国产精品1024永久观看,大尺度欧美暖暖视频在线观看,亚洲宅男精品一区在线观看,欧美日韩一区二区三区视频,2021中文字幕在线观看

  • <option id="fbvk0"></option>
    1. <rt id="fbvk0"><tr id="fbvk0"></tr></rt>
      <center id="fbvk0"><optgroup id="fbvk0"></optgroup></center>
      <center id="fbvk0"></center>

      <li id="fbvk0"><abbr id="fbvk0"><dl id="fbvk0"></dl></abbr></li>

      一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法

      文檔序號:3482534閱讀:341來源:國知局
      一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法
      【專利摘要】本發(fā)明涉及一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法,包括:對rhG-CSF基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),然后將培養(yǎng)菌體混懸于裂解液中,制得包涵體;將包涵體進(jìn)行變性處理,然后用柱層析進(jìn)行復(fù)性,得rhG-CSF復(fù)性液;最后進(jìn)行陽離子層析和凝膠過濾層析,收集得到重組人粒細(xì)胞集落刺激因子。采用柱層析復(fù)性的方法,簡化了操作方式,使重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的復(fù)性收率高于70%;復(fù)性液經(jīng)過陽離子交換和分子篩層析后制備成rhG-CSF的原液。原液電泳純度達(dá)到99%以上,RP-HPLC的純度達(dá)到98%以上,比活性6.6×107IU/mg。
      【專利說明】一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法

      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001] 本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域【技術(shù)領(lǐng)域】,特別涉及一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子 (recombinant human granulocyte colony stimulating factor, rhG-CSF)的制備方法。

      【背景技術(shù)】
      [0002] 人粒細(xì)胞集落刺激因子(human granulocyte colony stimulating factor, hG-CSF)屬于造血生長因子家族。內(nèi)毒素、TNF-a和IFN-γ可活化單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn) 生G-CSF。此外,成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、星狀細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞等在LPS、IL-1或TNF- α 刺激活化后也可分泌G-CSF。某些白血病細(xì)胞以及CHu-2人口腔癌細(xì)胞、5637人膀胱癌細(xì) 胞、MIAPa Ca-2胰腺癌細(xì)胞可組成性地表達(dá)G-CSF。
      [0003] 1986年G-CSF cDNA克隆成功,C-CSF基因全長2. 5kb,包括5個外顯子和4個內(nèi)含 子。人類有兩種不同的G-CSF cDNA,分別編碼含207和204氨基酸的前體蛋白,均有30個 氨基酸的先導(dǎo)序列,成熟蛋白分子分別為177和174個氨基酸,前者除了在成熟分子N端35 位處插入了 3個氨基酸外,其余的序列與174氨基酸分子相同,人G-CSF分子量為19. 6kDa, PI6. 1,0-糖基化,對酸堿(pH2?10)、熱以及變性劑等相對較穩(wěn)定。G-CSF有5個半胱氨 酸,Cys36與Cys42, Cys74與Cys64之間形成兩對二硫健,Cysl7為不配對半胱氨酸,二硫 鍵對于維持G-CSF生物學(xué)功能是必須的因素。
      [0004] 人粒細(xì)胞集落刺激因子(hG-CSF)是一種在哺乳動物中調(diào)節(jié)粒細(xì)胞(尤其是中性粒 細(xì)胞)成熟與生長的造血生長因子。它通過刺激粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落形成單位(CFU-GM)向 粒細(xì)胞集落形成單位(CFU-G)的分化和成熟,動員成熟中性粒細(xì)胞向外周血的釋放,從而促 進(jìn)中性粒細(xì)胞的生長。在臨床上用來治療各種原因引起的中性粒細(xì)胞減少癥,有很大的經(jīng) 濟意義和社會意義。
      [0005] hG-CSF的天然來源有限,產(chǎn)量甚微,還不能滿足臨床應(yīng)用的需要。利用基因工程技 術(shù)生產(chǎn)是獲取大量hG-CSF的一條途徑。天然hG-CSF雖是一種糖蛋白,但文獻(xiàn)報導(dǎo),未經(jīng)糖 基化和利用大腸桿菌表達(dá)的重組hG-CSF具有與天然hG-CSF同樣的生物活性。
      [0006] 利用基因工程手段構(gòu)建的表達(dá)外源目的基因的菌株常采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng),目 的蛋白多以包涵體形式表達(dá)于菌體內(nèi)。在某些生長條件下,大腸桿菌能積累某種特殊的生 物大分子,它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi),或被膜包裹或形成無膜裸露結(jié)構(gòu),這種水不溶性的結(jié) 構(gòu)稱為包涵體。包涵體一般含有50%以上的重組蛋白,其余為核糖體元件、RNA聚合酶、夕卜 膜蛋白、環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒DNA,以及脂體、脂多糖等,大小為0. 5-lum,難溶于水,只溶于變 性劑如尿素、鹽酸胍等。包涵體的形成主要因為在重組蛋白的表達(dá)過程中缺乏某些蛋白質(zhì) 折疊的輔助因子或環(huán)境不適,無法形成正確的次級鍵等原因形成的。
      [0007] 包涵體是以表達(dá)產(chǎn)物為主,聚集形成的蛋白性質(zhì)顆粒,目的蛋白具有正確的一級 結(jié)構(gòu)順序,但缺乏正確的構(gòu)象,因而不具備其生物活性。表達(dá)蛋白必須經(jīng)過變性和復(fù)性的過 程,使包涵體折疊成為正確的高級結(jié)構(gòu),才能具有生物活性。包涵體在蛋白變性劑的作用 下,成為可溶性的伸展?fàn)顟B(tài),通過緩慢去除變性劑使目標(biāo)蛋白從變性的完全伸展?fàn)顟B(tài)恢復(fù) 到正常的折疊結(jié)構(gòu),形成具有天然生物活性的天然結(jié)構(gòu)。在去除變性劑的同時,分子內(nèi)部的 二硫鍵、疏水鍵等往往來不及形成,從而導(dǎo)致分子間存在大量錯誤的折疊和聚合,以至蛋白 沉淀。復(fù)性是一個非常復(fù)雜的過程,除與蛋白質(zhì)復(fù)性的過程控制相關(guān)外,很大程度上與蛋白 質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)。一般說來,蛋白質(zhì)的復(fù)性效率在20%左右。影響復(fù)性效率的因素有蛋 白質(zhì)的復(fù)性濃度,變性劑的起始濃度和去除速度、溫度、pH、氧化還原電勢、離子強度、共溶 劑和其他添加劑的存在與否等。
      [0008] 目前,蛋白質(zhì)的復(fù)性方法主要有稀釋復(fù)性、透析復(fù)性、超濾復(fù)性等方法。但這些方 法存在設(shè)備要求高、收率低、操作繁瑣、易產(chǎn)生蛋白沉淀等諸多問題。因此,把rhG-CSF包涵 體復(fù)性為有生物活性的蛋白質(zhì),并盡可能提高復(fù)性收率,是一個很大的挑戰(zhàn)。


      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0009] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法, 采用柱層析復(fù)性的方法,簡化了操作方式,使重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的復(fù)性收率高于 70% ;復(fù)性液經(jīng)過陽離子交換和分子篩層析后制備成rhG-CSF的原液。原液電泳純度達(dá)到 99%以上,RP-HPLC的純度達(dá)到98%以上,比活性6. 6X 107IU/mg。
      [0010] 本發(fā)明的一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法,包括:
      [0011] (1)對rhG-CSF基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),然后將培養(yǎng)菌體混懸于裂解液中,經(jīng)超 聲破碎和離心處理,制得包涵體;
      [0012] (2)將上述包涵體經(jīng)洗滌和溶解后,進(jìn)行變性處理,得到變性蛋白溶液;
      [0013] (3)將所得變性蛋白溶液進(jìn)行稀釋,然后用柱層析進(jìn)行復(fù)性處理,得rhG-CSF復(fù)性 液;
      [0014] (4)將復(fù)性液直接進(jìn)行陽離子層析和凝膠過濾層析,收集得到重組人粒細(xì)胞集落 刺激因子。
      [0015] 所述步驟(1)中的裂解液為 20mMTris-HCl,EDTAlmM,DTT1. 5g/L,ρΗ8· 0 ;
      [0016] 所述步驟(2)中用溶液6Μ鹽酸胍,20mM醋酸-醋酸鈉,ρΗ5. 4對包涵體進(jìn)行變性 處理;
      [0017] 所述步驟(3)中用稀釋液6Μ鹽酸胍,20mM醋酸-醋酸鈉,ρΗ5. 4將變性蛋白溶稀 釋到1?2mg/ml ;
      [0018] 所述步驟(3)中的柱層析,所用層析介質(zhì)為Sephadex G_25coarse、Sephadex G_25media、Sephadex G_25fine 或 Sephadex superfine ;
      [0019] 所述步驟(3)中的柱層析,層析柱直接在5_20cm,柱床高度60-100cm ;
      [0020] 所述步驟(3)中的柱層析,層析上樣蛋白濃度1. 0?2. Omg/ml,上樣體積小于柱床 體積的20%,上樣和洗脫流速為5-lOcm/h ;
      [0021] 所述步驟(3)中的柱層析,所用洗脫液為pH5. 4, 20mM醋酸-醋酸鈉緩沖液。
      [0022] 本發(fā)明的柱層析復(fù)性主要是使用脫鹽的原理,變性劑是高濃度的鹽,在層析過 程中,被緩慢的脫去,rhG-CSF隨著變性劑濃度逐漸降低,而重新折疊變成具有活性的 rhG-CSF 分子。
      [0023] 有益效果
      [0024] 本發(fā)明采用柱層析復(fù)性的方法,簡化了操作方式,使重組人粒細(xì)胞集落刺激因子 的復(fù)性收率高于70%。柱層析所收獲的復(fù)性液無沉淀,溶液澄清透明,可以直接進(jìn)行下一步 的純化分離。復(fù)性液經(jīng)過陽離子交換和分子篩層析后制備成rhG-CSF的原液。原液電泳純 度達(dá)到99%以上,RP-HPLC的純度達(dá)到98%以上,比活性6. 6X 107IU/mg。

      【專利附圖】

      【附圖說明】
      [0025] 圖1為RP-HPLC空白對照圖譜;
      [0026] 圖2為柱層析復(fù)性后收集的洗脫峰RP-HPLC純度檢測圖譜;
      [0027] 圖3為rhG-CSF原液RP-HPLC純度檢測圖譜;
      [0028] 圖4為rhG-CSF原液的純度非還原性SDS-PAGE圖譜;
      [0029] 圖5為rhG-CSF原液的還原性SDS-PAGE圖譜。

      【具體實施方式】
      [0030] 下面結(jié)合具體實施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解,在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后,本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對本發(fā)明作各種改動或修改,這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
      [0031] 實施例
      [0032] rhG-CSF包涵體的獲取
      [0033] rhG-CSF基因工程菌(工程菌株pBVQG8/MM294,由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供)按常 規(guī)的高密度發(fā)酵(采用分批補料培養(yǎng)方式進(jìn)行工程菌發(fā)酵,當(dāng)菌體密度達(dá)0D值到達(dá)30時, 對工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵,表達(dá)外源蛋白;其中,補料培養(yǎng)基配方為:酵母浸出粉450g/L、葡 萄糖500g/L ;發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:蛋白胨12g/L、酵母膏24g/L、甘油4ml/L、葡萄糖20g/L、 磷酸二氫鉀2. 31g/L、磷酸氫二鉀12. 54g/L、硫酸鎂0. 75g/L)后,采用8000g離心力收集菌 體。
      [0034] 收集后的濕菌體,放置于_20°C,凍融一次。取400克凍融后的菌體,按固液比1:10 (g/ml)比例混懸于裂解液中(20mMTris-HCl,EDTAlmM,DTTl. 5g/L,pH8. 0),混合成均一的懸 液后,使用大功率超聲波細(xì)胞破碎儀對混懸液進(jìn)行破菌及勻漿處理,l〇〇〇〇g離心力離心收 集包涵體60克。離心機為Avanti J-25, Beckman公司。
      [0035] rhG-CSF包涵體的洗滌和溶解
      [0036] 收集的包涵體60g依次用注射用水、A液(ImM EDTA,0. 1M NaCl)、B液 (50mMTris-HCl,5mM DTT,5mM EDTA,1% 脫氧膽酸鈉,ρΗ9·0)進(jìn)行洗滌,采用 10000g 離心力 離心收集包涵體70g ;然后將收集的包涵體70g用C液(50mMTris-HCl,2%十二烷基肌氨酸 鈉,PH8. 0)溶解,室溫攪拌過夜,用丙酮沉淀蛋白,獲得高純度的包涵體50g。
      [0037] rhG-CSF包涵體的變性處理
      [0038] 取上述包涵體,用D液(6M鹽酸胍,20mM醋酸-醋酸鈉,pH5. 4)溶液進(jìn)行變性,室溫 溫和攪拌2-3小時,采用33000g離心力離心收集上清液,即為rhG-CSF蛋白變性溶液。采 用考馬斯亮藍(lán)法檢測蛋白濃度,用D溶液(6M鹽酸胍,20mM醋酸-醋酸鈉,pH5. 4)將其蛋白 濃度稀釋至1. 5mg/ml,準(zhǔn)備進(jìn)行柱上復(fù)性。
      [0039] rhG-CSF包涵體的柱層析復(fù)性
      [0040] 使用XK50/100柱子,柱床高度80cm,層析介質(zhì)為Sephadex G_25media。先用 0. 2MNa0H清洗1個柱體積,注射用水沖洗3個柱體積,用pH5. 4, 20mM醋酸-醋酸鈉緩沖液 平衡柱子至少3個柱體積,待電導(dǎo)和pH值穩(wěn)定后上樣。
      [0041] 上樣體積200ml,流速5cm/h,上樣完畢后,用pH5. 420mM醋酸-醋酸鈉緩沖液進(jìn)行 洗脫,洗脫流速5cm/h,收集洗脫峰,洗脫峰即為rhG-CSF復(fù)性液。洗脫峰進(jìn)行RP-HPLC檢測 (圖2),如圖所示,正確構(gòu)象的rhG-CSF的含量高達(dá)95. 4%,異構(gòu)體雜質(zhì)含量為4. 6%。
      [0042] rhG-CSF 的精純
      [0043] 將復(fù)性后的rhG-CSF溶液,上樣于CM-Sepharose Fast Flow陽離子交換層析介 質(zhì),用pH5. 4, 20mM醋酸-醋酸鈉緩沖液平衡2個柱體積,用0. 3M NaCl溶液進(jìn)行洗脫,收集 洗脫峰。上樣、平衡和洗脫流速均為lOcm/h。
      [0044] 離子交換洗脫峰進(jìn)行進(jìn)一步的分子篩凝膠過濾層析。層析介質(zhì)選用Sephacryl S200層析介質(zhì),用pH4. OlOmM醋酸-醋酸鈉緩沖進(jìn)行洗脫,收集洗脫峰。洗脫峰合并即為 rhG-CSF原液。原液進(jìn)行非還原性SDS-PAGE電泳(圖4)和還原性SDS-PAGE電泳(圖5)電 泳純度均為100%。RP-HPLC檢測(圖3),其純度為100%。
      [0045] 按照中國藥典進(jìn)行活性檢測,其活性高達(dá)7. 6X 107IU/mg。
      [0046] 雖然本發(fā)明已將較佳實施例揭示如上,然其并非用以限定本發(fā)明的內(nèi)容,任何熟 悉此技藝者,在不脫離本發(fā)明的主要精神和內(nèi)容范圍內(nèi),當(dāng)可作各種更動與潤飾,因此發(fā)明 的保護范圍應(yīng)以申請專利的實際權(quán)利要求范圍為準(zhǔn)。
      【權(quán)利要求】
      1. 一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法,包括: (1) 對rhG-CSF基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),然后將培養(yǎng)菌體混懸于裂解液中,經(jīng)超聲破 碎和離心處理,制得包涵體; (2) 將上述包涵體經(jīng)洗滌和溶解后,進(jìn)行變性處理,得到變性蛋白溶液; (3) 將所得變性蛋白溶液進(jìn)行稀釋,然后用柱層析進(jìn)行復(fù)性處理,得rhG-CSF復(fù)性液; (4) 將復(fù)性液進(jìn)行陽離子層析和凝膠過濾層析,收集得到重組人粒細(xì)胞集落刺激因子。
      2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法,其特征在于: 所述步驟(1)中的裂解液為 20mMTris-HCl,EDTAlmM,DTT1. 5g/L,ρΗ8· 0。
      3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法,其特征在于: 所述步驟(2)中用溶液6Μ鹽酸胍,20mM醋酸-醋酸鈉,ρΗ5. 4對包涵體進(jìn)行變性處理。
      4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法,其特征在于: 所述步驟(3)中用稀釋液6Μ鹽酸胍,20mM醋酸-醋酸鈉,ρΗ5. 4將變性蛋白溶稀釋到1? 2mg/ml〇
      5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法,其特征在于: 所述步驟(3)中的柱層析,所用層析介質(zhì)為Sephadex G_25coarse、Sephadex G_25media、 Sephadex G_25fine 或 Sephadex superfine。
      6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法,其特征在于: 所述步驟(3)中的柱層析,層析柱直接在5-20cm,柱床高度60-100cm。
      7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法,其特征在于: 所述步驟(3)中的柱層析,層析上樣蛋白濃度1. 0?2. Omg/ml,上樣體積小于柱床體積的 20%,上樣和洗脫流速為5-10cm/h。
      8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法,其特征在于: 所述步驟(3)中的柱層析,所用洗脫液為pH5. 4, 20mM醋酸-醋酸鈉緩沖液。
      【文檔編號】C07K14/53GK104120159SQ201310150982
      【公開日】2014年10月29日 申請日期:2013年4月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月26日
      【發(fā)明者】岑仡, 宋宏 申請人:上海三維生物技術(shù)有限公司
      網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
      • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
      1