專利名稱：Mip1基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的，本發(fā)明涉及MIPl基因及其用途。
背景技術(shù)：
煙草花葉病毒屬病毒(Tobamovirus)是危害我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要病毒病原之一，該屬以煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus, TMV)和番爺花葉病毒(tomato mosaicvirus, ToMV)為代表，引起的花葉病是多種重要經(jīng)濟作物上的重要病害。病害發(fā)生時，感病植株除形成明顯花葉癥狀外，還產(chǎn)生如葉片彎曲皺縮甚至枯萎，植株黃化(chlorosis)矮化，果實斑駁甚至畸形，癥狀導(dǎo)致作物生物產(chǎn)量劇烈下，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成重大損失。TMV作為最早發(fā)現(xiàn)的植物病毒，已成為病毒學(xué)研究的模式系統(tǒng)，本研究試圖從TMV運動蛋白(MP)的互作蛋白入手研究植物病毒的運動，致病性以及寄主對病毒的敏感性。通過分離與病毒組分互作的植物蛋白因子是研究病毒侵染和抗性的有效手段。迄今，寄主中與TMV MP相互作用的蛋白因子已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，其功能也得到了分析和鑒定。其中包括與細(xì)胞壁結(jié)合的蛋白因子:果膠甲酯酶(pectin methylesterase, PME), I丐網(wǎng)織蛋白(calreticulin)和ANKl (Chen et al., 2000;Chen et al., 2005;Ueki et al., 2010);胞質(zhì)蛋白:DnaJ類熱激蛋白MPIPl (Shimizu et al.，2009)。還包括細(xì)胞骨架及其輔助因子如:肌動蛋白微絲，微管及其單體微管蛋白，以及微管結(jié)合蛋白MPB2C，EBla等(Heinlein etal., 1995;McLean et al., 1995; Kragler et al., 2003; Brandner et al.，2008),這些通過與TMV MP互作的蛋白因子或參與TMV的細(xì)胞間運動，或功能不清楚，而直接與病毒侵染力和癥狀相關(guān)的蛋白因 子仍有待深入探索，仍需要分離新的與TMV MP互作的新因子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的:發(fā)明人采用酵母雙雜交系統(tǒng)，以煙草花葉病毒移動蛋白MP為釣餌，篩選番茄cDNA文庫，獲得了可以與MP蛋白相互作用的新蛋白，被命名為MIPl (MP-1nteractingproteinDo發(fā)明人發(fā)現(xiàn),通過下調(diào)MIPl在植物中的表達,能夠有效地提高植物抵抗病毒感染的能力。為此，在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種分離的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述蛋白質(zhì)具有下列氨基酸序列:MFGRAPKKSDNTKYYEILGVPKTASPEDLKKAYRKAAIKNHPDKGGDPEKFKELAQAYE VLSDPEKREIYDQYGEDALKEGMGGGGGGHDPFDIFSSFFGGSPFGGGMGGGSSRGRRQK RGEDVVHPLKVSLDDLYNGTSKKLSLSRNVLCPKCKGKGSKSGASMKCSGCQGSGMKVT IRQLGPSMIQQMQHACNECKGTGETISDKDRCGQCKGEKVVQEKKVLEVVVEKGMQNG QKITFPGEADEAPDTITCDIVFVLQQKEHPKFKRKGDDLFVEHTLNLTEALCGFQFILTHLD SRQLLIKSQPGEVVKPDQFKAINDEGMPMYQRPFMRGKLYIHFTVDFPETLSPEQCKNLEA VLPPKPKTQMTDMELDECEETTLHDVNIEEEMRRKQQQAQEAYDEDEDMHGGAQRVQC AQQ (SEQ ID NO:1)所示。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)(在本文中也稱為“MIP1”)能夠與煙草花葉病毒移動蛋白MP相互作用，并且發(fā)現(xiàn)MIPl在植物病毒尤其是煙草花葉病毒的侵染過程中發(fā)揮了重要作用。另外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過下調(diào)MIPl在細(xì)胞內(nèi)的表達，可以有效地賦予植物尤其是煙草抵抗病毒尤其是煙草花葉病毒的侵染，從而為植物尤其是煙草賦予抗病能力。具體的，MIPl基因的沉默大大削弱了病毒的細(xì)胞與細(xì)胞擴散的速率,病毒的系統(tǒng)擴散變慢。在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種分離的寡核苷酸，其包含編碼前面所述蛋白質(zhì)的核苷酸序列。由此，利用該寡核苷酸可以有效地編碼MIPl蛋白。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述寡核苷酸具有下列核苷酸序列:ATGTTTGGAAGGGCACCGAAGAAGAGCGACAACACAAAGTATTATGAGATCTTAGGTG TTCCTAAGACGGCTTCACCTGAAGATCTCAAAAAAGCTTACCGTAAAGCTGCTATTAAG AATCATCCTGATAAGGGAGGTGATCCTGAAAAGTTTAAAGAGCTTGCACAAGCTTATGA GGTTTTGAGTGATCCCGAGAAGCGTGAGATATATGACCAGTACGGTGAAGATGCTCTCA AGGAAGGGATGGGTGGTGGAGGTGGTGGACACGACCCATTCGACATTTTCTCGTCTTT CTTTGGTGGCAGCCCGTTTGGTGGTGGTATGGGTGGTGGAAGCAGCAGAGGAAGAAG ACAGAAAAGAGGAGAGGATGTTGTCCACCCTCTTAAAGTTTCTCTGGATGATCTGTAC AATGGGACGTCAAAGAAGCTGTCACTATCTCGCAATGTACTATGCCCCAAGTGCAAGG GGAAAGGATCTAAGTCAGGTGCTTCAATGAAATGTTCTGGCTGTCAAGGGTCCGGGAT GAAAGTCACTATCAGACAACTTGGCCCATCCATGATCCAGCAGATGCAACACGCTTGC AACGAGTGTAAGGGTACTGGTGAGACAATCAGTGATAAAGATAGGTGTGGACAGTGTA AAGGTGAGAAGGTTGTGCAGGAGAAGAAGGTGTTGGAAGTTGTTGTTGAGAAGGGTA TGCAGAACGGACAGAAGATTACGTTCCCGGGCGAGGCTGATGAAGCGCCTGATACTAT CACTGGGGACATAGTTTTTGTCTTGCAACAGAAGGAACATCCCAAGTTCAAGCGAAAG GGAGATGATCTCTTTGTAGAGCACACTTTGAACTTGACTGAGGCCCTATGTGGTTTCCA GTTCATCTTGACTCACCTAGACAGTAGACAGCTACTCATTAAGTCCCAACCTGGAGAAG TTGTCAAGCCTGATCAATTTAAGGCCATAAATGATGAAGGAATGCCAATGTACCAAAGG CCGTTTATGAGAGGAAAACTGTACATTCACTTTACTGTAGATTTCCCAGAGACATTATCC CCGGAGCAGTGCAAGAAC CTTGAAGCGGTGTTGCCACCAAAACCCAAAACGCAAATG ACTGATATGGAATTGGATGAGTGCGAGGAGACCACTTTGCATGATGTTAACATTGAAGA GGAGATGCGTAGGAAGCAGCAACAAGCCCAAGAGGCATATGACGAAGATGAAGACAT GCATGGTGGTGCCCAGAGAGTTCAATGTGCACAGCAGTGA (SEQ ID NO:2)所示。由此，根據(jù)本發(fā)明的實施例，利用該寡核苷酸，能夠進一步提高編碼MIPl蛋白的效率。在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了另一種分離的寡核苷酸，其具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。其中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列為:ATGTTTGGAAGGGCACCGAAGAAGAGCGACAACACAAAGTATTATGAGATCTTAGGTG TTCCTAAGACGGCTTCACCTGAAGATCTCAAAAAAGCTTACCGTAAAGCTGCTATTAAG AATCATCCTGATAAGGGAGGTGATCCTGAAAAGTTTAAAGAGCTTGCACAAGCTTATGA GGTTTTGAGTGATCCCGAGAAGCGTGAGATATATGACCAGTACGGTGAAGATGCTCTCA AGGAAGGGATG ；SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列為:ATGTTTGGAAGGGCACCGAAGAAGAGCGACAACACAAAGTATTATGAGATCTTAGGTG TTCCTAAGACGGCTTCACCTGAAGATCTCAAAAAAGCTTACCGTAAAGCTGCTATTAAG AATCATCCTGATAAGGGAGGTGATCCTGAAAAGTTTAAAGAGCTTGCACAAGCTTATGA GGTTTTGAGTGATCCCGAGAAGCGTGAGATATATGACCAGTACGGTGAAGATGCTCTCA AGGAAGGGATGGGTGGTGGAGGTGGTGGACACGACCCATTCGACATTTTCTCGTCTTT CTTTGGTGGCAGCCCGTTTGGTGGTGGTATGGGTGGTGGAAGCAGCAGAGGAAGAAG ACAGAAAAGAGGAGAGGATGTTGTCCACCCTCTTAAAGTTTCTCTGGATGATCTGTAC AATGGGACGTCAAAGAAGCTGTCACTATCTCGCAATGTACTATGCCCCAAGTGCAAGG GGAAAGGATCTAAGTCAGGTGCTTCAATGAAATGTTCTGGCTGTCAAGGGTCCGGGAT GAAAGTCACTATCAGACAACTTGGCCCATCCATGATCCAGCAGATGCAACACGCTTGC AACGAGTGTAAGGGTACTGGTGAGACAATCAGTGATAAAGATAGGTGTGGACAGTGTA AAGGTGAGAAGGTTGTGCAGGAGAAGAAGGTGTTGGAAGTTGTTGTTGAGAAGGGTA TGCAGAACGGACAGAAGATTACGTTCCCGGGCGAGGCTGATGAAGCGCCTGATACTAT CACTGGGGACATAGTTTTTGTCTTGCAACAGAAGGAACATCCCAAGTTCAAGCGAAAG GGAGATGATCTCTTTGTAGAGCACACTTTGAACTTGACTGAGGCCCTATGTGGTTTCCA GTTCATCT。將該寡核苷酸連入TRV病毒誘導(dǎo)的基因沉默載體中(Liu et al.，2002)，獲得MIPlRNAi克隆。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物細(xì)胞的侵染的方法在細(xì)胞內(nèi)表達該克隆，可以有效地作為RNAiJ^g MIPl蛋白在植物細(xì)胞，尤其是煙草細(xì)胞中的表達，可以有效地賦予植物尤其是煙草抵抗病毒尤其是煙草花葉病毒的侵染，從而為植物尤其是煙草賦予抗病能力。在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了一種構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含編碼SEQ IDNO:3或SEQ ID N0:4。由此，利用該構(gòu)建體可以有效地將表達包含SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4所示的核苷酸序列的核酸分子引入到植物細(xì)胞中，從而使植物細(xì)胞表達該RNA，可以有效地作為RNAi，降低MIPl蛋白在植物細(xì)胞， 尤其是煙草細(xì)胞中的表達，可以有效地賦予植物尤其是煙草抵抗病毒尤其是煙草花葉病毒的侵染，從而為植物尤其是煙草賦予抗病能力。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，構(gòu)建體可以采用包含編碼SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，并進一步構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“構(gòu)建體”是指這樣的一種遺傳載體，其包含特定核酸序列，并且能夠?qū)⒛康暮怂嵝蛄修D(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中，使目的核酸序列整合到宿主細(xì)胞的基因組上，以獲得重組細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，構(gòu)建體的形式不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的實施例，其可以為質(zhì)粒、噬菌體、人工染色體、粘粒(Cosmid)、病毒的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，構(gòu)建體呈質(zhì)粒的形式。質(zhì)粒作為遺傳載體，具有操作簡單，可以攜帶較大片段的性質(zhì)，便于操作和處理。質(zhì)粒的形式也不受特別限制，既可以是環(huán)形質(zhì)粒，也可以是線性質(zhì)粒，即可以是單鏈的，也可以是雙鏈的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要進行選擇。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“寡核苷酸”可以是任何包含脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于經(jīng)過修飾的或者未經(jīng)修飾的DNA、RNA，其長度不受任何特別限制。對于用于構(gòu)建重組細(xì)胞的構(gòu)建體，優(yōu)選所述核酸為DNA，因為DNA相對于RNA而言，其更穩(wěn)定，并且易于操作。根據(jù)本發(fā)明的實施例，構(gòu)建體中還可以包含其他的元件，從而為構(gòu)建體賦予額外的有益效果。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要，選擇這些元件在構(gòu)建體上與編碼SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的相對位置。即可以設(shè)置在編碼SEQ ID NO:3或SEQID NO:4所示的核苷酸序列的上游，也可以設(shè)置在編碼SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的下游，只要這些元件能夠發(fā)揮其相應(yīng)的功能即可。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“5’側(cè)”可以與“上游”互換使用，“3’側(cè)”可以與“下游”互換使用。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，構(gòu)建體可以進一步包含啟動子序列，所述啟動子序列與所述編碼SEQ ID N0:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列可操作地相連。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“啟動子”指的是這樣一種核酸序列，其能夠指導(dǎo)與其可操縱地連接的核酸分子的轉(zhuǎn)錄。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“可操縱地”指的是核酸表達控制序列例如啟動子、信號序列、增強子等與目標(biāo)核酸序列之間的功能連接，其中當(dāng)合適的分子例如轉(zhuǎn)錄活化分子與表達控制序列結(jié)合時，表達控制序列影響著對應(yīng)于目標(biāo)核酸序列的核酸的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。由此，可以直接通過構(gòu)建體在植物細(xì)胞中引入特定的啟動子，并且該啟動子可以用于啟動編碼SEQ ID NO:3或SEQID NO:4所不的核昔酸序列的轉(zhuǎn)錄和表達，由此,可以提聞所獲得的重組細(xì)胞中編碼SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的表達效率。根據(jù)本發(fā)明的具體實例，采用的啟動子可以為2*CaMV的35S啟動子。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，構(gòu)建體可以進一步包括篩選標(biāo)記基因。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“篩選標(biāo)記基因”指的是這樣的一種基因，其編碼的產(chǎn)物能夠賦予連同載體接受該基因的細(xì)胞一種特殊的性質(zhì)，該特殊的性質(zhì)使得接受該基因的細(xì)胞與未接受該基因的細(xì)胞很容易被區(qū)分開。由此，便于篩選接受構(gòu)建體的植物細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，篩選標(biāo)記基因的類型不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的一些示例，所述篩選標(biāo)記基因為藥物抗性基因。由此，容易地通過接受外源構(gòu)建體的重組細(xì)胞的抗藥性來進行篩選，例如在培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的藥物，則相應(yīng)連同載體接受并表達藥物抗性基因的細(xì)胞將在培養(yǎng)基上能夠存活下來。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，所述篩選標(biāo)記基因為卡拉霉素(Kan+，50mg/L)。由此，能夠進一步提高篩選接受外源構(gòu)建體的重組細(xì)胞的效率。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的，構(gòu)建體還可以包含其他常規(guī)的元件以促進構(gòu)建體被轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中并且整合到宿主細(xì)胞的基因組上，正常發(fā)揮功能，例如復(fù)制起點、多克隆位點等。在此對這些元件不再贅述。在本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明還提出了一種構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法可以包括以下步驟:將前面所述的構(gòu)建體導(dǎo)入到植物細(xì)胞；以及分離轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以采用的植物細(xì)胞的類型并不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以采用的植物細(xì)胞可以為野生型本生煙葉片組織細(xì)胞。所述植物細(xì)胞為煙草細(xì)胞。由此，可以有效地獲得MIPl蛋白表達下降的植物細(xì)胞。并且可以進一步基于該植物細(xì)胞獲得MIPl蛋白表達下降的植物，從而獲得抗病能力，尤其是抵抗病毒，如煙草花葉病毒，得到提高的植物。由此，在本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明提出了一種提高植物抗病毒能力的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括:降低所述植物中MIPl蛋白的表達。根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以抵抗的病毒為煙草花葉病毒，可以處理的植物類型還可以為其他的茄科植物，例如番茄。根據(jù)本發(fā)明的實施例，通過RNAi方式，使MIPl蛋白表達水平得到降低，例如，可以是使所述植物表達具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的RNA而實現(xiàn)的，優(yōu)選地，是通過向所述植物中引入前面所述的構(gòu)建體實現(xiàn)的。在本發(fā)明的第七方面，本發(fā)明提出了一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括以下步驟:通過利用攜帶前面所述構(gòu)建體的農(nóng)桿菌對所述植物的葉片進行轉(zhuǎn)化；以及基于經(jīng)過轉(zhuǎn)化的植物葉片，獲得轉(zhuǎn)基因植物。由此，可以有效地獲得抗病能力得到提高的植物，例如煙草。本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中 部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。


本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，NbMIPl與MP蛋白在體外相互作用的驗證結(jié)果。圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，NbMIPl與MP蛋白在體內(nèi)相互作用的驗證結(jié)果。圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，MIPl基因沉默植物的照片。圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，NbMIPl基因沉默的植物接種TMV-GFP病毒后的UV燈檢測照片。圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，NbMIPl的沉默降低MP蛋白的蛋白水平。圖6顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，對照植物與轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)染TMV-GFP病毒后的UV燈檢測照片。
具體實施例方式下面參考具體實施例，對本發(fā)明進行說明，需要說明的是，這些實施例僅僅是說明性的，而不能理解為對本發(fā)明的限制。若未特別指明，實施 例中所采用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，可以參照《分子克隆實驗指南》第三版或者相關(guān)產(chǎn)品進行，所采用的試劑和產(chǎn)品也均為可商業(yè)獲得的。未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法，所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時標(biāo)明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。實施例1:驗證MIPl與MP蛋白相互作用發(fā)明人在本生煙(Nb)中克隆獲得了全長的MIP-lcDNA序列。在本發(fā)明的實施例中，將來自Nb的MIPl基因也稱為NbMIPl。利用酵母雙雜交得到的番茄MIPl基因的序列，采用生物信息學(xué)的方法，利用NCBIblast和DFCI blast的結(jié)果，我們設(shè)計了 NbMIPl基因的特異的引物primer9/10:primer9:CGACGACAAGACCGTGACCATGTTTGGGAGGGCACCGAAG (SEQ ID NO:5)primer10:GAGGAGAAGAGCCGTCACTGTTGTGCACATTGAACTCTC (SEQ ID NO:6)利用實驗室的Nb cDNA文庫為模版,進行PCR。PCR 條件是:
將獲得的PCR產(chǎn)物通過LIC技術(shù)連接到相應(yīng)載體上，我們進行了 3個獨立克隆的測序，序列結(jié)果非常一致，我們成功克隆了 NbMIPl的全長序列。1、驗證MIPl與MP蛋白在體外的相互作用_酵母互作實驗(I)酵母AD結(jié)構(gòu)域融合表達LIC載體pSAH20b，酵母BD結(jié)構(gòu)域融合表達LIC載體pYL302-lic為實驗室內(nèi)部保存(2)相關(guān)載體的構(gòu)建:NbMIPl由引物primer7/8擴增獲得后，通過LIC技術(shù)連接至Ij pSAH20b上，構(gòu)成35S::AD-NbMIP10 ToMV MP由引物primerl7/30擴增獲得，并連至IjpYL302-lic 上，構(gòu)成 35S::BD-ToMV MP。Pr imer7:CGACGACAAGACCGTGACCATGGCTGAAATTCTTCTTACATCAG (SEQ ID NO:7)Primer8:GAGGAGAAGAGCCGTTAGATAAACAATGATTTGTGCAG (SEQ ID NO:8)Pr imer17: CGACGACAA`GACCGTGACCATGGCTCTAGTTGTTAAAGGTAAGG (SEQ ID NO:9)Primer30:GAGGAGAAGAGCCGTTAATACGAATCAGAATCCGCGACC (SEQ ID NO:10)(3)質(zhì)粒線性化處理:pYL302-lic 質(zhì)粒 30 μ L I ( I μ g)IOx Buffer Sac I IOuLSac I (Fermentas) 5 μ L無菌水tolOOyL37度酶切4h，電泳檢測酶切是否完全；pSAH20b 質(zhì)粒30 yL 1( lug)IOx Buffer Apa I IOuLApa I (Fermentas) 5 μ L無菌水tolOOyL37度酶切4h，電泳檢測酶切是否完全；(4)線性化質(zhì)粒LIC處理體系:線性化質(zhì)粒50 μ L ( 500ng)5x T4polymerase buffer20 μ LIOOmM dTTP5 μ LT4DNA polymerase(5U/μ L, Fermentas) 2 μ L無菌水tolOOyL(5)連接:LIC-質(zhì)粒5 μ LLIC-PCR 產(chǎn)物5 μ L
70 度 IOmin, 22 度 IOmin ;(6)轉(zhuǎn)化及鑒定:將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli ToplO感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化子按照常規(guī)分子克隆方法進行鑒定，包括菌落PCR，酶切以及測序等，得到35S-BD-ToMV MP及35S-AD-NbMIPl融合表達載體；(7)酵母轉(zhuǎn)化與鑒定:酵母轉(zhuǎn)化使用常規(guī)醋酸鋰轉(zhuǎn)化方法(參照clontech《YeastProtocols Handbook)), Protocol N0.PT3040-1 )。SKY48 (pLac ⑶S)培養(yǎng)在 SD-Ura平板上。質(zhì)粒 AD-NbMIPl/BD-ToMV MP 以及陰性對照 AD/BD，AD/BD-ToMV MP, AD-NbMIPl/BD 共轉(zhuǎn)化SKY48 (pLac⑶S)，轉(zhuǎn)化子在SD-Ura-Leu-His平板上進行篩選。28°C培養(yǎng)2天后，挑取單克隆，進行菌落PCR鑒定。(8)酵母印記實驗:將鑒定的完畢的克隆在SD-Ura-Leu-His平板上劃線生長后，依次印記以下五種平板:A:SC-Glu-UTH-X-GALB:SC-Gal/Raf-UTH-X-GALC:SC-Glu-UTHLD:SC-Gal/Raf-UTHLE:SC-Glu-UTH28 °C培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，觀察。結(jié)論:將克隆得到的NbMIPl全長基因連入酵母雙雜交載體中，進行其與MP相互作用的驗證實驗，結(jié)果見圖1A。實驗發(fā)現(xiàn)，NbMIPl可以特異的與MP蛋白互作，即轉(zhuǎn)有AD-NbMIPl/BD-ToMV MP的酵母克隆能夠在Gal/Raf-X-gal的UTH缺陷型培養(yǎng)基上變藍，而在Glu-X-gal上不變藍，在Gal/Raf的UTHL缺陷型培養(yǎng)基上生長，而在含Glu的UTHL缺陷型培養(yǎng)基上不能生長。說明NbMIPl可以特異的與MP蛋白在酵母中相互作用。2、驗證MIPl與MP蛋白在體外的相互作用-Pulldown實驗(I)GST融合蛋白LIC系統(tǒng)表達載體pPGH-liclO，F(xiàn)lag融合蛋白LIC系統(tǒng)表達載體pET28a-l ic 10-6H64為本實驗內(nèi)部保存。蛋白表達菌株BL21 (DE3) -RIL購自北京全式金公司。GST-beads 購自 Sigma 公司，抗 Flag 抗體為 Santa Cruz Biotechnology 公司產(chǎn)品，抗兔的HRP偶聯(lián)的抗體為Jackson Immuno Research公司產(chǎn)品。(2)相關(guān)載體的構(gòu)建:NbMIPl由引物primer9/10擴增獲得，并通過LIC技術(shù)連到 pPGH-liclO 上，構(gòu)成 35S-GST-NbMIPl;ToMV MP 由引物 primerl7/18 擴增獲得，并通過 LIC 技術(shù)連至Ij pET28a-liclO-6H64 上，構(gòu)成 35S-MP_Flag-His.同時，以 35S-GST 以及35S-cLUC-Flag-His 作為對照。Pr imer18:GAGGAGAAGAGCCGTCG ATACGAATCAGAATCCGCGACC (SEQ ID NO:11)(3)將構(gòu)建好的克隆轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)-RIL感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化子采用菌落PCR方法進行進行鑒定；
(4)蛋白的誘導(dǎo)表達:挑取單克隆進行液體搖床培養(yǎng)過夜；第二天按照1:100的比例轉(zhuǎn)接到IOOmL液體培養(yǎng)基中，37°C搖2_3小時，至菌濃度OD約為0.3-0.4 ;轉(zhuǎn)入28°C搖床進行降溫培養(yǎng)30min，加入終濃度為0.4mM IPTG，在28°C搖床上誘導(dǎo)表達4小時以上，收集菌體提取蛋白；
(5)蛋白的提取:4°C,5000g離心5min,收集菌體。每IOmL菌液加入2mL含有終濃度為lmg/mL的溶菌酶以及5mM的PMSF的提取液(GST融合蛋白的提取液為:50mMTri s-HCl (PH=8.0), 200mM NaCl，0.l%Triton_X100; Flag 融合蛋白的提取液為:含有0.l%Triton-X100的PBS溶液)；超聲破碎菌體后，加入Dnase和Rnase，4°C放置40分鐘后，采用4°C，12000g離心20min，吸取上清，_20°C保存蛋白；吸取20 μ L蛋白溶液進行SDS-PAGE電泳后，進行考馬斯亮藍染色，初測蛋白的濃度；(6)GST蛋白的純化:在200yL蛋白提取液中加入5yL GST beads，室溫?fù)u床孵育I小時；4000g離心5min,小心吸取上清，在加入500 μ L洗滌液(50mM Tris-HCl (PH=8.0)，200mM NaCl,0.l%Triton-X100),洗漆 beads,4000g 離心 5min,小心吸取上清，重復(fù)洗滌步驟4-5次，最后加入上述洗滌液40-50 μ L到beads中；取5 μ L上述樣品，加入1adingbuffer,煮樣進行蛋白電泳檢測，估計蛋白的純化效果和濃度；(7)加入約Iyg的GST融合蛋白與Flag融合表達的目標(biāo)蛋白，在室溫孵育I小時，加入洗漆液洗漆beads4-5次后,將最終樣品加入loading buffer煮樣,進行SDS-PAGE電泳，進行用抗Flag抗體(Santa Cruz Biotechnology)進行western blot雜交實驗,檢測蛋白是否互作。結(jié)論:將NbMIPl與GST的融合表達載體、MP與Flag的融合表達載體在大腸桿菌中進行蛋白表達，然后進行pull-down體外互作實驗。通過采用抗Flag的抗體進行westernblot檢測，檢測結(jié)果見圖1B。我們發(fā)現(xiàn)NbMIPl可以特異的直接與ToMV MP-Flag蛋白在體外互作，而對照組GST/ToMV MP-Flag,GST-NbMIPl/Flag則無相互作用。這表明，NbMIPl可以特異的與ToMV MP蛋白直接在體外互作。3、驗證MIPl與MP蛋白在體內(nèi)的相互作用-LCI與COIP實驗(I)相關(guān)載體的構(gòu)建:LIC cLUC/nLUC融合表達載體pXGY12 (目標(biāo)蛋白-cLUC)，PDYM006 (nLUC-目標(biāo)蛋白)為本實驗室保存。COIP HA/Myc融合表達載體pJGlOO (目標(biāo)蛋白-Myc), pXGY15 (目標(biāo)蛋白-HA) NbMIPl由引物primer9/10擴增得到并采用LIC連接到PDYM006以表達nLUC -NbMIPl;NbMIPl由引物primer9/20擴增得到并采用LIC連接到pJGlOO以表達NbMIPl-Myc ；ToMV MP由引物primerl7/18擴增得到并采用LIC連接到PXGY15 和 pXGY12 以表達 ToMV MP-HA, ToMV MP-cLUC 的融合表達克隆。Primer20:GAGGAGAAGAGCCGTCGCTGTTGTGCACATTGAACTCTC (SEQ ID NO:22)(2)采用凍融法，將載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，用于注射煙草共表達；(3)農(nóng)桿菌侵染:在含有 Kan(50mg/L)/Rif (30mgL)/Gen(50mg/L)的 LB 平板上活化農(nóng)桿菌 35S-MP-cLUC 與 35S-nLUC-NbMIPl，接種至含有 Kan (50mg/l)/Rif (30mg/l) /Gen(50mg/1)LB 液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；將 35S_MP_cLUC 與 35S_nLUC_NbMIPl，室溫 2500g離心5min，用注射緩沖液(IOmM MES, IOmM MgC12，200 μ M乙酰丁香酮)調(diào)至0D600=1.0 ;室溫放置3-4hr，用無針頭的注射器注射煙草；(4)注射煙草48-72小時后噴灑ImM光素酶的底物,進行拍照觀察(iXon, AndorTechnology)。(5)COIP實驗:將含有NbMIPl-Myc表達載體的農(nóng)桿菌分別與含有MP-HA、nLUC_HA表達載體的農(nóng)桿菌等量混合，二者共注射后48小時后取樣，提取蛋白樣品，進行COIP實驗。收取大約Ig的組織葉片，采用預(yù)冷的IP buffer (GTEN(10%[v/v]甘油，25mM TrispH7.5, ImM EDTA, 150mM NaCl,), IOmM DTT, 2%(w/v)PVPP(polyvinylpolypyrolidone), IXprotease inhibitor cocktail, ImM PMSF, 0.15%(v/v)NP_40)提取植物總蛋白；之后的操作均在4°C環(huán)境或者冰上進行，在蛋白提取液中加入25 μ L預(yù)先洗滌過的蛋白A/G交聯(lián)的瓊脂糖beads，在4°C的旋轉(zhuǎn)混合器上孵育30min后，4°C，2600g離心lmin，小心地上清轉(zhuǎn)移至另一個新管中，加入終濃度為I μ g/mL的抗HA(Abcam)抗體，4°C旋轉(zhuǎn)孵育2小時，再加入40 μ L預(yù)先洗滌過的蛋白A/G交聯(lián)的瓊脂糖beads，在4°C的旋轉(zhuǎn)混合器上孵育I小時；再用預(yù)冷的IP buffer洗漆beads4次,最終得到的樣品，經(jīng)過SDS-PAGE電泳以及用抗Myc或抗HA的抗體進行western blot雜交實驗；結(jié)果分析:采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蛋白表達的方法，將含有nLUC-NbMIPl與MP_cLUC的農(nóng)桿菌混合，共注射煙草葉片，48-72小時后摘取葉片進行熒光拍照。在加入底物后，nLUC-NbMIPl/MP-cLUC,能夠產(chǎn)生熒光，而對照組合 nLUC-NbMIPl/35S_cLUC，35S_nLUC/MP-cLUC均不能產(chǎn)生熒光見圖2A。說明NbMIPl可與MP在煙草葉片內(nèi)互作。NbMIPl -Myc/MP-HA 的農(nóng)桿菌共注射煙草葉片，同時以 NbMIPl-Myc/35S-HA_nLUC作為對照。在注射煙草葉片48小時后收樣提取總蛋白。加入抗HA抗體對MP-HA進行免疫共沉淀實驗，獲得的免疫復(fù)合體采用SDS-PAGE電泳進行分離，結(jié)果見圖2B，用抗Myc的抗體檢測互作的NbMIPl蛋白。NbMIPl可以特異的與MP在煙草體內(nèi)互作，而不與對照35S-HA_nLUC互作。實施例2:構(gòu)建NbMIPl基因沉默的植物(I) VIGS載體的構(gòu)建:NbMIPl片段I (1-880核苷酸)，片段2 (1-246核苷酸)分別由引物Primer9/29，Primer9/ll,以35S_AD_NbMIPl載體為模板擴增，通過LIC技術(shù)連接到 TRV-based 煙草 VIGS 載體 TRV2-LIC 上(Dong et al.，2007)，形成 TRV2_NbMIPl_l 和TRV2-NbMIPl-2 載體；Primer11:GAGGAGAAGAGCCGTCACTGGTCATATATCTCACGCTTCTCG (SEQ ID NO:12)Pr imer 29:GAGGAGAAGAGCCGTCAACCACATAGGGCTTCGGTCAAG (SEQ ID NO:13)(2) VIGS:將 TRV1，TRV2 (空載體做負(fù)對照)，TRV2_NbMIPl_l，TRV2_NbMIPl_2 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。鑒定后挑取單克隆進行液體培養(yǎng)，將TRV2、TRV2-NbMIPl-l、TRV2-NbMIPl-2分別同TRVl過夜培養(yǎng)菌液等體積混合，使用農(nóng)桿菌侵染液懸浮，室溫放置4hr后注射野生型本生煙草植物；(3)植物表型觀察:14天后，觀察并照相記錄植物發(fā)育表型；并收取上部葉片，使用Trizol試劑提取植物總RNA，反轉(zhuǎn)后，進行RT-PCR實驗；(4) TMV-GFP病毒的接種:將含有TMV-GFP病毒載體的農(nóng)桿菌，使用無針頭的ImL無菌注射器，將菌液混合物注入植物葉片背面。待TMV完全侵染后，整株植物出現(xiàn)GFP熒光。此時，采集植物葉片用少量金剛砂和適量水于研缽內(nèi)研磨。用干凈的棉花蘸取少量研磨液輕輕涂于受試植物葉片上。(5) TMV-GFP病毒的觀察:在接種病毒3天后，可在UV燈照射下，觀察到TMV-GFP熒光。(6)植物總RNA提取:將葉片去除主脈后剪碎置于液氮預(yù)冷的研缽中，加入液氮研磨，稱取相同重量的粉末(約0.2g)，加入ImL Trizol (天根，DP432)，樣品可保存-80度；提取方法參見該產(chǎn)品說明書；提取的RNA可通過低濃度(W/V0.6%)瓊脂糖凝膠電泳檢測，恒壓200v電泳5min,放入EB中染色Imin即可觀察RNA質(zhì)量,一般會有三條明顯條帶出現(xiàn)；(7) DNaseI 處理(Fermentas)
權(quán)利要求
1.一種分尚的蛋白質(zhì)，其特征在于，所述蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO:1所不的氣基酸序列。
2.一種分離的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包含編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸具有SEQID N0:2所示的核苷酸序列。
4.一種分離的寡核苷酸，其特征在于，具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
5.一種構(gòu)建體，其特征在于，所述構(gòu)建體包含編碼SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
6.一種構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟: 將權(quán)利要求5所述的構(gòu)建體導(dǎo)入到植物細(xì)胞；以及 分離轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞， 任選地，所述植物細(xì)胞為煙草細(xì)胞。
7.一種提高植物抗病毒能力的方法，其特征在于，包括:降低所述植物中權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的表達， 任選地，所述病毒為TMV， 任選地，所述植物為煙草。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述降低植物中權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的表達，是通過使所述植物表達權(quán)利要求4所述的寡核苷酸而實現(xiàn)的， 優(yōu)選地，是通過向所述植物中引入權(quán)利要求5所述的構(gòu)建體實現(xiàn)的。
9.一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于，包括以下步驟: 通過利用攜帶權(quán)利要求4所述構(gòu)建體的農(nóng)桿菌對所述植物的葉片進行轉(zhuǎn)化；以及 基于經(jīng)過轉(zhuǎn)化的植物葉片，獲得轉(zhuǎn)基因植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述植物為煙草。
全文摘要
本發(fā)明提供了MIP1基因及其應(yīng)用。MIP1基因編碼的蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。通過下調(diào)該蛋白的表達量，可以提高對病毒侵染的抵抗力。
文檔編號C07K14/415GK103204914SQ201310069679
公開日2013年7月17日 申請日期2013年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月5日
發(fā)明者劉玉樂, 趙晉平, 杜玉梅 申請人:清華大學(xué)