一種替度魯肽的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及多肽藥物制備方法領域，尤其涉及一種替度魯肽制備方法。該方法以Asp-Gly二肽及氨基酸為原料，制備第一多肽片段；合成C端多肽片段-樹脂及中間多肽片段；按照替度魯泰肽序，在C端多肽片段-樹脂上依次偶聯(lián)中間多肽片段和第一多肽片段，制得替度魯肽樹脂；取替度魯肽樹脂經(jīng)裂解、純化，即得；Asp-Gly二肽中Gly側(cè)鏈保護基為Dmb或Hmb；第一多肽片段具有SEQ?ID?NO：1或SEQ?ID?NO：2所示氨基酸序列；C端多肽片段具有如SEQ?ID?NO：3、SEQ?ID?NO：4或SEQ?ID?NO：5所示氨基酸序列；中間多肽片段為1～3個。該方法避免了五元環(huán)結構的形成，提高純度。
【專利說明】一種替度魯肽的制備方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及多肽藥物制備方法領域，尤其涉及一種替度魯肽制備方法。

【背景技術】
[0002]短腸綜合征(SBS)是指由于嚴重小腸疾病或外科手術切除大部分小腸導致機體無法正常吸收營養(yǎng)而引發(fā)一系列綜合征。SBS降低了患者攝取液體和營養(yǎng)物質(zhì)的能力，導致他們脫水和營養(yǎng)不良。而腸外營養(yǎng)支持治療又將增加全身感染和其他長期并發(fā)癥的風險，迄今為止尚無藥物可以治療短腸綜合征。
[0003]替度魯肽(teduglutide)是一種胰高血糖素樣肽2 (GLP-2)類似物，替度魯肽的氨基酸序列中包含有33個氨基酸，其結構如SEQ ID NO: 11所示，是一種天然生成的激素，可減少胃排空和分泌，并調(diào)節(jié)小腸內(nèi)膜細胞的生長、增殖和修復。替度魯肽于2001年被定性為孤兒藥。臨床試驗表明，該藥能夠降低短腸綜合征患者對胃腸外營養(yǎng)的需求。
[0004]目前，對替度魯肽的合成方式主要有順序偶聯(lián)和片段偶聯(lián)兩種方法，其中順序偶聯(lián)是以wang樹脂為載體，采用純固相順序偶聯(lián)的方法進行肽的合成，最終切割得到替度魯肽；片段偶聯(lián)則是先合成具有SEQ ID NO:2所示結構的全保護片段，然后采用純化后的全保護片段與具有SEQ ID NO: 12所示結構的片段肽樹脂進行固相偶聯(lián)，最終裂解得到替度魯肽。
[0005]由于替度魯肽的肽鏈較長，采用順序偶聯(lián)的方式合成會使合成的難度增大，并產(chǎn)生難以純化的雜質(zhì)，降低回收率。而更重要的是，替度魯肽的N端第3~第4個氨基酸為Asp-Gly,天冬氨酸(Asp)側(cè)鏈中的羧基能與酰胺鍵中的-H成五元環(huán)，這種五元環(huán)結構一旦形成，會在一定條件下降解開環(huán)，而在開環(huán)過程中會產(chǎn)生多種雜質(zhì)，例如:Asp的消旋、產(chǎn)生α, β天冬氨酸等，造成替度魯肽純度的下降。研究表明，五元環(huán)結構的形成與Asp或Asn的右側(cè)氨基酸有重大關系，而Gly由于側(cè)鏈沒有保護基團且空間位阻小，當Gly先于Asp偶聯(lián)時最易成環(huán)的結構。因此采用順序偶聯(lián)的方式必然會使替度魯肽的N端第3~第4個氨基酸在合成的過程中生成五元環(huán)，從而造成純度的降低。因此，為了解決Asp-Gly片段產(chǎn)生降解的問題，采用片段偶聯(lián)的方式先合成具有SEQ ID Ν0:2所示結構的全保護片段，該全保護片段即為替度魯肽的N端第I~第4個氨基酸，其中包括Asp-Gly結構，然后對該全保護片段進行純化，并采用純化后的全保護片段與具有SEQ ID NO: 12所示結構的片段肽樹脂進行固相偶聯(lián)，最終裂解得到替度魯肽。但是，雖然在固相偶聯(lián)之前已經(jīng)對會產(chǎn)生降解雜質(zhì)的全保護片段進行了純化，不但增加了制備步驟，且無法保證其在后續(xù)的固相偶聯(lián)過程中不發(fā)生再一次的降解。因此，采用這種片段方法不能從根本上解決Asp-Gly片段產(chǎn)生降解的問題。檢測表明，以現(xiàn)有技術制備替度魯肽現(xiàn)有技術制備的醋酸替度魯肽的收率為20%，純度為98.5%，其中Asp-Gly片段降解產(chǎn)生雜質(zhì)的含量為0.2%。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種替度魯肽的制備方法，采用Fmoc-Asp (OtBu) - (Hmb) Gly-OH 或 Fmoc-Asp (OtBu) - (Dmb) Gly-OH 為偶聯(lián)原料，從而解決合成過程中Asp-Gly降解的問題。
[0007]本發(fā)明提供了一種替度魯肽的制備方法，包括以下步驟:
[0008]步驟1:以Asp-Gly 二肽及氨基酸為原料，制備第一多肽片段；
[0009]步驟2:合成C端多肽片段-樹脂及中間多肽片段；
[0010]步驟3:按照替度魯泰肽序，在C端多肽片段-樹脂上依次偶聯(lián)中間多肽片段和第一多肽片段，制得替度魯肽樹脂；
[0011]步驟4:取替度魯肽樹脂經(jīng)裂解、純化，即得；
[0012]Asp-Gly 二妝為 Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH 或 Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH ；
[0013]第一多肽片段具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
[0014]C端多肽片段具有如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示氨基酸序列；
[0015]中間多肽片段的數(shù)量為I個~3個。
[0016]由于先偶聯(lián)Gly再偶聯(lián)Asp的合成方法極易使Asp側(cè)鏈中的羧基與酰胺鍵中的-H成五元環(huán)，因此本發(fā)明將易產(chǎn)生五元環(huán)結構的Asp-Gly作為一個整體進行偶聯(lián)，從而避免了在順序偶聯(lián)過程中五元環(huán)結構的形成，提高了純度及收率。而由于Asp-Gly相連時側(cè)鏈極不穩(wěn)定，因此采用OtBu對Asp的側(cè)鏈進行保護，而采用Hmb或Dmb對Gly的側(cè)鏈進行保護，從而進一步避免五元環(huán)結構的形成。本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法采用片段合成的方式，以Asp-Gly 二肽作為合成原料，從而提高了純度及收率。采用Asp-Gly 二肽作為合成原料的目的是避免Asp先于Gly偶聯(lián)而產(chǎn)生Asp降解產(chǎn)物，而采用片段合成是為了避免多次偶聯(lián)過程中使Asp發(fā)生降解。
[0017]當中間多肽片段數(shù)量為I時，步驟3中偶聯(lián)的順序為:如SEQ ID N0:3所示氨基酸序列的C端多肽片段-樹脂、如SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的中間多肽片段、如SEQ IDNO:1所示氨基酸序列的第一多肽片段。
[0018]當中間多肽片段數(shù)量為2時，步驟3中偶聯(lián)的順序為:如SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的C端多肽片段-樹脂、如SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的中間多肽片段、如SEQ IDNO:7所示氨基酸序列的中間多肽片段、如SEQ IDNO:2所示氨基酸序列的第一多肽片段。
[0019]當中間多肽片段數(shù)量為3時，步驟3中偶聯(lián)的順序為:如SEQ ID N0:5所示氨基酸序列的C端多肽片段-樹脂、如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的中間多肽片段、如SEQ IDNO:6所示氨基酸序列的中間多肽片段、如SEQ IDNO:9所示氨基酸序列的中間多肽片段、如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第一多肽片段。
[0020]作為優(yōu)選，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的中間多肽片段的數(shù)量為I個，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示
[0021]替度魯肽制備方法的中間多肽片段的數(shù)量為I個時，第一多肽片段優(yōu)選為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第I~9個氨基酸的多肽片段，序列如SEQ ID N0:1所示；中間片段為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第10~18個氨基酸的多肽片段，序列如SEQ ID NO:6所示；C端多肽片段-樹脂為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第19~33個氨基酸的多肽片段，序列如SEQ ID N0:3所示。
[0022]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的中制備序列如SEQ ID NO:1所示的第一多肽片段采用的固相載體為 HMPB Resin、HAL Resin, SASRIN Resin 或 CTC Resin。
[0023]更優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中制備序列如SEQ ID NO:1所示的第一多肽片段采用的固相載體為CTC Resin0
[0024]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中制備序列如SEQ ID NO:1所示的第一多肽片段采用的裂解液為TFA與DCM的混合物或TFE與DCM的混合物。
[0025]更優(yōu)選地，TFA與DCM的混合物作為裂解液，裂解液中TFA的體積分數(shù)為0.5%~
5% .
[0026]更優(yōu)選的，TFE與DCM的混合物作為裂解液，裂解液中TFE的體積分數(shù)為20%。
[0027]優(yōu)選地，序列如SEQ ID NO:6所示的中間片段的合成具體為:采用順序偶聯(lián)的方法，首先在固相載體上偶聯(lián)Ala,然后從C端至N端依次偶聯(lián)Leu、Asn、Asp、Leu、lie、Thr>Asn、Met,經(jīng)裂解即得。
[0028]優(yōu)選地，序列如SEQ ID NO: 3所示的C端多肽片段-樹脂的合成采用順序偶聯(lián)的方法。
[0029]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中序列如SEQ ID NO: 3所示的C端多肽片段-樹脂中的樹脂為 Wang Resin、PAM Resin, HMPA-AM Resin 或 HMPA-MBHA Resin。
[0030]更優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中序列如SEQ ID NO: 3所示的C端多肽片段-樹脂中的樹脂為Wang Resin0
[0031]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中序列如SEQ ID N0:3所示的C端多肽片段-樹脂的合成具體為:在Fmoc-Asp(OtBu)-Resin上自C端至N端依次偶聯(lián)Thr、lie、Lys> Thr> Gin、lie、Leu、Trp、Asn、lie、Phe、Asp、Arg 和 Ala 即得。
[0032]更優(yōu)選地，F(xiàn)moc-Asp(OtBu) -Resin 的替代度為 0.2mmol/L ~0.5mmol/L。
[0033]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟3中偶聯(lián)的偶聯(lián)試劑采用HATU、HOAt與DIPEA的混合物。
[0034]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟4中裂解的裂解液為TFA、PhSMe、EDT、TIS與!120的混合物。
[0035]更優(yōu)選地，裂解液中TFA、PhSMe、EDT、TIS與H2O的體積比為86:5:5:3:1。
[0036]作為優(yōu)選，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的中間多肽片段的數(shù)量為2個，其氨基酸序列分別如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示
[0037]替度魯肽制備方法的中間多肽片段的數(shù)量為2個時，第一多肽片段優(yōu)選為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第I~4個氨基酸的多肽片段，序列如SEQ ID NO: 2所示；序列如SEQ ID N0:7所示的中間片段為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第5~12個氨基酸的多肽片段；序列如SEQ ID NO:8所示的中間片段為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第13~20個氨基酸的多肽片段；C端多肽片段-樹脂為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第21~33個氨基酸的多肽片段序列如SEQ ID NO: 4所示。
[0038]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的中制備序列如SEQ ID N0:2所示的第一多肽片段采用的固相載體為 HMPB Resin、HAL Resin, SASRIN Resin 或 CTC Resin。
[0039]更優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中制備序列如SEQ ID N0:2所示的第一多肽片段采用的固相載體為CTC Resin0
[0040]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中制備序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段采用的裂解液為TFA與DCM的混合物或TFE與DCM的混合物。
[0041 ] 更優(yōu)選地，TFA與DCM的混合物作為裂解液，裂解液中TFA的體積分數(shù)為0.5%~
5% ο
[0042]更優(yōu)選的，TFE與DCM的混合物作為裂解液，裂解液中TFE的體積分數(shù)為20%。
[0043]優(yōu)選地，序列如SEQ ID NO:7所示的中間片段的合成具體為:采用順序偶聯(lián)的方法，首先在固相載體上偶聯(lián)Thr,然后從C端至N端依次偶聯(lián)Asn、Met、Glu、Asp、Ser> Phe、Ser，經(jīng)裂解即得。
[0044]優(yōu)選地，序列如SEQ ID NO:8所示的中間片段的合成具體為:采用順序偶聯(lián)的方法，首先在固相載體上偶聯(lián)Arg,然后從C端至N端依次偶聯(lián)Ala、Ala、Ley、Asn、Asp、Leu、Πθ，經(jīng)裂解即得。
[0045]優(yōu)選地，序列如SEQ ID NO:4所示的C端多肽片段-樹脂的合成采用順序偶聯(lián)的方法。
[0046]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中序列如SEQ ID N0:4所示的C端多肽片段-樹脂中的樹脂為 Wang Resin、PAM Resin, HMPA-AM Resin 或 HMPA-MBHA Resin。
[0047]更優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中序列如SEQ ID N0:4所示的C端多肽片段-樹脂中的樹脂為Wang Resin0
[0048]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中序列如SEQ ID N0:4所示的C端多肽片段-樹脂的合成具體為:在Fmoc-Asp(OtBu)-Resin上自C端至N端依次偶聯(lián)Thr、lie、Lys> Thr、Gin、lie、Leu、Trp、Asn、lie、Phe 和 Asp,即得。
[0049]更優(yōu)選地，F(xiàn)moc-Asp(OtBu) -Resin 的替代度為 0.2mmol/L ~0.5mmol/L。
[0050]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟3中偶聯(lián)的偶聯(lián)試劑采用HATU、HOAt與DIPEA的混合物。
[0051]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟4中裂解的裂解液為TFA、PhSMe、EDT、TIS與!120的混合物。
[0052]更優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟4中裂解液中TFA、PhSMe、EDT、TIS與H2O的體積比為86:5:5:3:1。
[0053]作為優(yōu)選，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的中間多肽片段的數(shù)量為3個，其氨基酸序列分別如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:11所示
[0054]替度魯肽制備方法的中間多肽片段的數(shù)量為3個時，第一多肽片段優(yōu)選為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第I~4個氨基酸的多肽片段，序列如SEQ ID N0:2所示；序列如SEQ ID N0:9所示的中間片段為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第5~9個氨基酸的多肽片段；序列如SEQ ID N0:6所示的中間片段為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第10~18個氨基酸的多肽片段；序列如SEQ ID NO: 10所示的中間片段為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第19~26個氨基酸的多肽片段；(:端多肽片段-樹脂為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第27~33個氨基酸的多肽片段序列如SEQ ID NO: 5所示。
[0055]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的中制備序列如SEQ ID N0:2所示的第一多肽片段采用的固相載體為 HMPB Resin、HAL Resin, SASRIN Resin 或 CTC Resin。
[0056]更優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中制備序列如SEQ ID N0:2所示的第一多肽片段采用的固相載體為CTC Resin0
[0057]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中制備序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段采用的裂解液為TFA與DCM的混合物或TFE與DCM的混合物。
[0058]更優(yōu)選地，TFA與DCM的混合物作為裂解液，裂解液中TFA的體積分數(shù)為0.5%~
5% ο
[0059]更優(yōu)選的，TFE與DCM的混合物作為裂解液，裂解液中TFE的體積分數(shù)為20%。
[0060]優(yōu)選地，序列如SEQ ID N0:9所示的中間片段的合成具體為:采用順序偶聯(lián)的方法，首先在固相載體上偶聯(lián)Glu，然后從C端至N端依次偶聯(lián)Asp、Ser, Phe、Ser，經(jīng)裂解即得。
[0061]優(yōu)選地，序列如SEQ ID N0:6所示的中間片段的合成具體為:采用順序偶聯(lián)的方法，首先在固相載體上偶聯(lián)Ala,然后從C端至N端依次偶聯(lián)Leu、Asn、Asp、Leu、lie、Thr、Asn、Met,經(jīng)裂解即得。
[0062]優(yōu)選地，序列如SEQ ID NO: 10所示的中間片段的合成具體為:采用順序偶聯(lián)的方法，首先在固相載體上偶聯(lián)Leu,然后從C端至N端依次偶聯(lián)Trp、Asn、lie、Phe、Asp、Arg、Ala，經(jīng)裂解即得。
[0063]優(yōu)選地，序列如SEQ ID NO: 5所示的C端多肽片段-樹脂的合成采用順序偶聯(lián)的方法。
[0064]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中序列如SEQ ID NO: 5所示的C端多肽片段-樹脂中的樹脂為 Wang Resin、PAM Resin, HMPA-AM Resin 或 HMPA-MBHA Resin。
[0065]更優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中序列如SEQ ID NO: 5所示的C端多肽片段-樹脂中的樹脂為Wang Resin0
[0066]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中序列如SEQ ID NO: 5所示的C端多肽片段-樹脂的合成具體為:在Fmoc-Asp(OtBu)-Resin上自C端至N端依次偶聯(lián)Thr、lie、Lys> Thr> Gln 和 lie,即得。
[0067]更優(yōu)選地，F(xiàn)moc-Asp(OtBu) -Resin 的替代度為 0.2mmol/L ~0.Smmol /I,η
[0068]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟3中偶聯(lián)的偶聯(lián)試劑采用HATU、HOAt與DIPEA的混合物。
[0069]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟4中裂解的裂解液為TFA、PhSMe、EDT、TIS與!120的混合物。
[0070]更優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟4中裂解液中TFA、PhSMe、EDT、TIS與H2O的體積比為86:5:5:3:1。
[0071]本發(fā)明提供了一種替度魯肽的制備方法，包括以下步驟:步驟1:以Asp-Gly 二肽及氨基酸為原料，制備第一多肽片段；步驟2:合成C端多肽片段-樹脂及中間多肽片段；步驟3:按照替度魯泰肽序，在C端多肽片段-樹脂上依次偶聯(lián)中間多肽片段和第一多肽片段，制得替度魯肽樹脂；步驟4:取替度魯肽樹脂經(jīng)裂解、純化，即得；Asp-Gly 二肽為Fmoc-Asp (OtBu) - (Hmb) Gly-OH 或 Fmoc-Asp (OtBu) - (Dmb) Gly-OH ;第一多妝片段具有 SEQID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；C端多肽片段具有如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示氨基酸序列；中間多肽片段的數(shù)量為I個~3個。現(xiàn)有的合成方法中，對于替度魯肽的合成不論是采用順序偶聯(lián)的方式還是采用片段偶聯(lián)的方式，都會由于先偶聯(lián)Gly再偶聯(lián)Asp而使Asp側(cè)鏈中的羧基與酰胺鍵中的-H成五元環(huán)，而這種五元環(huán)結構一旦形成，會在一定條件下降解開環(huán)產(chǎn)生雜質(zhì)，而這些由Asp降解產(chǎn)生的雜質(zhì)不易去除，因此本發(fā)明將易產(chǎn)生五元環(huán)結構的Asp-Gly作為一個整體進行偶聯(lián)，從而避免了在順序偶聯(lián)過程中五元環(huán)結構的形成，提高了純度及收率。由于Asp-Gly相連時側(cè)鏈極不穩(wěn)定，因此采用OtBu對Asp的側(cè)鏈進行保護,采用Hmb或Dmb對Gly的側(cè)鏈進行保護，從而進一步避免五元環(huán)結構的形成。另外，本發(fā)明通過對替度魯泰肽序的合理劃分，將替度魯泰分為3~5個片段進行合成，從而提高了合成效率，且降低了在逐步偶聯(lián)過程中造成的降解。因此，本發(fā)明提供的方法提高了替度魯肽的純度，縮短了合成周期，實驗表明，本發(fā)明提供的方法制備的替度魯肽的純度可達99.23%，較采用現(xiàn)有方法制備的替度魯肽的純度提高0.7%，而Asp降解雜質(zhì)的含量為0.15%。較現(xiàn)有技術降低25%。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0072]圖1示市售替度魯肽醋酸鹽對照樣品檢測的結果；
[0073]圖2示采用與市售對照樣品相同檢查色譜條件對本發(fā)明實施例138中制備的替度魯肽粗肽純化、成鹽并凍干后，得到替度魯肽醋酸鹽精肽進行檢測的結果。

【具體實施方式】
[0074]本發(fā)明提供了一種替度魯肽的制備方法，本領域技術人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn) 。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術。
[0075]本發(fā)明提供了一種替度魯肽的制備方法，包括以下步驟:
[0076]步驟1:以Asp-Gly 二肽及氨基酸為原料，制備第一多肽片段；
[0077]步驟2:合成C端多肽片段-樹脂及中間多肽片段；
[0078]步驟3:按照替度魯泰肽序，在C端多肽片段-樹脂上依次偶聯(lián)中間多肽片段和第一多肽片段，制得替度魯肽樹脂；
[0079]步驟4:取替度魯肽樹脂經(jīng)裂解、純化，即得；
[0080]Asp-Gly 二妝為 Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH 或 Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH ；
[0081]第一多肽片段具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
[0082]C端多肽片段具有如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示氨基酸序列；
[0083]中間多肽片段的數(shù)量為I個~3個。
[0084]當中間多肽片段數(shù)量為I時，步驟3中偶聯(lián)的順序為:如SEQ ID N0:3所示氨基酸序列的C端多肽片段-樹脂、如SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的中間多肽片段、如SEQ IDNO:1所示氨基酸序列的第一多肽片段。
[0085]當中間多肽片段數(shù)量為2時，步驟3中偶聯(lián)的順序為:如SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的C端多肽片段-樹脂、如SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的中間多肽片段、如SEQ IDNO:7所示氨基酸序列的中間多肽片段、如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第一多肽片段。
[0086]當中間多肽片段數(shù)量為3時，步驟3中偶聯(lián)的順序為:如SEQ ID N0:5所示氨基酸序列的C端多肽片段-樹脂、如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的中間多肽片段、如SEQ IDNO:6所示氨基酸序列的中間多肽片段、如SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的中間多肽片段、如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第一多肽片段。
[0087]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的中間多肽片段的數(shù)量為I個，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6 所示
[0088]替度魯肽制備方法的中間多肽片段的數(shù)量為I個時，第一多肽片段優(yōu)選為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第I~9個氨基酸的多肽片段，序列如SEQ ID NO:1所示；中間片段為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第10~18個氨基酸的多肽片段，序列如SEQ ID NO: 6所示；C端多肽片段-樹脂為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第19~33個氨基酸的多肽片段，序列如SEQ ID N0:3所示。
[0089]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中制備序列如SEQ ID NO:1所示的第一多肽片段的方法為:首先在固相載體上偶聯(lián)Gly,然后從C端至N端依次偶聯(lián)Asp、Ser> Phe、Ser>Asp-Gly、Gly、His,經(jīng)裂解即得。
[0090]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的中制備序列如SEQ ID NO:1所示的第一多肽片段采用的固相載體為 HMPB Resin、HAL Resin, SASRIN Resin 或 CTC Resin。
[0091]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中制備序列如SEQ ID NO:1所示的第一多肽片段采用的固相載體為CTC Resin0
[0092]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中制備序列如SEQ ID NO:1所示的第一多肽片段中偶聯(lián)采用的偶聯(lián)試劑為HOBt。
[0093]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中制備序列如SEQ ID NO:1所示的第一多肽片段采用的裂解液為TFA與DCM的混合物或TFE與DCM的混合物。
[0094]TFA與DCM的混合物作為裂解液，裂解液中TFA的體積分數(shù)為0.5%~5%。
[0095]TFE與DCM的混合物作為裂解液，裂解液中TFE的體積分數(shù)為20%。
[0096]制備序列如SEQ ID NO:1所示的第一多肽片段的方法中裂解后還包括:過濾、第一洗滌、濃縮、沉淀、第二洗滌、干燥的步驟。
[0097]序列如SEQ ID N0:6所示的中間片段的合成具體為:采用順序偶聯(lián)的方法，首先在固相載體上偶聯(lián)Ala,然后從C端至N端依次偶聯(lián)Leu、Asn、Asp、Leu、lie、Thr、Asn、Met,經(jīng)裂解即得。
[0098]序列如SEQ ID N0:6所示的中間片段的合成方法中，偶聯(lián)采用的偶聯(lián)試劑為HOBt。
[0099]序列如SEQ ID NO:6所示的中間片段的合成中裂解后還包括:過濾、第一洗滌、濃縮、沉淀、第二洗滌、干燥的步驟。
[0100]序列如SEQ ID NO: 3所示的C端多肽片段-樹脂的合成采用順序偶聯(lián)的方法。
[0101]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中序列如SEQ ID N0:3所示的C端多肽片段-樹脂中的樹脂為 Wang Resin、PAM Resin, HMPA-AM Resin 或 HMPA-MBHA Resin。
[0102] 本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中序列如SEQ ID N0:3所示的C端多肽片段-樹脂中的樹脂為Wang Resin。
[0103]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中序列如SEQ ID N0:3所示的C端多肽片段-樹脂的合成具體為:在Fmoc-Asp (OtBu) -Resin上自C端至N端依次偶聯(lián)Thr、lie、Lys> Thr>Gin、lie、Leu、Trp、Asn、lie、Phe、Asp、Arg 和 Ala 即得。
[0104]Fmoc-Asp (OtBu) -Resin 的替代度為 0.2mmol/L ~0.5mmol/L。
[0105]如SEQ ID NO: 3所示的C端多肽片段-樹脂的合成方法中，偶聯(lián)采用的偶聯(lián)劑為HOBt0
[0106]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟3中偶聯(lián)的偶聯(lián)試劑采用HATU、HOAt與DIPEA的混合物。
[0107]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟4中裂解的裂解液為TFA、PhSMe、EDT、TIS與H2O的混合物。
[0108]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟4的裂解液中TFA、PhSMe、EDT、TIS與H2O的體積比為86:5:5:3:1。
[0109]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟4中的純化采用高效液相色譜法。
[0110]為使替度魯肽能夠穩(wěn)定保存，在本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟4中的純化后還包括成鹽的步驟。
[0111]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的中間多肽片段的數(shù)量為2個，其氨基酸序列分別如 SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8 所示
[0112]替度魯肽制備方法的中間多肽片段的數(shù)量為2個時，第一多肽片段優(yōu)選為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第I~4個氨基酸的多肽片段，序列如SEQ ID N0:2所示；序列如SEQ ID N0:7所示的中間片段為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第5~12個氨基酸的多肽片段；序列如SEQ ID NO:8所示的中間片段為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第13~20個氨基酸的多肽片段；C端多肽片段-樹脂為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第21~33個氨基酸的多肽片段序列如SEQ ID NO:4所示。
[0113]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的中制備序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段采用的固相載體為 HMPB Resin、HAL Resin, SASRIN Resin 或 CTC Resin。
[0114]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中制備序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段的方法為:首先在固相載體上偶聯(lián)Asp-Gly，然后從C端至N端依次偶聯(lián)Gly、His，經(jīng)裂解即得。
[0115]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中制備序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段采用的固相載體為CTC Resin0
[0116]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中制備序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段中偶聯(lián)采用的偶聯(lián)試劑為HOBt。
[0117]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中制備序列如SEQ ID N0:2所示的第一多肽片段采用的裂解液為TFA與DCM的混合物或TFE與DCM的混合物。
[0118]TFA與DCM的混合物作為裂解液，裂解液中TFA的體積分數(shù)為0.5%~5%。
[0119]TFE與DCM的混合物作為裂解液，裂解液中TFE的體積分數(shù)為20%。
[0120]制備序列如SEQ ID N0:2所示的第一多肽片段的方法中裂解后還包括:過濾、第一洗滌、濃縮、沉淀、第二洗滌、干燥的步驟。
[0121]序列如SEQ ID N0:7所示的中間片段的合成具體為:采用順序偶聯(lián)的方法，首先在固相載體上偶聯(lián)Thr,然后從C端至N端依次偶聯(lián)Asn、Met、Glu、Asp、Ser、Phe、Ser,經(jīng)裂解即得。
[0122]序列如SEQ ID N0:7所示的中間片段的合成方法中，偶聯(lián)采用的偶聯(lián)試劑為HOBt。
[0123]序列如SEQ ID NO:7所示的中間片段的合成中裂解后還包括:過濾、第一洗滌、濃縮、沉淀、第二洗滌、干燥的步驟。
[0124]序列如SEQ ID N0:8所示的中間片段的合成具體為:采用順序偶聯(lián)的方法，首先在固相載體上偶聯(lián)Arg,然后從C端至N端依次偶聯(lián)Ala、Ala、Ley、Asn、Asp、Leu、lie,經(jīng)裂解即得。
[0125]序列如SEQ ID N0:8所示的中間片段的合成方法中，偶聯(lián)采用的偶聯(lián)試劑為HOBt。
[0126]序列如SEQ ID NO:8所示的中間片段的合成中裂解后還包括:過濾、第一洗滌、濃縮、沉淀、第二洗滌、干燥的步驟。
[0127]序列如SEQ ID N0:4所示的C端多肽片段-樹脂的合成采用順序偶聯(lián)的方法。
[0128]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中序列如SEQ ID NO: 4所示的C端多肽片段-樹脂中的樹脂為 Wang Resin、PAM Resin, HMPA-AM Resin 或 HMPA-MBHA Resin。
[0129]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中序列如SEQ ID NO: 4所示的C端多肽片段-樹脂中的樹脂為Wang Resin。
[0130]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中序列如SEQ ID N0:4所示的C端多肽片段-樹脂的合成具體為:在Fmoc-Asp (OtBu) -Resin上自C端至N端依次偶聯(lián)Thr、lie、Lys> Thr>Gin、lie、Leu、Trp、Asn、lie、Phe 和 Asp,即得。
[0131]Fmoc-Asp (OtBu) -Resin 的替代度為 0.2mmol/L ~0.5mmol/L。
[0132]如SEQ ID NO: 4所示的C端多肽片段-樹脂的合成方法中，偶聯(lián)采用的偶聯(lián)劑為HOBt0
[0133]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟3中偶聯(lián)的偶聯(lián)試劑采用HATU、HOAt與DIPEA的混合物。
[0134]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟4中裂解的裂解液為TFA、PhSMe、EDT、TIS與H2O的混合物。
[0135]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟4中裂解液中TFA、PhSMe、EDT、TIS與H2O的體積比為86:5:5:3:1。
[0136]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟4中的純化采用高效液相色譜法。
[0137]為使替度魯肽能夠穩(wěn)定保存，在本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟4中的純化后還包括成鹽的步驟。
[0138]作為優(yōu)選，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的中間多肽片段的數(shù)量為3個，其氨基酸序列分別如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10所示
[0139]替度魯肽制備方法的中間多肽片段的數(shù)量為3個時，第一多肽片段優(yōu)選為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第I~4個氨基酸的多肽片段，序列如SEQ ID N0:2所示；序列如SEQ ID N0:9所示的中間片段為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第5~9個氨基酸的多肽片段；序列如SEQ ID NO:6所示的中間片段為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第10~18個氨基酸的多肽片段；序列如SEQ ID NO: 10所示的中間片段為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第19~26個氨基酸的多肽片段；(:端多肽片段-樹脂為包含替度魯肽的肽序中自C端至N端的第27~33個氨基酸的多肽片段序列如SEQ ID NO: 5所示。
[0140]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的中制備序列如SEQ ID N0:2所示的第一多肽片段采用的固相載體為 HMPB Resin、HAL Resin, SASRIN Resin 或 CTC Resin。
[0141]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中制備序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段的方法為:首先在固相載體上偶聯(lián)Asp-Gly，然后從C端至N端依次偶聯(lián)Gly、His，經(jīng)裂解即得。
[0142]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中制備序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段采用的固相載體為CTC Resin0
[0143]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中制備序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段中偶聯(lián)采用的偶聯(lián)試劑為HOBt。
[0144]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中制備序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段采用的裂解液為TFA與DCM的混合物或TFE與DCM的混合物。
[0145]TFA與DCM的混合物作為裂解液，裂解液中TFA的體積分數(shù)為0.5%~5%。
[0146]TFE與DCM的混合物作為裂解液，裂解液中TFE的體積分數(shù)為20%。
[0147]制備序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段的方法中裂解后還包括:過濾、第一洗滌、濃縮、沉淀、第二洗滌、干燥的步驟。
[0148]序列如SEQ ID N0:9所示的中間片段的合成具體為:采用順序偶聯(lián)的方法，首先在固相載體上偶聯(lián)Glu，然后從C端至N端依次偶聯(lián)Asp、Ser, Phe、Ser,經(jīng)裂解即得。
[0149]序列如SEQ ID N0:9所示的中間片段的合成方法中，偶聯(lián)采用的偶聯(lián)試劑為HOBt。
[0150]序列如SEQ ID N0:9所示的中間片段的合成中裂解后還包括:過濾、第一洗滌、濃縮、沉淀、第二洗滌、干燥的步驟。
[0151]序列如SEQ ID N0:6所示的中間片段的合成具體為:采用順序偶聯(lián)的方法，首先在固相載體上偶聯(lián)Ala,然后從C端至N端依次偶聯(lián)Leu、Asn、Asp、Leu、lie、Thr、Asn、Met,經(jīng)裂解即得。
[0152]序列如SEQ ID N0:6所示的中間片段的合成方法中，偶聯(lián)采用的偶聯(lián)試劑為HOBt。
[0153]序列如SEQ ID NO:6所示的中間片段的合成中裂解后還包括:過濾、第一洗滌、濃縮、沉淀、第二洗滌、干燥的步驟。
[0154]序列如SEQ ID NO: 10所示的中間片段的合成具體為:采用順序偶聯(lián)的方法，首先在固相載體上偶聯(lián)Leu,然后從C端至N端依次偶聯(lián)Trp、Asn、Ile、Phe、Asp、Arg、Ala,經(jīng)裂解即得。
[0155]序列如SEQ ID NO: 10所示的中間片段的合成方法中，偶聯(lián)采用的偶聯(lián)試劑為HOBt0
[0156]序列如SEQ ID NO: 10所示的中間片段的合成中裂解后還包括:過濾、第一洗滌、濃縮、沉淀、第二洗滌、干燥的步驟。
[0157]優(yōu)選地，序列如SEQ ID NO:5所示的C端多肽片段-樹脂的合成采用順序偶聯(lián)的方法。
[0158]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中序列如SEQ ID N0:5所示的C端多肽片段-樹脂中的樹脂為 Wang Resin、PAM Resin, HMPA-AM Resin 或 HMPA-MBHA Resin。
[0159]更優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中序列如SEQ ID N0:5所示的C端多肽片段-樹脂中的樹脂為Wang Resin0
[0160]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法中序列如SEQ ID N0:5所示的C端多肽片段-樹脂的合成具體為:在Fmoc-Asp(OtBu)-Resin上自C端至N端依次偶聯(lián)Thr、lie、Lys> Thr> Gln 和 lie,即得。
[0161]更優(yōu)選地，F(xiàn)moc-Asp(OtBu) -Resin 的替代度為 0.2mmol/L ~0.Smmol /I,η
[0162]如SEQ ID NO: 5所示的C端多肽片段-樹脂的合成方法中，偶聯(lián)采用的偶聯(lián)劑為HOBt0
[0163]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟3中偶聯(lián)的偶聯(lián)試劑采用HATU、HOAt與DIPEA的混合物。
[0164]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟4中裂解的裂解液為TFA、PhSMe、EDT、TIS與!120的混合物。
[0165]更優(yōu)選地，本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟4中裂解液中TFA、PhSMe、EDT、TIS與H2O的體積比為86:5:5:3:1。
[0166]本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟4中的純化采用高效液相色譜法。
[0167]為使替度魯肽能夠穩(wěn)定保存，在本發(fā)明提供的替度魯肽制備方法的步驟4中的純化后還包括成鹽的步驟。
[0168]本發(fā)明對各氨基酸采用的側(cè)鏈保護基情況見表1:
[0169]表1本發(fā)明對各氨基酸采用的保護基
[0170]

【權利要求】
1.一種替度魯肽的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟1:以Asp-Gly 二肽及氨基酸為原料，制備第一多肽片段； 步驟2:合成C端多肽片段-樹脂及中間多肽片段； 步驟3:按照替度魯泰肽序，在所述C端多肽片段-樹脂上依次偶聯(lián)中間多肽片段和第一多肽片段，制得替度魯肽樹脂； 步驟4:取所述替度魯肽樹脂經(jīng)裂解、純化，即得； 所述 Asp-Gly 二妝為 Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH 或 Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH ； 所述第一多肽片段具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列； 所述C端多肽片段具有如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示氨基酸序列； 所述中間多肽片段的數(shù)量為I個~3個。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述中間多肽片段的數(shù)量為I個，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
3.根據(jù)權利要求1 所述的方法，其特征在于，所述中間多肽片段的數(shù)量為2個，其氨基酸序列分別如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述中間多肽片段的數(shù)量為3個，其氨基酸序列分別如 SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:6 和 SEQ ID NO:10 所示。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I中所述制備第一多肽片段采用的固相載體為 HMPB Resin、HAL Resin, SASRIN Resin 或 CTC Resin。
6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I中所述制備第一多肽片段采用的裂解液為TFA與DCM的混合物或TFE與DCM的混合物。
7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2中所述的C端多肽片段-樹脂中的樹脂為 Wang Resin、PAM Resin, HMPA-AM Resin 或 HMPA-MBHA Resin。
8.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3中所述偶聯(lián)的偶聯(lián)試劑采用HATU、HOAt與DIPEA的混合物。
9.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4中所述裂解的裂解液為TFA、PhSMe、EDT、TIS 與 H2O 的混合物。
【文檔編號】C07K14/605GK104072605SQ201310102450
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2013年3月27日 優(yōu)先權日:2013年3月27日
【發(fā)明者】宓鵬程, 劉建, 馬亞平, 袁建成 申請人:深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司