專利名稱：一種單環(huán)刺螠血紅蛋白及其分離純化和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及蛋白的分離純化及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
:海洋是人類有待開發(fā)的巨大寶貴藥物寶藏。經(jīng)全球海洋科學(xué)家們30多年的潛心研究，海洋生物已在醫(yī)藥材料、藥物和工具藥等方面呈現(xiàn)出巨大的市場潛力。臨床應(yīng)用的海洋資源產(chǎn)品函蓋了抗腫瘤、抗病毒、抗血栓、抗炎、工具藥與控劑以及保健品和化妝品等。研究表明，20%左右的海洋生物提取物或化合物，顯示了類型各異強(qiáng)度不同的生物活性。臨床試驗結(jié)果表明，海洋資源藥物通常展現(xiàn)了生物活性高和可選擇性強(qiáng)等特點(diǎn)，開發(fā)潛力顯而易見。美國、日本等國在海洋資源的利用與海洋藥物研發(fā)方面領(lǐng)先全球，并已獲得一批進(jìn)入II期臨床抗腫瘤的海洋藥物。研究發(fā)現(xiàn)，大量海洋動物的提取物具有抗病毒功能而不干擾機(jī)體正常細(xì)胞的代謝，為研 發(fā)新的抗病毒藥物提供了廣闊的空間。第一個抗病毒海洋資源藥物々作4(&作1^11081(16)，于1955年被美國FDA批準(zhǔn)用于治療人眼皰疹感染。鑒于海洋藥用資源開發(fā)的誘人前景，人們越來越重視把尋找高效、特異、安全的生物活性藥物的目光投向浩瀚的海洋。單環(huán)刺婦(Urechis unicinctus)俗名“海腸子”,體呈長圓筒形,體壁較厚,體表光滑，顆粒極細(xì)微，吻短，略呈圓錐形，與身體無明顯的分界，腹面有纖毛溝，口位于其底部。在口的后方，身體腹面有I對剛毛。身體后端純圓，肛門位于末端中央，周圍有I圈后剛毛，約10 13個。身體柔軟，生活時灰白色，酒精浸泡后為淡紅色或紅褐色。體長不等，一般長160 200mm，粗18 25mm。棲息于泥沙中，作“U”字形管自居，兩管口間距離約300mm。單環(huán)刺縊是無管縊目，在我國沿海分布的唯一種類。單環(huán)刺縊在種屬上介于軟體動物和環(huán)節(jié)動物之間，廣泛分布于福建、浙江、大連、煙臺等地；一年四季皆可采獲，資源十分豐富。在閩臺，煙臺等地成為一道享譽(yù)內(nèi)外的名菜。然而，沿海居民在加工制作單環(huán)刺縊海鮮時，通常錯誤地認(rèn)為，單環(huán)刺縊(海腸子體腔液不具任何利用價值，而被當(dāng)成海鮮加工污水排放，不僅浪費(fèi)了資源，也污染了人居和近海海域環(huán)境。長期以來，中外學(xué)者對于單環(huán)刺縊的研究，主要集中在單環(huán)刺縊水產(chǎn)養(yǎng)殖、單環(huán)刺縊在脅迫下的生理變化、營養(yǎng)成分、營養(yǎng)價值及凝集素的情況等。其中主要有從單環(huán)刺縊體腔壁中分離提取凝集素藥用價值及活性成分的研究。[Li F.L.等 Journal of Ocean University Qingdao, 1994，24:203-210.；YasuhiroOzeki 等 Comp.Biochem.Physiol.1997，118B (I):1-6。]。在動物血液中含量最多的蛋白是血紅蛋白，占血液蛋白的60% 70%，而血液中蛋白質(zhì)的含量高達(dá)17% 18%。血紅蛋白含有8種必需氨基酸。許多研究證實，血紅蛋白生物活性肽在體內(nèi)還具有一系列重要的生物活性，如阿片樣活性、ACE抑制活性、增強(qiáng)血管舒緩激肽活性、刺激細(xì)菌生長活性、鎮(zhèn)痛活性、抗菌活性及抗氧化活性等。然而，迄今尚未見有研究本發(fā)明所述單環(huán)刺縊血紅蛋白及其功能的相關(guān)報道
發(fā)明內(nèi)容
:
本發(fā)明對海洋生物單環(huán)刺婦進(jìn)行了其血紅蛋白(Urechis unicinctushemoglobin, UU-Hb)的分離純化、基因克隆、序列測定和分析等項研究。本發(fā)明提供的一種單環(huán)刺縊血紅蛋白UU-Hb，是源自單環(huán)刺縊腔液，其基因序列為423bp(SEQ N0.1)，編碼141個氨基酸(SEQ N0.2)，分子量為15019.576Da。所述研究包括:從單環(huán)刺縊腔液中分離蛋白；硫酸銨梯度鹽析，DEAE陰離子和分子篩層析，通過聚丙烯變性電泳分離蛋白后，轉(zhuǎn)膜到PVDF上，測定N端序列，并設(shè)計相應(yīng)的引物；提取單環(huán)刺縊體壁和體腔細(xì)胞的總RNA，RT-PCR獲得目的基因片段，連接到質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌；并進(jìn)一步提取質(zhì)粒，測定序列；以蛋白質(zhì)N端為5’序列設(shè)計引物及以基因終止密碼子反向互補(bǔ)序列上游20堿基為3’引物；通過PCR得到目的基因，測序進(jìn)一步鑒定正確性。具體技術(shù)路線如圖1所示。研究結(jié)果確證:變性SDS-PAGE顯示蛋白的純化過程，質(zhì)譜測定其分子量為15kD左右。本發(fā)明成功地測定了其N端序列，并通過cDNA克隆獲得了單環(huán)刺縊血紅蛋白基因的序列。本發(fā)明首次公開了一種源自單環(huán)刺縊體腔液中血紅蛋白的基因序列，并克隆獲得該基因。本發(fā)明初步生物活性實驗結(jié)果表明，所述單環(huán)刺縊血紅蛋白對金黃色葡萄球菌具有一定的抗菌活性，為進(jìn)一步研發(fā)成為臨床有效的抗菌藥物提供了依據(jù)。本發(fā)明還提供了所述血紅蛋白的藥物組合物，它是以單環(huán)刺縊血紅蛋白UU-Hb為有效成分，與藥學(xué)上可接受的一種或多種載體所組成。本發(fā)明還提供了所述組合物在制備抗感染藥物中的應(yīng)用。


:圖1 — UU-Hb基因的克隆路線

圖2 — SDS PAGE鑒 定UU-Hb硫酸銨梯度層析結(jié)果其中:1 — 30-40%硫酸銨飽和度鹽析；2 - 40-50%鹽析；3 — 50-60%鹽析；4 —60-70%飽和度鹽析；5 —蛋白分子量marker圖3 — UU-Hb陰離子柱層析其中:1、2 —以磷酸鹽緩沖液洗脫；3，4，5 —分別以0.1,0.3,0.5%NaCl濃度洗脫；橫座標(biāo)一時間；縱座標(biāo)一 A280nm圖4 一自然PAGE鑒定蛋白陰離子柱層析結(jié)果其中:1 —蛋白marker ；2 — DEAE柱層析2號峰收集樣品圖5 — SDS PAGE鑒定分子篩層析結(jié)果其中:1—蛋白 marker (117KD, 90KD, 49KD, 35KD, 26KD, 19KD) ；2 — S-100 層析 2
號峰收集樣品圖6 —質(zhì)譜測定蛋白的分子量其中:橫坐標(biāo)一分子量(Da);縱坐標(biāo)一強(qiáng)度(a.u)圖7 —轉(zhuǎn)膜后考馬斯染色結(jié)果Uu-Hb 轉(zhuǎn)印8 — UU-Hb cDNA 電泳鑒其中:1— DNA maker ；2 — cDNA 第一條鏈
圖9 — UU-HbPCR 產(chǎn)物鑒定其中:1— DNA maker ;2，3 —分別為 cDNA PCR 產(chǎn)物 I 和 具體實施方式
:《實施例1》UU-Hb樣品制備1、UU-Hb的分離和濃縮方法:取50ml單環(huán)刺婦體腔液,在12000rpm下離心IOmin,取上清。在上清中加入硫酸銨至硫酸銨飽和度的30%，40C，放置12h，4°C，IOOOOrpm離心15min，收集沉淀。上清液再進(jìn)行硫酸銨梯度鹽析以硫酸銨終飽和度達(dá)到40%、50%、60%、70%，重復(fù)上面離心，并收集沉淀，以純凈水溶解沉淀并放在分子量為IOkDa的透析袋中，以純凈水為透析緩沖液透析，直至用1% BaCl2檢測沒有白色沉淀。分別取透析后的樣品SDS-PAGE電泳鑒定。結(jié)果:SDS電泳結(jié)果見圖2。由于血紅蛋白在體腔中含量最多，且蛋白表征為紅色蛋白，所以可以清楚快速地鑒定。即單環(huán)刺縊體血紅蛋白含量在硫酸銨30-40%鹽析>硫酸銨40-50% >硫酸銨50-60% >硫酸銨60-70%，且血紅蛋白純度關(guān)系30-40%鹽析>硫酸銨40-50% >硫酸銨50-60% >硫酸銨60-70%。因此本實驗得到鹽析步驟為30%鹽析去沉淀，繼續(xù)硫酸銨50%離心收集沉淀，透析除鹽，冷凍干燥保存，得到Uu-Hb粗品。2、DEAE Sepharose Fast Flow 層析方法:以DEAE Sepharose Fast Flow為填料,柱內(nèi)徑為1.5cm,高為IOcm,以冰浴
0.0lM磷酸緩沖液(PH7.4)平衡，逐步以洗脫液為含0.1,0.2,0.3,0.4,0.5MNaCl的0.0lM磷酸緩沖液(PH7.4)洗脫。流速5mL/min，紫外檢測波長為280nm。結(jié)果:見圖3，為 DEAE層析圖，其中橫坐標(biāo)為:時間(min)，縱坐標(biāo):為280nm吸光度(mv)。自然凝膠電泳考馬斯亮藍(lán)染色后只有一條帶，說明達(dá)到電泳純見圖4。3> Sephacryl S-100 凝膠層析方法:凝膠排阻色譜以S^hacryl S-100 (凝膠分離分子量的范圍為100000 5000Da)為固定相，柱規(guī)格內(nèi)徑為3cm，柱長為lm，柱溫為:4°C，以冰浴0.0lM磷酸緩沖液(PH7.4)平衡，流速為1.5mL/min，洗脫液PBS (pH7.4)。紫外檢測波長為280nm。4、SDS凝膠電泳用于蛋白純度的鑒定方法:采用SDS PAGE垂直平板式電泳，分離膠濃度為17%，pH8.8，濃縮膠濃度為5%，pH6.8，電極緩沖液采用Tris-甘氨酸，pH8.3，在濃縮膠的電流為5mA，時間為30min。分離膠電流為12mA，電泳時間為90min。電泳后用20%的三氯乙酸固定，考馬斯亮藍(lán)R250染色，脫色液(45%乙醇，5%的乙酸)脫色。單環(huán)刺縊上清濃縮液5ul上樣，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)采用碧云天P0066 (117KD, 90KD, 49KD, 35KD, 26KD, 19KD)。SDS凝膠電泳考馬斯亮藍(lán)染色后只有一條帶，進(jìn)一步說明達(dá)到電泳純見圖5。5、質(zhì)譜測定蛋白分子量方法:儀器:BrukerAutoflex MALD1- TOF mass spectrometer, Operationmode:Linear mode, Matrix:sinapinic acid(SA)0結(jié)果:測定圖譜單一明顯，測定UU - Hb的分子量為15019.576Da，見圖6。《實施例2》UU-HbN端序列測定1、轉(zhuǎn)膜
方法:UU_Hb非變性凝膠電泳后，采用濕電轉(zhuǎn)印法，CAPS(3-(環(huán)己胺)-1_丙磺酸鈉)轉(zhuǎn)印緩沖液(2.213g/1000ml，10%甲醇)，4°C，240V電轉(zhuǎn)印PVDF膜3h。轉(zhuǎn)印后分別對膠和PVDF膜考馬斯亮藍(lán)染色。結(jié)果:PVDF膜上顯示蛋白順利UU-Hb轉(zhuǎn)印成功，見圖7，而余膠染色后沒有條帶。2、N端序列測定方法:米用Edman法對UU-HbN端測定。結(jié)果:UU-Hb N端前十個氨基酸的序列為NH2-G - L-T-G - A-Q-1-D-A-1?！秾嵤├?》UU-Hb cDNA的制備1、總RNA提取按照TRIZOL法進(jìn)行:取新鮮單環(huán)刺縊取體壁組織和體腔，迅速放于液氮預(yù)冷的研缽中冷凍。取組織塊50-100 mg在液氮中研磨成粉末，加入ImlTrizol研磨。加入總體積五分之一的氯仿，室溫靜置5min, 12000g4°C離心15min,將上清夜轉(zhuǎn)移到一新離心管中，加入與上清液等提及的異丙醇，室溫靜置lOmin，12000g4°C離心IOmin,向沉淀中加入IML的75%乙醇清洗沉淀，12000g4°C離心5min，棄上清保留沉淀，室溫干燥，溶解于適量的DEPC處理水中。2、cDNA的制備:按照TAKARA公司RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行。(I) cDNA第一鏈的合成，以O(shè)ligo(dT)為引物。(2)cDNA第二鏈的合成，以測得N端氨基酸序列設(shè)計引物并加入Nde I酶切位點(diǎn)，引物為:5’ -AGACATATGGGNYTNACNGGNGCNCARATHGAYGC(3)在雙鏈cDNA的末端分別連接EcoR I，Nde I接頭。PCR以引物I 5’ -AGACATATGGGNYTNACNGGNGCNCARATHGAYGC-3’Nde I引物2 5 ‘-AGAGAATTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3，EcoR I為引物，以Taq酶擴(kuò)增目的基因。分別對cDNA第一鏈和PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定:
1.5%的瓊脂糖，以TAE為電泳緩沖液，65v，30min，紫外燈下鑒定，并回收DNA。結(jié)果:取cDNA第一鏈電泳后有cDNA產(chǎn)生見圖8，取PCR產(chǎn)物電泳后發(fā)現(xiàn)分別含有300bp和700bp兩條帶見圖9。由于測定蛋白的分子量為15KDa左右，所以排除DNA為300bp的可能性。所以下面實驗只分析700bp PCR片段?！秾嵤├?》UU-HbcDNA的克隆及基因序列測定1、雙鏈cDNA的連接和轉(zhuǎn)化方法:0.5ul雙鏈cDNA與Iul PMD18-T載體加入3.5ul的滅菌蒸餾水，并加入5ul溶液I在16°C連接lh。連接產(chǎn)物IOul加入IOOul感受態(tài)Ecoli DH5中，依次冰上20min，42°C水浴90s，冰中5min。加入500 y L LB培養(yǎng)基(不含抗菌素)，37°C震蕩(200rpm)lh。取200ul涂布于含100ug/ml氨芐青霉素LB瓊脂糖平板上，37°C培養(yǎng)2h，37°C倒置培養(yǎng)14h至菌落形成。菌落PCR鑒定氨芐青霉素抗性菌落。在0.5ml PCR微量離心管中配制25iUPCR
反應(yīng)體系。
權(quán)利要求
1.一種單環(huán)刺縊血紅蛋白UU-Hb，其特征是，所述蛋白源自單環(huán)刺縊腔液，其基因序列為 423bp (SEQ N0.1)，編碼 141 個氨基酸(SEQ N0.2)，分子量為 15019.576Da。
2.制備權(quán)利要求1所述血紅蛋白UU-Hb的方法，其特征是，所述方法主要包括以下步驟: A)硫酸銨梯度鹽析； B)透析除鹽冷凍干燥，得到粗品； C)DEAE陰離子層析，用含NaCl梯度的磷酸緩沖液進(jìn)行洗脫； D)Sephacryl S-100分子篩和磷酸緩沖液進(jìn)行凝膠層析，得到純化蛋白。
3.權(quán)利要求1所述血紅蛋白UU-Hb在制備抗感染藥物中的應(yīng)用。
4.以權(quán)利要求1或2所述血紅蛋白UU-Hb為有效成分，與藥學(xué)上可接受的一種或多種載體組成的組合物。
5.權(quán)利要求4所述組合物 在制備抗感染藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種單環(huán)刺螠血紅蛋白及其分離純化和應(yīng)用，所述蛋白系源自單環(huán)刺螠腔液，核苷酸和氨基酸序列分析表明其屬于新的蛋白，生物學(xué)活性實驗結(jié)果表明，所述蛋白具有一定的抗菌作用，有望進(jìn)一步研究開發(fā)成為臨床有效的抗感染藥物。
文檔編號C07K1/18GK103145833SQ20131007828
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月11日
發(fā)明者許瑞安 申請人:許瑞安