專利名稱：具有抗耐藥菌活性的抗菌肽及其合成與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物化學技術領域，涉及一類新型結構的具有抗耐藥菌活性的抗菌肽；本發(fā)明同時還涉及該抗菌肽的合成方法及在制備抗菌藥物中的應用。
背景技術：
隨著抗生素在人們生活中的大量使用，耐藥菌株不斷產生，使得許多曾經高度有效的抗生素藥物失效，因此尋求新的抗生素類藥物對人類的發(fā)展越來越重要?？咕?Antimicrobial Peptides AMPs)是指一類常帶正電荷，具有廣譜抗菌性，氨基酸數目在12 50個的小分子多肽。隨著分子生物學的迅速發(fā)展，抗菌肽的研究已經越來越成為生物醫(yī)藥領域中的熱門課題(Hancock RE.Peptide antibiotics[J].Lancet,1997，349(9049):418-422.)。然而天然抗菌肽并非全部都沒有缺點，部分天然抗菌肽存在活性不是很強、抗菌譜相對較窄等。另外，抗菌肽作用機制對于傳統(tǒng)抗生素來說均不一樣，一般不會產生耐藥現象，但是自然界總存在著一定的病原微生物，由于十分穩(wěn)定的細胞膜結構或功能性特點使之具有天生的耐藥性。目前已經證明金黃色葡萄球菌除可分泌蛋白酶降解防御素和一些人源抗菌肽產生耐藥性外(陳福，羅玉萍，龔熹.抗菌肽耐藥性研究進展[J].微生物學通報，2008，35 (11):1786-1790.)，還可以通過調節(jié)vraDE和vraSR改變膜的轉運作用而產生對娃類抗菌肽temporin L和dermaseptin、K4 S4的耐藥性(PietiainenM， Francois P， Hyyrylainen H L， et al.Transcriptome analysis Of the responsesof Staphylococcus aureus to antimicrobial peptides and characterization of theroles of vraDE and vraSR in antimicrobial resistance[J].BMC Genomics，2009，10(1):429-431)0點擊化學主要用于研發(fā)和制造可用于醫(yī)學診斷和新藥開發(fā)的新型生化標記物。目前，它被認為是一項 非常理想的技術，已經被應用于藥物開發(fā)。特別是端基炔和疊氮化合物的1，3-偶極環(huán)加成反應已被用于一些肽類以及生物有機大分子和糖類化合物的修飾(Vogt A Po Sumerlin B S.Macromolecules, 2006,39:5286_5292)。有報道將抗菌肽以點擊化學的方法進行側鏈連接有助于提高抗菌肽對細胞膜的穿透能力(ChristopherJ.etal, Enhanced Membrane Pore Formation by Multimeric/Oligomeric AntimicrobialP印tides, Biochemistry 2007, 46，13437-13442)。因此利用新的化學修飾的方法，來對天然抗菌肽進行結構修飾從而得到抗菌活性更好，具有抗耐藥菌活性，并且具有一定的細胞內藥物作用靶點載體功能的人工合成抗菌肽有很好的應用前景。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的之一:為增加傳統(tǒng)的天然抗菌肽Anoplin和MPI對細胞膜的穿透能力，提高抗菌活性以及抗耐藥菌活性，提供了一類具有抗耐藥菌活性的抗菌肽；
本發(fā)明的目的之二:提供上述具有抗耐藥菌活性的抗菌肽在在制備抗菌藥物中的應用。
本發(fā)明的目的之三:提供上述具有抗耐藥菌活性的抗菌肽的合成方法。(—)具有抗耐藥菌活性的抗菌肽
本發(fā)明具有新結構的抗耐藥菌活性的抗菌肽，是對天然抗菌肽Anoplin和MPI分別先進行N末端的氨基酸修飾后再進行乙?；?，然后利用點擊化學的1，3-偶極環(huán)加成反應以一個1，4- 二取代-L7-1，2，3-三唑結構分別對上述肽進行分子間的兩兩側鏈連接，得到新型結構的抗菌肽J-AM和J-AA。天然抗菌肽Anoplin、MPI,修飾后的中間肽 AC-pra-Anoplin、AC-Nle (N3) -MPI>AC-Nle (N3) -Anoplin,以及本發(fā)明抗菌肽J_AM、J-AA的結構和序列如下:
權利要求
1.具有抗耐藥菌活性的抗菌肽，其結構特征如下所示
2.如權利要求I所述具有抗耐藥菌活性的抗菌肽在制備抗菌藥物中的應用。
3.如權利要求I所述具有抗耐藥菌活性的抗菌肽的制備方法，包括以下工藝步驟 (1)肽AC-pra-AnopI in的制備采用經典的固相合成方法合成連有MBHA樹脂的天然抗菌肽Anoplin-resin,再在Anoplin-resin的N末端插入Fmoc保護的非天然氨基酸L-炔丙基甘氨酸Fmoc-L-Pra-ΟΗ,脫保護得到連有MBHA樹脂的肽Pra-Anoplin-resin ;然后再對連有MBHA樹脂的肽Pra-Anoplin-resin的N端乙酰化，得到乙?；倪B有MBHA樹脂的肽AC-pra-Anoplin-resin ;切割純化得到妝 AC-pra-Anoplin ； (2)肽AC-Nle(N3)- Anoplin的制備用經典的固相合成方法合成連有MBHA樹脂的天然抗菌肽Anoplin-resin,再在Anoplin-resin的N末端插入Fmoc保護的側鏈MTT保護的賴氨酸 Fmoc-Lys (Mtt)-OH,脫保護得到連有 MBHA 樹脂的肽 Lys (Mtt)- Anoplin-resin ；再對連有MBHA樹脂的肽Lys (Mtt) - Anoplin -resin的N端乙酰化,得到乙?；倪B有MBHA樹脂的肽AC-Lys (Mtt) - Anoplin -resin ;然后進行側鏈疊氮化轉化得到乙?；倪B有MBHA樹脂的肽AC- Nle (N3)- Anoplin -resin，最后進行切割純化得到肽AC- Nle(N3) - Anoplin ； (3)肽AC-Nle (N3)- MPI的制備用經典的固相合成方法合成連有MBHA樹脂的天然抗菌肽MPI-resin,再在ΜΡΙ-resin的N末端插入Fmoc保護的側鏈MTT保護的賴氨酸Fmoc-Lys (Mtt)-0H，脫保護得到連有MBHA樹脂的肽Lys (Mtt) - MPI- resin ;再對連有MBHA樹脂的肽Lys (Mtt) - MPI- resin的N端乙?；?，得到乙酰化的連有MBHA樹脂的肽AC-Lys (Mtt)- MPI -resin ;然后進行側鏈疊氮化轉化得到乙?；倪B有MBHA樹脂的肽AC- Nle (N3) - MPI- resin，最后切割純化得到肽 AC- Nle (N3) - MPI ； (4)目標肽J-AM、J-AA的合成利用點擊化學的I，3-偶極環(huán)加成反應，使肽AC-pra-Anoplin側鏈的端基炔官能團與肽AC-Nle(N3)-MPI側鏈的疊氮官能團或肽AC-Nle(N3) -MPI側鏈的疊氮官能團連接，形成一個1，4- 二取代-L7-1，2，3-三唑結構的橋，得到具有抗耐藥菌活性的抗菌肽J-AA或抗菌肽J-AM。
4.如權利要求3所述具有抗耐藥菌活性的抗菌肽的制備方法，其特征在于步驟(I)所述肽AC-pra-Anoplin的制備方法為 采用經典的固相合成法得到連有MBHA樹脂的N末端Fmoc保護的母肽Fmoc-Anoplin-resin ;加入到六氫吡啶與DMF混合溶液中，攪拌使其充分反應，用DMF洗滌，得到脫保護的連有MBHA樹脂的肽Anoplin- resin ;將Fmoc保護的L-炔丙基甘氨酸Fmoc-L-Pra-OH溶于DMF中，攪拌使其充分溶解，加入HOBT和HBTU，攪拌溶解后再加入DIEA，然后與所述脫保護的連有MBHA樹脂的肽Anoplin- resin混合，氬氣保護、室溫下攪拌反應I 3h，抽干、用DMF洗漆,得到連有MBHA樹脂的肽Fmoc-Pra-Anoplin- resin ;所述Fmoc保護的L-炔丙基甘氨酸 Fmoc-L-Pra-OH 的摩爾量為 Fmoc-Anoplin- resin 的 I 8 倍； 將Fmoc-Pra-Anoplin- resin加入到六氫批唳與DMF混合溶液,攪拌使其充分反應，用DMF洗滌，得到脫保護的連有MBHA樹脂的肽Pra-Anoplin- resin ;將乙酸酐溶于DMF中，攪拌使其充分混勻，再加入DIEA，然后與所述脫保護的連有MBHA樹脂的肽Pra-Anoplin-resin混合，氬氣保護、室溫下攪拌反應O. 5h lh，抽干、用DMF洗滌，得到連有MBHA樹脂的肽AC-Pra-Anoplin- resin,切割純化得到肽AC-Pra-Anoplin ；乙酸酐的摩爾量為Fmoc-Pra-Anoplin- resin 的 4 32 倍； 所述六氫吡啶與DMF混合溶液中，六氫吡啶與DMF的體積比為1:10 1:4 ;所述HOBT的加入量為相應樹脂重量的I 8倍；所述HBTU的加入量為相應樹脂重量的I 8倍；所述DIEA的加入量為相應樹脂重量的I 8倍。
5.如權利要求3所述具有抗耐藥性的抗菌肽類似物的制備方法，其特征在于步驟(2)所述肽AC- Nle (N3) - Anoplin的制備方法如下 Fmoc保護的側鏈MTT保護的賴氨酸的插入采用經典的固相合成法得到連有MBHA樹脂的N末端Fmoc保護的母肽Fmoc-Anoplin- resin,加入到六氫批唳與DMF混合溶液中,攪拌使其充分反應；用DMF洗滌，得到脫保護的連有MBHA樹脂的肽Anoplin- resin ;將Fmoc保護的側鏈MTT保護的賴氨酸Fmoc-Lys (Mtt) -OH溶于DMF中，攪拌使其充分溶解，加入HOBT和HBTU，攪拌溶解后再加入DIEA，然后與上述脫保護的連有MBHA樹脂的肽Anoplin-resin混合，氬氣保護、室溫下攪拌反應I 2h，抽干、用DMF洗滌，得到連有MBHA樹脂的肽Fmoc-Lys (Mtt) - Anoplin - resin ； 所述 Fmoc-Lys (Mtt) -OH 的摩爾量為 Fmoc-Anoplin- resin 的 I 8 倍； 所述六氫吡啶與DMF混合溶液中，六氫吡啶與DMF的體積比為1:10 1:4 ;所述HOBT的加用量為Fmoc-Lys (Mtt)-OH重量的I 8倍；所述HBTU的用量為Fmoc-Lys (Mtt)-OH重量的I 8倍；所述DIEA的用量為Fmoc-Lys (Mtt) -OH重量的I 8倍； N端乙?；瘜moc-Lys (Mtt)- Anoplin - resin加入到六氫批唳與DMF混合溶液，攪拌使其充分反應；用DMF洗滌，得到脫保護的連有MBHA樹脂的肽Lys (Mtt)- Anoplin -resin ;將乙酸酐溶于DMF中，攪拌使其充分混勻，后再加入DIEA，然后與所述脫保護的連有MBHA樹脂的肽Lys (Mtt)- Anoplin - resin混合,IS氣保護、室溫下攪拌反應O. 5h Ih,抽干、用DMF洗漆,得到連有MBHA樹脂的肽AC-Lys (Mtt) - Anoplin - resin ；乙酸酐的摩爾量為Fmoc-Lys (Mtt)- Anoplin -resin的4 32倍；所述六氫卩比唳與DMF混合溶液中，六氫吡啶與DMF的體積比為1:10 1:4 ;所述DIEA的加入量為Fmoc-Lys(Mtt) - Anoplin -resin 重量的 I 8 倍； 側鏈疊氮化轉化用含TFA的DCM溶液洗滌所述連有MBHA樹脂的肽AC-Lys (Mtt)-Anoplin - resin,再依次用甲醇和DCM洗漆,抽干，即脫Mtt側鏈保護；將疊氮化鈉NaN3溶于水與DCM的混合溶液中，-10°C O°C下加入三氟甲磺酸酐Tf2O反應I 3h，用DCM萃取得三氟疊氮TfN3的DCM溶液；在所述連有MBHA樹脂的肽AC-Lys(Mtt)- Anoplin - resin中加入溶有硫酸銅和碳酸鉀的DCM與甲醇的混合溶液，再滴加三氟疊氮TfN3的DCM溶液，反應24 48h，然后用DCM、甲醇依次洗滌后抽干，得到乙?；倪B有MBHA樹脂的肽AC- Nle(N3) - Anoplin - resin,最后切割純化得到肽 AC- Nle (N3) - Anoplin ； 所述含TFA的DCM溶液中，TFA的質量百分數為f 10% ； 所述疊氮化鈉的用量為AC-Lys (Mtt)- Anoplin - resin重量的I 5倍；所述三氟甲磺酸酐的加入量為AC-Lys (Mtt) - Anoplin - resin重量的5 10倍；所述硫酸銅的加入量為AC-Lys (Mtt) - Anoplin - resin重量的O. 05 O. 5倍；所述碳酸鉀的加入量為 AC-Lys (Mtt) - Anoplin - resin 重量的 O. I O. 5 倍。
6.如權利要求3所述具有抗耐藥性的抗菌肽類似物的制備方法，其特征在于步驟(3)所述肽AC- Nle (N3)- MPI的制備方法如下 Fmoc保護的側鏈MTT保護的賴氨酸的插入采用經典的固相合成法得到連有MBHA樹脂的N末端Fmoc保護的母肽Fmoc-MPI- resin ;加入到六氫吡啶與DMF混合溶液中，攪拌使其充分反應；用DMF洗滌，得到脫保護的連有MBHA樹脂的肽MPI- resin ;將Fmoc保護的側鏈MTT保護的賴氨酸Fmoc-Lys (Mtt) -OH溶于DMF中，攪拌使其充分溶解，加入HOBT和HBTU，攪拌溶解后再加入DIEA，然后與得到所述脫保護的連有MBHA樹脂的肽MPI- resin混合，氬氣保護、室溫下攪拌反應I 2h，抽干、用DMF洗滌，得到連有MBHA樹脂的肽Fmoc-Lys(Mtt) - MPI - resin ； 所述 Fmoc-Lys (Mtt) -OH 的摩爾量為 Fmoc-MPI- resin 的 I 8 倍； 所述六氫吡啶與DMF混合溶液中，六氫吡啶與DMF的體積比為1:10 1:4 ;所述HOBT的加用量為Fmoc-Lys (Mtt)-OH重量的I 8倍；所述HBTU的用量為Fmoc-Lys (Mtt)-OH重量的I 8倍；所述DIEA的用量為Fmoc-Lys (Mtt) -OH重量的I 8倍； N端乙?；痎fFmoc-Lys(Mtt)- MPI - resin加入到六氫吡啶與DMF混合溶液，攪拌使其充分反應；用DMF洗滌，得到脫保護的連有MBHA樹脂的肽Lys (Mtt)- MPI - resin ；將乙酸酐溶于DMF中，攪拌使其充分混勻后，再加入DIEA，然后與所述脫保護的連有MBHA樹脂的肽Lys (Mtt)- MPI - resin混合，氬氣保護、室溫下攪拌反應O. 5h lh，抽干、用DMF洗滌，得到連有MBHA樹脂的肽AC-Lys (Mtt)- MPI - resin ； 乙酸酐的摩爾量為Fmoc-Lys (Mtt) - MPI - resin的4 32倍；所述六氫卩比唳與DMF混合溶液中，六氫吡啶與DMF的體積比為1:10 1:4 ;所述DIEA的加入量為Fmoc-Lys(Mtt) - MPI - resin 重量的 I 8 倍； 側鏈疊氮化轉化用含TFA的DCM溶液洗滌所述的連有MBHA樹脂的肽AC-Lys (Mtt)-MPI - resin，再依次用甲醇和DCM洗滌，抽干，即脫Mtt側鏈保護；將疊氮化鈉NaN3加入水和DCM混合溶液中，-I(TC O°C下加入三氟甲磺酸酐Tf2O反應I 3h，用DCM萃取得三氟疊氮TfN3的DCM溶液；在所述連有MBHA樹脂的肽AC-Lys (Mtt) - MPI - resin中加入溶有硫酸銅和碳酸鉀的DCM與甲醇的混合溶液，再滴加三氟疊氮TfN3的DCM溶液，反應24 48h，然后用DCM、甲醇依次洗滌后抽干，得到乙?；倪B有MBHA樹脂的肽AC- Nle (N3)-MPI- resin ;最后進行切割純化得到肽AC- Nle (N3)- MPI ； 所述含TFA的DCM溶液中，TFA的質量百分數為I 10% ； 所述疊氮化鈉的用量為AC-Lys (Mtt)- MPI - resin重量的I 5倍；所述三氟甲磺酸酐的加入量為AC-Lys (Mtt) - MPI - resin重量的5 10倍；所述硫酸銅的加入量為AC-Lys(Mtt)- MPI - resin重量的O. 05 O. 5倍；所述碳酸鉀的加入量為AC-Lys(Mtt)-MPI - resin 重量的 O. I O. 5 倍。
7.如權利要求3所述具有抗耐藥性的抗菌肽類似物的制備方法，其特征在于如步驟(4)所述具有抗耐藥菌活性的抗菌肽J-AA和J-AM的制備方法，是以硫酸銅為催化劑，含DMF的水溶液為反應介質，抗壞血酸鈉為保護劑，將純化的肽AC-pra-Anoplin與肽AC-Nle (N3)-Anoplin或肽AC-Nle (N3)-MPI以2:1 3:1的摩爾比在室溫下反應24h 48h后，經高效液相純化得到目標妝J-AA、J-AM。
8.如權利要求7所述具有抗耐藥性的抗菌肽類似物的制備方法，其特征在于所述硫酸銅的用量為肽AC-Nle (N3) -MPI或肽AC-Nle (N3) - Anoplin摩爾量的2 4倍；抗壞血酸鈉的用量為肽AC-Nle (N3) -MPI或肽AC-Nle (N3) - Anoplin摩爾量的3 8倍；含DMF的水溶液中，DMF的體積百分數為2% 10%。
全文摘要
本發(fā)明設計合成了新型結構的具有抗耐藥菌活性的抗菌肽，是先對天然抗菌肽Anoplin和MPI分別進行N末端的氨基酸修飾后再進行乙?；?，然后利用點擊化學的1,3-偶極環(huán)加成反應以一個1,4-二取代-1H-1,2,3-三唑結構分別對上述肽進行分子間的兩兩側鏈連接而得。通過對常見的革蘭氏陽性菌的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及臨床分離的耐藥金黃色葡萄球菌和耐藥大腸桿菌的抗菌實驗和碘化吡啶染色法實驗表明，本發(fā)明合成的J-AM肽和J-AA肽具有較強的抗菌活性、抗耐藥菌活性以及較強的細胞膜穿透能力，而且對于普通抗生素所產生的耐藥現象有著明顯的抗耐藥優(yōu)勢，因此，在制備臨床治療藥物方面具有很好的應用前景。
文檔編號C07K19/00GK103254316SQ201310168658
公開日2013年8月21日 申請日期2013年5月9日 優(yōu)先權日2013年5月9日
發(fā)明者倪京滿, 王銳, 楊志斌 申請人:倪京滿, 王銳