專利名稱：源于稻瘟病菌的真菌致病性基因Movma11及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物病理學(xué)和微生物基因工程領(lǐng)域，提供了一個來源于稻瘟病菌的、在營養(yǎng)生長、孢子產(chǎn)生、附著胞形成致病性中起重要作用的新基因Movmall的編碼區(qū)的核苷酸序列及其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
背景技術(shù)：
由稻痕病菌(Magnaporthe Oryzae)引起的稻痕病是世界性的一種水稻上的毀滅性病害。世界上每年由稻瘟病造成的水稻產(chǎn)量損失在1(Γ30%之間。我國幾乎每年都有稻瘟病菌的流行爆發(fā)。最近的2005年，四川省和重慶市遭受到10年來最嚴重的稻瘟病，四川省共有20個市、127個縣的230萬畝稻田發(fā)生稻瘟病，重慶市共有100多萬畝稻田發(fā)生稻瘟病菌；這次稻瘟病流行迅速、危害程度重、發(fā)病水稻品種多、對水稻產(chǎn)量影響嚴重。除了水稻外，稻痕病菌也能侵染其它50多種禾本科植物,也對小米(Eleusine coracana)、大麥(Hordeum vulgare)、小麥(Triticum aestivum)等重要農(nóng)作物造成嚴重的危害。稻痕病菌也是一種研究植物病原真菌一寄主植物相互作用的模式生物，具有許多病原真菌共有的植物致病侵染循環(huán)，包括孢子產(chǎn)生、萌發(fā)、附著胞形成、侵染栓形成、侵入菌絲生長等致病過程；許多發(fā)達國家正在進行研究其致病分子機制，期望通過此類研究設(shè)計出新型農(nóng)藥篩選的藥靶，從而開發(fā)、設(shè)計新型抗真菌藥物。稻瘟病菌的生活史包括有性階段和無性階段。有性階段由2個不同交配型的菌株交配后產(chǎn)生子囊和子囊孢子。稻瘟病菌 的交配型由交配基因MATl — I和MATl — 2控制。無性階段為營養(yǎng)菌絲分化產(chǎn)生分生孢子梗和梨形分生孢子。在自然界，稻瘟病菌主要通過無性階段完成生活史，而分生孢子是植物的主要侵入源。稻瘟病菌無性孢子落到水稻葉片表面后，侵染過程開始。當孢子與水相遇后，孢子頂端分隔內(nèi)的粘膠釋放出來，使孢子緊緊粘附在水稻葉片表面。水稻葉片表面具有一層蠟質(zhì)角質(zhì)膜，該膜具有很大的疏水性，而粘膠使孢子粘附在這一疏水的排斥性表面。粘附后2小時內(nèi)，孢子萌發(fā)并產(chǎn)生芽管。芽管通常從孢子的一個頂端細胞伸出并生長。芽管頂端也分泌一種粘膠物質(zhì)，使芽管緊緊粘附在植物葉片表面，防止被水滴沖走。4小時內(nèi)，芽管生長停止，頂端鉤狀體形成并膨大形成附著胞?；|(zhì)的硬度是芽管分化的一個重要因子，如稻瘟病菌孢子僅在硬的固體表面形成附著胞，而不能在液體表面或軟基質(zhì)表面形成附著胞。而基質(zhì)疏水表面也通過類似于水稻葉片表面的蠟質(zhì)的作用激發(fā)附著胞的形成。在孢子萌發(fā)后不久，產(chǎn)生芽管的細胞進行一次有絲分裂。一個細胞核留在孢子內(nèi)，而另一個細胞核通過芽管移動，與孢子和芽管的細胞質(zhì)內(nèi)容物一起轉(zhuǎn)移到形成中的附著胞。這些細胞質(zhì)內(nèi)容物包括儲存在正在發(fā)育的附著胞中央大液泡的脂滴。然后，在附著胞和芽管之間形成隔膜。隨著附著胞成熟，附著胞細胞壁出現(xiàn)黑色素沉積，最終形成黑色素層。黑色素層允許水分子自由通過，但溶解于水的物質(zhì)不能自由通過，從而讓附著胞建立并維持一個很大的細胞內(nèi)膨壓。附著胞的黑色素化過程完成后，附著胞產(chǎn)生一根狹小的菌絲一侵染栓。侵染栓對水稻葉片的穿透由于附著胞產(chǎn)生巨大的膨壓而得以完成。膨壓只要稍微降低就會阻止附著胞在人工表面或水稻葉片表面穿透。測量結(jié)果表明附著胞膨壓達到8.0Mpa，相當于40倍汽車輪胎的壓力。附著胞黑色素層的作用在于限制了細胞壁的滲透性，有利于細胞內(nèi)滲透物質(zhì)的積累和膨壓的產(chǎn)生。甘油是一種可溶性物質(zhì)，產(chǎn)生的滲透勢足以使附著胞產(chǎn)生巨大的膨壓。在膨壓產(chǎn)生過程中，甘油在細胞內(nèi)累積濃度超過3M。侵入后，侵染栓分化成侵染菌絲，迅速在水稻葉片內(nèi)生長并侵染其它細胞。侵入72小時后，病原菌生物量已經(jīng)達到感染葉片的10%。5 7天后，分生孢子梗上分化出大量新的分生孢子，并從病斑釋放出來。這些新形成的孢子被潮濕的空氣帶到鄰近的植物開始新的侵染過程。在冬天，稻瘟病菌以菌絲和分生孢子形式在稻草和稻谷上越冬，完成侵染循環(huán)。稻瘟病菌的致病過程是一個復(fù)雜的分子過程。目前已經(jīng)克隆了許多與稻瘟病菌致病性相關(guān)的基因，如:MPGl、CPKA、PMKl、MAGB、PLSl、SMOl、PDEl、MPSl、PTHl1、CBPl、ICLl、BUF1、ALB1、ACR1、RSY1、HEX1。其中多數(shù)與附著胞形成有關(guān)，如PMK1、MAGB、MAC1等；部分參與黑色素的形成和積累(ALB1、RSYl、BUFl等)以及甘油合成相關(guān)(ICL1等)；少數(shù)與稻瘟病菌的穿透相關(guān)(MPS1、PLS1、H)E1等)。稻瘟病菌芽管分泌的一種疏水蛋白，由MPGl基因編碼，參與菌絲和水稻葉表的互作，為形成正常的附著胞所必須(Talbot，1999)。MAGB基因編碼的異源三聚G蛋白的α亞單位和MACl編碼的cAMP環(huán)化酶也是形成附著胞所必需的(Liuand Dean, 1997; Choi and Dean, 1997; Kulkarni and Dean, 2004)。CPKA 基因編碼的cAMP依賴性蛋白激酶A的催化亞單位PKA-c是附著胞穿透所必須的(Mitchell & Hamer,1995 ； Xu et al，1997)，而正在分化的芽管中的PKA活性對于形成正常的附著胞也非常關(guān)鍵(Adachi & Hamer 1998)。同樣,有絲分裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-activatedprotein kinase, MAPK)基因PMKl是附著胞形成所需的(Xu & Hamer 1996)。黑色素合成系列基因也證明是附著胞穿透所不可缺少的(Chumley and Valent, 1990 ；Motoyama等，1998)。在各種突變子庫中也發(fā)現(xiàn)了一些突變子缺失致病性，如:編碼一種與ATP運輸體(ATP-binding cassette transporters )相關(guān)的蛋白的 ABCl 基因(Urban等，1999)、編石馬P-型ATP酶的F1DEl基因(Balhadere等，1999，2001)和編碼tetraspannin樣蛋白的PLSl基因(Clergeot等，2001)。盡管如此，稻瘟病菌的分子致病機制還是不清楚。鑒定、克隆植物病原真菌的致病性基因，尤其是與侵入過程相關(guān)的基因，可以為設(shè)計、篩選抗真菌藥物提供有用的靶標位點。目前已經(jīng)在包括稻瘟病菌在內(nèi)的一些真菌中證明了一些藥物的靶點，如三環(huán)唑是一種很重要的稻瘟病菌殺菌劑，其作用是抑制黑色素的合成，靶點是稻瘟病菌的三羥萘還原酶；多肽殺菌劑sorphen A的作用靶點是青霉的脫甲基酶(CYP51)。因此，利用分子生物學(xué)技術(shù)鑒定、克隆新的在稻瘟病菌的致病過程中具有重要功能的致病性基因，可以為設(shè)計、篩選新的抗真菌藥物提供有用的藥物靶點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種新的、對稻瘟病菌等真菌的菌絲生長、分生孢子產(chǎn)生和萌發(fā)、附著胞形成以及致病性有重要影響的基因Movmall及該基因的用途。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種源于稻瘟病菌的真菌致病性基因MovmalI，該基因的核苷酸序列或其互補鏈的核苷酸序列為SEQ ID N0:1。
本發(fā)明同時提供了上述基因Movmall編碼的cDNA序列，該cDNA序列具有SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列。
本發(fā)明同時提供了上述基因Movmall編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。具體如下:
權(quán)利要求
1.源于稻瘟病菌的真菌致病性基因MovmalI，其特征是:該基因Movmall的核苷酸序列或其互補鏈的核苷酸序列為SEQ ID N0:1。
2.如權(quán)利要求1所述的真菌致病性基因Movmall編碼的cDNA序列，其特征是:所述的cDNA序列具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求1所述的真菌致病性基因Movmall編碼的蛋白質(zhì)，其特征是:所述的蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO:3所不的氣基酸序列。
4.如權(quán)利要求1或2所述的真菌致病性基因Movmall的用途，其特征是:基因Movmall的表達作為用于設(shè)計和篩選抗真菌藥物的靶標。
5.如權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)的用途，其特征是:所述蛋白質(zhì)的表達和修飾作為設(shè)計和篩選抗真菌藥物的 靶標。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物病理學(xué)和微生物基因工程領(lǐng)域，提供了一個來源于稻瘟病菌的、在營養(yǎng)生長、孢子產(chǎn)生、附著胞形成致病性中起重要作用的新基因Movma11的編碼區(qū)的核苷酸序列及其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列。具體而言，本發(fā)明公開了一種源于稻瘟病菌的真菌致病性基因Movma11，該基因Movma11的核苷酸序列或其互補鏈的核苷酸序列為SEQ ID NO1。該真菌致病性基因Movma11編碼的蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列?；騇ovma11的表達作為用于設(shè)計和篩選抗真菌藥物的靶標，蛋白質(zhì)的表達和修飾作為設(shè)計和篩選抗真菌藥物的靶標。
文檔編號C07K14/37GK103146716SQ20131008292
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月15日
發(fā)明者劉小紅, 陳國慶, 曾曉清, 林福呈, 章初龍, 馮曉曉 申請人:浙江大學(xué)