專利名稱：具有抗血小板聚集活性的僵蠶多肽及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化學(xué)中的多肽藥物技術(shù)領(lǐng)域，涉及由僵蠶(BombyxBatryticatus)中分離純化的一種抗血小板聚集多肽,尤其涉及該多肽的制備方法以及作為抗血栓藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
心腦血管疾病是一大類包括急性心肌梗死、缺血性心臟病、心臟瓣膜病、周圍性血管疾病、心率不齊，高血壓以及腦卒中等的疾病，是嚴(yán)重威脅人類身體健康的重要疾病之一。而其中重要的病因是血栓的形成。誘導(dǎo)血管內(nèi)血栓形成的因素有很多種，血小板聚集性過高是促使心血管疾病發(fā)病的重要因素。隨著人口的老齡化，其發(fā)病率在快速增高。因此，快速研究開發(fā)抗血栓藥物具有重要意義。以抗血小板聚集為靶點(diǎn)的抗血栓藥物具有較好的專一性，一直受到廣泛關(guān)注。抗血小板聚集藥物在臨床上的使用最 為廣泛，在血栓性疾病的治療中發(fā)揮重要作用。但常用的一線藥物還是有一些嚴(yán)重的副作用，如阿司匹林的胃腸反應(yīng)、出血以及出現(xiàn)抵抗的問題；噻氯匹定和氯吡格雷的導(dǎo)致粒細(xì)胞減少的問題。近年來，國外大量文獻(xiàn)報(bào)道了由天然動植物，微生物諸如蜈蚣、大豆和食用真菌中分離純化的具有抗血小板聚集的蛋白質(zhì)和多肽。從天然生物中發(fā)現(xiàn)和鑒定新的抗血小板聚集多肽仍然是抗血栓研究的一個(gè)重要方向。僵蠶為傳統(tǒng)中藥，是蠶蛾科昆蟲家蠶(Bombyx mori) 4-5齡的幼蟲感染(或人工接種)白僵菌(Beauveria bassiana)而致死的干燥體。藥典載:味咸辛,性平，歸肝、肺、胃經(jīng)，具有息風(fēng)止痙、祛風(fēng)止痛、祛風(fēng)熱、化痰鎮(zhèn)咳、活絡(luò)通經(jīng)、解毒散結(jié)等功效。臨床廣泛用于驚風(fēng)抽搐，咽喉腫痛，頜下淋巴結(jié)炎，面神經(jīng)麻痹，皮膚瘙癢，熱癥哮喘，乳部癖塊等病癥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明:僵蠶含有脂肪4.4%、蛋白質(zhì)67%，有10多種氨基酸和鎂、鈣、鋅、鐵等20多種元素，還有多種生物活性物質(zhì)。僵蠶所含的蛋白質(zhì)，有促腎上腺皮質(zhì)作用，全品具有抗^(厥、抗凝、降血糖和一定的抗腫瘤作用。本發(fā)明從僵蠶中分離純化出一個(gè)由八個(gè)氨基酸組成的多肽，通過體外兔血小板聚集實(shí)驗(yàn)來測定其抗血小板聚集活性。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該多肽對膠原誘導(dǎo)的血小板聚集有顯著的抑制作用。同時(shí)應(yīng)用小鼠急性肺血栓栓塞模型實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，該多肽對小鼠死亡或偏癱癥狀有較好的保護(hù)作用。該多肽有望發(fā)展成新型抗血栓藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種對兔血小板聚集具有抑制活性的多肽,該多肽是僵蠶(BombyxBatryticatus)來源的。本發(fā)明所提供的具有抗血小板聚集活性的僵蠶多肽是利用Edman降解法測得其氛基酸序列的，序列為 Asp-Pro-Asp-Ala-Asp-1Ie-Leu-Gln。本發(fā)明所提供的具有抗血小板聚集活性的僵蠶多肽，經(jīng)質(zhì)譜測定其分子量為885Da。
本發(fā)明還涉及獲得該多肽的方法。它主要包含下述步驟:[I]取生僵蠶粉碎勻漿，有機(jī)溶劑回流提取，收集上清。[2]上清液去掉有機(jī)溶劑后濃縮、凍干，緩沖液重新溶解，S^hadex G_50凝膠過濾層析，得到活性峰B;[3]峰B部分再經(jīng)過SOurce30Q陰離子交換色譜后，得到活性峰B3 ；[4]峰B3部分最后通過C8柱RP-HPLC純化，得到活性峰B3_6，收集凍干，命名為BB octapeptide。本發(fā)明所提供的多肽，經(jīng)測試具有抗血小板聚集活性:在給藥劑量100μ g/ml至1000 μ g/ml范圍內(nèi)可抑制膠原誘導(dǎo)的血小板聚集，且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。本發(fā)明所提供的多肽，經(jīng)測試對小鼠急性肺血栓栓塞模型具有較好的保護(hù)作用:在連續(xù)4日尾靜脈給藥，給藥劑量分別10，30，50mg/kg時(shí)，對小鼠死亡或偏癱癥狀有較好的保護(hù)作用，且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。


下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明發(fā)明范圍。圖1為僵蠶回流提取后上清液S^hadex G-50凝膠過濾層析圖:活性峰為峰B。圖2為峰B部分Source30Q陰離子交換色譜圖:活性峰為峰B3。圖3為峰B3部分RP-HPLC色譜圖:活性峰為峰B3-6，即BB octapeptide。圖4為BB octapeptide的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:BB octapeptide 的制備(I)取白僵蠶，浸泡清洗后，粉碎勻漿，按照W/V1: 6比例添加60%乙醇?；亓?次，時(shí)間分別為lh、40min、20min，合并3次回流液體，回流溫度80°C。(2)將回流液用微孔濾膜除去顆粒，并將所得濾液減壓濃縮，然后離心10000 X g30min,取上清。將上清液減壓濃縮和凍干。(3)將凍干后的僵蠶提取粉末溶解于少量20mM PBS PH7.6，Sephadex G-50凝膠過濾層析。洗脫液20mM PBS PH7.6，流速0.3ml/min，收集單位3ml。得到4個(gè)峰，收集第3個(gè)峰，即峰B，凍干，如圖1所示。(4)峰B溶解于少量IOmM Tris-HC1,PH7.6, Source30Q陰離子交換層析。洗脫液A:10mM Tris-HCl, PH7.6 ；B:10mM Tris-HCl, PH7.6+1M NaCl。流速 2ml/min。洗脫程序:
0-25ml,0% B ；25-125ml,0% B-50% B。得到5個(gè)峰，收集第3個(gè)峰，即峰B3，凍干，如圖2所示。(5)峰B3溶解于少量50%乙腈+0.1 %三氟乙酸。C8柱RP-HPLC純化，洗脫液A:水+0.1%三氟乙酸；B:乙腈+0.1%三氟乙酸。流速0.7ml/min。洗脫程序:0_5ml，0% B ;5-55ml,0% B-60% B。得到7個(gè)峰，收集第6個(gè)峰，即峰B3-6，即BB octap印tide，凍干，如圖3所示。(6) BB octapeptide利用Edman降解法測得其氨基酸序列為Asp-Pro-Asp-Ala-Asp-1Ie-Leu-Gln。其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖4所示。經(jīng)質(zhì)譜測定其分子量為885Da。實(shí)施例2:BB octapeptide的體外抗血小板聚集活性(I)將雄性家兔麻醉，頸總動脈取血置于含有Iml的3.2%枸櫞酸鈉的15ml離心管中，(每管終體積約為10ml，保證兔血和抗凝劑體積比為9: 1)，離心120Xgl0min，20°C,得到上層液即富血小板血衆(zhòng)。余下血樣以1600XglOmin離心,得到貧血小板血衆(zhòng)。(2)吸取300 μ I貧血小板血漿置于血小板聚集儀測試區(qū)調(diào)零，再吸取270 μ I富血小板血漿置于預(yù)熱槽中，分別加入生理鹽水配置的不同濃度梯度的BBoctapeptide30 μ I (100，300，600，900，1000 μ g/ml)和測試珠，預(yù)熱 37°C，Imin 后置于測試區(qū)，加入誘導(dǎo)劑膠原30μ 1(終濃度2μ/πι1)，測定5min內(nèi)血小板最大聚集率。其中，空白對照為生理鹽水。通過以下公式計(jì)算血小板聚集抑制率:[(X-Y)/X] X 100%。X代表生理鹽水組血小板最大聚集率；Y代表各濃度多肽組血小板最大聚集率。(3)該多肽經(jīng)血小板聚集實(shí)驗(yàn)，BB octapeptide能顯著抑制膠原誘導(dǎo)的兔血小板聚集，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，其結(jié)果如下:BB octapeptide對膠原誘導(dǎo)的兔血小板聚集的抑制作用
權(quán)利要求
1.一種具有抗血小板聚集活性的僵蠶多肽，其特征在于以僵蠶為原材料提取，氨基酸序列為 Asp-Pro-Asp-Ala-Asp-1Ie-Leu-Gln,分子量為 88 a。
2.一種獲得權(quán)利要求1所述的具有抗血小板聚集活性的僵蠶多肽的方法，它包括以下步驟: -取生僵蠶粉碎勻漿，有機(jī)溶劑回流提取，收集上清。
-上清液去掉有機(jī)溶劑后濃縮、凍干，緩沖液重新溶解，Sephadex G_50凝膠過濾層析，得到活性峰B ； -峰B部分再經(jīng)過SOurce30Q陰離子交換色譜后，得到活性峰B3 ； -峰B3部分最后通過C8柱RP-HPLC純化，得到活性峰B3-6，收集凍干，命名為BBoctapeptide,即具有抗血小板聚集活性的僵蠶多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述具有抗血小板聚集活性的僵蠶多肽的應(yīng)用，其特征在于該多肽具有抗血小板聚集作用，對膠原誘導(dǎo)的血小板聚集有顯著的抑制作用，同時(shí)對小鼠急性肺血栓栓塞模型有較好的保護(hù)作用 ，可作為在制備抗血栓藥中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公布從僵蠶中分離出的多肽，并對其抗血小板聚集活性進(jìn)行測定。應(yīng)用有機(jī)溶劑回流，凝膠過濾層析，陰離子交換色譜和反相色譜分離方法從僵蠶中分離純化出一個(gè)由八個(gè)氨基酸組成的多肽，應(yīng)用Edman降解法測得其序列為Asp-Pro-Asp-Ala-Asp-IIe-Leu-Gln，質(zhì)譜法測得分子量為885Da。并用體外兔血小板聚集實(shí)驗(yàn)來測定其抗血小板聚集活性。本發(fā)明中的多肽具有抗血小板聚集活性，對膠原誘導(dǎo)的兔血小板聚集有抑制作用，且對小鼠急性肺血栓栓塞模型具有較好的保護(hù)作用，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，可用于血栓性疾病的預(yù)防及治療。
文檔編號C07K1/18GK103113456SQ201310069320
公開日2013年5月22日 申請日期2013年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月5日
發(fā)明者孔毅, 胥誠, 何志龍, 周秋梅 申請人:中國藥科大學(xué)