用于結(jié)核病診斷的蛋白以及藥物組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物化學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及一種用于結(jié)核病診斷的蛋白以及藥物組合物。具體地，本發(fā)明涉及一種分離的蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1或SEQ?ID?NO：2所示。本發(fā)明的蛋白可以作為作為細(xì)胞水平的結(jié)核病免疫診斷分子標(biāo)識(shí)或疫苗候選物，具有良好的符合率和反應(yīng)強(qiáng)度。
【專利說明】用于結(jié)核病診斷的蛋白以及藥物組合物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及一種用于結(jié)核病診斷的蛋白以及藥物組 合物。

【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核分枝桿菌是對(duì)人類健康威脅最大的病原體之一，結(jié)核病是當(dāng)今世界上成年人 中的主要傳染病，已對(duì)國際公共衛(wèi)生構(gòu)成嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。結(jié)核菌在感染人體以后，多處于潛伏狀 態(tài)或持續(xù)感染狀態(tài)，它能在感染宿主細(xì)胞內(nèi)逃避宿主的防御作用而大量繁殖并和宿主達(dá)到 一種微妙的平衡，感染者一生中的任何時(shí)候都有可能發(fā)病。一般情況下，10%的感染者將發(fā) 展為活動(dòng)性肺結(jié)核。一個(gè)未經(jīng)治療的活動(dòng)性肺結(jié)核病人，一年能傳染10 - 15人。
[0003] 近五十年來，結(jié)核病的控制理論與技術(shù)、臨床診斷治療水平與研究均有長足的進(jìn) 步。由于有效化療藥物（異煙肼、利福平、吡嗪酰銨、鏈霉素、乙胺丁醇等）的普遍應(yīng)用和卡 介苗在世界范圍的推廣，使得結(jié)核病的發(fā)病率曾一度降低，以至于人們樂觀地認(rèn)為，結(jié)核病 將同天花一樣被人類徹底消滅。但在八十年代中期，由于過分樂觀的估計(jì)形勢(shì)，減少投資、 縮減機(jī)構(gòu)，放松對(duì)結(jié)核病的治療與管理，結(jié)核病又在許多國家死灰復(fù)燃，發(fā)病率在全世界范 圍內(nèi)再次回升。1993年WHO宣布結(jié)核病處于"全球緊急狀態(tài)"，并呼吁"迅速采取行動(dòng)與結(jié) 核病危機(jī)進(jìn)行斗爭(zhēng)"，這在WHO歷史上發(fā)表這樣的聲明尚屬首次。耐藥及耐多藥結(jié)核病也已 成為當(dāng)前結(jié)核病控制工作中的重大威脅。
[0004] 在常用的肺結(jié)核診斷技術(shù)中存在著陽性率低、周期長、操作復(fù)雜、假陽性率高等問 題。故此需要一種快速、簡便、敏感、特異的診斷方法。
[0005] 目前結(jié)核病毒診斷方法有：（一)痰菌檢查：痰涂菌檢查和痰結(jié)核菌檢查簡便易行， 準(zhǔn)確性較高，痰中查出結(jié)核菌，就能確診患了結(jié)核病。一般初次就診要查三個(gè)痰標(biāo)本，即夜 間痰、清晨痰和即時(shí)痰。它雖然是診斷肺結(jié)核"金指標(biāo)"但診斷率低，培養(yǎng)周期長。痰結(jié)核 菌培養(yǎng)，結(jié)果可信度高，并能做結(jié)核菌藥敏試驗(yàn)，但需時(shí)6 - 8周，應(yīng)用受到限制。（二)X射 線檢查：胸部X線檢查可以早期發(fā)現(xiàn)結(jié)核病，而且可以確定病灶的部位、性質(zhì)、范圍，了解發(fā) 病情況及用于治療效果的判斷，并且開展方便，病人樂于接受。胸部CT可以發(fā)現(xiàn)較小的或 隱蔽部位的病變，可以彌補(bǔ)一般X線檢查的不足。但容易與其他肺部疾病混淆，需要專業(yè)醫(yī) 生確證。（三）肺結(jié)核病免疫學(xué)診斷：1.常用的有結(jié)核菌素純蛋白衍化物（PPD)試驗(yàn)，該試 驗(yàn)陽性是感染過結(jié)核菌的證據(jù)之一，但是假陽性率高，容易誤診。2.血中、痰中結(jié)核抗體檢 測(cè)陽性也有助于診斷，也容易出現(xiàn)假陽率。3. BACTEC法測(cè)結(jié)核分枝桿菌的代謝物，一般兩周 可分離出分枝桿菌，但菌量多少能影響陽性結(jié)果出現(xiàn)的天數(shù)。5.聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)，優(yōu)點(diǎn) 是敏感性可達(dá)98% - 100%，缺點(diǎn)是特異性較差。（四)其他檢查：只能作為輔助診斷，不能作 為診斷依據(jù)。1.纖維支氣管鏡檢查，可以直接觀察或間接判斷支氣管、肺內(nèi)病變，并且有活 組織檢查、灌洗、錄像、拍攝氣管內(nèi)照片等功能，對(duì)于診斷和鑒別診斷特別有用。2.胸腔鏡和 縱隔鏡檢查，均可用于觀察胸腔、縱隔內(nèi)腫大淋巴結(jié)，并可取出活組織檢查以利診斷和鑒別 診斷。3.超聲波檢查，主要用于胸腔積液的診斷和鑒別診斷。
[0006] 結(jié)核分枝桿菌（MTB)培養(yǎng)物濾液中有一種早期分泌抗原革巴蛋白（early secretory antigenic target，ESAT-6)，GenBank 登錄號(hào)為：NC_00962，gi :57117165,相對(duì)分子質(zhì)量為 6000,在MTB感染早期即可被機(jī)體的免疫系統(tǒng)所識(shí)別，是重要的T細(xì)胞抗原抗原。ESAT-6 來源的合成多肽被廣泛地用于外周血MTB特異性γ-干擾素（IFN-γ)應(yīng)答情況的檢測(cè)， 臨床上用于診斷是否有MTB感染指標(biāo)之一 [Ravn P. Munk ME. Andersen AB Prospective evaluation of a whole-blood test using Mycobacterium tuberculosis-specific antigens ESAT_6and CFP-10for diagnosis of active tuberculosis2005 ；Harbce M. Oetteinger T. ffiker HG Evidence for oceurrence of the ESAT-6 protein in Mycobacterium tuberculosis and virulent Mycobacterium bovis and for its absence in Mycabacterium bovis BCG1996 ；Zhang, Μ. , H. Wang, M. Liao, et al. (2010) ·''Diagnosis of latent tuberculosis infection in bacille Calmette-Guerin vaccinated subjects in China by interferon-gamma ELISpot assay.〃Int J Tuberc Lung Disl4(12):1556-1563. ]〇
[0007] 盡管如此，目前尚需要發(fā)現(xiàn)新的診斷結(jié)核病或者檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的標(biāo)識(shí)，以及 新的檢測(cè)診斷結(jié)核病或者檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的方法和試劑。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究和創(chuàng)造性的勞動(dòng)，得到了一類蛋白，本發(fā)明人驚奇地發(fā) 現(xiàn)，本發(fā)明的蛋白能夠作為診斷結(jié)核病或者檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的標(biāo)識(shí)，并且其具有良好的 敏感性和特異性。由此提供了下述發(fā)明：
[0009] 本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種分離的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0 :1(本發(fā)明中 有時(shí)稱為Rv0232)或SEQ ID N0:2 (本發(fā)明中有時(shí)稱為Rvl031)所示。所述蛋白為用于結(jié) 核病診斷或結(jié)核桿菌檢測(cè)的蛋白。
[0010] Rv0232的氨基酸序列：150aa
[0011] KGSLFQYFADKRDLYAFIADIASQRVRSYMEDLIRELDPNR PFFEFLTDLLDGWVAYFAE HPRERALHAAATLEVDTDARISVRS VLHRHYLDVLRPLVRDAHARGDLRADSDTGALMSLLLLIFPHL ALAPYMRGLDPILGLDEPTPEQ (SEQ ID NO ：1)
[0012] Rvl031的氨基酸序列：189aa
[0013] MRRQLLPALTMLLVFTVITGIVYPLAVTGVGQLFFGDQAN GALLERDGQVIGSAHIGQQFTAAKYFH PRPSSAGDGYDAAASSG SNLGPTNEKLLAAVAERVTAYRKENNLPADTLVPVDAVTGSGS GLDPAISVVNAKLQA PRVAQARNISIRQVERLIEDHTDARGLGF LGERAVNVLRLNLALDRL (SEQ ID NO ：2)
[0014] 本發(fā)明的另一方面一種分離的核苷酸，其編碼本發(fā)明的蛋白；具體地，所述核苷酸 的序列如SEQ ID N0 :3或SEQ ID N0 :4所示。
[0015] Rv0232的核苷酸序列（讀碼框）：450bp
[0016] AAGGGCAGCCTGTTCCAGTACTTCGCGGACAAGCGCGAC CTCTACGCGTTTATTGCCGACATCGCCAG CCAGCGAGTCCGC TCCTACATGGAGGACCTGATCCGCGAGCTGGACCCGAACCG GCCGTTCTTCGAATTCCTCAC CGACCTGCTCGATGGCTGGGT CGCCTACTTCGCCGAGCATCCTCGGGAACGTGCGTTGCATGC TGCGGCGACCCT GGAGGTCGACACCGATGCCCGCATCAGCG TGCGCAGCGTCCTGCACCGCCACTACCTGGACGTGCTACGG CCGCT GGTGCGCGACGCGCACGCGCGGGGCGACCTGCGCGC AGATTCCGACACCGGTGCATTGATGTCGCTGCTGCTGCTG AT CTTTCCGCACCTGGCGCTGGCTCCATACATGCGTGGTTTGGA TCCGATCCTGGGCCTCGACGAGCCCACACCT GAGCAG (SEQ ID NO ：3)
[0017] Rvl031的核苷酸序列（讀碼框）：570bp
[0018] ATGCGTCGTCAATTACTGCCCGCGCTCACCATGCTGTTG GTGTTCACCGTCATCACCGGCATCGTCTA CCCGCTTGCCGTG ACCGGCGTCGGGCAACTGTTCTTCGGTGACCAGGCGAACGG CGCGCTGCTCGAGCGGGACGG GCAGGTCATCGGCTCCGCCC ACATCGGCCAGCAGTTCACCGCCGCGAAGTACTTCCACCCGC GCCCCTCGTCGGC AGGCGACGGTTACGACGCTGCGGCGAGC TCGGGCTCCAACCTGGGACCGACGAACGAGAAGCTGCTGGC GGCCGT CGCTGAACGGGTCACCGCCTACCGCAAGGAAAACA ATCTGCCGGCCGATACGCTGGTTCCGGTCGACGCGGTTACC GGCTCGGGTTCCGGGCTGGACCCGGCCATATCGGTGGTCAA TGCCAAGCTGCAGGCACCGCGGGTGGCGCAGGCGC GCAATA TCTCGATAAGGCAGGTCGAGCGTCTGATCGAGGACCACACC GACGCGCGTGGTCTCGGCTTCCTGGGCG AGCGCGCGGTGAA CGTGCTCAGGCTGAACCTCGCATTGGATCGCCTCTGA (SEQ ID NO ：4)
[0019] Rv0232和Rvl031的讀碼框的核苷酸序列可以由實(shí)施例1或2中的相應(yīng)的質(zhì)粒或 PCR產(chǎn)物測(cè)序得到，并可進(jìn)一步根據(jù)讀碼框核苷酸序列推知編碼的氨基酸序列。當(dāng)然，上述 的讀碼框的核苷酸序列也可以通過人工合成得到。所述蛋白可以通過將讀碼框序列通過合 適的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞得到。
[0020] 本發(fā)明的再一方面涉及一種重組載體，其含有本發(fā)明的核苷酸。
[0021] 本發(fā)明的再一方面涉及一種重組宿主細(xì)胞，其含有本發(fā)明的重組載體。
[0022] 本發(fā)明的再一方面涉及一種引物對(duì)，其包含SEQ ID N0 :7和SEQ ID N0 :8所示的 核苷酸序列，和/或包含SEQ ID N0 :9和SEQ ID N0:10所示的核苷酸序列。具體地，所述 引物對(duì)的核苷酸序列如SEQ ID N0 :7和SEQ ID N0 :8所示，和/或如SEQ ID N0 :9和SEQ ID N0 :10 所示。
[0023] 本發(fā)明的再一方面涉及一種抗體，其能夠與本發(fā)明的蛋白（Rv0232和/或Rvl031) 特異性結(jié)合；具體地，所述抗體為單克隆抗體或多克隆抗體；具體地，所述抗體連接有可檢 測(cè)的標(biāo)記物。
[0024] 所述多克隆抗體或單克隆抗體可以參照本領(lǐng)域人員知悉的方法制備。
[0025] 在本發(fā)明中，術(shù)語"特異性結(jié)合"具有免疫學(xué)的一般含義，例如抗原抗體間的結(jié)合。
[0026] 本發(fā)明的再一方面涉及一種抗體偶聯(lián)物，包括抗體部分和偶聯(lián)部分，其中，所述抗 體部分為本發(fā)明的抗體，所述偶聯(lián)部分為選自放射性核素、藥物、毒素、細(xì)胞因子、酶、熒光 素、載體蛋白、脂類、和生物素中的一種或多種。
[0027] 本發(fā)明的再一方面涉及一種組合物，其含有本發(fā)明的蛋白（Rv0232和/或 Rvl031)、本發(fā)明的核苷酸、本發(fā)明的重組載體、本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞、本發(fā)明的引物對(duì)、 本發(fā)明的抗體、或者本發(fā)明的抗體偶聯(lián)物；可選地，所述組合物(藥物組合物）還含有藥學(xué)上 可接受的載體或賦形劑；具體地，所述組合物為疫苗組合物，并且所述藥學(xué)上可接受的載體 或賦形劑為疫苗用載體或賦形劑。
[0028] 在本發(fā)明中，術(shù)語"疫苗用載體或賦形劑"是指選自如下物質(zhì)的一種或多種，包括 但不限于：pH調(diào)節(jié)劑、表面活性劑、佐劑、離子強(qiáng)度增強(qiáng)劑。具體地，例如，pH調(diào)節(jié)劑包括但 不限于磷酸鹽緩沖液，表面活性劑包括但不限于陽離子，陰離子或者非離子型表面活性劑。 其中，非離子型表面活性劑包括但不限于：Tween-80。佐劑包括但不限于氫氧化鋁，氟氏完 全佐劑。離子強(qiáng)度增強(qiáng)劑包括但不限于氯化鈉。
[0029] 本發(fā)明的再一方面涉及一種試劑盒，其包含本發(fā)明的抗體、本發(fā)明的抗體偶聯(lián)物、 或者本發(fā)明的引物對(duì)；具體地，所述試劑盒為用于診斷結(jié)核病特別是肺肺結(jié)核或者檢測(cè)結(jié) 核桿菌的試劑盒。
[0030] 本發(fā)明的再一方面涉及一種篩選藥物的模型，其包含本發(fā)明的蛋白（Rv0232和/ 或Rvl031)或者本發(fā)明的核苷酸；具體地，所述藥物為診斷和/或治療和/或預(yù)防和/或輔 助治療結(jié)核病特別是肺結(jié)核的藥物或者為抗結(jié)核桿菌的藥物。
[0031] 例如，可以通過被篩選的藥物是否能夠檢測(cè)本發(fā)明的蛋白（Rv0232和/或Rvl031) 或者本發(fā)明的核苷酸，來判斷被篩選的藥物是否能夠用作診斷和/或治療和/或預(yù)防和/ 或輔助治療結(jié)核病特別是肺結(jié)核的藥物或者為抗結(jié)核桿菌的藥物。
[0032] 本發(fā)明的再一方面涉及本發(fā)明的蛋白或者本發(fā)明的核苷酸在制備或者作為篩選 藥物的模型中的用途，具體地，所述所述藥物為診斷和/或治療和/或預(yù)防和/或輔助治療 結(jié)核病特別是肺結(jié)核的藥物或者為檢測(cè)結(jié)核桿菌或抗結(jié)核桿菌的藥物。
[0033] 本發(fā)明的再一方面涉及本發(fā)明的蛋白（Rv0232和/或Rvl031)、本發(fā)明的核苷酸、 本發(fā)明的重組載體、本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞、本發(fā)明的引物對(duì)、本發(fā)明的抗體或者本發(fā)明的 抗體偶聯(lián)物在制備診斷和/或治療和/或預(yù)防和/或輔助治療結(jié)核病特別是肺結(jié)核的藥物 (包括但不限于疫苗）或者制備檢測(cè)結(jié)核桿菌或抗結(jié)核桿菌的藥物中的用途。
[0034] 本發(fā)明的再一方面涉及一種在體內(nèi)或體外檢測(cè)結(jié)核桿菌的方法，包括使用本發(fā)明 的抗體或者本發(fā)明的引物對(duì)的步驟；具體地，所述方法為抗原檢測(cè)方法(例如western blot 或者ELISA)或者PCR法。一種在體內(nèi)或體外檢測(cè)結(jié)核桿菌的方法，其為ELISP0T法。檢測(cè) 的樣本包括但不限于：被檢測(cè)者的痰液、血液、組織、淋巴細(xì)胞、DNA等等。
[0035] 本發(fā)明的再一方面涉及一種診斷結(jié)核病特別是肺結(jié)核的方法，包括使用本發(fā)明的 抗體或者本發(fā)明的引物對(duì)的步驟；具體地，所述方法為抗原檢測(cè)方法(例如western blot 或者ELISA)或者PCR法。一種診斷結(jié)核病特別是肺結(jié)核的方法，其為ELISP0T法。
[0036] 下面還給出了本發(fā)明涉及的部分術(shù)語的解釋。
[0037] 表達(dá)載體
[0038] 本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核酸序列、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄及翻譯終止信號(hào)的重組表達(dá)載 體?？梢詫⑸鲜龈鞣N核酸和調(diào)控序列連接在一起來制備重組表達(dá)載體，該載體可以包括一 個(gè)或多個(gè)方便的限制位點(diǎn)，以便在這些位點(diǎn)插入或取代編碼本發(fā)明的蛋白或抗體的核酸序 列?；蛘?，可以通過將核酸序列或包含該序列的核酸構(gòu)建體插入適當(dāng)表達(dá)載體而表達(dá)本發(fā) 明所述核酸序列。制備表達(dá)載體時(shí)，可使編碼序列位于載體中以便與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)調(diào)控序列 可操作地連接。
[0039] 重組表達(dá)載體可以是任何便于進(jìn)行重組DNA操作并表達(dá)核酸序列的載體(例如質(zhì) ?；虿《?。載體的選擇通常取決于載體與它將要導(dǎo)入的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是 線性或閉環(huán)質(zhì)粒。
[0040] 載體可以是自主復(fù)制型載體（即存在于染色體外的完整結(jié)構(gòu)，可獨(dú)立于染色體進(jìn) 行復(fù)制)，例如質(zhì)粒、染色體外元件、微小染色體或人工染色體。載體可包含保證自我復(fù)制的 任何機(jī)制?；蛘?，載體是一個(gè)當(dāng)導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)，將整合到基因組中并與所整合到的染色體 一起復(fù)制的載體。此外，可應(yīng)用單個(gè)載體或質(zhì)粒，或總體包含將導(dǎo)入宿主細(xì)胞基因組的全部 DNA的兩個(gè)或多個(gè)載體或質(zhì)粒，或轉(zhuǎn)座子。
[0041] 優(yōu)選本發(fā)明所述載體含有一個(gè)或多個(gè)便于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇標(biāo)記。選擇標(biāo)記是 這樣一個(gè)基因，其產(chǎn)物賦予對(duì)殺生物劑或病毒的抗性、對(duì)重金屬的抗性，或賦予營養(yǎng)缺陷體 原養(yǎng)型等。細(xì)菌選擇標(biāo)記的例子如枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或者抗生素 如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素的抗性標(biāo)記。
[0042] 優(yōu)選本發(fā)明所述載體包含能使載體穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞基因組中，或保證載體在 細(xì)胞中獨(dú)立于細(xì)胞基因組而進(jìn)行自主復(fù)制的元件。
[0043] 就進(jìn)行自主復(fù)制的情況而言，載體還可以包含復(fù)制起點(diǎn)，使載體能在目標(biāo)宿主細(xì) 胞中自主地復(fù)制。復(fù)制起點(diǎn)可以帶有使其在宿主細(xì)胞中成為溫度敏感型的突變(參見例如， fEhrlich，1978,美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)75 :1433)。
[0044] 可以向宿主細(xì)胞插入一個(gè)以上拷貝的本發(fā)明核酸序列以提高該基因產(chǎn)物的產(chǎn)量。 該核酸序列的拷貝數(shù)增加可以通過將該序列的至少一個(gè)附加拷貝插入宿主細(xì)胞基因組中， 或者與該核酸序列一起插入一個(gè)可擴(kuò)增的選擇標(biāo)記，通過在有合適選擇試劑存在下培養(yǎng)細(xì) 胞，挑選出含有擴(kuò)增拷貝的選擇性標(biāo)記基因、從而含有附加拷貝核酸序列的細(xì)胞。
[0045] 用于連接上述各元件來構(gòu)建本發(fā)明所述重組表達(dá)載體的操作是本領(lǐng)域技術(shù)人員 所熟知的(參見例如Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉 港，紐約，1989)。
[0046] 宿主細(xì)胞
[0047] 本發(fā)明還涉及包含可用來重組生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白或抗體的本發(fā)明所述核酸序列 (多核苷酸)的重組宿主細(xì)胞。可將包含本發(fā)明之核酸序列的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，從而使該 載體以上述染色體整合體或自我復(fù)制的染色體外載體形式得以維持。術(shù)語"宿主細(xì)胞"涵 蓋任何由于復(fù)制期間發(fā)生的突變而與親本細(xì)胞不同的后代。宿主細(xì)胞的選擇很大程度上取 決于本發(fā)明的蛋白或抗體編碼基因及其來源。
[0048] 宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞，例如細(xì)菌或酵母細(xì)胞?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域 技術(shù)人員熟知的技術(shù)將載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。
[0049] 制備方法
[0050] 本發(fā)明還涉及重組制備本發(fā)明本發(fā)明的蛋白或抗體的方法，該方法包括：（a)在 適于產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白或抗體的條件下，培養(yǎng)含有核酸構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，該核酸構(gòu)建體 包含編碼所述本發(fā)明的蛋白或抗體的核酸序列；和（b)回收該肽。
[0051] 在本發(fā)明所述制備方法中，用本領(lǐng)域已知方法在合適本發(fā)明的蛋白或抗體產(chǎn)生的 營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。例如，可以在合適的培養(yǎng)基中，在允許本發(fā)明的蛋白或抗體表達(dá)和 /或分離的條件下，通過搖瓶培養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、 分批、分批加料或固態(tài)發(fā)酵）來培養(yǎng)細(xì)胞。在包含碳源和氮源以及無機(jī)鹽的合適的培養(yǎng)基 中，采用本領(lǐng)域已知的步驟進(jìn)行培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基可由供應(yīng)商提供或者可以參照公開的 組成(例如，美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中所述）來制備。如果本發(fā)明的蛋白或抗體被 分泌到培養(yǎng)基中，則可以直接從培養(yǎng)基中回收。如果本發(fā)明的蛋白或抗體不分泌，可以從細(xì) 胞裂解物中回收。
[0052] 可以用本領(lǐng)域已知方法回收所產(chǎn)生的本發(fā)明的蛋白或抗體。例如，可以通過常規(guī) 操作(包括，但不限于離心、過濾、抽提、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀）從培養(yǎng)基中回收。
[0053] 可以通過各種本領(lǐng)域已知的操作來純化本發(fā)明所述本發(fā)明的蛋白或抗體，這些操 作包括，但不限于層析(例如，離子交換層析、親和層析、疏水作用層析、層析聚焦、和大小排 阻層析)、HPLC、電泳(例如，制備性等電點(diǎn)聚焦)、差示溶解度(例如硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE 或抽提（例如參見，蛋白質(zhì)純化，J. C. Janson和Lars Ryden編，VCH Publishers, New York, 1989) 〇
[0054] 在本發(fā)明中，術(shù)語"結(jié)核桿菌"，包括但不限于，例如，結(jié)核分枝桿菌；術(shù)語"結(jié)核分 枝桿菌"包括但不限于，結(jié)核分枝桿菌H37Rv。
[0055] 發(fā)明的有益效果
[0056] 本發(fā)明的蛋白可以作為作為結(jié)核病(例如肺結(jié)核）或結(jié)核桿菌細(xì)胞免疫診斷分子 標(biāo)識(shí)，具有良好的符合率和反應(yīng)強(qiáng)度。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0057] 圖1 :目的基因 Rv0232和Rvl031的電泳結(jié)果，各泳道的樣品從左往右依次是： Rvl031、DNA marker、Rv0232。
[0058] 圖2 :表達(dá)后Rv0232和Rvl031的PAGE結(jié)果。各泳道的樣品從左往右依次是蛋白 marker、Rv 1031、Rv2032。
[0059] 圖3 :Rv0232和Rvl031蛋白純化的PAGE結(jié)果。各泳道的樣品從左往右依次是蛋 白 marker、Rvl031、Rv2032。
[0060] 圖4 :表達(dá)蛋白初篩結(jié)果示例。
[0061] 圖5 :部分蛋白的ELISP0T鑒定部分結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0062] 下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理 解，下面的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體 技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著， 黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社）或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用 試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0063] 實(shí)施例1 :MTB H37Rv的相關(guān)某閔的克降和表汰（Gateway法)
[0064] Invitrogen公司的Gateway技術(shù)為蛋白的重組和表達(dá)提供了一種可能，它是從 PCR產(chǎn)物開始創(chuàng)建Gateway?入門克隆。這種方法是通過合并attB位點(diǎn)到上游和下游引物 上，然后共同孵育PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pDONR?(包含attP位點(diǎn)）以及Gateway? BP Clonase? 酶混合物。接著轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌中，將會(huì)獲得包含目的基因的入門克隆，同時(shí)目的基因兩側(cè) 具有attL重組位點(diǎn)。這個(gè)入門克隆可以與Gateway?目的載體pDEST17進(jìn)行重組表達(dá)，快速 高效得到目的蛋白[Walhout AJ, Temple GF，Brasch MA.et al. GATEWAY recombinational cloning:application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol, . 2000, 328:575-592 ；Rachael M.Goldstone, Nicole J. Moreland, Ghader Bashiri，et al.A new Gateway_vector and expression protocol for fast and efficient recombinant protein expression in Mycobacterium smegmatis. Protein Expression and Purification57(2008) 81 - 87 ;A high throughput screen to identify secreted and transmembrane proteins involved in Drosophila embryogenesis. PNAS1998;95;9973-9978.]。
[0065] 本實(shí)驗(yàn)以于MTB H37Rv的基因組為模板，利用Invitrogen公司提供的Gateway技 術(shù)，表達(dá)全部0RF編碼的蛋白質(zhì)，經(jīng)過western blot方法檢測(cè)臨床血楽獲得具有較高敏感 性特異性抗原，為臨床診斷、疾病治療、預(yù)防控制提供堅(jiān)實(shí)的物質(zhì)基礎(chǔ)。
[0066] 一、實(shí)驗(yàn)方法
[0067] 1.基因序列的獲取
[0068] 根據(jù)已經(jīng)公開的MTB H37Rv的ORFs基因序列，用Primer designer設(shè)計(jì)引物序列， 按照Gateway系統(tǒng)的引物設(shè)計(jì)方案，為引物序列添加 attB臂，由北京新擎科公司完成引物 的合成。
[0069] 其為正向引物臂為：
[0070] GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC (SEQ ID NO ：5)；
[0071] 反向引物臂為：
[0072] GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTA (SEQ ID NO ：6)〇
[0073] 共完成引物設(shè)計(jì)3535對(duì)，因篇幅所限，部分引物如下面的表1所示。
[0074] 表1 :部分合成引物(不含att臂的部分）
[0075]

【權(quán)利要求】
1. 一種分離的蛋白，其氨基酸序列如SEQIDN0:1或SEQIDN0:2所示。
2. -種分離的核苷酸，其編碼權(quán)利要求1所述的蛋白；具體地，所述核苷酸的序列如 SEQ ID NO :3 或 SEQ ID NO :4 所示。
3. -種重組載體，其含有權(quán)利要求2所述的核苷酸。
4. 一種重組宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求3所述的重組載體。
5. -種引物對(duì)，其包含SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列，和/或包含 SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :10所示的核苷酸序列。
6. -種抗體，其能夠與權(quán)利要求1所述的蛋白特異性結(jié)合；具體地，所述抗體為單克隆 抗體或多克隆抗體；具體地，所述抗體連接有可檢測(cè)的標(biāo)記物。
7. -種抗體偶聯(lián)物，包括抗體部分和偶聯(lián)部分，其中，所述抗體部分為權(quán)利要求6所述 的抗體，所述偶聯(lián)部分為選自放射性核素、藥物、毒素、細(xì)胞因子、酶、熒光素、載體蛋白、月旨 類、和生物素中的一種或多種。
8. -種組合物，其含有權(quán)利要求1所述的蛋白、權(quán)利要求2所述的核苷酸、權(quán)利要求3 所述的重組載體、權(quán)利要求4所述的重組宿主細(xì)胞、權(quán)利要求5所述的引物對(duì)、權(quán)利要求6 所述的抗體或者權(quán)利要求7所述的抗體偶聯(lián)物；可選地，所述組合物還含有藥學(xué)上可接受 的載體或賦形劑；具體地，所述組合物為疫苗組合物，并且所述藥學(xué)上可接受的載體或賦形 劑為疫苗用載體或賦形劑。
9. 一種試劑盒，其包含權(quán)利要求6所述的抗體、權(quán)利要求7所述的抗體偶聯(lián)物、或者權(quán) 利要求5所述的引物對(duì)；具體地，所述試劑盒為用于診斷結(jié)核病特別是肺肺結(jié)核或者檢測(cè) 結(jié)核桿菌的試劑盒。
10. -種篩選藥物的模型，其包含權(quán)利要求1所述的蛋白或者權(quán)利要求2所述的核苷 酸；具體地，所述藥物為診斷和/或治療和/或預(yù)防和/或輔助治療結(jié)核病特別是肺結(jié)核的 藥物或者為抗結(jié)核桿菌的藥物。
11. 權(quán)利要求1所述的蛋白或者權(quán)利要求2所述的核苷酸在制備或者作為篩選藥物的 模型中的用途，具體地，所述所述藥物為診斷和/或治療和/或預(yù)防和/或輔助治療結(jié)核病 特別是肺結(jié)核的藥物或者為檢測(cè)結(jié)核桿菌或抗結(jié)核桿菌的藥物。
12. 權(quán)利要求1所述的蛋白、權(quán)利要求2所述的核苷酸、權(quán)利要求3所述的重組載體、權(quán) 利要求4所述的重組宿主細(xì)胞、權(quán)利要求5所述的引物對(duì)、權(quán)利要求6所述的抗體或者權(quán)利 要求7所述的抗體偶聯(lián)物在制備診斷和/或治療和/或預(yù)防和/或輔助治療結(jié)核病特別是 肺結(jié)核的藥物(包括但不限于疫苗）或者制備檢測(cè)結(jié)核桿菌或抗結(jié)核桿菌的藥物中的用途。
【文檔編號(hào)】C07K19/00GK104151411SQ201310176083
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2013年5月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月14日
【發(fā)明者】劉立國, 金奇, 張笑冰, 張維佳 申請(qǐng)人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所