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      結(jié)核耐藥相關(guān)外排蛋白來(lái)源抗結(jié)核ctl表位肽及其應(yīng)用的制作方法

      文檔序號(hào):3546765閱讀:288來(lái)源:國(guó)知局
      專利名稱:結(jié)核耐藥相關(guān)外排蛋白來(lái)源抗結(jié)核ctl表位肽及其應(yīng)用的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及結(jié)核病治療性多肽疫苗,尤其是涉及利用結(jié)核桿菌自身耐藥相關(guān)抗原篩選出的具有治療活性的抗結(jié)核CTL表位肽,本發(fā)明還涉及該肽在制備結(jié)核病治療性多肽疫苗中的應(yīng)用。
      背景技術(shù)
      耐藥結(jié)核分枝桿菌數(shù)量的日益增加是造成近年來(lái)結(jié)核病死灰復(fù)燃、卷土重來(lái)的重要原因。結(jié)核分枝桿菌耐藥機(jī)制主要分天然耐藥機(jī)制和獲得性耐藥機(jī)制。獲得性耐藥主要是由于耐藥相關(guān)基因的點(diǎn)突變,而天然耐藥機(jī)制主要由于細(xì)胞壁的通透性障礙和活躍外排泵系統(tǒng)。因此,藥物外排系統(tǒng)可以成為重要的耐藥結(jié)核治療靶點(diǎn)。近年來(lái)在動(dòng)物I旲型及臨床研究中發(fā)現(xiàn),CD8 CTL在抗結(jié)核感染保護(hù)性應(yīng)答中起著重要和獨(dú)特的作用,CD8+ CTL對(duì)靶細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用,必須能識(shí)別靶細(xì)胞表面與相應(yīng)MHC-1類分子結(jié)合的特異性抗原表位,即細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocyte, CTL)表位。目前研究的⑶8+CTL蛋白抗原表位,主要集中在結(jié)核菌特異的分泌蛋白上,如ESAT-6、CFP-10、CFP-21、MPT64、Ag85復(fù)合物等,而對(duì)于膜蛋白尤其是藥物外排蛋白CD8+CTL表位報(bào)道很少。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明的目的在于提供一類結(jié)核耐藥相關(guān)外排蛋白來(lái)源的抗結(jié)核CTL表位肽,本發(fā)明還提供該類肽在制備結(jié)核病治療性多肽疫苗中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案:
      本發(fā)明所述的結(jié)核耐藥相關(guān)外排蛋白來(lái)源抗結(jié)核CTL表位肽為九肽,所述九肽的氨基酸序列為:
      P8:Gly-Leu-Val-Ala-Gly-Leu-Ser-Ala-Val。本發(fā)明所述的結(jié)核耐藥相關(guān)外排蛋白來(lái)源抗結(jié)核CTL表位肽在制備結(jié)核病治療性多肽疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明是根據(jù)抗原的一級(jí)結(jié)構(gòu),采用免疫信息學(xué)手段,運(yùn)用SYFPEITH1、BIMAS和NetCTL 1.2數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)結(jié)核耐藥相關(guān)蛋白抗原的HLA_A*0201限制性CTL表位進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析,篩選獲得表位肽。 然后通過(guò)體外ELISP0T實(shí)驗(yàn)對(duì)預(yù)測(cè)表位肽進(jìn)行鑒定。本發(fā)明采用理論和實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法初步鑒定出能夠體外誘導(dǎo)CTL的表位肽,鑒定的九肽未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道,為研制基于耐藥相關(guān)蛋白抗原的結(jié)核疫苗提供了理論基礎(chǔ),并為設(shè)計(jì)基于混合T細(xì)胞表位的結(jié)核多表位肽疫苗提供更多的信息。


      圖1-8是本發(fā)明表位肽的質(zhì)譜分析圖譜。圖9-16是本發(fā)明表位肽誘導(dǎo)的特異性CTL分泌IFN-Y的能力。
      具體實(shí)施例方式本發(fā)明所述的本發(fā)明所述的結(jié)核耐藥相關(guān)外排蛋白來(lái)源抗結(jié)核CTL表位肽為九肽,所述九肽的氨基酸序列為:
      P5 =Tyr-Leu-Gly-Gly-Thr-Thr-Gly-Pro-Val (YLGGTTGPV )分子量:864.6 (理論值:863.44)
      或 P6 =Tyr-1le-Val-Gly-Phe-Cys-Leu-Leu-Val (YIVGFCLLV)分子量:1026.7 (理論值:1025.86)
      或 P7 =Thr-Leu-Thr-Trp-Leu-Phe-Ala-Phe-Val (TLTffLFAFV)分子量:1097.7 (理論值:1097.32)
      或 P8 =Gly-Leu-Val-Ala-Gly-Leu-Ser-Ala-Val (GLVAGLSAV)分子量:786.7 (理論值=786.7)
      或 P9 =Ala-Leu-Gly-Met-Leu-1le-Ala-Gly-Leu (ALGMLIAGL)分子量:858.7 (理論值:857.81)
      或 PlO =Met-Leu-1le-Ala-Gly-Leu-Pro-Cys-Leu (MLIAGLPCL)分子量:930.6 (理論值:930.24)
      或 Pll =Leu-Leu-Cys-Ala-1le-Phe-Ala-Glu-Val (LLCAIFAEV)分子量:978.6 (理論值=977.52)
      或 P12 =Arg-Leu-Trp-Pro-Thr-Val-Gly-Cys-Leu (RLWPTVGCL)分子量:1044.6 (理論值:1043.56)。本發(fā)明主要采用理論與實(shí)踐相結(jié)合的方法,根據(jù)抗原的一級(jí)結(jié)構(gòu),采用免疫信息學(xué)手段,運(yùn)用SYFPEITH1、BIMAS和NetCTL 1.2數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)耐藥相關(guān)外排蛋白的HLA_A*0201限制性CTL表位進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析,篩選獲得表位肽采用標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc方案進(jìn)行合成,經(jīng)HPLC純化后,其純度大于90%,質(zhì)譜分析并證實(shí)其分子量符合理論值。各肽質(zhì)譜鑒定圖見(jiàn)圖1-8。本發(fā)明表位肽的合成及制備:采用固相合成法合成CTL表位肽?;玖鞒倘缦?首先將一個(gè)氨基被Fmoc基團(tuán)保護(hù)的氨基酸連接在不溶性固相載體Wang樹(shù)脂上,然后脫掉氨基的保護(hù)基,第一個(gè)氨基酸即·連接至固相載體上;其次將氨基被Fmoc基團(tuán)保護(hù)的第二個(gè)氨基酸的羧基用縮合劑活化,活化后的氨基酸再與已接在固相載體的第一個(gè)氨基酸的氨基反應(yīng)形成肽鍵,此時(shí)在固相載體上就生成了一個(gè)帶有保護(hù)基的二肽。重復(fù)上述的肽鍵形成反應(yīng),使肽鏈從C端向N端生長(zhǎng),直至達(dá)到所需要的肽鏈長(zhǎng)度,最后切割得到目的肽。經(jīng)HPLC純化后,其純度大于90%,質(zhì)譜分析并證實(shí)其分子量符合理論值。(參見(jiàn):①黃惟德、陳常慶著,多肽合成,科學(xué)出版社,1985年。②.N.休厄德、H.D.賈庫(kù)布克著,劉克良等譯,肽:化學(xué)與生物學(xué),科學(xué)出版社,2005年。)
      人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)的分離與ELISP0T實(shí)驗(yàn)檢測(cè):
      抽取健康供者的外周血經(jīng)密度梯度離心分離,獲得PBMCs,添加白細(xì)胞介素2 (IL-2,Peprotech公司)和人β 2微球蛋白誘導(dǎo)分化CTL細(xì)胞,進(jìn)一步在體外ELISP0T實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。方法如下:
      1.PBMCs的分離與誘導(dǎo):(I)以40ml PBS (PH 7.2)稀釋抗凝處理后的外周血40ml ;
      (2)離心管中加入4ml Lymphoprep分離液(Axis-Shield公司);(3)加8ml步驟(I)中稀釋后的外周血于4ml Lymphoprep分離液液面上;(4) 20°C離心(2000rmpX20min) ; (5)離心后,分為四層,棄去最上層,用玻璃吸管吸取第二層即白膜層(富含PBMCs); (6)吸出的白膜層用PBS (pH 7.2)離心洗滌兩次;(7)用24孔板鋪板,細(xì)胞的濃度為1X10 6/ml,每孔Iml ; (8)第二天每孔加入3 UgAP2微球蛋白和10 μ g表位肽,同時(shí)設(shè)立PBS組(以PBS替代表位肽)作為陰性對(duì)照組;(9)第三天每孔加入50u IL-2;每2 3天換液,于七天后進(jìn)行第二輪荷肽(即每孔補(bǔ)加50u IL-2U0 UgAP2微球蛋白和10 yg表位肽/PBS),十四天后進(jìn)行第三輪荷肽。第三輪荷肽后3天,得到效應(yīng)細(xì)胞CTL,然后進(jìn)行ELISP0T實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IFN-Y釋放。2.ELISP0T實(shí)驗(yàn):具體實(shí)驗(yàn)步驟如下:(1)封閉:取出所需板條,用含5% FCS RPMI1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)基封閉,200 μ L /孔,室溫下(25°C)靜置5 10 min后將其扣出(FCS可以封閉所包被抗體的FCS受體以降低非特異性反應(yīng));(2)細(xì)胞上板:誘導(dǎo)的CTL作為效應(yīng)細(xì)胞(I X IO5/孔),荷肽的T2A2細(xì)胞作為刺激細(xì)胞(I X IO5/孔)鋪板。100 μ L/孔。細(xì)胞在孔中的分布要盡量均勻(加入細(xì)胞之后,不要再震動(dòng)或者拍擊ELISP0T板);.正對(duì)照:細(xì)胞濃度為I X IO5/孔、加入10 μ L ΡΗΑ,該濃度能有效刺激IFN-Y的分泌;.背景負(fù)對(duì)照:加入100 μ L的含5%FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基;(3)加完所有的樣品之后,蓋上板蓋,放入CO2培養(yǎng)箱,37 °C培養(yǎng)18h ; (4)裂解細(xì)胞:傾倒孔內(nèi)的細(xì)胞及培養(yǎng)基,200 μ L/孔加入冰冷的去離子水,4 1:冰浴反應(yīng)10 min(低滲法裂解細(xì)胞);(5)洗滌:傾倒孔內(nèi)的液體,IX的Washing Buff er,200 μ L/孔,洗滌5 7次,每次停留30 60 S,最后一次,在吸水紙上扣干;(6)加入檢測(cè)抗體孵育:每孔加入100 μ L稀釋好的生物素標(biāo)記檢測(cè)抗體,37°C孵育Ih ; (7)洗滌 :傾倒孔內(nèi)的液體,I X的Washing Buffer, 200 μ L/孔,洗滌5次,每次停留時(shí)間為3(T60 s,最后一次,在吸水紙上扣干;(8)酶聯(lián)親和素孵育:將稀釋好的酶聯(lián)親和素工作液加入到實(shí)驗(yàn)孔,100 μ L/孔,37 °C孵育Ih; (9)洗滌:傾倒孔內(nèi)的液體,IX的Washing Buffer,200uL/孔,洗滌5次,每次停留時(shí)間為30 60 S,最后一次,在吸水紙上扣干;(10)顯色:解凍已配好的AEC顯色液。每孔加入100 UL的顯色液,室溫靜置15-45min (在20 -25° C,顯色25min較合適),注意避光;(11)終止顯色:傾倒孔內(nèi)液體,揭開(kāi)板底座,以去離子水洗滌3飛遍,終止顯色過(guò)程。將板倒扣在吸水紙上,拍干細(xì)小的水珠,之后取下保護(hù)層,放在通風(fēng)的地方,室溫靜置10-30min,讓膜自然晾干;用ELISP0T圖象分析儀計(jì)數(shù)96孔板中每孔形成的斑點(diǎn)數(shù)。體外ELISP0T實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:候選肽均能夠在健康供者的外周血中誘導(dǎo)獲得CTLs,且獲得的CTLs經(jīng)刺激后與陽(yáng)性肽相比較均有較高量的IFN- Y分泌(如圖9_16所示)。本發(fā)明利用結(jié)核桿菌自身的耐藥相關(guān)外排蛋白抗原篩選出具有抗結(jié)核的治療性活性肽,為研制基于抗原表位的結(jié)核疫苗提供了理論基礎(chǔ),并為設(shè)計(jì)基于混合T細(xì)胞表位的結(jié)核多表位肽疫苗提供更多的信息。
      權(quán)利要求
      1.一種結(jié)核耐藥相關(guān)外排蛋白來(lái)源抗結(jié)核CTL表位肽,其特征在于:所述表位肽為九肽,所述九肽的氨基酸序列為:P8:Gly-Leu-Val-Ala-Gly-Leu-Ser-Ala-Val。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核耐藥相關(guān)外排蛋白來(lái)源抗結(jié)核CTL表位肽在制備結(jié)核病治療性多肽疫苗中的應(yīng)用。
      全文摘要
      本發(fā)明公開(kāi)了一種結(jié)核耐藥相關(guān)外排蛋白來(lái)源抗結(jié)核CTL表位肽為九肽,所述九肽的氨基酸序列為P8GLVAGLSAV。本發(fā)明根據(jù)抗原的一級(jí)結(jié)構(gòu),采用免疫信息學(xué)手段,運(yùn)用SYFPEITHI、BIMAS和NetCTL1.2數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)結(jié)核耐藥相關(guān)蛋白抗原的HLA-A*0201限制性CTL表位進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析,篩選獲得表位肽,鑒定的九肽未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。通過(guò)體外ELISPOT實(shí)驗(yàn)對(duì)表位肽進(jìn)行鑒定,其結(jié)果為研制基于耐藥相關(guān)蛋白抗原的結(jié)核疫苗提供了理論基礎(chǔ),并為設(shè)計(jì)基于混合T細(xì)胞表位的結(jié)核多表位肽疫苗提供更多的信息。
      文檔編號(hào)C07K7/06GK103172702SQ20131010123
      公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2011年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月26日
      發(fā)明者祁元明, 陳飛, 高艷鋒, 朱宇皇, 吳亞紅, 陳艷平, 韓艷林 申請(qǐng)人:鄭州大學(xué)
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