一種從魚糜漂洗液中提取抗菌魚蛋白鐵肽的方法
【專利摘要】一種從魚糜漂洗液中提取抗菌魚蛋白鐵肽的方法，其特征在于步驟為：1）將魚糜漂洗液過濾，用鹽酸調節(jié)濾液pH值為5.0～6.0，靜置90～120min，用NaOH調節(jié)pH值為8.0～9.0，加入堿性蛋白酶，酶解8～10h后滅酶，離心，去除沉淀得到酶解液；2）按比例加入抗壞血酸和氯化亞鐵，攪拌后調節(jié)pH至6.0～8.0，抽真空震蕩螯合30～60min，離心去沉淀后真空濃縮，冷凍干燥，即為抗菌魚蛋白鐵肽粗提物；對粗提物進行一下純化，得到成品抗菌魚蛋白鐵肽。本發(fā)明的提取方法具有操作簡單、分離提取率高、成本低的特點，制得的抗菌魚蛋白鐵肽天然、無毒、無污染、高效抗菌，可以使魚糜漂洗液中可溶性蛋白得到高值化利用。
【專利說明】一種從魚糜漂洗液中提取抗菌魚蛋白鐵肽的方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種魚蛋白鐵肽的提取方法，特別是關于一種從魚糜漂洗液中提取抗菌魚蛋白鐵肽的方法。

【背景技術】
[0002]魚糜制品在中國的發(fā)展前景是十分廣闊的。但是在魚糜生產中，為了得到彈性好、色澤白的優(yōu)質魚糜，采肉后的碎魚肉需用大量的清水進行漂洗。在漂洗過程中一定量的水溶性蛋白質、色素、脂類等物質溶于水中，作為廢水而廢棄，十分可惜。魚糜漂洗液中所含的必需氨基酸齊全，各種氨基酸組成合理，易被人體消化吸收利用，是一種優(yōu)質蛋白質。從魚糜漂洗水中提取的蛋白，可作為蛋白源添加到食品中供人食用，也可以添加到飼料中，供各種動物養(yǎng)殖用，用途廣泛。我國每年遠洋捕撈量至少達幾萬噸，漂洗液達幾十萬噸，數(shù)量相當可觀。因此從漂洗液中提取氨基酸和蛋白質，并高效利用提取的氨基酸和蛋白質，具有重要的經濟價值和社會意義。
[0003]現(xiàn)代生物代謝研究發(fā)現(xiàn)，蛋白經消化酶水解后，并不都是被水解成氨基酸形式被吸收，更多則是以短肽或寡肽形式吸收，劉洋等研究鍉魚水解肽用于促動物生長(鍉魚蛋白酶水解物的營養(yǎng)評價[J].青島海洋大學學報，1996，26 (1):37-43.)等。水解肽_金屬配合物是由可溶性金屬離子同多肽按一定摩爾比結合而成的有機元素鰲合物，具有穩(wěn)定性高、吸收快、適口性好、生物效價高等特點。如鄧尚貴等研究低值魚下腳料水解肽鐵(II )螯合物具有抗菌作用(低值魚蛋白多肽-鐵(II )螯合物的酶解制備及其抗氧化、抗菌活性[J].湛江海洋大學學報，2006,26(4):54-58.)、Worst 等(WorstDJ, OttoBR, De GraffJ.1ron-repressible outer membrane proteins of Helicobacter pylori involved inheme uptake [J].1nfect Immunj 1995，63:4161-4165.)研究發(fā)現(xiàn)多妝-鐵螯合物體內吸收率為無機鐵絡合物的49倍。α -酪蛋白特定多肽經磷酸化后，形成的酪磷肽可螯合Cu、Ca及Zn等元素，具有防治骨質疏松、調節(jié)血壓等功效。此外，研究發(fā)現(xiàn)部分蛋白肽-Fe配合物能自由地通過成熟的胎盤而到達特定的祀點器官(Maria KK.1ron speciat1n inintestinal contents of rats fed meal composed of meat and nonmeat sources ofprotein and fat [J].Food Chemj 1995，52:47-56.)。這些研究結果說明水解肽-金屬配合物是一種安全的，可食用的物質。
[0004]因此，有效利用魚糜漂洗液中的可溶性蛋白制備有抗菌抗氧化功效的功能性食品或食品配料，可為實現(xiàn)魚資源的綜合利用、提高其附加值開辟新的途徑。


【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種從魚糜漂洗液中提取抗菌魚蛋白鐵肽的方法，具有操作簡單、分離提取率高、成本低的特點，制得的抗菌魚蛋白鐵肽具有天然、無毒、無污染、聞效抗菌等優(yōu)點。
[0006]本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案為:一種從魚糜漂洗液中提取抗菌魚蛋白鐵肽的方法，其特征在于步驟依次為:
[0007]I)將魚糜漂洗液過濾，用鹽酸調節(jié)濾液pH值為5.0~6.0，靜置90~120min，用NaOH調節(jié)pH值為8.0~9.0，加入堿性蛋白酶，酶解8~1h后滅酶，離心，去除沉淀，得到酶解液；
[0008]2)按抗壞血酸與酶解液I~60mg:80mL,氯化亞鐵與酶解液I~30mg:40ml的比例加入抗壞血酸和氯化亞鐵，充分攪拌后調節(jié)pH至6.0~8.0,抽真空震蕩螯合30~60min,離心去沉淀后真空濃縮，冷凍干燥，即為抗菌魚蛋白鐵肽粗提物；
[0009]3)對上述所得到的抗菌魚蛋白鐵肽粗提物進行一下純化，得到成品抗菌魚蛋白鐵肽。
[0010]作為優(yōu)選，所述魚糜漂洗液的濾液與堿性蛋白酶的重量份數(shù)比為100:4~7 ;所述堿性蛋白酶酶解溫度為30~50°C，所述滅酶的溫度為90~100°C，滅酶時間為10~20min。
[0011]作為優(yōu)選，所述步驟2)的螯合溫度為30~50°C，所述真空濃縮的溫度為40~60°C，濃縮時間為10~12h ;所述冷凍干燥的溫度為-60~-70°C，冷凍時間為24~48h。
[0012]作為改進，所述步驟3)的純化的具體步驟為:將所述抗菌魚蛋白鐵肽粗提物經葡聚糖凝膠層析洗脫分離，有抗菌活性的層析組分再經反向高效液相色譜洗脫，收集洗脫液；接著對所述洗脫液進行真空冷凍干燥，即為抗菌魚蛋白鐵肽。
[0013]最后，所述葡聚糖凝膠層析柱為Sephadex G50,所述洗脫液為pH6.5~7.0,
0.09~0.llmol/L的磷酸緩沖液，洗脫速度為16~20mL/h ;所述反向高效液相色譜為XBrige?Prep-C18 ;所述真空冷凍干燥溫度為-60~_70°C，冷凍時間為24~36h。
[0014]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于:以魚加工廢棄物魚糜漂洗液為原料，通過酶解、螯合、純化進行提取，不僅原料來源廣泛，而且變廢為寶、成本低，可以滿足大規(guī)模深加工的需要；制得的亞鐵抗菌肽，屬于天然提取物，具有天然、無毒、無污染、高效抗菌等特點，是一種新型的綠色抗微生物物質。本發(fā)明操作方便、分離提取率高，為生產抗菌肽提供了一個新的途徑和方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是本發(fā)明實施例的抗菌魚蛋白鐵肽粗提物的Sephadex G50層析曲線；
[0016]圖2是本發(fā)明實施例的抗菌魚蛋白鐵肽的反向高效液相色譜XBrigeTMPrep-C18洗脫曲線圖；
[0017]圖3是本發(fā)明實施例的抗菌魚蛋白鐵肽抑制大腸桿菌的掃描電鏡圖，其中A、為對照，沒有被亞鐵螯合抗菌肽作用的大腸桿菌細胞、作用8h的大腸桿菌細胞；C、作用16h的大腸桿菌細胞。

【具體實施方式】
[0018]以下結合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。
[0019]實施例子I
[0020]一種從魚糜漂洗液中提取抗菌魚蛋白鐵肽的方法，具體步驟為:
[0021]1、將魚糜漂洗液用紗布進行過濾，去除油脂、碎魚骨等物質，用鹽酸調節(jié)濾液pH值為5.5，靜置lOOmin，用NaOH調節(jié)pH值為8.5，加入堿性蛋白酶，濾液與堿性蛋白酶的重量份數(shù)比為100:5,酶解溫度為40°C，酶解9h后，在95°C進行滅酶15min，然后離心，去除沉淀，得到酶解液；
[0022]2、向酶解液中加入抗壞血酸和氯化亞鐵，抗壞血酸與酶解液體積份數(shù)之比為30:80 (mg:mL)，氯化亞鐵與酶解液體積份數(shù)之比為20:40 (mg:mL);螯合溫度為40°C，抽真空震蕩螯合45min，離心，去沉淀，成為抗菌魚蛋白鐵肽的粗提物。
[0023]3、真空濃縮抗菌魚蛋白鐵肽粗提物，40°C，濃縮Ilh ;濃縮物-60°C冷凍干燥24h，得粗提物凍干粉。
[0024]4、將螯合抗菌肽粗提物凍干粉經葡聚糖凝膠S印hadex G50過柱分離，洗脫液為pH6.8,0.lmol/L的磷酸緩沖液，洗脫速度為18mL/h，收集約180mL洗脫液。
[0025]見圖1所示，抗菌魚蛋白鐵肽的粗提物經葡聚糖凝膠S印hadex G50層析柱后有四個洗脫峰，將各洗脫峰取約10uL進行抗菌實驗，抑菌試驗顯示第一個洗脫峰(F2)有抑菌活性。
[0026]5、洗脫峰F2經反向高效液相色譜為XBrigeTMPi^p-C18分離出現(xiàn)四個洗脫峰，將各洗脫峰取約10uL進行抗菌實驗，抑菌試驗顯示第二個洗脫峰(見圖2F2-3)有抑菌活性。
[0027]6、收集洗脫峰F2-3，_60°C真空冷凍干燥24h，成為抗菌魚蛋白鐵肽純品，在_20°C下保存抗菌魚蛋白鐵肽。
[0028]下面對上述制得的抗菌魚蛋白鐵肽進行抗菌實驗
[0029]采用牛津杯法，對實施例提取的抗菌魚蛋白鐵肽進行抗菌活性實驗。細菌為大腸桿菌。
[0030]抗菌魚蛋白鐵肽對大腸桿菌的最低抑菌濃度如表1所示，最低殺菌濃度結果如表2所示。
[0031]表1魚糜漂洗液抗菌魚蛋白鐵肽的最低抑菌濃度
[0032]

【權利要求】
1.一種從魚糜漂洗液中提取抗菌魚蛋白鐵肽的方法，其特征在于步驟依次為: 1)將魚糜漂洗液過濾，用鹽酸調節(jié)濾液PH值為5.0~6.0，靜置90~120min，用NaOH調節(jié)PH值為8.0~9.0，加入堿性蛋白酶，酶解8~1h后滅酶，離心，去除沉淀，得到酶解液； 2)按抗壞血酸與酶解液I~60mg:80mL,氯化亞鐵與酶解液I~30mg:40ml的比例加入抗壞血酸和氯化亞鐵,充分攪拌后調節(jié)pH至6.0~8.0,抽真空震蕩螯合30~60min,離心去沉淀后真空濃縮，冷凍干燥，即為抗菌魚蛋白鐵肽粗提物； 3)對上述所得到的抗菌魚蛋白鐵肽粗提物進行一下純化，得到成品抗菌魚蛋白鐵肽。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述魚糜漂洗液的濾液與堿性蛋白酶的重量份數(shù)比為100:4~7 ;所述堿性蛋白酶酶解溫度為30~50°C，所述滅酶的溫度為90~100 °C，滅酶時間為10~20min。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟2)的螯合溫度為30~50°C，所述真空濃縮的溫度為40~60°C，濃縮時間為10~12h ;所述冷凍干燥的溫度為-60~-70°C，冷凍時間為24~48h。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟3)的純化的具體步驟為:將所述抗菌魚蛋白鐵肽粗提物經葡聚糖凝膠層析洗脫分離，有抗菌活性的層析組分再經反向高效液相色譜洗脫，收集洗脫液；接著對所述洗脫液進行真空冷凍干燥，即為抗菌魚蛋白鐵肽。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述葡聚糖凝膠層析柱為SephadexG50,所述洗脫液為PH6.5~7.0,0.09~0.llmol/L的磷酸緩沖液，洗脫速度為16~20mL/h ；所述反向高效液相色譜為XBrige?Pr印-C18 ;所述真空冷凍干燥溫度為_60~_70°C，冷凍時間為24~36h。
【文檔編號】C07K1/20GK104073538SQ201310098581
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2013年3月25日 優(yōu)先權日:2013年3月25日
【發(fā)明者】林慧敏, 鄧尚貴, 張賓 申請人:浙江海洋學院