含硒重組人血白蛋白的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明適用于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，提供了含硒重組人血白蛋白的制備方法，包括構(gòu)建畢赤酵母工程菌、發(fā)酵培養(yǎng)、純化等步驟。本發(fā)明含硒重組人血白蛋白的制備方法，操作簡單，成本低廉，產(chǎn)率高，所制備的含硒重組人血白蛋白即可作為白蛋白補(bǔ)充劑，起其保健作用，克服血源白蛋白安全性的問題，又可以作為有機(jī)硒抑制癌癥，提高免疫力，增強(qiáng)組織修復(fù)能力，具有很大的市場潛力。含硒重組人血白蛋白作為單純的營養(yǎng)保健品投放市場，與現(xiàn)有的硒營養(yǎng)品相比，其成分更加明確，安全性、有機(jī)純度和營養(yǎng)價(jià)值更高。
【專利說明】含砸重組人血白蛋白的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種含硒重組人血白蛋白的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]人血清白蛋白在人血漿中含量極其豐富，是循環(huán)系統(tǒng)中用量最多的蛋白質(zhì)，約占血漿總蛋白的60%，典型的血漿濃度HSA含量為50g/L，滲透壓占全部血漿的80%。正常人血清白蛋白水平為每100mL3.9~4.5g,當(dāng)每IOOmL血衆(zhòng)中白蛋白水平低于3g時(shí),就會(huì)發(fā)生全身水腫，當(dāng)病人受外傷而發(fā)生腦壓升高，腦部水腫壓迫神經(jīng)時(shí)，白蛋白是最重要的搶救手段。因此，人血清白蛋白在臨床上主要用于手術(shù)輸血和危重病人補(bǔ)液，治療創(chuàng)傷休克、發(fā)燒、水腫、低白蛋白血癥和紅細(xì)胞過多癥等，而且能增強(qiáng)人體抵抗能力，是重要的臨床藥物。HSA的主要作用是維持血液的正常滲透壓和運(yùn)送許多親水分子(如類固醇激素，膽色素和脂肪酸等大量醫(yī)療分子)。另外，人血清白蛋白也應(yīng)用在生物產(chǎn)品的制備上，如臨床和層析劑純化膽紅素，用做肝病毒疫苗和穩(wěn)定劑等。目前市場上銷售的HSA商品均來自人源血漿提取純化。然而人血來源有限，艾滋病、乙肝等病毒的蔓延及檢測技術(shù)方面的原因，使得因使用該種血液制品而感染艾滋病及肝炎的情況時(shí)有發(fā)生，以致有的國家禁止國外血液制品的進(jìn)口，這就對血源人血白蛋白的生產(chǎn)要求和質(zhì)量控制更加嚴(yán)格。
[0003]為了解決人血清白蛋白來源有限的矛盾，通過基因工程技術(shù)把人血清白蛋白基因克隆到微生物(細(xì)菌、真菌等)、動(dòng)物、植物宿主上進(jìn)行高效表達(dá)是最具有前景的方法，近20年以來，國際上許多實(shí)驗(yàn)室和公司陸續(xù)嘗試通過遺傳工程開發(fā)HSA，國內(nèi)也有多家單位已經(jīng)開展了重組人血清白蛋白的研究，HSA基因已被引入細(xì)菌、真菌、植物以及動(dòng)物中進(jìn)行表達(dá)。rHSA在細(xì)菌表達(dá)中的表達(dá)主要是在大腸桿菌E.coli和枯草桿菌Bacillus subtilis兩種系統(tǒng)中的表達(dá)。rHSA在E coli中表達(dá)量可達(dá)細(xì)胞總蛋白的7%，但因?yàn)檠灏椎鞍追肿又泻写罅康亩蜴I，使得胞外折疊 很難正確完成，產(chǎn)物不具有生物活性，而且可能產(chǎn)生極個(gè)別的氨基酸序列變化；因而大腸桿菌蛋白表達(dá)量雖高，但應(yīng)用到生產(chǎn)上意義不大。枯草桿菌作表達(dá)HSA時(shí)，產(chǎn)物聚集在細(xì)胞內(nèi)或在胞外(細(xì)胞膜的外面)導(dǎo)致信號序列沒有被酶解，阻礙了外源蛋白的分泌途徑，使得表達(dá)量不高且信號肽去除率低，因而也不適合工業(yè)化生產(chǎn)。rHSA也可在大鼠，小鼠，山羊，奶牛等轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中得到表達(dá)，在體內(nèi)試驗(yàn)時(shí)，可通過微注射方法把HSA基因片斷注射到受精卵中，基因通過同源重組來表達(dá)完整的HSA;也可以通過中間受體基因傳送把HSA DNA輸送到肝細(xì)胞中表達(dá)；另外，rHSA基因通過細(xì)胞外植培養(yǎng)也可進(jìn)行分泌表達(dá)，在外植培養(yǎng)時(shí)能夠很快地誘導(dǎo)，但基因的表達(dá)調(diào)控受到胞外基質(zhì)的雙重調(diào)控，操作復(fù)雜，F(xiàn)DA目前還沒有批準(zhǔn)任何一家公司用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的重組人血清白蛋白上市，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的高成本，也使得動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)受到成本的限制；rHSA也可通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在馬鈴薯和煙葉中得到成功的分泌表達(dá)，但與同樣存在成本限制的問題。
[0004]硒是生物體所必需的微量營養(yǎng)元素之一，它具有重要的生物學(xué)功能。生物體硒缺乏可導(dǎo)致40多種病癥，如人體的克山病、大骨節(jié)病和動(dòng)物的白肌病等，因而補(bǔ)硒對生物體是非常必要的。近來的研究還表明，硒作為生物抗氧化劑，有清除有機(jī)體內(nèi)的自由基，減少機(jī)體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的效應(yīng)；砸具有抗癌和延緩裳老的作用；砸還有提聞機(jī)體免疫活力的作用。此外，硒還對重金屬鹽如Hg、N1、Pb、Cd等毒性有頡抗效應(yīng)。研究證實(shí)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH — Px)是哺乳動(dòng)物體內(nèi)最早確證其酶功能的含硒蛋白質(zhì)，硒攝入量不足，血液中此酶的活性會(huì)下降。
[0005]到目前為止，人類營養(yǎng)中硒的補(bǔ)充形式大致有2類:第I類是無機(jī)硒化合物，這在我國克山病區(qū)已收到了較好的效果，但是硒的無機(jī)化合物多具有毒性，使用劑量不慎極易引起不良副作用；第2類是人工合成的有機(jī)硒化合物，用于注射，以期在體內(nèi)逐漸釋放硒，起到長效作用，但是注射用藥的方式限制了它的應(yīng)用。
[0006]目前或獲取的蛋白質(zhì)中，含有硒的較少，難以達(dá)到補(bǔ)硒的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]有鑒于此，本發(fā)明提供一種含硒重組人血白蛋白的制備方法，解決現(xiàn)有技術(shù)中人血白蛋白制備成本高、產(chǎn)量低，并且硒含量差的技術(shù)問題。
[0008]本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，
[0009]一種含硒重組人血白蛋白的制備方法，包括如下步驟:
[0010]構(gòu)建含重組人血白蛋白基因的畢赤酵母工程菌；
[0011]將該畢赤酵母工程菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；該發(fā)酵培養(yǎng)過程中向培養(yǎng)基中加入體積分?jǐn)?shù)為0.001%~0.05%的亞硒酸鈉；
[0012]將發(fā)酵培養(yǎng)的產(chǎn)物純化，得到含硒重組人血白蛋白。
[0013]本發(fā)明含硒重組人血白蛋白的制備方法，操作簡單，成本低廉，產(chǎn)率高，所制備的含硒重組人血白蛋白即可作為白蛋白補(bǔ)充劑，起其保健作用，克服血源白蛋白安全性的問題，又可以作為有機(jī)硒抑制癌癥，提高免疫力，增強(qiáng)組織修復(fù)能力，具有很大的市場潛力。含硒重組人血白蛋白作為單純的營養(yǎng)保健品投放市場，與現(xiàn)有的硒營養(yǎng)品相比，其成分更加明確，安全性、有機(jī)純度和營養(yǎng)價(jià)值更高。
【具體實(shí)施方式】
[0014]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0015]本發(fā)明實(shí)施例提供一種含硒重組人血白蛋白的制備方法，包括如下步驟:
[0016]步驟SOI，構(gòu)建畢赤酵母工程菌；
[0017]構(gòu)建方法采用基因工程領(lǐng)域 中常規(guī)技術(shù)手段:
[0018]通過RT-PCR克隆人肝細(xì)胞來源的rHSA，擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)酶切和電泳回收后，插入質(zhì)粒pPIC9K的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-rHSA，雙酶切鑒定陽性克隆后轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，PCR鑒定陽性克隆。具體如下:
[0019]總RNA的提取:
[0020]A.事先準(zhǔn)備提取RNA專用的離心管、槍頭、研缽及相關(guān)試劑等:
[0021]1.用氯仿浸泡1.5mL的離心管、10yL、200yL和ImL的槍頭，分別裝于用氯仿拭搽過的玻璃瓶和槍頭盒中，于121°C (1.034X105Pa)固體模式滅菌20min。[0022]2.研缽和研錘洗凈烘干后，先用乙醇浸泡一小時(shí)，再用氯仿浸泡半小時(shí)，用前先加液氮冷卻。
[0023]3.DEPC水的準(zhǔn)備:在雙蒸水中加入DEPC，使終濃度達(dá)到0.1%(V/V)，用力搖勻后，繼續(xù)置于搖床上以IOOrpm的速度搖過夜。于121°C (1.034X 105Pa)液體模式滅菌20min。冷卻后密閉備用。
[0024]B.用Trizol Reagent試劑盒(INVITR0GEN)進(jìn)行總RNA的提取，按試劑盒提供的說明書進(jìn)行操作。
[0025]1.先將人胎盤組織在液氮中研磨成粉。將粉末分裝到Eppendorf中，每管分裝IOOmg左右。每管加入ImL Trizol試劑,混勻，室溫放置5min。加入氯仿200 μ L,用力振蕩15sec,室溫孵育2~3min。
[0026]2.在4°C下以12000Xg的速度離心15min，混合物分為紅色的酚一氯仿相(下相)、白色的中間相以及無色的上層水相。總RNA分散在上層水相中。
[0027]3.將上層水相(500 μ L)轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的Eppendorf管中，加入ImL無水乙醇,混勻以沉淀RNA。
[0028]4.室溫孵育IOmin以上，在4°C下以12000Xg的速度離心lOmin，可見白色的RNA
沉淀貼于試管底壁。
[0029]5.棄上清，用70%的乙醇洗滌RNA沉淀一次，在4°C下以7500Xg的速度離心5min。
[0030]6.棄上清，空氣中自然干燥，用60 μ L DEPC水溶解沉淀，一 70°C保存?zhèn)溆谩?br> [0031]變性瓊脂糖膠電泳檢測總RNA的質(zhì)和量
[0032]1.作一塊1.5%的變性瓊脂糖膠:稱取0.9g瓊脂糖，加入45mL DEPC水，用微波爐加熱溶膠后，依次加入甲醛10mL、10XM0PS6mL，混勻，冷卻到35 — 40°C后倒于插好梳子的水平托盤上，放置I小時(shí)使之凝固。
[0033]2.離心出總RNA沉淀，洗滌干燥后溶于20 μ L的DEPC水。
[0034]3.于65°C恒溫干浴鍋中變性IOmin.,馬上冰浴5min.。
[0035]4.取5 μ L總RNA溶液,力卩5 μ L預(yù)冷的上樣緩沖液(loading buffer)和10 μ L預(yù)冷的樣品緩沖液(sample buffer),混勻。
[0036]5.用移液器小心將混合液滴加入瓊脂糖凝膠的加樣孔中。
[0037]6.以50伏的電壓電泳90 — 120分鐘(溴酚蘭泳動(dòng)到膠長2/3的位置)。
[0038]7.將瓊脂糖凝膠置于紫外燈下觀察并照像。
[0039]RT-PCR 擴(kuò)增 HSA cDNA
[0040]根據(jù)Lawn等發(fā)表的人血清白蛋白cDNA序列(Genebank V00495)設(shè)計(jì)上下游引物，引物序列如下:
[0041]SEQ ID NO:1PRIMER13:5’ -gatgcacacaagagtgaggtt-3’
[0042]SEQ ID NO:2PRIMER14:5’ _ttataagcctaaggcagcttg_3’
[0043]把所得RNA稀釋10倍作為PCR摸板，用反轉(zhuǎn)錄酶和特定引物P14，將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)行PCR。反轉(zhuǎn)錄的步驟和體系為:(1)在1.5或0.5mL EP管中加入primerl40.5μ L, RNA2 μ L, dNTP0.5 μ L，雙蒸水 9 μ L，65C 水浴 5min 后冰浴，稍離心。(2)在上述管中加入 5Xbuffer2y L，0.1mol/mL DTTl μ L，Rnase out0.5 μ L，混勻后 42°C水浴2min。(3)加 0.2uL SupprscriptTMRT(Invitrogen)混勻。(4)在溫箱中 42°C培養(yǎng) 50min。
(5)70°C, 15min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。
[0044]以反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，
[0045]反應(yīng)體系:
[0046]
IOxbuffer5.0 μ L
Ex-Taq0.5 μ L
dNTP4.0 μ L
PRIM ER 131.0 μ L
PRIMER 14I ΟμΕ
cDNA2,0 μ L
^dciH2050.0 μ L
[0047]反應(yīng)條件為:
[0048]
94 °C4 min 94 C I --ι in 56'C I min I for 30 cycles 72 °C 2 min」
12X15 mill
4 °Cpause
[0049]PCR擴(kuò)增的HSA基因片段的純化
[0050](I)配制瓊脂糖凝膠，電泳以分離DNA片段。
[0051](2)電泳足夠時(shí)間后，在紫外燈下小心地把所需的DNA片段切下來。并盡量去除多余的凝膠。
[0052](3)稱取空離心管的重量，切下帶目的片段的凝膠裝在1.5ml離心管中并稱其重量，求出凝膠塊的重量，近似地確定其體積。一般情況下，凝膠的密度為Ig / ml，于是凝膠的體積與重量的關(guān)系可按下面換算:凝膠薄片的重量為0.2g則其體積為0.2ml ;加入等倍凝膠體積的Binding Buffer,把混合物置于55? -65?水浴中溫浴7min至凝膠完全融化，其間每隔2-3分鐘混勻一次.[0053](4)轉(zhuǎn)移700 μ I的DNA-瓊脂糖溶液到一個(gè)HiBind DNA柱子，并把柱子裝在一個(gè)干凈的2ml收集管內(nèi)，室溫下，10, OOOXg離心Imin,棄去液體。
[0054](5)將柱子重新套回收集管中，加300 μ LBinding Buffer至HiBind DNA柱子中；室溫下，10，000 Xg離心I分鐘，去棄濾出液。[0055](6)將柱子重新套回收集管中，加入700 μ L Wash buffer至HiBind DNA柱子中，室溫下，10，000 Xg離心I分鐘，去棄濾出液。
[0056](7)將柱子重新套回收集管中，重復(fù)加入700 μ L Wash buffer至HiBind DNA柱子中，室溫下，10，000Xg離心I分鐘，去棄濾出液；
[0057](8)棄去液體，將空柱子重新套回收集管中，10，000Xg離心Imin以甩干柱基質(zhì)殘余的液體。
[0058](9)把柱子裝在一個(gè)干凈的1.5ml離心管上，加入3-50 μ I洗脫液或滅菌水上柱子膜上，10，OOOXg離心I分鐘，離心管中的溶液就是純化的DNA產(chǎn)物，保存于-20°c。
[0059]重組質(zhì)粒pUCMT-HSA的構(gòu)建
[0060]將純化的HSA基因和pUCMT載體用T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a受體菌。涂布含Amp、IPTG、X-gal的SOC瓊脂平板，37°C培養(yǎng)過夜后，平板上長出許多藍(lán)色、白色菌落。
[0061]重組質(zhì)粒的鑒定
[0062](I)利用藍(lán)白斑篩選，從每個(gè)平板上挑取10個(gè)白色菌落，分別接種于含ImL(加ampicilli)液體LB培養(yǎng)基的Ep管中。
[0063](2)于37°C搖床上以250rpm的速度振蕩培養(yǎng)36h，中間在凈化工作臺上打開管蓋，換氣I次。
[0064](3)室溫以12, OOOrpm離心5min,收集菌體沉淀,棄上清,加入100 μ L冰預(yù)冷的溶液I，在渦旋器上劇烈振蕩使 沉淀完全懸浮。
[0065](4)加入200 μ L溶液II，顛倒數(shù)次混勻，室溫放置5min。
[0066](5)加入150 μ L冰預(yù)冷的溶液III，輕微顛倒數(shù)次混勻，冰浴lOmin，澄清的溶液中會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。
[0067](6)室溫以12, OOOrpm離心5min,將上清轉(zhuǎn)移到另一新的Ep管中。
[0068](7)加入2倍體積的無水乙醇，反復(fù)顛倒幾次混勻，室溫下放置15min以上，以沉淀質(zhì)粒DNA。
[0069](8)室溫以12，OOOrpm離心5min，棄上清。用75%乙醇洗滌DNA沉淀一次。
[0070](9)干燥后將質(zhì)粒 DNA 溶于 50 μ L TE (ρΗ8.0)中，并加入 I μ L RNase A(10mg/mL)，置于37°C過夜以除去RNA。
[0071](10)對每種重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測，以確定是否含有目的基因.[0072]重組質(zhì)粒的序列測定
[0073]提取陽性克隆菌帶有的重組質(zhì)粒送南京金思瑞生物技術(shù)有限公司測序。采用T7通用引物進(jìn)行測序，得到的結(jié)果為HSA cDNA基因的反向互補(bǔ)序列。利用軟件DNAMAN處理后得到HSA基因序列，序列對齊結(jié)果顯示克隆得到的HSA基因序列與GENBANK數(shù)據(jù)庫中登記號為V00495的序列完全一致，結(jié)果如下:
[0074]SEQ ID NO:3 1758bp;
[0075]Composition 548A;350C;403G;457T;OOTHER
[0076]Percentage:31.2%A; 19.9%C; 22.9%G; 26.0%T;0.0%0THER
[0077]Molecular Weight(kDa):ssDNA:544.19dsDNA:1083.68
[0078]ORIGIN
【權(quán)利要求】
1.一種含硒重組人血白蛋白的制備方法，包括如下步驟: 構(gòu)建含重組人血白蛋白基因的畢赤酵母工程菌； 將所述畢赤酵母工程菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；所述發(fā)酵培養(yǎng)過程中向培養(yǎng)基中加入體積分?jǐn)?shù)為0.001%-0.05%的亞硒酸鈉； 將發(fā)酵培養(yǎng)的產(chǎn)物純化，得到含硒重組人血白蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的含硒重組人血白蛋白的制備方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)步驟為: 將所述畢赤酵母工程菌在30°C條件下用YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)12~18h ； 將種子液轉(zhuǎn)移至BMGY培養(yǎng)基中，在溫度為28°C，pH值為6的條件下培養(yǎng)，檢測菌液OD600為0.6時(shí)向培養(yǎng)基中加入甲醇溶液； 將溫度調(diào)整至28°C，PH值調(diào)節(jié)為5-9發(fā)酵培養(yǎng)72-120小時(shí)，每隔12小時(shí)向培養(yǎng)基中加入甲醇和甘油混合溶液及體積分?jǐn)?shù)為0.001%-0.05%的亞硒酸鈉。
3.如權(quán)利要求2所述的含硒重組人血白蛋白的制備方法，其特征在于，所述甘油溶液的質(zhì)量濃度為0.01%-5%，所述甲醇溶液的質(zhì)量濃度為0.01%-5%。
4.如權(quán)利要求1、2或3所述的含硒重組人血白蛋白的制備方法，其特征在于，所述純化步驟前還包括如下滅活步驟: 將發(fā)酵培養(yǎng)后的溶液離心，收集上清液； 將所述上清液在溫度為30~80°C條件下熱處理1-5小時(shí)，離心處理后收集上清液，得到熱處理后上清液。
5.如權(quán)利要求4所述的含硒重組人血白蛋白的制備方法，其特征在于，所述純化步驟如下: 將所述熱處理后上清液經(jīng)過(NH4)2SO4沉淀、離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾分離純化及使用相對分子量為5000~100，000中空纖維超濾膜進(jìn)行脫鹽處理，得到含硒重組人血白蛋白。
【文檔編號】C07K1/18GK103468769SQ201310188214
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年5月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月20日
【發(fā)明者】徐東, 楊艷群 申請人:深圳市亞太興實(shí)業(yè)有限公司