專利名稱：一種用于常溫下抗體活性保存的溶液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于常溫下抗體活性保存的溶液及其制備方法，屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
抗體是動物(牛、馬、羊、鼠、兔等)體內(nèi)產(chǎn)生的針對特異性抗原物質(zhì)(如蛋白質(zhì)等)免疫球蛋白。由于抗體能夠特異、穩(wěn)定地結(jié)合特異性抗原，因此廣泛用于臨床診斷、治療與實驗室研究。但由于抗體屬于生物活性物質(zhì)，其活性不可避免地受到溫度、氧化等環(huán)境變化的影響，和抗原的結(jié)合能力(效價)逐步降低，影響其使用效果。目前常規(guī)保存抗體效價的方法主要是以較高濃度(>lmg/ml)低溫保存(4度、零下20度與零下80度)，但是效價保存的時間往往小于I年，并且如果在冷凍過程中，如果發(fā)生反復(fù)凍融，則效價往往以I個數(shù)量級的速度下降，凍融一次，效價甚至?xí)陆抵猎r的10%。為解決這一問題，美國Invitrogen公司開發(fā)出一種抗體稀釋液(貨號003218 ),應(yīng)用后抗體效價能夠在4度保持12個月。但是由于運輸、儲存和應(yīng)用環(huán)節(jié)都要保持4度，因此在具體使用過程中仍有各種不便。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的:本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于常溫下抗體活性保存的溶液，能夠使抗體效價在常溫(小于等于25度)環(huán)境下，長期(大于6個月)保持不變。本發(fā)明的另一目的在于提供這種溶液的制備方法。技術(shù)方案:本發(fā)明所述的用于常溫下抗體活性保存的溶液，以0.0lM磷酸鹽緩沖液為溶劑，溶質(zhì)包括0.75 1.5%牛血清白蛋白，0.75 1.5%冷水魚皮膚膠原，0.02 0.05%疊氮鈉，0.001 0.0015%的多肽，所述多肽的氨基酸序列為:Trp-Lys-Val-(D-Met)-NH2 ;以占溶液總質(zhì)量的百分比計，溶液的pH值為 .2。優(yōu)選地，所述牛血清白蛋白為1%，所述冷水魚皮膚膠原為1%，所述疊氮鈉為
0.05%,所述多肽為0.001%。本發(fā)明所述的溶液的制備方法，取0.0lM磷酸鹽緩沖液，加入溶液總質(zhì)量的
0.75 1.5%冷水魚皮膚膠原，攪拌溶解后，在1.1 1.2個大氣壓下加熱沸騰20 30分鐘，冷卻至室溫，再加入溶液總質(zhì)量的0.75 1.5%牛血清白蛋白、0.02 0.05%疊氮鈉和0.001 0.0015%的多肽，溶解后過濾，分裝保存，所述多肽的氨基酸序列為:Trp-Lys-Val-(D-Met)-NH2。本發(fā)明與現(xiàn)有 技術(shù)相比，其有益效果是:本發(fā)明產(chǎn)品用于常溫下保存抗體，保存時間長，抗體效價高。與現(xiàn)有產(chǎn)品(美國Invitrogen抗體稀釋液,貨號003218)相比,抗體經(jīng)本發(fā)明產(chǎn)品稀釋后，常溫下保存超過6個月，抗體效價相當(dāng)或高于003218保存或與負(fù)20度保存的抗體。


圖1為本發(fā)明產(chǎn)品與其他方式對抗體保存后，抗體效價測定結(jié)果 圖2為本發(fā)明產(chǎn)品與其他方式對抗體保存后，膽堿酯酶抗體的免疫印跡實驗結(jié)果圖； 圖3為本發(fā)明產(chǎn)品與其他方式對抗體保存后，膽堿酯酶抗體的免疫共沉淀實驗結(jié)果圖。
具體實施例方式下面對本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于所述實施例。實施例1:用于常溫下抗體活性保存的溶液，以0.0lM磷酸鹽緩沖液為溶劑，溶質(zhì)包括1%牛血清白蛋白，1%冷水魚皮膚膠原，0.05%疊氮鈉，0.001%的多肽，所述多肽的氨基酸序列為=Trp-Lys-Val-(D-Met)-NH2 ;以占溶液總質(zhì)量的百分比計，溶液的pH值為7.2。制備方法，取0.0lM磷酸鹽緩沖液，加入溶液總質(zhì)量的1%冷水魚皮膚膠原，攪拌溶解后，在1.2個大氣壓下加熱沸騰20分鐘，冷卻至室溫，再加入溶液總質(zhì)量的I牛血清白蛋白、0.05%疊氮鈉和0.001%的多肽，溶解后過濾，分裝保存。實施例2:用實施例1制得的本發(fā)明產(chǎn)品常溫保存6個月的小鼠抗AChE單克隆抗體(購自美國Abgent公司，貨號AM2184a),與美國Invitrogen抗體稀釋液(貨號003218,以下簡稱003218)保存6個月的抗體、負(fù)20°C條件下保存6個月的抗體和1%牛血清白蛋白(溶于磷酸鹽緩沖液)常溫保存6個月的抗體，進(jìn)行抗體效價比較。對抗體效價用直接ELISA法測定，操作步驟如下:
(I)包被:用包被緩沖液(0.05mol/L,pH9.6)稀釋包被抗原(人重組AChE，購自Sigma公司，貨號:C-1682)至I μ g/ml濃度，加入酶標(biāo)板，每孔100 μ 1，37°C溫箱中孵育2h。(2)洗板:倒去殘液，在洗板機(jī)上用洗滌液PBST洗滌5次，吸水紙拍干。(3)封閉:每孔加入1%脫脂奶粉200μ 1，37°C溫箱中孵育1.5h。(4)洗板:倒去殘液，在洗板機(jī)上用洗滌液PBST洗滌5次，吸水紙拍干。(5)加入一抗:不同保存方法的小鼠抗AChE單克隆抗體(購自美國Abgent公司，貨號AM2184a)以不同濃度加入酶標(biāo)板，每孔100 μ 1，37°C溫箱中孵育lh。(6)洗板:倒去殘液，在洗板機(jī)上用洗滌液PBST洗滌5次，吸水紙拍干。(7)加酶標(biāo)抗體:加入用PBST溶液稀釋10000倍的辣根過氧化物酶-羊抗小鼠IgG，每孔100μ 1，37°C溫箱中孵育I h。(8)洗板:倒去殘液，在洗板機(jī)上用洗滌液PBST洗滌5次，吸水紙拍干。(9)顯色:每孔加入新鮮配制的顯色液100 μ 1，避光置37°C溫箱10 15min。(10)終止:每孔加50 μ I 2mol/L的H2S04終止反應(yīng)。(11)吸光度測定:酶標(biāo)儀上測定450nm波長處的各孔吸光值。圖中橫坐標(biāo)為抗體稀釋度，I表示1:1000 ；2表示1:2000 ；3表示1:4000 ；4表示1:8000 ;5 表示 1:16000 ;6 表示 1:32000 ;7 表示 1:64000。測定結(jié)果如圖1所示，圖中:
系列1:本發(fā)明產(chǎn)品常溫保存6個 月的抗體；系列2:負(fù)20度保存6個月的抗體；
系列3 =003218在4度保存6個月的抗體；
系列4:1%牛血清白蛋白(溶于磷酸鹽緩沖液)常溫保存6個月的抗體；
系列5:陰性對照。由圖1可知，本發(fā)明產(chǎn)品用于保存抗體，在同等條件下，抗體的效價高于其他保存方法保存的抗體的效價。實施例3:用實施例1制得的本發(fā)明產(chǎn)品保存的膽堿酯酶抗體的免疫印跡(Western)實驗。實驗步驟如下:
1、取成年SD大鼠腦組織，置于冰上的組織勻漿液中，勻漿。2、4度，12000轉(zhuǎn)離心15分鐘，取上清，測定蛋白濃度。3、取相同質(zhì)量的組織勻漿，進(jìn)行常規(guī)SDS-PAGE電泳。4、常規(guī)轉(zhuǎn)膜，孵育鼠抗ACHE抗體(購自美國Abcam公司，產(chǎn)品貨號:ab78228) 4度過夜。5、磷酸鹽緩沖液清洗，孵育辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體(購自美國Santacruz公司，產(chǎn)品貨號:sc-20 05)室溫1.5小時。6、磷酸鹽緩沖液清洗，ECL化學(xué)發(fā)光液室溫下孵育I分鐘后，X光片曝光。結(jié)果如圖2所示。圖中:
4:蛋白 Marker ；
40:003218在4度保存6個月的抗體；
41:負(fù)20度保存6個月的抗體；
42:本發(fā)明產(chǎn)品常溫保存6個月的抗體；
43:1%牛血清白蛋白(溶于磷酸鹽緩沖液)常溫保存6個月的抗體。實驗結(jié)果表明:
本發(fā)明產(chǎn)品用于保存抗體，在同等條件下的免疫印跡反應(yīng)中，抗體的效價高于其他保存方法保存的抗體的效價。實施例4:用實施例1制得的本發(fā)明產(chǎn)品保存膽堿酯酶抗體的免疫共沉淀(IP)實驗。實驗步驟如下:
1、取SD大鼠腦組織勻漿，方法及步驟同實施例3。2、取相同質(zhì)量的腦組織勻漿，加入20微升蛋白A包被的免疫磁珠(購自國內(nèi)碧云天公司，產(chǎn)品貨號:P2C12)和5微升自制的膽堿酯酶抗體4度孵育過夜。3、4度12000轉(zhuǎn)離心15分鐘，棄上清，磷酸鹽緩沖液清洗。4、沉淀物加上樣緩沖液，煮沸5分鐘，常規(guī)進(jìn)行常規(guī)SDS-PAGE電泳。5、常規(guī)轉(zhuǎn)膜，孵育鼠抗ACHE抗體(購自美國Abcam公司，產(chǎn)品貨號:ab78228) 4度過夜。6、磷酸鹽緩沖液清洗，孵育辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體(購自美國Santacruz公司，產(chǎn)品貨號:sc-2005)室溫1.5小時。7、磷酸鹽緩沖液清洗，ECL化學(xué)發(fā)光液室溫下孵育I分鐘后，X光片曝光。
結(jié)果如圖3所示。圖中:
13:蛋白 Marker ；
14: 0032184度保存6個月的抗體；
15:負(fù)20度保存6個月的抗體；
16:本產(chǎn)品常溫保存6個月的抗體；
17:1%牛血清白蛋白(溶于磷酸鹽緩沖液)常溫保存6個月的抗體；
18:陰性對照。實驗結(jié)果表明:
本發(fā)明產(chǎn)品用于保存抗體，在同等條件下的免疫共沉淀反應(yīng)中，抗體的結(jié)合能力高于其他保存方法保存的抗體的效價。如上所述，盡管參照特定的優(yōu)選實施例已經(jīng)表示和表述了本發(fā)明，但其不得解釋為對本發(fā)明自身的限制。在不脫離所附權(quán)利要求定義 的本發(fā)明的精神和范圍前提下，可對其在形式上和細(xì)節(jié)上作出各種變化。
權(quán)利要求
1.一種用于常溫下抗體活性保存的溶液，其特征在于:以0.0lM磷酸鹽緩沖液為溶劑，溶質(zhì)包括0.75 1.5%牛血清白蛋白，0.75 1.5%冷水魚皮膚膠原，0.02 0.05%疊氮鈉，0.001 0.0015%的多肽，所述多肽的氨基酸序列為:Trp-Lys-Val-(D-Met)-NH2 ;以占溶液總質(zhì)量的百分比計，溶液的PH值為7.2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的溶液，其特征在于:所述牛血清白蛋白為1%，所述冷水魚皮膚膠原為1%，所述疊氮鈉為0.05%,所述多肽為0.001%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的溶液的制備方法，其特征在于:取0.0lM磷酸鹽緩沖液，加入溶液總質(zhì)量的0.75 1.5%冷水魚皮膚膠原，攪拌溶解后，在1.1 1.2個大氣壓下加熱沸騰20 30分鐘，冷卻至室溫，再加入溶液總質(zhì)量的0.75 1.5%牛血清白蛋白、0.02 0.05%疊氮鈉和0.001 0.0015%的多肽，溶解后過濾，分裝保存，所述多肽的氨基酸序列為:Trp-Lys-Val-(D-Met)-NH2。
全文摘要
本發(fā)明公開一種用于常溫下抗體活性保存的溶液，其特征在于以0.01M磷酸鹽緩沖液為溶劑，溶質(zhì)包括0.75～1.5%牛血清白蛋白，0.75～1.5%冷水魚皮膚膠原，0.02～0.05%疊氮鈉，0.001～0.0015%的多肽，所述多肽的氨基酸序列為Trp-Lys-Val-(D-Met)-NH2；以占溶液總質(zhì)量的百分比計，溶液的pH值為7.2。本發(fā)明還公開這種溶液的制備方法。本發(fā)明產(chǎn)品用于常溫下保存抗體，保存時間長，抗體效價高。
文檔編號C07K1/00GK103224542SQ20131013334
公開日2013年7月31日 申請日期2013年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月17日
發(fā)明者戈應(yīng)濱, 滕文臣, 曹曉健, 董虎 申請人:江蘇澳格姆生物科技有限公司