂解液；
3:經(jīng) ImM IPTG 誘導(dǎo)的 Rosetta(DE3) (pET_rG17PE38)菌體裂解液上清；
4:經(jīng) ImM IPTG 誘導(dǎo)的 Rosetta(DE3) (pET_rG17PE38)包涵體；
圖3是蛋白純化效果圖；圖中:
1.對照；2.1PTG誘導(dǎo)表達(dá)效果；3.45%硫酸銨沉淀效果；4.待純化樣品；5.PhenylFF column純化效果；6.DEAE FF純化效果；7.分子篩純化效果；
圖4是重組毒素對胃癌BGC-823細(xì)胞的殺傷效果圖；加入重組毒素20h后，BGC-823細(xì)胞即皺縮、變黑，最終死亡(右圖)；對照組細(xì)胞 圓潤透明，生長狀態(tài)良好(左圖);
圖5是重組毒素對胃癌MGC-803細(xì)胞的殺傷效果圖；加入重組毒素20h后，MGC-803細(xì)胞即皺縮、變黑，最終死亡(右圖)；對照組細(xì)胞圓潤透明，生長狀態(tài)良好(左圖);
圖6是重組毒素對胚腎細(xì)胞HEK293無殺傷效果圖；細(xì)胞形態(tài)(右圖)與空白對照組(左圖)相比無明顯變化；
圖7是受體免疫熒光檢測結(jié)果圖；重組毒素在5min內(nèi)即可識別并結(jié)合胃癌BGC-823細(xì)胞膜上的CCK2R，顯微觀察細(xì)胞膜有大量熒光點(diǎn)(c);而不加重組毒素時，細(xì)胞均不能被熒光二抗識別，沒有特異性熒光(a)、( b )。
具體實施例方式實施例1高表達(dá)本發(fā)明重組毒素(以下簡稱rG7PE38)重組菌株的構(gòu)建
對GenBank公布的已有PEA毒素序列進(jìn)行比對分析:U78761，RFT5 (scFv) ETA免疫毒素基因序列；AY585869，H22 (scFv) PE40重組毒素基因序列；K01397，綠膿桿菌外毒素A基因；EU595736綠膿桿菌PACS458菌株基因；EU595734，綠膿桿菌PACS181株基因；CP002496，綠膿桿菌M18株基因；AE004091，綠膿桿菌PAOl株基因；AP012280，綠膿桿菌NCGM2株SI基因；FM209186，綠膿桿菌LESB58株基因；CP000438，綠膿桿菌UCBPP-PA14株基因；根據(jù)比對結(jié)果及Jcat軟件優(yōu)化序列，進(jìn)行人工基因合成，其核苷酸序列如SEQ N0.2所述。將該人工基因進(jìn)行Xba I與EcoR I雙酶切，插入pET_28a載體(購自美國Novagen公司)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)(購自美國Novagen公司)得到重組菌株Rosetta(DE3)(pET-rG17PE38)。該重組菌株經(jīng)異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)，目的蛋白獲得高效表達(dá)；其氨基酸序列如SEQ N0.1所述。表達(dá)量可達(dá)全菌總蛋白的40%以上(見圖1)。實施例2表達(dá)條件優(yōu)化 (I)誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化
過夜搖培的Rosetta(DE3) (pET_rG17PE38)菌液以1%的接菌量接種到5ml LB液體培養(yǎng)基(含ZOygAil氨芐青霉素)中，160rpm 37°C培養(yǎng)至OD6tltl為0.4，接入終濃度為1.0 mM的異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，分別在20°C、25°C、30°C、37°C、42V條件下180rpm
繼續(xù)培養(yǎng)6h。(2)誘導(dǎo)時機(jī)的優(yōu)化
過夜搖培的Rosetta(DE3) (pET_rG17PE38)菌液以1%的接種到5ml LB液體培養(yǎng)基(含20 μ g/ml 氨芐青霉素)中，160rpm 37°C培養(yǎng)至 0.5h、l.0h、l.5h、2h、2.5h、3.0h,3.5h 時分別加入終濃度為1.0 mM的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，37°C 180rpm繼續(xù)培養(yǎng)6h。(3)誘導(dǎo)劑用量的優(yōu)化
過夜搖培的Rosetta(DE3) (pET_rG17PE38)菌液以1%的接菌量接種到5ml LB液體培養(yǎng)基(含20 μ g/ml氨芐青霉素)中，37°C 160rpm搖培至0D_為0.8，分別加入不同終濃度的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG):0 mM、0.05 mM、0.1 mM、0.5 mMU.0 mM、1.5 mM、
2.0 mM、5.0 mM, 37 °C 180rpm 繼續(xù)培養(yǎng) 6h。經(jīng)各種誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，篩選到最佳誘導(dǎo)條件為:S0B培養(yǎng)基，1%接種量接種，160rpm 37°C搖培2h后加入終濃度為1.0 mM的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，180rpm 30°C繼續(xù)4.5h，表達(dá)蛋白絕大部分以可溶狀態(tài)存在(見圖2)。實施例3蛋白純化 (1)硫酸銨濃度選擇
重組菌經(jīng)異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)，超聲300W破碎5min，離心取上清；分為6等份，分別加入終飽和度為10%、20%、30%、40%、50%、60%的硫酸銨，充分混勻后離心收集上清，繼續(xù)加入硫酸銨至飽和度為20%、30%、40%、50%、60%和70%，離心棄上清；沉淀重懸后制備蛋白樣，進(jìn)行12% SDS-PAGE分析。篩選最佳硫酸銨濃度。(2)疏水層析條件篩選
Phenyl FF (high sub)、Phenyl HP>ButyI FF、0ctyl FF 等(購自美國通用電氣醫(yī)療集團(tuán))，收集各峰洗脫液，加入終 濃度為12%的三氯乙酸沉淀蛋白。然后分別選用0.2M、0.4M、0.6M、0.8M、1M的硫酸銨作為結(jié)合緩沖液，純化后收集
各蛋白峰。最后，采用pH7.0、pH7.2、pH7.4、pH7.6、pH7.8及pH8.0 6個梯度進(jìn)行疏水層析最佳pH值的篩選。(3)離子交換層析條件篩選
首先，篩選不同的純化介質(zhì)進(jìn)行純化:Q Sepharose Fast Flow、DEAE Sepharose FastFlow、ANX Sepharose 4 Fast Flow (high sub)及 Q Sepharose XL (購自美國通用電氣醫(yī)療集團(tuán))；收集各峰洗脫液，加入終濃度為12%的三氯乙酸沉淀蛋白。然后采用ρΗ7.0、ρΗ7.2、ρΗ7.4、ρΗ7.6、ρΗ7.8及ρΗ8.0 6個梯度進(jìn)行離子交換層析最佳pH值的篩選。最終篩選得到的純化條件為:45%的硫酸銨沉淀后，0.4M硫酸銨、20mM Tris、pH7.4的緩沖液重懸，過濾后進(jìn)行Phenyl FF (high sub)線性純化；目標(biāo)蛋白峰收集液上DEAE Sepharose FF柱純化，20mM TrisUM NaCl、ρΗ7.4緩沖液線性洗脫；目標(biāo)蛋白峰收集液上SuperdeX75 (購自美國通用電氣醫(yī)療集團(tuán))分子篩柱，最后收集目標(biāo)蛋白峰，經(jīng)SDS-PAGE分析，目的蛋白的純度可達(dá)94%以上(見圖3)。用鱟試劑(購自湛江安度思生物有限公司)檢測，純化蛋白中內(nèi)毒素含量為2.0EU/mg，不影響細(xì)胞殺傷實驗效果。實施例4細(xì)胞殺傷活性檢測
將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，細(xì)胞計數(shù)，約IO3個/孔鋪板，4h后加入終濃度為200ng/ml的rG17PE38重組蛋白，37°C CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，30h后定時觀察細(xì)胞形態(tài)變化及死亡情況。
制備細(xì)胞懸液并計數(shù)細(xì)胞；鋪入96孔板，IO3個細(xì)胞/150μ1/孔；37°C CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h ;加入不同濃度的rG17PE38，37°C CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72h ;分別加入10μ1的CCK-8試劑(購自東京理化公司)；37°C孵育l_4h ;酶標(biāo)儀測定490nm吸光度值。按照以下公式計算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率為50%的值即為半數(shù)致死劑量。細(xì)胞存活率(%)= [ (As-Ab) / (Ac-Ab) ] X 100%
As:實驗孔(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8試劑、rG17PE38)；
Ac:對照孔(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8試劑)；
Ab:空白孔(不含細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8試劑)。結(jié)果如下表所示。rG17PE38對胃癌細(xì)胞系細(xì)胞具有很高的靶向殺傷活性，而對其他癌細(xì)胞及正常細(xì)胞無明顯毒副作用(見圖4、5、6)。
權(quán)利要求
1.種胃癌靶向重組毒素，其特征在于胃癌靶向重組毒素的氨基酸序列是SEQ N0.1。
2.權(quán)利要求1所述的一種胃癌靶向重組毒素的制備方法，其特征在于包括下列步驟: 根據(jù)表達(dá)宿主密碼子的偏愛性，優(yōu)化基因并進(jìn)行人工合成，將該基因進(jìn)行Xba I與EcoRI雙酶切，插入pET_28a載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3),得到重組菌株Rosetta(DE3)(pET-rG17PE38)，該重組菌株經(jīng)異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)，目的蛋白獲得高效表達(dá)。
3.權(quán)利要求2所述的一種胃癌靶向重組毒素的制備方法，其特征在于所述基因的核苷酸序列如SEQ N0.2所述。
4.權(quán)利要求2所述的一種胃癌靶向重組毒素的制備方法，其特征在于所述誘導(dǎo)條件是:SOB培養(yǎng)基，1%接種量接種，160rpm 37°C搖培2h后加入終濃度為1.0 mM的異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷IPTG，180rpm 30°C繼續(xù)4.5h。
5.權(quán)利要求2所述的一種胃癌靶向重組毒素的制備方法，其特征在于還包括蛋白純化方法: 對所獲得的目的蛋白，超聲300W破碎5min，離心取上清；45%的硫酸銨沉淀后，0.4M硫酸銨、20mM Tris、pH7.4的緩沖液重懸，過濾后進(jìn)行Phenyl FF線性純化；目標(biāo)蛋白峰收集液上DEAE Sepharose FF柱純化，20mM TrisUM NaCl、pH7.4緩沖液線性洗脫；目標(biāo)蛋白峰收集液上Superdex75分子篩柱,最后收集目標(biāo)蛋白峰。
6.權(quán)利要求1所述的胃癌靶向 重組毒素在制備抗胃癌的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種胃癌靶向重組毒素及其制備方法，屬于靶向重組毒素及其制備方法。利用人胃泌素G17與綠膿桿菌外毒素A衍生的重組毒素PE38KDEL連接形成的具有胃癌靶向的重組毒素，特別是利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的反向翻譯的G17作為導(dǎo)向單元，通過基因工程表達(dá)制備該重組毒素；并建立其獨(dú)特的規(guī)模化生產(chǎn)可溶性蛋白的發(fā)酵條件，提供了一種靶向胃癌的具有高度選擇殺傷活性重組毒素。
文檔編號C07K19/00GK103087199SQ20131002475
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月23日
發(fā)明者柳增善, 宋杰, 任洪林, 盧士英, 李巖松, 周玉, 張茂林, 高世奇 申請人:吉林大學(xué)