專利名稱：抗體與微珠連接方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗體與微珠連接方法。
背景技術(shù)：
自1979年將聚苯乙烯微珠成功磁化并與抗體連接后，即成為一種效果極佳的分離方法，引發(fā)了生物分離技術(shù)上的一次革命。該方法具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)分離速度快、效率高、可重復(fù)性好；(2)操作簡單、不需要昂貴的儀器設(shè)備；(3)比表面積大，可提高檢測靈敏度；(4)不影響被分離細(xì)胞或其它生物材料的生物學(xué)性狀和功能。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及納米技術(shù)的推廣，納米材料已在生命科學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。磁性納米微珠作為一種新型的納米技術(shù)，已經(jīng)成功應(yīng)用于核酸提取、廢水處理、靶向藥物、食品安全檢測等系統(tǒng)上，并取得一定的進(jìn)展。包被技術(shù)的進(jìn)步能大大擴(kuò)展磁性微珠的應(yīng)用范圍。因此，研究微珠表面的連接技術(shù)與方法，將使其運(yùn)用至更廣闊的分離、檢測領(lǐng)域，并將極大地提高檢測靈敏度。食品安全事關(guān)廣大人民群眾的身體健康，受到政府和老百姓的高度關(guān)注。近年來食品質(zhì)量問題十分突出，非法使用違禁藥物、濫用抗生素，超量超范圍使用獸藥等都對群眾身體健康造成了很大危害。針對以上問題，一方面要加強(qiáng)監(jiān)管；另一方面要開發(fā)特異性的快速分離、檢測方法。對磁性微珠表面包被特異性的抗體將是一種較為簡便且高效的檢測方面。包被方法多樣，較為常用的是將抗體直接通過基團(tuán)作用固定至微珠表面。然而此種方法靈敏度有限，抗體在微珠上的非特異性吸附將大大降低其檢測效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解 決的技術(shù)問題是提供一種能提高檢測靈敏度的抗體與微珠連接方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種抗體與微珠連接方法，包括以下步驟:1)、抗體與核苷酸交聯(lián):A、抗體的修飾與脫鹽:25 lOOu g免疫球蛋白(Immunoglobulin,簡稱IgG)稀釋成濃度為2 8mg/mL后與 SANH (Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone)均勻混合后，于20 30°C的搖床中孵育修飾2 6小時，SANH與免疫球蛋白的摩爾比為10 70:1 ;將所得的抗體修飾產(chǎn)物經(jīng)洗滌、離心過濾，以除去多余的SANH ;得脫鹽后的抗體修飾產(chǎn)物；測IgG的蛋白濃度，待用(目的是:計算修飾、脫鹽步驟后抗體的回收率，避免因為超濾膜或操作問題導(dǎo)致樣品過分損失。)B、核苷酸的修飾與脫鹽:用pH7.0 7.6的磷酸緩沖液將核苷酸(寡核苷酸)稀釋至6 12mg/mL，加入SFB(Succinimidyl 4-formylbenzoate)均勻混合,于20 30°C的搖床中孵育修飾2 6小時，SFB與核苷酸(寡核苷酸)的摩爾比為10 70:1 ;備注說明:上述核苷酸序列為GGGAA ATCTC TGCAG GCAAA TGTGA (5， 3’)，3’端修飾了氨基；將所得的核苷酸修飾產(chǎn)物經(jīng)洗滌、離心、過濾，以除去多余的SFB ;得脫鹽后的核苷酸修飾產(chǎn)物；測核苷酸濃度，待用(目的是計算修飾、脫鹽步驟后寡聚核苷酸的回收率，避免因為超濾膜或操作問題導(dǎo)致樣品過分損失。)C、修飾后抗體與核苷酸的交聯(lián)與純化將脫鹽后的抗體修飾產(chǎn)物(為修飾成功的脫鹽后的抗體修飾產(chǎn)物)和脫鹽后的核苷酸修飾產(chǎn)物(為修飾成功的脫鹽后的核苷酸修飾產(chǎn)物)按照1:8 12的摩爾比均勻混合，于2 8°C充分反應(yīng)8 24小時，將所得的交聯(lián)后產(chǎn)物經(jīng)洗滌、離心、過濾，除去游離寡核苷酸并進(jìn)行脫鹽；得純化后的抗體一核苷酸交聯(lián)體 ；在350nm下測定吸光值，待用(抗體和寡核苷酸的修飾基團(tuán)在交聯(lián)的過程中生成穩(wěn)定存在的腙鍵，該腙鍵在350nm下有特異吸收峰；因此測定350nm是否有明顯吸收峰生成是驗證交聯(lián)成功的有力證明；通過測定350nm下特異吸收峰值，可進(jìn)一步計算出交聯(lián)產(chǎn)物的濃度);2)、抗體一核苷酸交聯(lián)體與微珠作用:微珠先經(jīng)洗滌液洗滌，然后靜置；將I 9Xl(Tnmol biotin 修飾的核苷酸(序列為 TCACA TTTGC CTGCA GAGATTTCCC5’ 3’，3’ biotin修飾)加入5 15 y I的Neutravidin包被的磁珠，于20 30°C的搖床孵育10 30分鐘，接著用洗滌液洗滌；隨后加入上述5 IOX 10_13mol純化后的抗體一核苷酸交聯(lián)體，在6XSSPE緩沖液(pH6.0)條件下于20 30°C的搖床孵育I 4小時，再用洗滌液洗滌；得微珠體系；所述洗滌液為將BSA用PBS溶液(pH7.4)稀釋至質(zhì)量濃度為0.1 0.5%而得。備注說明:步驟A所得的脫鹽后的抗體修飾產(chǎn)物和步驟B所得的脫鹽后的核苷酸修飾產(chǎn)物分別通過對硝基苯甲醛與2-肼吡啶二鹽酸鹽鑒定基團(tuán)修飾是否成功；方法為各取少量脫鹽后的抗體修飾產(chǎn)物或脫鹽后的核苷酸修飾產(chǎn)物，分別加入過量對硝基苯甲醛、2-肼吡啶二鹽酸鹽，避光孵育后，測定產(chǎn)物基團(tuán)在特定波長下的吸光值。當(dāng)抗體鑒定產(chǎn)物在390nm下有特異吸收峰，則判定修飾成功；當(dāng)寡核苷酸鑒定產(chǎn)物在350nm下有特異吸收峰，則判定為修飾成功。作為本發(fā)明的抗體與微珠連接方法的改進(jìn):將所得的微珠體系進(jìn)行如下步驟:在Cy3標(biāo)記的熒光二抗或轉(zhuǎn)基因蛋白中加入微珠體系，在20 30°C條件下?lián)u床孵育I 4小時；接著用PBS (pH7.4)洗去未結(jié)合的熒光二抗或轉(zhuǎn)基因蛋白，最后用熒光顯微鏡觀察結(jié)果。備注說明:在熒光顯微鏡下觀察到熒光信號，則證明抗體已成功通過寡核苷酸的“聯(lián)系”連接到了磁珠的表面。作為本發(fā)明的抗體與微珠連接方法的進(jìn)一步改進(jìn):Cy3標(biāo)記的熒光二抗與PBS緩沖液(pH7.4)的體積比為:1:10 30。作為本發(fā)明的抗體與微珠連接方法的進(jìn)一步改進(jìn):
步驟I) A中:搖床的轉(zhuǎn)速為50 150轉(zhuǎn)/分；用pH8的0.1mM的EDTA溶液進(jìn)行洗漆;步驟I )B中:搖床的轉(zhuǎn)速為50 150轉(zhuǎn)/分；用pH8的0.1mM的EDTA溶液洗滌；步驟I) C中:將所得的交聯(lián)后產(chǎn)物用pH8的0.1mM的EDTA溶液洗滌。在步驟I)的A中:孵育完后收集修飾產(chǎn)物，將產(chǎn)物移入密理博的YM-100 (截留分子量大于IOOOOKDa的生物分子)濾管里面，用PH8的0.1mM的EDTA溶液洗滌、離心過濾2 4次，除去多余的SANH修飾劑，然后倒扣濾管離心，收集脫鹽后的修飾產(chǎn)物。測IgG的蛋白濃度，待用。在步驟I)的B中:孵育完后收集修飾產(chǎn)物，將產(chǎn)物移入密理博的YM-3 (截留分子量大于3000KDa的生物分子)濾管里面，用PH8的0.1mM的EDTA溶液洗滌、離心過濾2 4次，除去多余的SFB修飾劑，然后倒扣濾管離心，收集脫鹽后的核苷酸修飾產(chǎn)物。測核苷酸濃度，待用。在步驟I)的C中:由于交聯(lián)后產(chǎn)物需要再次純化，交聯(lián)完后收集交聯(lián)后產(chǎn)物，將產(chǎn)物移入密理博的YM-100 (截留分子量大于IOOOOKDa的生物分子)濾管里面，用pH8的0.1mM EDTA溶液洗滌、離心過濾2 4次，除去未交聯(lián)的多余的核苷酸單體，然后倒扣濾管離心，收集純化后交聯(lián)產(chǎn)物。在350nm下測定吸光值，待用。在本發(fā)明中，任意一種抗體均可被固定到微珠上；與抗體交聯(lián)的寡核苷酸長度一般在20-23個堿基，3’端修飾氨基，從而能夠通過本發(fā)明所述的方法與抗體交聯(lián)。選用的磁珠預(yù)先包被了抗生物素蛋白 ；與磁珠表面連接的寡核苷酸必須與抗體交聯(lián)的寡核苷酸對應(yīng)互補(bǔ)，并在3’端修飾有生物素，從而能夠如本發(fā)明的方法與磁珠表面連接。具體而言，本發(fā)明開發(fā)了一種新型的抗體與微珠相連的方法，成功的對抗體與核苷酸進(jìn)行交聯(lián)，并保持其良好活性。本發(fā)明的連接方法是將帶有生物素(biotion)的互補(bǔ)核苷酸鏈與包被有親和素(Neutravidin)微珠連接后,通過兩條核苷酸鏈雜交的方式,將抗體-核苷酸交聯(lián)體連接到微珠表面來完成抗體與微珠的相連，最后以Cy3標(biāo)記的二抗鑒定是否連接成功。具體原理如圖1所示。本發(fā)明的抗體與微珠交聯(lián)方法:包括抗體與核苷酸交聯(lián)，核苷酸與微珠結(jié)合，核苷酸互補(bǔ)鏈雜交等流程?？贵w與核苷酸交聯(lián)包括抗體的修飾與脫鹽、核苷酸的修飾與脫鹽、修飾后抗體與核苷酸的交聯(lián)與純化等步驟。本發(fā)明是以雙功能基團(tuán)為核苷酸和抗體作修飾，通過醛基與氨基使其結(jié)合形成腙鍵結(jié)合。在本發(fā)明中，核苷酸與微珠的結(jié)合是由微珠上包被的親和素與核苷酸鏈上修飾的生物素特異性吸附完成的；核苷酸互補(bǔ)鏈雜交通過特定的雜交液在一定溫度條件下完成；通過Cy3標(biāo)記的二抗在特定溫度條件下孵育鑒定微珠上反應(yīng)是否成功。本發(fā)明的抗體與微珠連接方法，具有如下優(yōu)點(diǎn):1、寡核苷酸作為“支撐臂”，將抗體與磁珠表面隔開一定距離，有利于避免抗體遭結(jié)構(gòu)破壞，保護(hù)抗體活性。2解決了抗體固定于固相載體時的活性基團(tuán)衍向問題。3、提高抗體與其他物質(zhì)反應(yīng)的靈活性。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖1為抗體與微珠交聯(lián)方法原理圖。圖2為抗體與微珠成功交聯(lián)后熒光二抗鑒定圖像。
具體實施例方式實施例1、兔免疫球蛋白(IgG)與磁珠的連接:I)、兔免疫球蛋白(IgG)與核苷酸交聯(lián)A、兔免疫球蛋白(IgG)的修飾與脫鹽將50 U g的兔免疫球蛋白(Rabbit Immunoglobulin,簡稱Rabbit IgG)用修飾緩沖液(IOOmM磷酸鹽、150mM氯化鈉，pH7.2-7.4)稀釋成濃度為6mg/mL ;然后用SANH溶液(濃度為 6.89Xl(T2mol/L)修飾，SANH 與 Rabbit IgG 的摩爾比為 60:1。將 SANH 溶液與 RabbitIgG溶液均勻混合后，放置于25°C的搖床中，以100轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速孵育修飾4小時。孵育完后將產(chǎn)物移入密理博的YM-100濾管里面，用pH8的0.1mM EDTA溶液洗滌、離心(5000轉(zhuǎn)/分)過濾3次，以除去多余的SANH修飾劑，然后倒扣濾管離心(5000轉(zhuǎn)/分)，收集脫鹽后的抗體修飾產(chǎn)物。測Rabbit IgG的蛋白濃度為2.44mg/mL,待用。將以上步驟所得的脫鹽后的抗體修飾產(chǎn)物取少量，通過與對硝基苯甲醛(4-nitrobenzaldehyde)反應(yīng)鑒定基團(tuán)修飾是否成功(反應(yīng)如下)；
權(quán)利要求
1.抗體與微珠連接方法，其特征是包括以下步驟: 1)、抗體與核苷酸交聯(lián): A、抗體的修飾與脫鹽: 25 100 ii g免疫球蛋白稀釋成濃度為2 8mg/mL后與SANH均勻混合后，于20 30V的搖床中孵育修飾2 6小時，SANH與免疫球蛋白的摩爾比為10 70:1 ； 將所得的抗體修飾產(chǎn)物經(jīng)洗滌、離心過濾，以除去多余的SANH ;得脫鹽后的抗體修飾產(chǎn)物； B、核苷酸的修飾與脫鹽: 用pH 7.0 7.6的磷酸緩沖液將核苷酸稀釋至6 12 mg/mL，加入SFB均勻混合，于20 30 °C的搖床中孵育修飾2 6小時，SFB與核苷酸的摩爾比為10 70:1 ; 將所得的核苷酸修飾產(chǎn)物經(jīng)洗滌、離心、過濾，以除去多余的SFB ;得脫鹽后的核苷酸修飾產(chǎn)物； C、修飾后抗體與核苷酸的交聯(lián)與純化 將脫鹽后的抗體修飾產(chǎn)物和脫鹽后的核苷酸修飾產(chǎn)物按照1:8 12的摩爾比均勻混合，于2 8 V充分反應(yīng)8 24小時， 將所得的交聯(lián)后產(chǎn)物經(jīng)洗滌、離心、過 濾，除去游離寡核苷酸并進(jìn)行脫鹽；得純化后的抗體一核苷酸交聯(lián)體； 2)、抗體一核苷酸交聯(lián)體與微珠作用: 微珠先經(jīng)洗滌液洗滌，然后靜置； 將I 9X ICT11 mo I biotin修飾的核苷酸加入5 15 U I的Neutravidin包被的磁珠，于20 30 °C的搖床孵育10 30分鐘，接著用洗滌液洗滌；隨后加入上述5 IOX 10_13mo I純化后的抗體一核苷酸交聯(lián)體，在6X SSPE緩沖液(pH 6.0)條件下于20 30 °C的搖床孵育I 4小時，再用洗滌液洗滌；得微珠體系； 所述洗滌液為將BSA用PBS溶液(pH 7.4)稀釋至質(zhì)量濃度為0.f 0.5 %而得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體與微珠連接方法，其特征是: 將所得的微珠體系進(jìn)行如下步驟: 在Cy3標(biāo)記的熒光二抗或轉(zhuǎn)基因蛋白中加入微珠體系，在20 30 1:條件下?lián)u床孵育I 4小時；接著用PBS (pH 7.4)洗去未結(jié)合的熒光二抗或轉(zhuǎn)基因蛋白，最后用熒光顯微鏡觀察結(jié)果。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體與微珠連接方法，其特征是: 所述步驟I) A中:搖床的轉(zhuǎn)速為50 150轉(zhuǎn)/分；用pH 8的0.1 mM的EDTA溶液進(jìn)行洗滌； 所述步驟I) B中:搖床的轉(zhuǎn)速為50 150轉(zhuǎn)/分；用pH 8的0.1 mM的EDTA溶液洗滌； 所述步驟I) C中:將所得的交聯(lián)后產(chǎn)物用pH 8的0.1 mM的EDTA溶液洗滌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗體與微珠連接方法，包括抗體與核苷酸交聯(lián)，核苷酸與微珠結(jié)合，核苷酸互補(bǔ)鏈雜交等流程?？贵w與核苷酸交聯(lián)包括抗體的修飾與脫鹽、核苷酸的修飾與脫鹽、修飾后抗體與核苷酸的交聯(lián)與純化等步驟。本發(fā)明是以雙功能基團(tuán)為核苷酸和抗體作修飾，通過醛基與氨基使其結(jié)合形成腙鍵結(jié)合。在本發(fā)明中，核苷酸與微珠的結(jié)合是由微珠上包被的親和素與核苷酸鏈上修飾的生物素特異性吸附完成的；核苷酸互補(bǔ)鏈雜交通過特定的雜交液在一定溫度條件下完成；通過Cy3標(biāo)記的二抗等在特定溫度條件下孵育鑒定微珠上反應(yīng)是否成功。 本發(fā)明以寡核苷酸作為“支撐臂”，將抗體與磁珠表面隔開一定距離，有利于避免抗體遭結(jié)構(gòu)破壞，保護(hù)抗體活性。
文檔編號C07K17/00GK103159854SQ201310072939
公開日2013年6月19日 申請日期2013年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月7日
發(fā)明者鄭曉冬, 殷赟, 沙莎 申請人:浙江大學(xué)