專利名稱：一種鼠源單克隆抗體及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗體技術(shù)領(lǐng)域。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種新的重組抗人抗狂犬病毒單克隆抗體的單克隆抗體，及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
狂犬病是由狂犬病毒所致的自然疫源性或動(dòng)物源性人畜共患急性傳染病，流行性廣，病死率幾近百分之百，對(duì)人民生命健康造成嚴(yán)重威脅。人狂犬病主要通過(guò)患病動(dòng)物咬傷、抓傷或由粘膜感染引起，在特定的條件下還可通過(guò)呼吸道氣溶膠傳染。傳染動(dòng)物主要是犬(超過(guò)90%)，其次是貓。根據(jù)中國(guó)疫情報(bào)告系統(tǒng)資料，1998年后狂犬病疫情年增長(zhǎng)幅度越來(lái)越高，死亡人數(shù)不斷攀升。對(duì)于狂犬病毒暴露后預(yù)防，WHO推薦的處理方法是全程注射狂犬疫苗，同時(shí)合并注射抗狂犬病馬血清(ERIG)或抗狂犬病毒人免疫球蛋白(HRIG)。但HRIG由于來(lái)源限制價(jià)格昂貴，而馬血清制品則較易發(fā)生嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)，所以現(xiàn)今國(guó)際上已經(jīng)公認(rèn)有必要用重組單克隆抗體取代狂犬病毒暴露后預(yù)防中使用的抗狂犬病毒血源抗體。國(guó)外研究者已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的相關(guān)研究，并取得了顯著的成果。B.Dietzschold利用細(xì)胞融合技術(shù)制備了多株人抗狂犬病毒單克隆抗體，發(fā)現(xiàn)能特異結(jié)合狂犬病毒G蛋白的一株抗體Mab57能夠高效和廣泛地中和狂犬病毒并且對(duì)狂犬病毒攻擊的實(shí)驗(yàn)室嚙齒動(dòng)物可以起保護(hù)作用(J Virol.1990 June ;64 (6): 3087-3090)。B.Dietzschold 等將 Mab57 基因轉(zhuǎn)入SPBN重組病毒表達(dá)系統(tǒng)，在BSR細(xì)胞中制備了 S057抗體(J Immunol Methods.200IJunl ；252(1-2) =199-206, )，S057抗體重鏈和輕鏈的氨基酸序列分別見(jiàn)GENEBANKg1:27728677和g1:27728683.華北制藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司把S057的基因序列在CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，構(gòu)建成功高效表達(dá)該基因序列編碼抗體的工程細(xì)胞，并把得到的單抗命名為匪57，該方法操作工藝簡(jiǎn)便、產(chǎn)品表達(dá)水平高(超過(guò)100毫克/升)、生產(chǎn)的抗體質(zhì)量均一而且穩(wěn)定性好，具備了產(chǎn)業(yè)化價(jià)值，可以取代目前所使用的抗狂犬病馬血清或人免疫球蛋白(中國(guó)專利:重組人抗狂犬病毒單克隆抗體的制備方法，公開(kāi)號(hào)CN101100663A)。在匪57進(jìn)行臨床前研究及臨床研究的過(guò)程中，以及將來(lái)成為藥物后患者應(yīng)用的過(guò)程中，為了研究藥物代謝及保證用藥安全，必須檢測(cè)受試者(動(dòng)物或人)或患者的血清匪57濃度和人抗匪57的抗體，但是目前還沒(méi)有實(shí)現(xiàn)該功能的檢測(cè)試劑或試劑盒出現(xiàn)，因此，迫切需要一種能有效、快速檢測(cè)匪57濃度和人抗匪57抗體的產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種抗匪57單克隆抗體，用于檢測(cè)匪57濃度和人抗匪57抗體。本發(fā)明需要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種編碼上述抗匪57單克隆抗體的DNA分子。本發(fā)明需要解決 的第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種表達(dá)載體。
本發(fā)明需要解決的第四個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種真核宿主細(xì)胞。本發(fā)明需要解決的第五個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種該重組抗匪57單克隆抗體的制備方法。本發(fā)明需要解決的第五個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供上述單克隆抗體的兩種用途。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明一方面提供了一種重組抗匪57單克隆抗體，該抗體含有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其特征在于，輕鏈可變區(qū)具有SEQID NO:1所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。本發(fā)明另一方面提供了編碼上述單克隆抗體的DNA分子。在一個(gè)較佳的實(shí)例中，該DNA分子含有SEQ ID NO: 3所示的編碼所述單抗輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列，以及 SEQ ID N0:4所示的編碼所述單抗重鏈可變區(qū)的核苷酸序列。本發(fā)明第三方面提供了一種表達(dá)載體，該表達(dá)載體含有上述DNA分子。本發(fā)明第四方面提供了一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它被上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。在一個(gè)較佳的實(shí)例中，該宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。本發(fā)明第五方面提供了一種制備上述單克隆抗體的方法，其特征在于，該方法包括:
a)構(gòu)建含有權(quán)利要求2所述DNA分子的表達(dá)載體；
b)用步驟a)所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；
c)培養(yǎng)步驟b)所得的宿主細(xì)胞；
d)分離純化獲得所述單克隆抗體。本發(fā)明提供的抗體可以在體外檢測(cè)匪57的濃度和人抗匪57抗體，本發(fā)明第六方面提供了一種利用本發(fā)明所述抗體檢測(cè)NM57濃度的方法。在一個(gè)較佳的實(shí)例中，檢測(cè)方法為基于洗脫的ELISA法。該抗體可用于制備檢測(cè)試劑或者檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明涉及一種重組抗匪57單克隆抗體，該抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。本文所用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體(單抗)”指從一類基本均一的群體獲得的抗體，即該群體中包含的單個(gè)抗體是相同的，除少數(shù)可能存在的天然發(fā)生的突變外。單克隆抗體高特異性地針對(duì)單個(gè)抗原位點(diǎn)，而且，與常規(guī)多克隆抗體制劑(通常是具有針對(duì)不同決定簇的不同抗體)不同，各單克隆抗體是針對(duì)抗原上的單個(gè)決定簇。除了它們的特異性外，單克隆抗體的好處還在于它們是通過(guò)基因工程手段來(lái)合成的，不會(huì)被其它免疫球蛋白污染。修飾語(yǔ)“單克隆”表示了抗體的特性，是從基本均一的抗體群中獲得的，這不應(yīng)被解釋成需要用任何特殊方法來(lái)生產(chǎn)抗體。本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”和“免疫球蛋白”是有相同結(jié)構(gòu)特征的約150，000道爾頓的異四聚糖蛋白，其由兩個(gè)相同的輕鏈(L)和兩個(gè)相同的重鏈(H)組成。每條輕鏈通過(guò)一個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈間的二硫鍵數(shù)目不同。每條重鏈和輕鏈也有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(qū)(VH)，其后是多個(gè)恒定區(qū)。每條輕鏈的一端有可變區(qū)(VL)，另一端有恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)相對(duì)，輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)相對(duì)。特殊的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈的可變區(qū)之間形成界面。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“可變”表示抗體中可變區(qū)的某些部分在序列上有所不同，它形成各種特定抗體對(duì)其特定抗原的結(jié)合和特異性。然而，可變性并不均勻地分布在整個(gè)抗體可變區(qū)中。它集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)中稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或超變區(qū)中的三個(gè)片段中?？勺儏^(qū)中較保守的部分稱為構(gòu)架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)中各自包含四個(gè)FR區(qū)，它們大致上呈β-折疊構(gòu)型，由形成連接環(huán)的三個(gè)⑶R相連，在某些情況下可形成部分β折疊結(jié)構(gòu)。每條鏈中的⑶R通過(guò)FR區(qū)緊密地靠在一起并與另一鏈的⑶R —起形成了抗體的抗原結(jié)合部位。恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是它們表現(xiàn)出不同的效應(yīng)功能，例如參與抗體的依賴于抗體的細(xì)胞毒性。單克隆抗體可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種方法來(lái)制得。例如，單克隆抗體可用雜交瘤方法制得，或用重組DNA方法制得，也可從噬菌體抗體庫(kù)中分離獲得。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明重組抗匪57單克隆抗體的DNA分子。在一個(gè)較佳的實(shí)例中，該DNA分子含有SEQ ID NO: 3所示的編碼所述單抗輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列，以及SEQ ID Ν0:4所示的編碼所述單抗重鏈可變區(qū)的核苷酸序列。在獲得編碼本發(fā)明重組抗匪57單克隆抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列后，通常可通過(guò)以下方法來(lái)制備本發(fā)明的單克隆抗體。首先，提供含有編碼本發(fā)明單克隆抗體的核苷酸序列的表達(dá)載體。編碼本發(fā)明單克隆抗體的DNA序列可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)手段來(lái)制得。例如，可根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的序列人工合成或用PCR法擴(kuò)增得到編碼該單克隆抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。然后，用本領(lǐng)域熟知的各種方法通過(guò)選擇合適的酶切位點(diǎn)將這些核苷酸序列插入合適的表達(dá)載體中，使它們分別在表達(dá)載體所攜帶的重鏈恒定區(qū)編碼序列和輕鏈恒定區(qū)編碼序列之前，并使它們?cè)谕婚喿x框內(nèi)。本發(fā)明中所用的表達(dá)載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的各種市售的表達(dá)載體，例如購(gòu)自Qiagen或Promega公司·的表達(dá)載體,或其他可購(gòu)得的表達(dá)載體如ρΜΗ3 (杭州安瑞普生物制品研究有限公司)。隨后，用上述獲得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞?！八拗骷?xì)胞”一般包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在本發(fā)明中，較佳的宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法有很多種，所用的轉(zhuǎn)化程序取決于待轉(zhuǎn)化的宿主。將異源多核苷酸導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的方法是本領(lǐng)域所知的，其包括葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸I丐沉淀、Polybrene (1,5- 二甲基-1,5- 二氮^ 亞甲基聚甲溴化物)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電擊法、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染以及將DNA直接顯微注射到胞核中。在本發(fā)明中，較佳的方法是電擊法。然后，在適合本發(fā)明單克隆抗體表達(dá)的條件下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化所得的宿主細(xì)胞。用常規(guī)的免疫球蛋白純化步驟，如蛋白A-Sepharose,輕基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、離子交換層析、疏水層析、分子篩層析或親和層析等本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)分離純化手段純化得到本發(fā)明的重組抗匪57單克隆抗體。所得單克隆抗體可用常規(guī)手段來(lái)鑒定。單克隆抗體的結(jié)合特異性可用免疫沉淀或體外結(jié)合試驗(yàn)，如放射性免疫測(cè)定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)來(lái)測(cè)定。單克隆抗體的結(jié)合親和力可用如SPR等分析方法來(lái)測(cè)定。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明的單克隆抗體用于檢測(cè)匪57具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，能在匪57進(jìn)行臨床前研究及臨床研究的過(guò)程中，以及將來(lái)成為藥物后患者應(yīng)用的過(guò)程中，快速、準(zhǔn)確檢測(cè)受試者(動(dòng)物或人)或患者的血清匪57濃度；還可用于檢測(cè)人抗匪57抗體。


圖1:還原SDS-PAGE電泳檢測(cè)NM57 (Fab) 2純度，泳道I為制備所得NM57 (Fab)2,泳道2為NM57。圖2:載體pMH3-L示意圖，并且標(biāo)明了其中的元件及酶切位點(diǎn)，其中，S-230-L為輕鏈基因；polyA為多聚腺苷化信號(hào)。圖3:載體pMH3-H示意圖，并且標(biāo)明了其中的元件及酶切位點(diǎn)，其中，S-230-H為重鏈基因，PolyA為多聚腺苷化信號(hào)。圖4:SPR法檢測(cè)抗匪57抗體親和常數(shù)，圖中為不同稀釋度的抗體結(jié)合曲線。圖5:NM57濃度-OD值擬合曲線。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而應(yīng)當(dāng)理解，列舉這些實(shí)施例只是為了起說(shuō)明作用，而并不是用來(lái)限制本發(fā)明。實(shí)施例中未標(biāo)明來(lái)源的實(shí)驗(yàn)試劑均為市售。實(shí)施例1表達(dá)抗匪57鼠單抗的雜交瘤細(xì)胞系的制備和篩選 I)抗原NM57(Fab)2的制 備
將匪57 (制備方法參見(jiàn)中國(guó)專利:重組人抗狂犬病毒單克隆抗體的制備方法，公開(kāi)號(hào)CN101100663A)用0.5 mol/L鹽酸調(diào)pH值至3.5，37 °C水浴30分鐘。將胃蛋白酶(購(gòu)自Sigma-Aldrich C0.公司)與抗體樣品按1:50 (w/w)的比例混合,37°C水浴2小時(shí),加入0.5mol/L Na2HPO4溶液調(diào)pH值至7.0終止反應(yīng)后，離心去除沉淀。用層析介質(zhì)rProteinA對(duì)酶切所得NM57 (Fab) 2進(jìn)行純化后，用30kD超濾膜對(duì)所得純化溶液超濾換液，保存溶液組成為lOmmol/L PB, 150mmol/L NaCl，pH6.0。根據(jù)體積加入1/200體積的10mg/ml Tween80,混勻，用0.22 μ m濾膜過(guò)濾，分裝。用還原SDS-PAGE電泳法檢測(cè)制備所得抗原匪57 (Fab)2的純度> 90% (電泳圖見(jiàn)圖1)。2)免疫小鼠
用步驟I)制得的匪57 (Fab)2皮下注射免疫6周齡Balb/c小鼠，首次免疫使用福氏完全佐劑，每隔兩周使用福氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫一次，共免疫三次，每次每只50 μ g。取上述免疫的小鼠脾臟，制成淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液。3)融合和篩選
按照《The Protein Protocols Handbook》第二版(John M.Walker 2002 HumanaPress Inc.) PART VIII MONOCLONAL ANTIBODIES 159 節(jié) Hybridoma Production中所述方法，將步驟2)制得的淋巴單細(xì)胞與BALB/c小鼠來(lái)源的sp2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合及克隆培養(yǎng)。米用《The Protein Protocols Handbook))第二版(John M.Walker2002 Humana Press Inc.) PART VIII MONOCLONAL ANTIBODIES 第 161 節(jié) ScreeningHybridoma Culture Supernatants Using ELISA 所述方法,使用 NM57 對(duì)克隆進(jìn)行篩選,最后篩選得到一株表達(dá)抗NM57鼠源單抗的雜交瘤細(xì)胞株。實(shí)施例2抗體可變區(qū)編碼序列的克隆和測(cè)序
I)取實(shí)施例1篩選得到的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，取細(xì)胞IO7個(gè)，于4°C以離心力200g離心5分鐘,盡棄上清,所得細(xì)胞使用Qiagen公司的RNA抽提試劑盒(MagAttract RNACell Mini M48 Kit，貨號(hào):958236)提取總 RNA。2)以提取的RNA為模版，使用TaKaRa公司的RT-PCR試劑盒(RNA PCR Kit (AMV)Ver.3.0, code N0.:DRR019A)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄引物分別為:
A輕鏈擴(kuò)增引物:
正向引物:
LLl:5’ ATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT 3’
LL2:5’ ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG 3’
LL3:5’ ATGGAGffCACAKffCTCAGGTCTTTRTA 3’
LL4:5 ’ ATGKCCCCWRCTCAGYTYCTKGT 3，
LL5:5’ ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG 3’
反向引物:
Ck:5’ GTTGGTGCAGCATCAGC 3，
B重鏈引物:
正向引物:
VHl:5’ ATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT 3’
VH2:5’ ATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT 3’
VH3:5’ ATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT 3’
VH4:5 ’ ATGATRGTGTTRAGTCTTYTGTRCCTG 3，
反向引物:
C γ: 5，GGGGCCAGTGGATAGAC 3，
反應(yīng)結(jié)束后取反應(yīng)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行分離，采用Qiagen公司的膠回收試劑盒(QIAquick Gel Extraction Kit,貨號(hào):28704)提純擴(kuò)增的DNA片段,進(jìn)行序列測(cè)定(交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)定)。結(jié)果如下:SEQ ID NO:3顯示了其輕鏈可變區(qū)基因序列(5，到3’，336bp)，其氨基酸序列顯示在SEQ ID NO:1中；SEQ ID NO:4顯示了其重鏈可變區(qū)基因序列((5’到3’，363bp)，其氨基酸序列顯示在SEQ ID NO:2中。實(shí)施例3抗體的表達(dá)載體構(gòu)建、表達(dá)與純化
I)用EcoR I和Not I限制性酶酶切表達(dá)載體pMH3，然后將上述抗體可變區(qū)與鼠源恒定區(qū)通過(guò)搭橋PCR拼接起來(lái)，并在兩端設(shè)計(jì)EcoR I和Not I酶切位點(diǎn)序列，之后與酶切的表達(dá)載體連接，從而構(gòu)建得到分別含有重組抗匪57抗體輕鏈全長(zhǎng)和重鏈全長(zhǎng)基因的表達(dá)載體pMH3-L和pMH3-H，如圖2、3所示。2) CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選 上述構(gòu)建的表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOB菌種，接種于100毫升LB培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增，收集細(xì)胞，用Qiagen公司質(zhì)粒DNA純化試劑盒(QIAGEN Plasmid Mini KU，貨號(hào):12125)抽提質(zhì)粒DNA4 μ g，采用電轉(zhuǎn)化法將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。
轉(zhuǎn)染后的CHO細(xì)胞在MTX選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行克隆篩選，最后在96孔板上進(jìn)行有限稀釋培養(yǎng)，連續(xù)進(jìn)行3次。挑取單克隆細(xì)胞系在RPMI1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，用ELISA法檢測(cè)上清中的抗體表達(dá)水平，選擇表達(dá)水平最高的克隆作為工作株保存。3)抗體純化與檢測(cè)
將選定的工作株培養(yǎng)后，收集細(xì)胞上清或培養(yǎng)液，10000rpm、4°C離心20分鐘，經(jīng)
0.45 μ m濾膜過(guò)濾、抽濾除氣后備用。0.lmol/L的PB緩沖液(pH7.0)作為平衡緩沖液平衡Protein A Sepharose 4 Fast Flow層析柱,流速lml/分鐘平衡10-20個(gè)柱體積至記錄儀基線穩(wěn)定。將處理后的上清以同樣流速上樣，收集流穿液。上樣結(jié)束后用平衡緩沖液洗至基線平穩(wěn)。用0.lmol/L的甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH3.0)洗脫融合蛋白，流速Iml/分鐘，收集洗脫峰，用lmol/1的Tris-HCL緩沖液調(diào)pH至中性，經(jīng)超濾濃縮置換于PBS (pH7.4)緩沖液中，凍存，用于以下的進(jìn)一步分析與研究中。實(shí)施例4單克隆抗體親和力測(cè)定 I)標(biāo)記NM57
依照偶聯(lián)試劑盒(Amine Coupling KU，購(gòu)自GE公司，貨號(hào)BR-1000-50)說(shuō)明，將EDC和NHS按一定的比例加水分別溶解；CM5傳感片(GE公司)插入檢測(cè)儀Biacore 2000(GE公司)后，控制流速為 5μ I / 分鐘，用 HBS 緩沖液(10 mmol/1 HEPESU50 mmol/1 NaCU3.4mmol/1 EDTA、0.005% Tween20, pH7.4)平衡體系，待基線穩(wěn)定，開(kāi)始標(biāo)記 NM57: (I)EDC 和NHS各100 μ L混合均勻，注射50 μ I混合液使其流過(guò)待標(biāo)記通道，活化傳感片表面的羧基；
(2)注射3.0mg/L NM57溶液(溶于10 mmol/1醋酸鈉緩沖液，pH4.5)，將NM57通過(guò)氨基偶聯(lián)標(biāo)記于芯片表面，標(biāo) 記目標(biāo)8000RU;(3)注射35 μ L乙醇胺的鹽酸溶液封閉殘余的活化羧基；(4)注射10 μ I甘氨酸緩沖液洗去非鍵合的吸附蛋白和乙醇胺。2)單抗結(jié)合過(guò)程檢測(cè)
用HBS緩沖液梯度稀釋實(shí)施例3制備所得單抗(35.5 μ g/ml、17.75 μ g/ml、8.9 μ g/ml、
4.45μ g/ml,2.2μ g/ml),12 OOOrpm離心10分鐘，上機(jī)檢測(cè)。上樣30秒(流速30 μ I/分鐘)，HBS緩沖液平衡4分鐘(流速30 μ I/分鐘)，10mmol/l甘氨酸緩沖液(pH2.0)再生30秒(流速30 μ I/分鐘)，HBS緩沖液平衡3分鐘。3)親和常數(shù)計(jì)算
通過(guò)BIAeval 3.0軟件擬合結(jié)合曲線(見(jiàn)圖4)，計(jì)算單抗與匪57的親和常數(shù)為4.0nmol/lο實(shí)施例5基于捕獲-洗脫的ELISA法應(yīng)用單抗檢測(cè)匪57濃度
用包被液緩沖液(0.1 mol/L碳酸鹽，pH 9.6)稀釋實(shí)施例3制備所得單抗至10 μ g/ml，4 °C過(guò)夜包被酶標(biāo)板，用封閉液(P/oBSA-PBS )封閉，將含有不同濃度匪57的標(biāo)準(zhǔn)品(S1-S6)和含有匪57的血清樣本(將特定量匪57樣品加入人血清中制備所得樣本X1-X3)及陰性對(duì)照品(Blank)加入孔板，37°C孵育I小時(shí)進(jìn)行捕獲。洗板3遍，每孔加入300mmol/L乙酸溶液60 μ I洗脫5分鐘。從每孔中取50 μ I洗脫液，加入50 μ I中和液(含有2%BSA的lmol/L Tris-HCl緩沖液，ρΗ8.0)中進(jìn)行中和。取用羊抗人IgG (Fe)抗體包被并用封閉液封閉的酶標(biāo)板，將中和后的體系加入對(duì)應(yīng)孔中，37°C孵育I小時(shí)。用PBS-T洗板3遍，用封閉液稀釋實(shí)施例3制備所得單抗至10 μ g/ml.加入板孔中，37°C孵育I小時(shí)。洗板3遍，加入用封閉液稀釋的人血清吸附處理的羊抗鼠IgG-HRP加入板孔中，37°C孵育I小時(shí)。洗板5遍，向板孔中加入TMB底物顯色液，37°C顯色30分鐘。加終止液(2mol/lH2SO4) 50μ1/孔，終止反應(yīng)。終止后30分鐘內(nèi)讀數(shù)，波長(zhǎng)450/630nm。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖5 )計(jì)算樣品的匪57含量。含量測(cè)定結(jié)果實(shí)例見(jiàn)表I。
權(quán)利要求
1.一種重組抗匪57單克隆抗體，它包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其特征在于，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示，重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
2.—種DNA分子，其特征在于，它編碼權(quán)利要求I所述的單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA分子，其特征在于，該DNA分子含有SEQID NO: 3所示的編碼所述單抗輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列，以及SEQ ID N0:4所示的編碼所述單抗重鏈可變區(qū)的核苷酸序列。
4.一種表達(dá)載體,其特征在于,它含有權(quán)利要求2所述的DNA分子。
5.一種真核宿主細(xì)胞，其特征在于，它被權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的真核宿主細(xì)胞，其特征在于，它是CHO細(xì)胞。
7.一種制備權(quán)利要求I所述的單克隆抗體的方法，其特征在于，該方法包括 a)構(gòu)建含有權(quán)利要求2所述DNA分子的表達(dá)載體； b)用步驟a)所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化真核宿主細(xì)胞； c)培養(yǎng)步驟b)所得的真核宿主細(xì)胞； d)分離純化獲得所述單克隆抗體。
8.權(quán)利要求I所述的單克隆抗體在制備檢測(cè)匪57濃度的試劑中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求I所述的單克隆抗體在制備檢測(cè)匪57濃度的試劑盒中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求I所述的單克隆抗體在檢測(cè)NM57免疫原性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種鼠源單克隆抗體及其制備方法和用途。該鼠源單克隆抗體即抗NM57單克隆抗體，輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。本發(fā)明還公開(kāi)了編碼該抗體的DNA分子，表達(dá)該抗體的載體以及被該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的真核宿主細(xì)胞。本發(fā)明提供的抗NM57單克隆抗體能在NM57用藥過(guò)程中快速檢測(cè)受試者血清中NM57濃度，同時(shí)也能作為抗NM57的陽(yáng)性對(duì)照抗體應(yīng)用于NM57的免疫原性檢測(cè)。
文檔編號(hào)C07K16/42GK103254312SQ201310093318
公開(kāi)日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2013年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月22日
發(fā)明者趙偉, 魏敬雙, 王惠欣, 劉曉志, 常亮, 程立均, 李燕霞, 劉艷玲, 段迎霞, 劉祥義, 劉洪喜, 于蘭, 李玉鳳, 張靜, 高健 申請(qǐng)人:華北制藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司