專利名稱：一種g因子的分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鱟試劑的技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種G因子的分離純化方法。
背景技術(shù)：
1968年Levin J和Bang F B創(chuàng)建鱟試劑以來(lái)，使內(nèi)毒素的檢測(cè)成為靈敏、快速、簡(jiǎn)便的方法，已被舉世公認(rèn)，并被美、日、中、歐洲藥典以《細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)》收載。但1981年日本學(xué)者Kakinuma A發(fā)現(xiàn)非熱原物質(zhì)(1-3)- β -D-葡聚糖也可使當(dāng)試劑凝聚，這極大影響了普通鱟試劑檢測(cè)內(nèi)毒素的特異性，因而目前檢測(cè)內(nèi)毒素的鱟試劑主要為特異鱟試劑，其生產(chǎn)工藝的特點(diǎn)是利用親和層析方法將普通鱟試劑中存在的可以和(1-3) _β-D-葡聚糖產(chǎn)生凝聚反應(yīng)的G因子分離去除，如本發(fā)明人申請(qǐng)的中國(guó)專利CN1621841A中披露的“抗干擾鱟試劑的制備工藝”。因?yàn)槠暇厶鞘钦婢?xì)胞壁的主要成分，而患者的真菌感染檢測(cè)在醫(yī)學(xué)上一直是個(gè)難題，所以葡聚糖與G因子發(fā)生凝聚反應(yīng)的原理很快被用于真菌感染的檢測(cè)上，如本發(fā)明人申請(qǐng)的中國(guó)專利CN101880706A披露的“一種直接真菌檢測(cè)鱟試劑盒及方法”。該檢測(cè)方法對(duì)G因子的純度要求較高,尤其是當(dāng)血細(xì)胞中含有的凝固原(coagulogen)不能混雜其中，而常規(guī)親和層析法分離的G因子和凝固原是在同一區(qū)間洗脫的，因此G因子的合并組分中通常含有凝固原組分，并不能直接作為真菌檢測(cè)的試劑來(lái)使用。所以，要么以獲取高純度G因子組分為目標(biāo)開發(fā)一種從鱟全血中特異性分離純化G因子的方法，要么以特異鱟試劑生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的含有凝固原的G因子合并組分為基礎(chǔ)發(fā)明進(jìn)一步分離純化的方法。顯然，后一種方法更能夠充分利用寶貴的鱟資源，但是從G因子組分中去除性質(zhì)相近的凝固原是一個(gè)技術(shù)難題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提 供一種G因子的分離純化方法，其包括從鱟全血中分離提取血細(xì)胞步驟及將血細(xì)胞崩解后利用親和層析法對(duì)鱟血細(xì)胞中包括G因子的各種血細(xì)胞成分進(jìn)行初級(jí)分離純化的步驟，其還包括對(duì)初級(jí)分離純化所得的主要含G因子的合并組分進(jìn)一步分離純化的步驟，籍以制備去除凝固原的高純度G因子組分。該進(jìn)一步分離純化的步驟為:
第一步:制備ConA-Sepharose瓊脂糖凝膠柱,該ConA-Sepharose瓊脂糖凝膠柱規(guī)格為柱為Φ2Χ16ο ，用含有pH=8.0、0.25 mol/L NaCl的20 mM Tris-HCl溶液進(jìn)行預(yù)平衡，接著以上述主要含G因子的合并組分作為樣品上樣；
第二步:用0.5 mol/L NaCl溶液充分沖洗及0.5 mol/L甲基葡萄糖苷methyl- a -D-glucoside 溶液洗脫，該 0.5 mol/L 甲基葡萄糖苷methyl- a -D-glucoside 溶液用 pH=8.0,20 mM Tris-HCl 溶液配制；
第三步:收集第二步產(chǎn)生的洗脫液，用Amicon PM-1O超濾膜濃縮；
第四步:收集第三步產(chǎn)生的濃縮液，用Sephacryl S-200HR柱進(jìn)一步提純，該Sephacryl S-200HR 柱為 Φ2.7X98cm, M pH8.0、50mM Na3PO4 緩沖液預(yù)平衡；
第五步:收集第四步產(chǎn)生的高純度G因子合并組分，用冷凍干燥機(jī)低溫濃縮。本發(fā)明的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)了對(duì)鱟資源的充分利用，同時(shí)克服了凝固原難以從G因子組分中除去的難題。


圖1為本發(fā)明的ConA-Sepharose瓊脂糖凝膠柱洗脫曲線。圖2為本發(fā)明的S^hacryl S-200HR柱洗脫曲線。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明揭示一種G因子分離純化方法，其包括從鱟全血中分離提取血細(xì)胞步驟及將血細(xì)胞崩解后利用親和層析法對(duì)鱟血細(xì)胞中包括G因子的各種血細(xì)胞成分進(jìn)行初級(jí)分離純化的步驟，還包括對(duì)初級(jí)分離純化所得的主要含G因子的合并組分進(jìn)一步分離純化的步驟，籍以制備去除凝固原的高純度G因子組分。如中國(guó)專利申請(qǐng)CN1632580A中的具體實(shí)施方式
部分披露的，典型的從鱟全血中分離提取血細(xì)胞步驟及將血細(xì)胞崩解后利用親和層析法對(duì)鱟血細(xì)胞中包括G因子的各種血細(xì)胞成分進(jìn)行初級(jí)分離純化的步驟為:
活鱟加抗凝劑采血后，于IOOOrpm下離心，棄上清液，收集細(xì)胞，再加入含NaCl 3 mol/L和Tris-HCl 0.05 mol/L pH 8.0的洗滌液洗滌，棄去上清液；收集的細(xì)胞加入含有NaCl0.1 mol/L和Tris-HCl 0.02 mol/L pH 8.0的崩解液進(jìn)行細(xì)胞崩解，之后進(jìn)行離心，收集提取液；提取液進(jìn)行親和層析，用不同鹽濃度的NaCl和Tris-HCl洗脫液洗柱，收集洗脫液；對(duì)洗脫液進(jìn)行鑒別后，將 相同成分的洗脫液進(jìn)行合并。再如，初級(jí)分離純化的步驟還可以如中國(guó)專利申請(qǐng)CN1621841A中的具體實(shí)施方式
部分披露的:采用親和層析法，利用凝膠Dextran sulfate Sepharose CL-6B制備的無(wú)菌無(wú)熱原親和層析柱以及收集分離成份的設(shè)備，將鱟血細(xì)胞中各因子如C因子、B因子、G因子、抗內(nèi)毒素因子、凝固酶原等成份分別分離出來(lái)。在利用上述技術(shù)方案或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的類似技術(shù)方案獲得主要含G因子的合并組分后，本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化步驟，在本實(shí)施例中采取的具體步驟為:
第一步:制備ConA-Sepharose瓊脂糖凝膠柱,該ConA-Sepharose瓊脂糖凝膠柱規(guī)格為柱為Φ2Χ16ο ，用含有0.25 mol/L NaCl的pH=8.0、20 mM Tris-HCl溶液進(jìn)行預(yù)平衡，接著以上述主要含G因子的合并組分作為樣品上樣；
第二步:用0.5 mol/L NaCl溶液充分沖洗及0.5 mol/L甲基葡萄糖苷methyl- a -D-glucoside 溶液洗脫，該 0.5 mol/L 甲基葡萄糖苷methyl- a -D-glucoside 溶液用ρΗ=8.0、20 mM Tris-HCl溶液配制。參閱圖1所示的ConA-Sepharose瓊脂糖凝膠柱洗脫曲線可知，G因子與凝固原的洗脫峰重疊(圖1中空心圓圈連成的洗脫峰所示)，圖1中的α-MG是甲基葡萄糖苷methyl-a-D-glucoside的簡(jiǎn)寫；
第三步:收集第二步產(chǎn)生的洗脫液，用Amicon PM-1O超濾膜濃縮?！暗诙疆a(chǎn)生的洗脫液”指圖1中0.5 mol/L甲基葡萄糖苷methyl-a -D-glucoside溶液洗脫的洗脫液，不包括0.5 mol/L NaCl溶液充分沖洗產(chǎn)生的溶液；
第四步:收集第三步產(chǎn)生的濃縮液，用Sephacryl S-200HR柱進(jìn)一步提純，該Sephacryl S-200HR柱為 Φ2.7X98cm，用 pH 8.0、50mM Na3PO4 緩沖液預(yù)平衡。參閱圖 2 所示的Sephacryl S-200HR柱洗脫曲線，可見第二步中亦即圖1中所示的洗脫峰重疊的G因子與凝固原兩個(gè)組分明顯分開(圖2中空心圓圈連成的洗脫峰表示G因子組分)；
第五步:收集第四步產(chǎn)生的高純度G因子合并組分，用冷凍干燥機(jī)低溫濃縮。上述步驟中，ConA-Sepharose瓊脂糖凝膠柱填料購(gòu)買自美國(guó)Bio-Rad公司，Amicon PM-10超濾膜購(gòu)買自美國(guó)Millipore公司，Sephacryl S-200HR柱填料購(gòu)買自美國(guó)GE公司，其他試劑及耗材均為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。上述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例，但本發(fā)明的設(shè)計(jì)構(gòu)思并不局限于此，凡利用此構(gòu)思對(duì)本發(fā)明進(jìn)行非實(shí)質(zhì)性的 改動(dòng)，均應(yīng)屬于侵犯本發(fā)明保護(hù)范圍的行為。
權(quán)利要求
1.一種G因子的分離純化方法，其包括從鱟全血中分離提取血細(xì)胞步驟及將血細(xì)胞崩解后利用親和層析法對(duì)鱟血細(xì)胞中包括G因子的各種血細(xì)胞成分進(jìn)行初級(jí)分離純化的步驟，其特征在于:還包括對(duì)初級(jí)分離純化所得的主要含G因子的合并組分進(jìn)一步分離純化的步驟，籍以制備去除凝固原的高純度G因子組分； 該進(jìn)一步分離純化的步驟為: 第一步:制備ConA-Sepharose瓊脂糖凝膠柱,該ConA-Sepharose瓊脂糖凝膠柱規(guī)格為柱為Φ2Χ 16cm，用含有pH=8.0、0.25 mol/L NaCl的20 mM Tris-HCl溶液進(jìn)行預(yù)平衡，接著以上述主要含G因子的合并組分作為樣品上樣； 第二步:用0.5 mol/L NaCl溶液充分沖洗及0.5 mol/L甲基葡萄糖苷methyl- a -D-glucoside 溶液洗脫，該 0.5 mol/L 甲基葡萄糖苷methyl- a -D-glucoside 溶液用 pH=8.0,20 mM Tris-HCl O 溶液配制； 第三步:收集第二步產(chǎn)生的洗脫液，用Amicon PM-1O超濾膜濃縮； 第四步:收集第三步產(chǎn)生的濃縮液，用Sephacryl S-200HR柱進(jìn)一步提純，該Sephacryl S-200HR 柱為 Φ2.7X98cm，用 pH 8.0、50mM Na3PO4 緩沖液預(yù)平衡; 第五步:收集第四 步產(chǎn)生的高純度G因子合并組分，用冷凍干燥機(jī)低溫濃縮。
全文摘要
本發(fā)明公開一種G因子的分離純化方法，其包括從鱟全血中分離提取血細(xì)胞步驟及將血細(xì)胞崩解后利用親和層析法對(duì)鱟血細(xì)胞中包括G因子的各種血細(xì)胞成分進(jìn)行初級(jí)分離純化的步驟，其還包括對(duì)初級(jí)分離純化所得的主要含G因子的合并組分進(jìn)一步分離純化的步驟，籍以制備去除凝固原的高純度G因子組分。本發(fā)明的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)了對(duì)鱟資源的充分利用，同時(shí)克服了凝固原難以從G因子組分中除去的難題。
文檔編號(hào)C07K1/22GK103214566SQ20131010766
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月30日
發(fā)明者丁友玲 申請(qǐng)人:福州新北生化工業(yè)有限公司