一種簡便、工業(yè)化純化豬纖維蛋白原的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種簡便、工業(yè)化純化豬纖維蛋白原的方法，包括以下步驟：a、用檸檬酸三鈉作為抗凝劑獲得豬全血，用管式離心機(jī)離心獲得血漿；b、用去離子水稀釋血漿9-11倍，4℃攪拌條件用2％乙酸調(diào)pH5.4-5.6過夜沉淀，傾去上清液，沉淀用SZLDH5型蝶式分離機(jī)獲得纖維蛋白原沉淀粗品；c、用NaAc-HAc緩沖液(0.05mol/L，pH5.4-5.6)洗滌纖維蛋白原3次；d、用生理鹽水溶解纖維蛋白原獲得纖維蛋白原溶液，調(diào)至pH5.5沉淀纖維蛋白原，離心獲得漿狀纖維蛋白原純品；e、用1M?Tris-HCl緩沖液調(diào)節(jié)纖維蛋白原至pH6.8，然后分別用10％、30％、60％、90％和無水乙醇逐步脫鹽、脫水，冷凍干燥獲得纖維蛋白原。本發(fā)明方法簡單、制備成本低、適合規(guī)模生產(chǎn)，企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益顯著。
【專利說明】一種簡便、工業(yè)化純化豬纖維蛋白原的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 一種簡便、工業(yè)化純化豬纖維蛋白原的方法，屬生化【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 纖維蛋白原是重要的凝血因子之一，在血漿中濃度2_3g/L，分子量340KD，等電點(diǎn) 5. 5。纖維蛋白原在血漿中以溶解狀態(tài)存在，經(jīng)凝血酶作用轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗艿睦w維蛋白發(fā)揮止血 的功能。在醫(yī)學(xué)上纖維蛋白原制劑適用于先天性無或低纖維蛋白原血癥，以及纖維蛋白原 含量低下而引起的異常出血和需實(shí)施手術(shù)的病人，外用纖維蛋白原用于生物止血材料（如 止血海綿和止血膠）的主要成分。由于人血漿資源有限，臨床用的纖維蛋白原多來源于牛 血或豬血。我國生豬產(chǎn)量居世界第一，年產(chǎn)豬血約10萬噸，這些豬血除少量以血粉的形式 被利用外，絕大部分以廢物形式排放，造成極大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染，研究出一種簡便、 工業(yè)化純化豬纖維蛋白原的方法十分重要。
[0003] 目前提取纖維蛋白原的方法有離子交換層析法、硫酸銨沉淀法、凍融法、冷乙醇沉 淀法和介體電泳法。
[0004] 離子交換層析法是依據(jù)纖維蛋白原在特定pH條件下帶電荷特性進(jìn)行純化。因?yàn)?血漿中含有多種與纖維蛋白原等電點(diǎn)接近的蛋白質(zhì)，該方法提取纖維蛋白原純度不高；另 一方面，離子交換樹脂昂貴，用這種方法制備纖維蛋白原成本較高。
[0005] 凍融法是利用纖維蛋白原在低溫下形成絮狀沉淀的特性純化纖維蛋白原。工藝大 致如下：新鮮豬血漿置于-20°C下冷凍12h后在4°C下融化，剛好融化后低溫離心收集纖維 蛋白原。這種方法需要在-20冷凍，因此不但成本高，而且限制了規(guī)模生產(chǎn)；另一方面，收集 的沉淀還含有纖維蛋白、白蛋白、清蛋白等雜蛋白，制備的纖維蛋白原純度不高。
[0006] 硫酸銨沉淀法是利用硫酸銨的鹽析作用純化纖維蛋白原。血漿加入等體積的PBS， 加入預(yù)冷的飽和硫酸銨，置于4°C下充分沉淀，低溫離心收集纖維蛋白原。該方法最大的缺 點(diǎn)是大量纖維蛋白原變性失去生物活性；其次，硫酸銨鹽析選擇性較差，制備的纖維蛋白原 純度不高。
[0007] 冷乙醇沉淀法是利用有機(jī)溶劑對(duì)蛋白質(zhì)的沉淀作用純化纖維蛋白原。血漿加入一 定量Tween-80和磷酸三丁酯，置于25°C下孵育6h。冰水浴攪拌下將預(yù)冷的30%乙醇溶液 緩慢加入至乙醇的終濃度為10%，4°C充分沉淀，低溫離心收集纖維蛋白原。冷乙醇沉淀法 最大的缺點(diǎn)是加乙醇速度控制難度大，而且纖維蛋白原變性或者轉(zhuǎn)變成纖維蛋白的較多。
[0008] 介體電泳法是利用纖維蛋白原和雜蛋白分子量以及帶電何不同進(jìn)行純化。在 pH8. 3條件下，纖維蛋白原和雜質(zhì)都帶負(fù)電荷，它們?cè)陔妶?chǎng)作用下向同一方向運(yùn)動(dòng)，但分離 膜只允許分子量較小的雜蛋白通過，分子量較大的纖維蛋白原不能通過，而被擋在分離膜 的一側(cè)。第二步是在PH5. 2的條件下，纖維蛋白原帶正電荷而雜蛋白帶負(fù)電荷，纖維蛋白原 和雜質(zhì)在電場(chǎng)的作用下向兩個(gè)不同的電極方向運(yùn)動(dòng)，結(jié)果纖維蛋白原得以進(jìn)一步純化。該 方法只適合實(shí)驗(yàn)室制備少量的纖維蛋白原，不適合規(guī)模生產(chǎn)；其次，已經(jīng)轉(zhuǎn)變成纖維蛋白的 雜質(zhì)不能被去除。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明旨在利用豬纖維蛋白原在等電點(diǎn)pH5. 5時(shí)沉淀的特性進(jìn)行純化。新鮮血漿 用去離子水稀釋9-11倍后用2%乙酸調(diào)pH至5. 4-5. 6過夜沉淀，傾去上清液后低溫離心獲 得纖維蛋白原粗品；用〇. 〇5mol/L NaAc-HAc緩沖液（pH5. 4-5. 6)洗滌維蛋白原粗品3次徹 底去除纖維蛋白原粗品中溶解性雜蛋白；用生理鹽水溶解纖維蛋白原，離心后棄不溶性沉 淀，將纖維蛋白原溶液再次調(diào)至PH5. 4-5. 6沉淀纖維蛋白原，低溫離心獲得漿狀纖維蛋白 原；調(diào)節(jié)pH至6.8,分別用10-100%乙醇逐步脫鹽、脫水，冷凍干燥獲得纖維蛋白原。本發(fā) 明適合規(guī)模生產(chǎn)，生產(chǎn)成本較低、純度高、生物活完整，其技術(shù)效果體現(xiàn)在幾個(gè)方面：
[0010] 1、與現(xiàn)有的方法相比，本發(fā)明制備纖維蛋白原適合規(guī)模生產(chǎn)
[0011] 離子交換層析法、凍融法、和介體電泳法制備纖維蛋白原都不能規(guī)模生產(chǎn)，只能在 實(shí)驗(yàn)室少量制備使用。
[0012] 2、本發(fā)明制備纖維蛋白原成本較低
[0013] 現(xiàn)有方法中可能進(jìn)行規(guī)模生產(chǎn)纖維蛋白原的方法有硫酸銨沉淀法和冷乙醇沉淀 法，2種方法分別要用大量的硫酸銨和乙醇，本發(fā)明方法制備纖維蛋白原過程中只用少量的 乙酸和乙酸鈉，制備成本大大降低。
[0014] 3、制備的纖維蛋白原不但具有完全的生物活性，而且純度高
[0015] 硫酸銨法和冷乙醇法制備纖維蛋白原時(shí)，硫酸銨和乙醇對(duì)纖維蛋白原有變性作 用，本發(fā)明方法采用溫和的等電點(diǎn)沉淀法，制備的纖維蛋白原具有完全的生物活性。本發(fā)明 采用0. 05mol/L NaAc-HAc緩沖液反復(fù)洗滌纖維蛋白原粗品，生理鹽水溶解纖維蛋白原后再 次進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀，最大程度去除非纖維蛋白原雜質(zhì)，獲得的纖維蛋白原純度很高。
[0016] 4、減少了企業(yè)的治污費(fèi)用，提高了企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益
[0017] 從豬血中提取纖維蛋白原，既可以充分利用豬血資源，提高豬血的附加值，又可以 減少因排放造成的環(huán)境污染，具有很高的環(huán)境效益。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 制備的纖維蛋白原8% SDS-PAGE分析。
[0019] 圖注：1 :實(shí)施例一制備的豬纖維蛋白原；2 :實(shí)施例二制備的豬纖維蛋白原；3 :實(shí) 施例三制備的豬纖維蛋白原。

【具體實(shí)施方式】
[0020] 按照3. 8%檸檬酸三鈉：豬血1 : 9獲得豬全血，用GFX105型管式離心機(jī)（轉(zhuǎn)速 19000r/min)離心分別獲得血漿和血球，血球用于其它生物產(chǎn)品的制備，血漿備用。
[0021] 實(shí)施例一：
[0022] 第一步：獲得纖維蛋白原粗品
[0023] 取100kg血楽，用去離子水稀釋9倍，4°C攪拌條件用2%乙酸調(diào)pH至5. 4過夜沉 淀，傾去上清液，沉淀用SZLDH5型蝶式分離機(jī)（轉(zhuǎn)鼓轉(zhuǎn)速為7500r/min)離心獲得纖維蛋白 原沉淀粗品。
[0024] 第二步：洗滌除去纖維蛋白原粗品中溶解性雜蛋白
[0025] 每次用10kg NaAc-HAc緩沖液（0. 05mol/L，pH5. 4)洗滌纖維蛋白原，SZLDH5型蝶 式分離機(jī)離心，重復(fù)洗滌3次。
[0026] 第三步：第二次純化、脫水、干燥
[0027] 用10L生理鹽水溶解纖維蛋白原，離心獲得纖維蛋白原溶液；再次調(diào)至pH5. 4沉淀 纖維蛋白原，低溫離心獲得漿狀纖維蛋白原；先用約lOOmLIM Tris-HCl(pH6.8)緩沖液調(diào) 節(jié)pH至6. 8,然后分別用5L10%乙醇、5L30%乙醇、5L60%乙乙醇、5L90%乙乙醇、5L無水乙 醇逐步脫鹽、脫水，冷凍干燥獲得189g纖維蛋白原。
[0028] 第四步：純度和生物活性測(cè)定
[0029] 纖維蛋白原純度的測(cè)定采用8% SDS-PAGE。纖維蛋白原生物活性的測(cè)定依據(jù)纖維 蛋白原能被凝血酶轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白凝膠的特性，大致方法為：用生理鹽水溶解制備的纖維 蛋白原，取400 μ L纖維蛋白原溶液，加入100 μ L用生理鹽水溶解的凝血酶溶液（5U/mL)，置 于37°C下約20min，觀察纖維蛋白原溶液是否凝固，如果發(fā)生凝固現(xiàn)象，說明制備的纖維蛋 白原有生物活性。
[0030] 結(jié)果表明，制備的纖維蛋白原純度很高，如圖。通過Biosens sc805全自動(dòng)凝膠成 像系統(tǒng)分析，纖維蛋白原含量在98%以上；制備的纖維蛋白原具有完全的生物活性。
[0031] 實(shí)施例二：
[0032] 按照實(shí)施例一獲得血漿備用。
[0033] 第一步：獲得纖維蛋白原粗品
[0034] 取100kg血楽，用去離子水稀釋10倍，4°C攪拌條件用2%乙酸調(diào)pH至5. 5過夜沉 淀，其他步驟如實(shí)施例一。
[0035] 第二步：洗滌除去纖維蛋白原粗品中溶解性雜蛋白
[0036] 用10kg NaAc-HAc緩沖液（0· 05mol/L，ρΗ5· 5)洗滌纖維蛋白原，其他步驟如實(shí)施 例
[0037] 一。
[0038] 第三步：第二次純化、脫水、干燥
[0039] 用10L生理鹽水溶解纖維蛋白原，離心分離獲得纖維蛋白原溶液，再次調(diào)至ρΗ5. 5 沉淀纖維蛋白原，其他步驟如實(shí)施例一，獲得192g纖維蛋白原。
[0040] 第四步：純度和生物活性測(cè)定
[0041] 純度和生物活性測(cè)定的測(cè)定同實(shí)施例一，純度最高（如圖）。纖維蛋白原含量在 98%以上，具有完全的生物活性。
[0042] 實(shí)施例三：
[0043] 按照實(shí)施例一獲得血漿備用。
[0044] 第一步：獲得纖維蛋白原粗品
[0045] 取100kg血漿，用去離子水稀釋11倍，4°C攪拌條件用2%乙酸調(diào)pH至5. 6過夜沉 淀，其他步驟如實(shí)施例一。
[0046] 第二步：洗滌除去纖維蛋白原粗品中溶解性雜蛋白
[0047] 用10kg NaAc-HAc緩沖液（0. 05mol/L，pH5. 6)洗滌纖維蛋白原，其他步驟如實(shí)施 例一。
[0048] 第三步：第二次純化、脫水、干燥
[0049] 用10L生理鹽水溶解纖維蛋白原，離心分離獲得纖維蛋白原溶液，再次調(diào)至pH5. 6 沉淀纖維蛋白原，其他步驟如實(shí)施例一。獲得190g纖維蛋白原。
[0050] 第四步：純度和生物活性測(cè)定
[0051] 純度和生物活性測(cè)定的測(cè)定同實(shí)施例一，純度很高（如圖）。纖維蛋白原含量在 98%以上，具有完全的生物活性。
【權(quán)利要求】
1. 一種簡便、工業(yè)化純化豬纖維蛋白原的方法，其特征包括以下步驟： a、 去離子水稀釋豬血漿9-11倍，低溫下用2%乙酸調(diào)pH至5. 4-5. 6過夜沉淀，傾去上 清液，蝶式分離機(jī)分離纖維蛋白原粗品； b、 用NaAc-HAc緩沖液（0. 05mol/L，pH5. 4-5. 6)洗滌纖維蛋白原沉淀3次； c、 用生理鹽水溶解纖維蛋白原，離心獲得纖維蛋白原溶液，調(diào)至PH5. 5沉淀纖維蛋白 原； (1、用說1^8-!1(：1緩沖液調(diào)節(jié)？!1至6.8，分別用10%-100%乙醇逐步脫鹽、脫水，冷凍 干燥獲得纖維蛋白原。
【文檔編號(hào)】C07K14/75GK104109203SQ201310160519
【公開日】2014年10月22日 申請(qǐng)日期:2013年4月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月16日
【發(fā)明者】韋傳寶, 何許旺, 馮江華, 汪權(quán) 申請(qǐng)人:宿松縣春潤食品有限公司, 韋傳寶