專利名稱：一種聚乙二醇修飾的重組人白介素2的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種聚乙二醇修飾的重組人白介素2的制備方法。
背景技術(shù)：
白介素(interleukin)，白細(xì)胞介素的簡(jiǎn)稱，是指在白細(xì)胞或免疫細(xì)胞間相互作用的淋巴因子，它和血細(xì)胞生長(zhǎng)因子同屬細(xì)胞因子。兩者相互協(xié)調(diào)，相互作用，共同完成造血和免疫調(diào)節(jié)功能。白細(xì)胞介素在傳遞信息，激活與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，介導(dǎo)T、B細(xì)胞活化、增殖與分化及在炎癥反應(yīng)中起重要作用。白介素一2即白細(xì)胞介素一2(interleukin-2，IL_2)，是白介素家族中的一員，又名T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，主要由活化的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生，其具有廣泛生物活性，可以作用于所有T細(xì)胞亞群。重組人白介素一 2(rhIL-2)，通常由原核表達(dá)載體表達(dá)，與白介素IL-2相比，重組人白介素_2在N末端多一個(gè)甲硫氨酸Met，其具有人白介素_2的主要功能，可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖，激活淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK細(xì)胞)，促進(jìn)β —干擾素的產(chǎn)生，對(duì)免疫應(yīng)答 的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)有重要作用，是目前調(diào)控免疫應(yīng)答的重要因子，臨床上已顯示出具有較好的抗腫瘤活性。在用作外源蛋白質(zhì)藥物時(shí)，由于其具有不同于人白介素_2的結(jié)構(gòu)，屬于天然抗原，具有較強(qiáng)的免疫原性，反復(fù)注射會(huì)引發(fā)受試者的免疫反應(yīng)，使得患者依從性較差。此外還會(huì)受到各種蛋白酶的攻擊而容易失去生物活性，且生物半衰期短，無(wú)法充分發(fā)揮其生物活性，且為了維持其在體內(nèi)有效的血藥濃度，需要多次給藥，導(dǎo)致患者依從性差，嚴(yán)重影響了其藥理作用的發(fā)揮，限制了其臨床應(yīng)用。針對(duì)上述問(wèn)題，研究人員采用了各種藥物傳遞技術(shù)來(lái)提高其療效，諸如采用不同的給藥途徑、不同的藥物緩釋控釋技術(shù)、不同高分子材料的修飾等。而目前研究最為廣泛和成熟的是聚乙二醇[Polyethylene glycol),PEG]修飾技術(shù)。PEG具有良好的生物相容性，高度的親水性，在水溶液中具有較大的水動(dòng)力學(xué)體積，且無(wú)免疫原性。PEG修飾技術(shù)主要是通過(guò)PEG的端基活化后與蛋白藥物或多肽上的殘基基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)形成PEG-蛋白偶聯(lián)物。實(shí)驗(yàn)證明，PEG偶聯(lián)的蛋白質(zhì)藥物或多肽可以延長(zhǎng)蛋白質(zhì)藥物在體內(nèi)的半衰期，降低其免疫原性和抗原性；另外還可以減弱蛋白酶的水解作用，增加蛋白分子的可溶性等。目前關(guān)于PEG修飾白介素-2的研究報(bào)道中，PEG的分子量大都采用5kDa IOkDa,所得到的偶聯(lián)物是多修飾產(chǎn)物，均一性比較差，且活性損失較大，不易控制質(zhì)量和放大生產(chǎn)。一般來(lái)說(shuō)，分子量越小，在相同反應(yīng)條件下的修飾率越高，對(duì)產(chǎn)物活性的影響也就越大。而采用分子量較大的PEG修飾時(shí)，由于會(huì)受到空間位阻作用，所得到的偶聯(lián)產(chǎn)物將較為均一，且產(chǎn)物的活性損失也比較小。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種聚乙二醇修飾的重組人白介素2的制備方法，旨在解決PEG修飾重組人白介素2時(shí)出現(xiàn)的偶聯(lián)產(chǎn)物均一性比較差，且活性損失較大的問(wèn)題。本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種聚乙二醇修飾的重組人白介素2的制備方法，包括以下步驟:用活化劑將單甲氧基聚乙二醇(mPEG)活化，得到單甲氧基聚乙二醇活化分子；將該單甲氧基聚乙二醇活化分子與重組人白介素2在pH為7.5^9.0的緩沖液中反應(yīng)，然后加入甘氨酸溶液終止該反應(yīng)，將反應(yīng)產(chǎn)物分離純化，其中該活化劑選自:琥珀酸酐和N-羥基琥珀酰亞胺、對(duì)甲苯磺酸氯、N，N’-羰基二咪唑、N，N’ - 二琥珀酰亞胺基·碳酸酯、對(duì)硝基苯碳酸酯、苯并三唑碳酸酯、苯基琥珀酰亞胺碳酸酯、乙酸-N-琥珀酰亞胺酯。本發(fā)明實(shí)施例還提供一種由本發(fā)明的方法制備的聚乙二醇修飾的重組人白介素2。本發(fā)明的制備方法采用大分子量的mPEG來(lái)修飾重組白介素_2上的氨基殘基，該方法步驟簡(jiǎn)單，易于操作，合成效率高，易于控制質(zhì)量和放大生產(chǎn)。通過(guò)本發(fā)明的制備方法制得的聚乙二醇修飾的重組人白介素2能夠保留較高的抗病毒活性，同時(shí)與未修飾的rhIL-2相比，其免疫原性較低，體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)，血清清除率低，無(wú)需多次給藥，而且本發(fā)明制備的mPEG-rhIL-2，其分子量均一性較好。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明實(shí)施例提供一種聚乙二醇修飾的重組人白介素2的制備方法，包括以下步驟:SOl用活化劑將mPEG活化，得mPEG活化分子；S02將該mPEG活化分子與重組人白介素2在pH為7.5^9.0的緩沖液中反應(yīng)，然后加入甘氨酸溶液終止該反應(yīng)，將反應(yīng)產(chǎn)物分離純化。具體地，在步驟SOl中使用的單甲氧基聚乙二醇(MethoxyPolyethyleneGlycol),簡(jiǎn)稱mPEG,是聚乙二醇的一種,具有良好的水溶性、潤(rùn)濕性、潤(rùn)滑性、生理惰性、對(duì)人體無(wú)刺激、性質(zhì)溫和。在優(yōu)選實(shí)施例中，步驟SOI中使用的mPEG的分子量在IOkDa IOOkDa之間，進(jìn)一步優(yōu)選為IOkDa 50kDa之間，更優(yōu)選為IOkDa 30kDa。該步驟SOl中，該活化劑選自琥珀酸酐和N-羥基琥珀酰亞胺、對(duì)甲苯磺酸氯、N, N’ -羰基二咪唑、N, N’ - 二琥珀酰亞胺基碳酸酯、對(duì)硝基苯碳酸酯、苯并三唑碳酸酯、苯基琥珀酰亞胺碳酸酯、乙酸-N-琥珀酰亞胺酯。 在優(yōu)選實(shí)施例中，活化劑可選用琥珀酸酐和N-羥基琥珀酰亞胺混合物，此種情況下，還采用了吡啶作為催化劑。該優(yōu)選實(shí)施例能顯著提高步驟SOl中的活化反應(yīng)速率。上述步驟SOl中的活化反應(yīng)過(guò)程中，以摩爾量計(jì)，活化劑加入量略多于mPEG的加入量即可，或者采用更多量的活化劑。在優(yōu)選實(shí)施例中，單甲氧基聚乙二醇活化分子與所述活化劑的摩爾比為1:2-1:20o通過(guò)上述步驟SOl中的活化劑活化后，可獲得mPEG琥珀酰亞胺碳酸酯、mPEG-對(duì)甲苯磺酰氯、mPEG羰酰咪唑、mPEG琥拍酰亞胺琥拍酸酯、mPEG對(duì)硝基苯碳酸酯、mPEG苯并三唑碳酸酯、mPEG苯基琥珀酰亞胺碳酸酯、mPEG-琥珀酰酯乙酸酯等mPEG活化分子，這些mPEG活化分子分別與上述活化劑對(duì)應(yīng)。這些mPEG活化分子與上述步驟S02中的重組人白介素2作用后使mPEG與重組人白介素2偶聯(lián),得到mPEG修飾的重組人白介素2,而上述活化劑游離出來(lái)，不與重組人白介素2結(jié)合。具體地，在上述步驟S02中，重組人白介素rhIL-2可從市場(chǎng)購(gòu)得，也可利用大腸桿菌等原核表達(dá)載體重組表達(dá)獲得，采用后一種方式獲得時(shí)，其制備方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。在優(yōu)選實(shí)施例中，在上述步驟S02中，mPEG活化分子與重組人白介素2的反應(yīng)在0-25°C反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為2 24h。在優(yōu)選實(shí)施例中，該步驟S02中mPEG活化分子與重組人白介素2的摩爾比為2:1飛0:1，在mPEG活化分子過(guò)量 的情況下便于使重組人白介素2分子充分偶聯(lián)。在優(yōu)選實(shí)施例中，在步驟S02中，上述該mPEG活化分子與重組人白介素2反應(yīng)在磷酸鹽緩沖液或硼酸鹽緩沖液，該磷酸鹽緩沖液或硼酸鹽緩沖液PH為7.5-9.0,使用此種反應(yīng)緩沖液便于后續(xù)的分離純化操作，且分離純化操作中使用的緩沖液與步驟S02偶聯(lián)反應(yīng)對(duì)應(yīng)，即步驟S02中偶聯(lián)反應(yīng)與分離純化均使用磷酸鹽緩沖液或均使用硼酸鹽緩沖液。在優(yōu)選實(shí)施例中，在步驟S02中，所述甘氨酸溶液的濃度為0.5-0.6M，優(yōu)選濃度為0.5M。經(jīng)上述反應(yīng)，mPEG與重組人白介素2偶聯(lián)，可得到多種不同分子量的偶聯(lián)產(chǎn)物，因此需要對(duì)粗產(chǎn)物進(jìn)行分離和純化。在優(yōu)選實(shí)施例中，對(duì)粗產(chǎn)物進(jìn)行分離和純化處理是使用離子交換色譜進(jìn)行分離，該分離過(guò)程中使用PH為5.(Γ8.0磷酸鹽緩沖液或硼酸鹽緩沖液，且該磷酸鹽緩沖液或硼酸鹽緩沖液中含有0-0.2M的梯度NaCl ;在該分離之后進(jìn)行純化操作，該純化操作優(yōu)選通過(guò)凝膠滲透色譜進(jìn)行，該純化過(guò)程中使用PH為6.5^7.5的磷酸鹽緩沖液或硼酸鹽緩沖液，該磷酸鹽緩沖液或硼酸鹽緩沖液中含有0.15M的NaCl。本發(fā)明的制備方法采用大分子量的mPEG來(lái)修飾重組白介素_2上的氨基殘基，該方法步驟簡(jiǎn)單，易于操作，合成效率高，易于控制質(zhì)量和放大生產(chǎn)。本發(fā)明實(shí)施例還提供由上述制備方法獲得的mPEG修飾的rhIL_2，即聚乙二醇修飾的重組人白介素2，其中mPEG對(duì)rhIL-2的賴氨酸的ε -氨基和N末端的α -氨基進(jìn)行修飾，且該mPEG-rhIL-2可用如下通式表示:CH3O-(CH2CH2O)n-(CH2) pC0-NH-rhIL-2 ；其中η的取值與mPEG的分子量直接相關(guān)，η為200到2000之間的整數(shù)，對(duì)應(yīng)的mPEG分子量為IOkDa IOOkDa之間，優(yōu)選η為200到1000之間的整數(shù)，對(duì)應(yīng)的mPEG分子量為101^& 501^)&之間，更優(yōu)選η為200到500之間的整數(shù)，其對(duì)應(yīng)的mPEG分子量為10kDa 30kDa ；其中P值也可調(diào)節(jié)，P為O到5的整數(shù)。本發(fā)明實(shí)施例制備的mPEG-rhIL-2，其分子量均一性較好，且分離純化方法較為方便，易于控制質(zhì)量和放大生產(chǎn)。本發(fā)明實(shí)施例制備的mPEG-rhIL-2能夠保留較高的抗病毒活性，同時(shí)與未修飾的rhIL-2相比，其免疫原性較低，體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)，血清清除率低，無(wú)需多次給藥。以下通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述。實(shí)施例1本實(shí)施例中使用的mPEG分子量為IOkDa,活化劑為琥珀酸酐和N-羥基琥珀酰亞胺。具體操作步驟如下:1.mPEG 活化將mPEG溶于二氧六環(huán)中，加入適量琥珀酸酐，使得琥珀酸酐摩爾量略多于mPEG摩爾量，以吡啶為催化劑，在100°C下回流4h。反應(yīng)液冷卻后在劇烈攪拌下加無(wú)水乙醚至沉淀不再出現(xiàn)，之后再冰浴中攪拌30min。過(guò)濾，所得沉淀物溶于二氯甲烷，再次過(guò)濾除去不溶物，向?yàn)V液中加無(wú)水乙醚至沉淀不再產(chǎn)生，之后冰浴攪拌15min。再次過(guò)濾得沉淀，真空干燥。該干燥產(chǎn)物與N-羥基琥珀酰亞胺按1:3的摩爾比溶于二甲基甲酰胺(DMF)，將二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的DMF溶液加入其中，攪拌過(guò)夜，過(guò)濾去除沉淀，濾液處理同上，即向?yàn)V液中加無(wú)水乙醚至沉淀不再產(chǎn)生后，冰浴中攪拌15min ;再次過(guò)濾得沉淀，真空干燥，所得沉淀即為mPEG活化物，即mPEG-琥珀酰亞胺琥珀酸酯，簡(jiǎn)稱為mPEG_SS。2.修飾反應(yīng)將mPEG-SS與rhIL-2按2:l的摩爾比加入到IOOmM磷酸鹽緩沖液(pH7.5)中，4°C下反應(yīng)4h，加0.5M甘氨酸終止反應(yīng)，過(guò)濾得反應(yīng)液，反應(yīng)液中含有mPEG-rhIL-2。

3.分離純化取CM-S印harose離子交換柱，以10倍柱體積的20mM磷酸鹽緩沖液(pH8.0)平衡該離子柱，然后取稀釋后的步驟2的反應(yīng)液上柱，用含0-0.2M NaCl的pH8.0，20mM磷酸鹽緩沖液梯度洗脫，收集含mPEG-rhIL-2組分的洗脫液。取該洗脫液加至已平衡好的S印hadexGlOO層析柱上，以IOOmM磷酸鹽緩沖液(pH6.5，含有0.15M的NaCl)洗脫，收集活性洗脫液，冷凍干燥，得白色粉末狀mPEG-rhIL-2偶聯(lián)物。實(shí)施例2本實(shí)施例中使用的mPEG分子量20kDa，活化劑為琥珀酸酐和N-羥基琥珀酰亞胺。具體操作步驟如下:1.mPEG 活化將mPEG溶于二氧六環(huán)中，加入適量琥珀酸酐，使其摩爾量多于mPEG摩爾量，以吡啶為催化劑，在0°c下回流24h。反應(yīng)液冷卻后在劇烈攪拌下加無(wú)水乙醚至沉淀不再出現(xiàn)，之后再冰浴中攪拌30min。過(guò)濾，所得沉淀物溶于二氯甲烷，再次過(guò)濾除去不溶物，向?yàn)V液中加無(wú)水乙醚至沉淀不再產(chǎn)生，之后冰浴攪拌15min。再次過(guò)濾得沉淀，真空干燥。該干燥產(chǎn)物與N-羥基琥珀酰亞胺混合溶于二甲基甲酰胺(DMF)，將二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的DMF溶液加入其中，攪拌過(guò)夜，過(guò)濾去除沉淀，其余處理步驟同實(shí)施例1步驟I，所得沉淀即為mPEG活化物，即mPEG-琥珀酰亞胺琥珀酸酯，簡(jiǎn)稱為mPEG-SS。2.修飾反應(yīng)將mPEG-SS與rhIL_2按20:1的摩爾比加入到IOmM磷酸鹽緩沖液(pH9.0)中，25°C下反應(yīng)24h，加0.6M甘氨酸終止反應(yīng)，過(guò)濾得反應(yīng)液，反應(yīng)液中含有mPEG-rhIL-2。。
3.分離純化取CM-S印harose離子交換柱，以10倍柱體積的20mM磷酸鹽緩沖液(pH5.0)平衡該離子柱，然后取稀釋后的步驟2的反應(yīng)液上柱，用含0-0.2M梯度NaCl的pH為5.0，20mM磷酸鹽緩沖液梯度洗脫，收集含mPEG-rhIL-2組分的洗脫液。取該洗脫液加至已平衡好的Sephadex GlOO層析柱上，以IOmM磷酸鹽緩沖液(ρΗ6.5，含有0.15Μ的NaCl)洗脫，收集活性洗脫液，冷凍干燥，得白色粉末狀mPEG-rhIL-2偶聯(lián)物。實(shí)施例3本實(shí)施例中使用的mPEG分子量為50kDa，活化劑為琥珀酸酐和N-羥基琥珀酰亞胺，具體操作步驟如下:1.mPEG 活化具體操作步驟同實(shí)施例1步驟1，所得產(chǎn)物為mPEG-SS。2.修飾反應(yīng)將mPEG-SS與rhIL-2按50:1的摩爾比加入到IOOmM硼酸鹽緩沖液(pH8.5)中，4°C下反應(yīng)4h，加0.5M甘氨酸終止反應(yīng)，過(guò)濾得反應(yīng)液，反應(yīng)液中含有mPEG-rhIL-2。3.分離純化取CM-S印harose離子交換柱，以10倍柱體積的20mM硼酸鹽緩沖液(pH8.0)平衡該離子柱，然后取稀釋后的步驟2的反應(yīng)液上柱，用含0-0.2M的梯度NaCl的pH8.0，20mM硼酸鹽緩沖液洗脫，收集含mPEG-rhIL-2組分的洗脫液。取該洗脫液加至已平衡好的Sephadex GlOO層析柱上，以IOOmM硼酸鹽緩沖液(ρΗ6.5，含有(λ 15Μ的NaCl)洗脫，收集活性洗脫液，冷凍干燥，得白色粉末狀mPEG-rhIL-2偶聯(lián)物。實(shí)施例4本實(shí)施例使用的mPEG分子量為IOOkDa,活化劑為琥珀酸酐和N-羥基琥珀酰亞胺。具體操作步驟如下:1.mPEG 活化將mPEG溶于二氧六環(huán)中，加入適量琥珀酸酐，以吡啶為催化劑，在100°C下回流12h。反應(yīng)液冷卻后在劇烈攪拌下加無(wú)水乙醚至沉淀不再出現(xiàn)，之后再冰浴中攪拌30min。過(guò)濾，所得沉淀物溶于二氯甲烷，再次過(guò)濾除去不溶物，向?yàn)V液中加無(wú)水乙醚至沉淀不再產(chǎn)生，之后冰浴攪拌15min。再次過(guò)濾得沉淀，真空干燥。該干燥產(chǎn)物與N-羥基琥珀酰亞胺混合溶于二甲基甲酰胺(DMF)，將二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的DMF溶液加入其中，攪拌過(guò)夜，過(guò)濾去除沉淀，其余處理步驟同實(shí)施例1步驟1，所得沉淀即為mPEG活化物，即mPEG-琥珀酰亞胺琥珀酸酯，簡(jiǎn)稱為mPEG-SS。2.修飾反應(yīng)操作步驟同實(shí)施例1步驟2。3.分離純化操作步驟同實(shí)施例1步驟3。實(shí)施例5本實(shí)施例使用的是mPEG，其分子量為IOkDa,活化劑為對(duì)甲苯磺酸氯。具體操作步驟如下:LmPEG 活化
將2g mPEG溶于5ml 二氯甲烷中，于0°C加入吡啶64yL，以及對(duì)甲苯磺酸氯
0.04g，所得混合物于25°C下攪拌，反應(yīng)6h。于(TC下向上述反應(yīng)混合物逐滴加入甲醇，棄去上清液，所得沉淀過(guò)濾，以乙醚多次洗滌沉淀，最后于真空下干燥。所得活化衍生物簡(jiǎn)稱為Tosyl-mPEG。2.修飾反應(yīng)將步驟I獲得的Tosyl-mPEG與rhIL_2按2:1的摩爾比加到IOOmM磷酸鹽緩沖液(pH8.5)中，4°C下反應(yīng)4h，加0.5M甘氨酸終止反應(yīng)，反應(yīng)液過(guò)濾。3.分離純化取CM-Sepharose離子柱，以10倍柱體積的pH7.5, 50mM磷酸鹽緩沖液平衡柱子，后取稀釋后的反應(yīng)液上柱，用含0.2M NaCl的pH8.0, 20mM磷酸鹽緩沖液梯度洗脫，收集含mPEG-rhIL-2組分的洗脫液。取洗脫液上已平衡好的S印hadex GlOO層析柱，以IOOmM磷酸鹽緩沖液(PH6.5，含有0.15M的NaCl)洗脫，收集活性洗脫液，冷凍干燥，得白色粉末狀mPEG-rhIL-2 偶聯(lián)物。實(shí)施例6本實(shí)施例使用的是mPEG，其分子量為20kDa，活化劑為對(duì)甲苯磺酸氯。具體操作步驟如下:1.mPEG 活化將2g mPEG溶于5ml 二氯甲烷中，于0°C加入三乙基胺64yL，以及對(duì)甲苯磺酸氯
0.04g，所得混合物于25°C下攪拌，反應(yīng)IOh。于0°C下向上述反應(yīng)混合物逐滴加入甲醇，混合，棄去上清液，所得沉淀過(guò)濾，以乙醚多次洗滌沉淀，最后于真空下干燥。所得活化衍生物簡(jiǎn)稱為 Tosyl-mPEG。2.修飾反應(yīng)將步驟I獲得的Tosyl-mPEG與rhIL_2按5:1的摩爾比加到50mM磷酸鹽緩沖液(pH8.5)中，4°C下反應(yīng)6h，加0.5M甘氨酸終止反應(yīng)，反應(yīng)液過(guò)濾。3.分離純化取CM-Sepharose離子柱，以10倍柱體積的ρΗ6.5, 20mM磷酸鹽緩沖液平衡柱子，后取稀釋后的反應(yīng)液上柱，用含0.2M NaCl的pH6.5，20mM磷酸鹽緩沖液梯度洗脫，收集含mPEG-rhIL-2組分的洗脫液。取洗脫液上已平衡好的S印hadex G100層析柱，以IOOmM磷酸鹽緩沖液(PH6.5，含有0.15M的NaCl)洗脫，收集活性洗脫液，冷凍干燥，得白色粉末狀mPEG-rhIL-2 偶聯(lián)物。實(shí)施例7本實(shí)施例使用的mPEG分子量10kDa，活化劑為N，N’-羰基二咪唑(⑶I)。具體操作步驟如下:l.m PEG 活化按摩爾比為1:10分別稱取mPEG和⑶I置于錐形瓶中，加入3ml的N, N’-二甲基甲酰胺，在無(wú)氧和避光條件下將錐形瓶置于37°C的水浴搖床中進(jìn)行合成反應(yīng)，5h后取出。將所得反應(yīng)液用G4漏斗過(guò)濾，保留抽濾瓶中的濾液。向抽濾瓶中的濾液中加入攪拌子。在層析冷柜中于0°C滴加預(yù)冷乙醚，得到白色沉淀，用氯仿 溶解，上述步驟重復(fù)4次，得到白色粉末狀成品，稱mPEG-咪唑。所得產(chǎn)品在真空干燥箱中干燥。后將產(chǎn)品密封，保存在低溫4°C、避光、干燥的環(huán)境中，備用。2.修飾反應(yīng)將mPEG-CDI與rhIL_2按2:1的摩爾比加入到IOOmM磷酸鹽緩沖液(pH8.5)中，4°C下反應(yīng)4h,加0.5M甘氨酸終止反應(yīng),所得反應(yīng)液過(guò)濾。3.分離純化取CM-Sepharose離子柱，以10倍柱體積的pH8.0, 20mM磷酸鹽緩沖液平衡柱子，將步驟2的反應(yīng)液稀釋，上柱，用含0.2M NaCl的pH8.0，20mM磷酸鹽緩沖液洗脫，收集含mPEG-rhIL-2組分的洗脫液。將該洗脫液用已平衡好的S印hadex GlOO層析柱再次洗脫，使用IOOmM磷酸鹽緩沖液(pH6.5，含有0.15M的NaCl)洗脫，收集活性洗脫液，冷凍干燥，得白色粉末狀mPEG-rhIL-2偶聯(lián)物。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任 何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種聚乙二醇修飾的重組人白介素2的制備方法，包括以下步驟: 用活化劑將單甲氧基聚乙二醇活化，得到單甲氧基聚乙二醇活化分子，其中，所述活化劑選自:琥珀酸酐和N-羥基琥珀酰亞胺、對(duì)甲苯磺酸氯、N，N’-羰基二咪唑、N，N’-二琥珀酰亞胺基碳酸酯、對(duì)硝基苯碳酸酯、苯并三唑碳酸酯、苯基琥珀酰亞胺碳酸酯、乙酸-N-琥珀酰亞胺酯； 將所述單甲氧基聚乙二醇活化分子與重組人白介素2在pH為7.5^9.0的緩沖液中反應(yīng)，然后加入甘氨酸溶液終止所述反應(yīng)，將反應(yīng)產(chǎn)物分離純化。
2.如權(quán)利要求1所述的聚乙二醇修飾的重組人白介素2的制備方法，其特征在于，所述將單甲氧基聚乙二醇活化分子與重組人白介素2反應(yīng)的步驟中，所述單甲氧基聚乙二醇活化分子與所述重組人白介素的摩爾比為2:1 50:1。
3.如權(quán)利要求1所述的聚乙二醇修飾的重組人白介素2的制備方法，其特征在于，所述活化反應(yīng)的步驟中，所述活化劑為琥珀酸酐和N-羥基琥珀酰亞胺，并使用吡啶作為催化劑。
4.如權(quán)利要求1所述的聚乙二醇修飾的重組人白介素2的制備方法，其特征在于，所述單甲氧基聚乙二醇的分子量為10kDa-100kDa。
5.如權(quán)利要求1所述的聚乙二醇修飾的重組人白介素2的制備方法，其特征在于，所述單甲氧基聚乙二醇活化分子與重組人白介素2的反應(yīng)在磷酸鹽緩沖液或硼酸鹽緩沖液中進(jìn)行。
6.如權(quán)利要求1所述的聚乙二醇修飾的重組人白介素2的制備方法，其特征在于，所述甘氨酸溶液濃度為0.5-0.6M。
7.如權(quán)利要求1所述的聚乙二醇修飾的重組人白介素2的制備方法，其特征在于，所述分離純化步驟包括離子交 換色譜處理步驟。
8.如權(quán)利要求1所述的聚乙二醇修飾的重組人白介素2的制備方法，其特征在于，所述分離純化步驟包括凝膠滲透色譜處理步驟。
9.一種聚乙二醇修飾的重組人白介素2，其特征在于，所述聚乙二醇修飾的重組人白介素2由權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的聚乙二醇修飾的重組人白介素2的制備方法獲得。
10.如權(quán)利要求9所述的聚乙二醇修飾的重組人白介素2，其特征在于，所述聚乙二醇對(duì)重組人白介素2的賴氨酸的ε-氨基和N末端的α-氨基進(jìn)行修飾。
全文摘要
本發(fā)明適用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，提供一種聚乙二醇修飾的重組人白介素2的制備方法，該方法包括以下步驟用活化劑將mPEG活化，得mPEG活化分子；將該mPEG活化分子與重組人白介素2反應(yīng)，然后加入甘氨酸溶液終止反應(yīng)，將產(chǎn)物分離純化，其中該活化劑選自琥珀酸酐和N-羥基琥珀酰亞胺、對(duì)甲苯磺酸氯、N,N'-羰基二咪唑、N,N'-二琥珀酰亞胺基碳酸酯、對(duì)硝基苯碳酸酯、苯并三唑碳酸酯、苯基琥珀酰亞胺碳酸酯、乙酸-N-琥珀酰亞胺酯。本發(fā)明的制備方法操作簡(jiǎn)便，易于控制質(zhì)量和放大生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07K14/55GK103193879SQ20131004928
公開日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2013年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月7日
發(fā)明者徐東, 葉垚平 申請(qǐng)人:深圳市亞太興實(shí)業(yè)有限公司