專利名稱：一種羅丹明b人工抗原及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種羅丹明B人工抗原及其制備方法和應(yīng)用。背景技術(shù)：
羅丹明B (Rhodamine B)俗稱玫瑰紅，花粉紅，是一種鄰苯二酚類的堿性熒光染料，由于其具有很好的熒光性質(zhì)，目前已廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測、有色玻璃、特色煙花爆竹和生物學(xué)染色等領(lǐng)域。羅丹明B的結(jié)構(gòu)如圖1所示。近些年來，實驗研究表明:羅丹明B可以明顯減少人纖維原細(xì)胞的數(shù)量，抑制其增殖；同時，它還可以抑制人血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的增殖。另外，經(jīng)動物試驗發(fā)現(xiàn):羅丹明B能引起皮下組織生肉瘤，具有潛在的致癌和致突變能力。歐美等國家和地區(qū)從1993年起明令禁止其在食品加工中使用。我國衛(wèi)生部也在2008年將其列入首批食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單之中。但是由于其價廉易得、色澤鮮亮持久等特點，仍然有一些不法食品生產(chǎn)、加工商違規(guī)、違法使用羅丹明染料。這一方面給國家的食品安全帶來了很大的隱患；另一方面，也給消費者的身心健康帶來嚴(yán)重威脅。目前，國內(nèi)外對食品中羅丹明B的常用檢測方法是高效液相色譜法(HPLC)、高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)。但是由于色譜法的樣品前處理復(fù)雜繁瑣，需要精密昂貴的檢測器和質(zhì)譜等儀器設(shè)備，同時還要有專門的技術(shù)人員操作儀器，很難達到快速、便捷的現(xiàn)場檢測要求，因此限制了其在許多檢測機構(gòu)尤其是基層檢測部門的大規(guī)模推廣使用。酶聯(lián)免疫檢測分析(Enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)由于具有特異性強、靈敏度高、簡便、快速等優(yōu)點，近些年來備受人們的關(guān)注。免疫分析是以抗體作為生物檢測器的分析技術(shù)，而羅丹明B作為小分子物質(zhì)，分子量為479，是半抗原，本身不具有誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的能力，不能直接通過它免疫動物而得到檢測所必須的抗體，因此，合成羅丹明B的人工抗原便成為建立其ELISA分析方法的首要步驟和關(guān)鍵所在。從羅丹明B分子結(jié)構(gòu)中可以看出:它本身含有羧基，因此不需要另行引入活性基團。本發(fā)明將羅丹明B分子直接以碳二亞胺為偶聯(lián)劑，在N-羥基琥珀酰亞胺
存在的情況下與載體蛋白偶聯(lián)從而得到羅丹明B的人工抗原。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是:
本發(fā)明主要是利用羅丹明B分子結(jié)構(gòu)本身含有的活性基團一羧基，為羅丹明B提供了一種人工抗原及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案是:
本發(fā)明所述的羅丹明B人工抗原為載體蛋白直接與羅丹明B分子中的羧基通過脫水縮合形成酰胺鍵而得，其結(jié)構(gòu)如圖1。將羅丹明B以碳二亞胺為偶聯(lián)劑，在N-羥基琥珀酰亞胺存在的情況下與載體蛋白偶聯(lián)從而得到羅丹明B的人工抗原，其結(jié)構(gòu)如圖2。

羅丹明B人工抗原的合成:1、將羅丹明B96mg、N, N-二環(huán)己基碳二亞胺41.2mg、N_輕基琥拍酰亞胺46mg混合,溶解于400ul經(jīng)無水處理的N，N-二甲基甲酰胺中，室溫密封攪拌過夜；
2、將混合液IOOOrpm,離心5分鐘，后吸取上層反應(yīng)液,將其緩慢逐滴加入到冰浴的IOuM的BSA溶液中，4°C攪拌反應(yīng)過夜；
3、將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至透析袋中，以PBS為透析液4°C透析7天，每12小時換一次透析液，以除去未反應(yīng)的羅丹明B等雜質(zhì)；
4、透析結(jié)束后，將反應(yīng)液離心，7000rpm，離心5分鐘，得羅丹明B的人工抗原。羅丹明B人工抗原的合成路線見圖3。本發(fā)明與已有技術(shù)相比其有益效果是:
目前所報道的羅丹明B人工抗原的制備方法中，主要是通過對羅丹明B的類似物一羅丹明123中的活性基團氨基進行修飾偶聯(lián)而來。雖然羅丹明123與羅丹明B的結(jié)構(gòu)相似，都具有苯環(huán)部分和羧基部分，但是與羅丹明B相比，羅丹明123結(jié)構(gòu)中苯環(huán)上所連接的是氨基，而不是兩個乙基，這樣就導(dǎo)致了其空間結(jié)構(gòu)在這一區(qū)域有著很大的不同；另一方面，由于羅丹明123結(jié)構(gòu)中帶有兩個氨基而直接引起了兩種物質(zhì)帶電情況具有很大的區(qū)另IJ，這兩方面的原因可能直接導(dǎo)致抗原決定簇的改變和抗原遞呈細(xì)胞對羅丹明B的識別和遞呈能力，最終導(dǎo)致產(chǎn)生的抗體具有很大的差異。本發(fā)明的優(yōu)勢在于我們根據(jù)羅丹明B自身帶有活性基團這一特點 ，不改變它的結(jié)構(gòu)，直接對其進行與載體的偶聯(lián)反應(yīng)，從而最大程度上保持了結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，因此將其免疫動物后有助于提高抗體的質(zhì)量。本發(fā)明所述羅丹明B人工抗原可用于酶聯(lián)免疫檢測分析。四

圖1羅丹明B結(jié)構(gòu)式
圖2羅丹明B人工抗原結(jié)構(gòu)式
圖3羅丹明B人工抗原的合成路線圖
圖4A羅丹明B與載體蛋白BSA偶聯(lián)物的紫外掃描圖譜
圖4B羅丹明B與載體蛋白OVA偶聯(lián)物的紫外掃描圖譜
五具體實施例方式 實施例1羅丹明B-BSA偶聯(lián)物
1、將羅丹明B96mg、N, N-二環(huán)己基碳二亞胺41.2mg、N_輕基琥拍酰亞胺46mg混合,溶解于400ul經(jīng)無水處理的N，N-二甲基甲酰胺中，室溫密封攪拌過夜；
2、將混合液IOOOrpm,離心5分鐘，后吸取上層反應(yīng)液,將其緩慢逐滴加入到冰浴的IOuM的BSA溶液中，4°C攪拌反應(yīng)過夜；
3、將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至透析袋中，以PBS為透析液4°C透析7天，每12小時換一次透析液，以除去未反應(yīng)的羅丹明B等雜質(zhì)；
4、透析結(jié)束后，將反應(yīng)液離心，7000rpm，離心5分鐘，得羅丹明B的人工抗原。實施例2羅丹明B-OVA偶聯(lián)物
1、將羅丹明B96mg、N, N-二環(huán)己基碳二亞胺41.2mg、N_輕基琥拍酰亞胺46mg混合,溶解于400ul經(jīng)無水處理的N，N-二甲基甲酰胺中，室溫密封攪拌過夜；
2、將混合液IOOOrpm,離心5分鐘,后吸取上層反應(yīng)液,將其緩慢逐滴加入到已經(jīng)冰浴的IOuM的OVA溶液中，4°C攪拌反應(yīng)過夜；3、將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至透析袋中，以PBS為透析液4°C透析7天，每12小時換一次透析液，以除去未反應(yīng)的羅丹明B等雜質(zhì)；
4、透析結(jié)束后，將反應(yīng)液離心，7000rpm，離心5分鐘，得羅丹明B的人工抗原。實施例3羅丹明B-BSA和羅丹明B-OVA偶聯(lián)物的鑒定
首先，采用紫外分光光度掃描的方法分別對羅丹明B-BSA (圖4A)和羅丹明B-OVA (圖4B)偶聯(lián)物進行鑒定，根據(jù)其特征吸收峰的變化及其峰形鑒定是否偶聯(lián)成功。羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品在560nm處有一強的吸收峰，而BSA和OVA的最大吸收峰在280nm左右，但是偶聯(lián)物在這兩個波長下均有吸收，這是由于兩種物質(zhì)偶聯(lián)后而引起的吸收峰疊加，表明兩者偶聯(lián)成功，計算得 出偶聯(lián)比約為1:6。
權(quán)利要求
1.一種羅丹明B的人工抗原，其結(jié)構(gòu)為:
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種羅丹明B人工抗原的合成方法，其特征在于合成步驟為: (1)將羅丹明B96mg、N,N- 二環(huán)己基碳二亞胺41.2mg、N-輕基琥拍酰亞胺46mg混合，溶解于400ul無水N，N- 二甲基甲酰胺中，室溫密封攪拌過夜； (2)將混合液離心，IOOOrpm,5分鐘，然后吸取上層反應(yīng)液，將其緩慢逐滴加入到冰浴的IOuM的BSA溶液中，4°C攪拌反應(yīng)過夜； (3)將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至透析袋中，以PBS為透析液4°C透析7天，每12小時換一次透析液，以除去未反應(yīng)的羅丹明B雜質(zhì)； (4)透析結(jié)束后，將反應(yīng)液離心，7000rpm，離心5分鐘，得羅丹明B的人工抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種羅丹明B人工抗原合成方法，其特征是偶聯(lián)劑為N，N-二環(huán)己基碳二亞胺或1-乙基-3-3 (3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺或N，N- 二異丙基碳二亞胺(DIC)0
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種羅丹明B人工抗原合成方法，其特征在于載體蛋白為牛血清白蛋白 Bovine serum albumin, BSA 或卵清蛋白 Ovalbumin, OVA。
5.權(quán)利要求1所述羅丹明B人工抗原在酶聯(lián)免疫檢測分析中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于免疫學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種羅丹明B人工抗原及其制備方法和應(yīng)用。由于羅丹明B分子結(jié)構(gòu)本身含有羧基，因此不需要另行引入活性基團。本發(fā)明將羅丹明B分子直接以碳二亞胺為偶聯(lián)劑，在N-羥基琥珀酰亞胺存在的情況下與載體蛋白偶聯(lián)從而得到羅丹明B的人工抗原。由于在最大程度上保持了其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，因此將其免疫動物后有助于提高抗體的質(zhì)量。整個方法簡單易行，操作簡便，人工抗原得率和純度高。
文檔編號C07K1/107GK103145830SQ20131007271
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月7日
發(fā)明者沈萍萍, 徐加發(fā) 申請人:南京大學(xué)