專利名稱：一種利用高速逆流色譜分離白木香葉片中活性成分的方法
一種利用高速逆流色譜分離白木香葉片中活性成分的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分離白木香葉片中活性成分的方法，該活性成分為抗癌活性成分和抗氧化活性成分，具體地涉及一種利用高速逆流色譜分離白木香葉片中活性成分的方法，即分離白木香葉片中抗癌和抗氧化活性成分的方法。
背景技術(shù)：
國產(chǎn)沉香為瑞香科沉香屬植物白木香(Aquilaria sinensis (Lour.)Gilg)含有樹脂的木材，是中醫(yī)臨床常用名貴藥材，為廣東著名的地產(chǎn)藥材。白木香是國產(chǎn)沉香藥材的來源植物，其葉片活性成分據(jù)報道具有抗氧化、鎮(zhèn)痛、抗炎、調(diào)節(jié)糖尿病、抑制呼吸系統(tǒng)疾病等活性。眾所周知，癌癥是當(dāng)今全世界范圍的醫(yī)學(xué)難題。王紅剛等[沉香葉抗腫瘤活性化學(xué)成分研究，林產(chǎn)化學(xué)·與工業(yè)，2008，28 (2):1-5]認(rèn)為黃酮類化合物是沉香葉中所含的主要的一類化合物，并將白木香葉總提取物按極性大小分為石油醚層、乙酸乙酯層、正丁醇層、水層4個部位進(jìn)行抗腫瘤活性篩選，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯層部位具有明顯的抑制腫瘤細(xì)胞生長的活性；余伯陽等[中國專利，申請?zhí)?00710019969.3]發(fā)現(xiàn)白木香葉提取物具有抑制小鼠H22肝癌的腫瘤生長作用，但該葉提取物是用溶劑提取樣品原料所得的成分組成復(fù)雜的混合物，里面含有多種不同的化合物，提取物或萃取后的浸膏成分不清楚、結(jié)果難重復(fù)、成分間可能有相互作用等情況，在用藥或藥物研發(fā)中使用不方便，而高純度的白木香葉抗癌作用的活性單體化合物及其分離純化方法未見報道。而傳統(tǒng)的固-液柱色譜分離單體化合物時，大多需要一個月左右，同時需要使用大量的溶劑，分離成本高，對環(huán)境有很大的污染，得率一般小于5%，純度需要多次細(xì)分才能達(dá)到95%。高速逆流色譜(high-speedcounter current chromatography, HSCCC)是一種獨(dú)特的不用固態(tài)載體的液相分配色譜技術(shù)，是一種能實(shí)現(xiàn)連續(xù)有效分離的實(shí)用分離制備技術(shù)。在黃酮、生物堿、植物多酚、醌類、萜類、木脂素、香豆素、皂苷等天然植物化學(xué)成分的精細(xì)分離中都已有廣泛的應(yīng)用。在沉香藥材和葉片化學(xué)成分的研究方法方面，活性成分的提取目前主要是有機(jī)溶劑浸提、柱層析等傳統(tǒng)的方法。HSCCC技術(shù)是不用任何固態(tài)支撐體的液-液分配色譜技術(shù)，不會出現(xiàn)對于樣品成分的不可逆吸附，對于黃酮類等容易在固-液色譜過程中被吸附和損耗的物質(zhì)，是更加有效和經(jīng)濟(jì)的處理手段，利用HSCCC技術(shù)對白木香葉片的活性成分進(jìn)行分離純化，國內(nèi)外尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種高速逆流色譜法提純白木香葉片中活性成分的方法，可以得到純度很高的活性成分。本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題，采用以下技術(shù)方案:一種利用高速逆流色譜分離白木香葉片中活性成分的方法，其特征在于包括以下步驟:(I)常溫下用滲漉溶劑以滲漉法提取干燥粉碎后的白木香葉片得提取液，減壓濃縮提取液后得到白木香葉片提取液浸膏；(2)依次用石油醚、乙酸乙酯對白木香葉片提取液浸膏各萃取3-4次，分別將石油醚萃取液和乙酸乙酯萃取液減壓濃縮，得到石油醚部位浸膏和乙酸乙酯部位浸膏；(3)將石油醚部位浸膏和乙酸乙酯部位浸膏分別用高速逆流色譜法分離得到活性成分A:7，4’ - 二甲氧基-5-羥基黃酮；(4)將乙酸乙酯部位浸膏用硅膠柱層析粗分離出含有目標(biāo)成分的粗提物后，再將所述的粗提物用高速逆流色譜分離得到活性成分B:3，5，7，3’，4’ -五羥基-黃酮和活性成分C:3，5，7，4’ -四羥基-黃酮。本發(fā)明步驟(I)中滲漉法所用的滲漉溶劑為60-80%體積濃度的丙酮水溶液或者75-95%體積濃度的乙醇水溶液，所述的滲漉溶劑的流速為2-3ml/min。本發(fā)明中減壓濃縮步驟中所用的設(shè)備為真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。本發(fā)明步驟(2)中用石油醚和乙酸乙酯對白木香葉片提取液進(jìn)行萃取時，石油醚和乙酸乙酯作為萃取溶劑，其用量按照浸膏:萃取溶劑體積比=1:1，得到的石油醚部位浸膏的極性小于乙酸乙酯部位浸膏。石油醚部位浸膏和乙酸乙酯部位浸膏經(jīng)過活性鑒定，發(fā)現(xiàn)石油醚部位浸膏和乙酸乙酯部位浸膏均含有活性成分A:7，4’ -二甲氧基-5-羥基黃酮，乙酸乙酯部位浸膏還含有活性成分B:3，5，7，3’，4’ -五羥基-黃酮和活性成分C:3，5，7，4’ -四羥基-黃酮。因此，可 以用以下參數(shù)條件分別對石油醚部位浸膏和乙酸乙酯部位浸膏進(jìn)行高速逆流色譜分離得到活性成分A:溶劑體系為正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水體積比=(0.5 1.5): (Γ2): (Γ2):(0.5^1.5)，其中上相為流動相，下相為固定相。高速逆流色譜主機(jī)順時針轉(zhuǎn)動，轉(zhuǎn)速為75(T900rpm，樣品量40.0^60.0mg ;固定相保留值為:65.4% 73.0%，流動相的流速為0.8^1.2ml/min ;檢測波長254nm ;分離溫度為17^23 0C ο進(jìn)樣后40_66min收集活性成分A。通過質(zhì)譜和1H-NMRU3C-NMR圖譜并參考相關(guān)文獻(xiàn)確定活性成分A為7，4’ - 二甲氧基-5-羥基黃酮，該活性成分A又稱為洋芹素_7，4’ - 二甲醚，其結(jié)構(gòu)示為:
權(quán)利要求
1.一種利用高速逆流色譜分離白木香葉片中活性成分的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)常溫下用滲漉溶劑以滲漉法提取干燥粉碎后的白木香葉片得提取液，減壓濃縮提取液后得到白木香葉片提取液浸膏； (2)依次用石油醚、乙酸乙酯對白木香葉片提取液浸膏各萃取3-4次，分別將石油醚萃取液和乙酸乙酯萃取液減壓濃縮，得到石油醚部位浸膏和乙酸乙酯部位浸膏； (3)將石油醚部位浸膏和乙酸乙酯部位浸膏分別用高速逆流色譜法分離得到活性成分A:7，4’ - 二甲氧基-5-羥基黃酮； (4)將乙酸乙酯部位浸膏用硅膠柱層析粗分離出含有目標(biāo)成分的粗提物后，再將所述的粗提物用高速逆流色譜分離得到活性成分B:3，5，7，3’，4’-五羥基-黃酮和活性成分C:3，5，7，4’ -四羥基-黃酮。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用高速逆流色譜分離白木香葉片中活性成分的方法，其特征在于所述的滲漉法所用的滲漉溶劑為60-80%體積濃度的丙酮水溶液或者75-95%體積濃度的乙醇水溶液，所述的滲漉溶劑的流速為2-3ml/min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用高速逆流色譜分離白木香葉片中活性成分的方法，其特征在于所述的步驟(2)中石油醚和乙酸乙酯作為萃取劑的用量按照浸膏:萃取溶劑體積比=1:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用高速逆流色譜分離白木香葉片中活性成分的方法，其特征在于所述的石油醚部位浸膏或乙酸乙酯部位浸膏用高速逆流色譜分離得到活性成分A的參數(shù)包括: 溶劑體系為正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水體積比=(0.5 1.5): (Γ2): (Γ2):(0.5^1.5)，其中上相為流動相，下相為固定相； 高速逆流色譜主機(jī)順時針轉(zhuǎn)動，轉(zhuǎn)速為75(T900rpm ;樣品量40.(Γ60.0mg，固定相保留值為:65.4% ^73.0%，流動相的流速為0.8^1.2ml/min ;檢測波長為254nm ;分離溫度為17^23 0C ； 進(jìn)樣后40-66min收集活性成分A。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用高速逆流色譜分離白木香葉片中活性成分的方法，其特征在于所述乙酸乙酯部位浸膏用硅膠柱層析粗分離得到含有目標(biāo)成分的粗提物包括以下步驟: 用硅膠柱層析粗分離，先按以下體積比、順序的石油醚-乙酸乙酯體系進(jìn)行梯度洗脫:5:1 — 3:1 — 2:1 — 1:1 — 0:1，再按以下體積比、順序的乙酸乙酯-甲醇體系進(jìn)行梯度洗脫:20:1 — 10:1 — 5:1 — 1:1,每500ml接收為I個懼分至減壓濃縮已無浸膏即更換下一梯度的洗脫劑，全部梯度的洗脫劑洗脫完成后合并薄層色譜主點(diǎn)相同的餾分后，對合并的各餾分進(jìn)行檢測確定含有活性成分B和C的餾分為含有目標(biāo)成分的粗提物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用高速逆流色譜分離白木香葉片中活性成分的方法，其特征在于所述的含有目標(biāo)成分的粗提物用高速逆流色譜法分離得到活性成分B和活性成分C的參數(shù)包括: 溶劑體系為正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水體積比=(0.5 1.5): (0.5 1.5): (0.5 1.5):(0.5 1.5)，其中上相為固定相，下相為流動相；高速逆流色譜主機(jī)順時針轉(zhuǎn)動，轉(zhuǎn)速為75(T900rpm ;樣品量40.(Γ60.0mg,固定相保留值為:72.0% ^75.9%，流動相的流速為0.8^1.2ml/min ;檢測波長為254nm ;分離溫度為17^23 0C ο 進(jìn)樣后52-72min收集活性成分B，90_120min收集活性成分C。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的一種利用高速逆流色譜分離白木香葉片中活性成分的方法，其特征在于所述的活性成分A又稱為洋芹素_7，4’ - 二甲醚，其結(jié)構(gòu)示為:
8.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的一種利用高速逆流色譜分離白木香葉片中活性成分的方法，其特征在于所述的活性成分B又稱為槲皮素，其結(jié)構(gòu)示為:
9.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的一種利用高速逆流色譜分離白木香葉片中活性成分的方法，其特征在于 所述的活性成分C又稱為山萘酚，其結(jié)構(gòu)示為:
10.一種權(quán)利要求1或6所述的利用高速逆流色譜分離白木香葉片中活性成分的抗癌藥物應(yīng)用，其特征在于所述的活性成分B對人肝癌細(xì)胞株HepG2具有良好的抑制活性，所述的活性成分C對人肝癌細(xì)胞株HepG2具有中等的抑制活性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用高速逆流色譜分離白木香葉片中活性成分的方法，其步驟為常溫下以滲漉法提取干燥粉碎后的白木香葉片，得到白木香葉片提取液浸膏；依次用石油醚、乙酸乙酯對該提取液浸膏各萃取3-4次，分別將石油醚萃取液和乙酸乙酯萃取液減壓濃縮為浸膏；再將石油醚部位浸膏和乙酸乙酯部位浸膏分別用高速逆流色譜法分離得到活性成分A7，4’-二甲氧基-5-羥基黃酮；將乙酸乙酯部位浸膏用硅膠柱層析粗分離后，再用高速逆流色譜分離得到活性成分B3，5，7，3’，4’-五羥基-黃酮和活性成分C3，5，7，4’-四羥基-黃酮。本發(fā)明分離出的活性成分損失少，分離速度快，純度高，穩(wěn)定，易于應(yīng)用。
文檔編號C07D311/30GK103145677SQ201310062910
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月27日
發(fā)明者楊懋勛, 陳河如, 梁耀光, 張?zhí)煊? 謝朝良, 蔣建平, 高慎凎, 李小玉 申請人:中山火炬職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 陳河如, 梁耀光