木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明揭示了兩種木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。將所述蛋白在目的菌株中表達(dá)后，目的菌株對木糖的利用速度和產(chǎn)溶劑速度加快，其對葡萄糖的利用速度也出乎意料地得到加快，從而獲得了對木糖和葡萄糖利用速度均顯著提高的生產(chǎn)菌，進(jìn)而提高了相應(yīng)生物燃料，例如乙醇或丁醇的產(chǎn)量。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供了包含所述蛋白的編碼序列的表達(dá)載體、包含所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞以及它們在產(chǎn)生生物燃料中的用途和方法。
【專利說明】木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】。具體地說，本發(fā)明涉及一種木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]由于石油資源的有限性以及國際原油價格的波動性，利用可再生資源制造生物能源已受到世界各國的普遍重視，例如乙醇、丁醇等等。而丁醇由于其優(yōu)良的燃燒特性及較乙醇更優(yōu)的儲存運(yùn)輸特性，更是有望在將來成為新一代生物燃料。自二戰(zhàn)以來隨著石油工業(yè)的發(fā)展，生物丁醇發(fā)酵由于較高的原料成本，大規(guī)模發(fā)酵一直處于停滯狀態(tài)，而且隨著近年來糧食價格的不斷上漲及國家相關(guān)糧食安全戰(zhàn)略的制定，采用糧食發(fā)酵生產(chǎn)燃料丁醇已受到嚴(yán)格限制。
[0003]我國傳統(tǒng)的丁醇發(fā)酵生產(chǎn)中采用的生產(chǎn)菌-丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)以糧食原料(如玉米、小麥等)為底物。較高的糧食價格致使原料費(fèi)用占溶劑生產(chǎn)總成本的比例偏高(75%以上)，這不僅限制了丁醇產(chǎn)品的市場競爭力，也嚴(yán)重違背了我國的糧食安全戰(zhàn)略。因此，就長遠(yuǎn)而言，以非糧原料，尤其是廉價的木質(zhì)纖維素資源(如秸桿、稻草等)通過生物轉(zhuǎn)化制造生物燃料，例如丁醇是今后發(fā)展的必然趨勢。
[0004]丙酮丁醇梭菌除了能夠利用葡萄糖、蔗糖、淀粉外，還能利用木糖、乳糖、阿拉伯糖等多種碳源。農(nóng)林廢棄物(秸桿、稻草等)中的纖維素和半纖維素水解后的主要成分是葡萄糖、木糖及阿拉伯糖，丙酮丁醇梭菌寬泛的底物譜使得該菌可以利用纖維素、半纖維素水解液為原料進(jìn)行生物丁醇的發(fā)酵。纖維素和半纖維素在自然界中占到植物界碳素的50%以上，利用纖維素和半纖維素水解液進(jìn)行生物丁醇發(fā)酵，有望大大降低原料成本。
[0005]然而，丙酮丁醇梭菌與很多其它細(xì)菌一樣存在著糖代謝物阻遏效應(yīng)(carboncatabolite repress1n, CCR),即在葡萄糖存在時,幾乎不利用木糖和阿拉伯糖。此外,丙酮丁醇梭菌木糖代謝本身也存在瓶頸，例如對木糖的利用較慢，或者在高木糖濃度下，對木糖的利用緩慢且不充分。鑒于此，要提高丙酮丁醇梭菌在混合糖中木糖和阿拉伯糖利用率需要克服兩個問題，一是葡萄糖存在時對木糖、阿拉伯糖代謝的阻遏，二是木糖代謝自身存在的瓶頸。
[0006]此外，現(xiàn)有技術(shù)中利用的菌株還往往存在產(chǎn)酸過多的問題，產(chǎn)酸過多說明碳源被消耗在非所需產(chǎn)物上，降低了對原材料的利用率，因此，對于生產(chǎn)菌株，產(chǎn)酸越低越好。而產(chǎn)酸過多也會對于菌體生長產(chǎn)生不利影響。丙酮丁醇梭菌發(fā)酵分為產(chǎn)酸期和產(chǎn)溶劑期，如果能加快酸回用速度就能夠讓菌株更早進(jìn)入產(chǎn)溶劑期。
[0007]綜上所述，本領(lǐng)域急需鑒定新的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，進(jìn)而開發(fā)出能夠高效轉(zhuǎn)運(yùn)木糖的菌株，從而提高菌株對木糖的利用率和利用速度以及提高酸回用速度。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種新型木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，開發(fā)出能夠高效轉(zhuǎn)運(yùn)木糖的菌株，從而提聞菌株對木糖的利用率和利用速度以及提聞酸回用速度。
[0009]在第一方面,本發(fā)明提供一種表達(dá)載體,所述表達(dá)載體包含:
[0010](i)氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示的蛋白的編碼序列；或
[0011](ii)由SEQ ID NO:1或2所示氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的且具有氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示蛋白功能的衍生蛋白的編碼序列。
[0012]在優(yōu)選的實施方式中，所述表達(dá)載體包含SEQ ID N0:3或4所示的多核苷酸序列。
[0013]在第二方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明第一方面所述表達(dá)載體或基因組上整合有以下編碼序列的宿主細(xì)胞:
[0014](i)氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示的蛋白的編碼序列；或
[0015](ii)由SEQ ID NO:1或2所示氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的且具有氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示蛋白功能的衍生蛋白的編碼序列。
[0016]在優(yōu)選的實施方式中，所述宿主細(xì)胞是丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌(Clostridiumbei jerinckii)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或大腸桿菌(E.Coli)。
[0017]在另一優(yōu)選的實施方式中，所述宿主細(xì)胞是丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。
[0018]在第三方面，本發(fā)明提供以下蛋白或包含其編碼序列的表達(dá)載體或包含所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞在產(chǎn)生生物燃料中的用途:
[0019]⑴氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示的蛋白；或
[0020](ii)由SEQ ID NO:1或2所示氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的且具有氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示的蛋白功能的由(i)衍生的蛋白。
[0021]在優(yōu)選的實施方式中，所述生物燃料是乙醇、丙酮或丁醇。
[0022]在另一優(yōu)選的實施方式中，所述生物燃料是乙醇或丁醇。
[0023]在第四方面，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生生物燃料的方法，所述方法包括以下步驟:
[0024]i)對本發(fā)明第二方面所述的宿主細(xì)胞進(jìn)行發(fā)酵，使所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生生物燃料；和
[0025]ii)從i)的體系中獲得所述生物燃料。
[0026]在優(yōu)選的實施方式中，所述生物燃料是乙醇、丙酮或丁醇。
[0027]在另一優(yōu)選的實施方式中，所述生物燃料是乙醇或丁醇。
[0028]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1A所示為大腸桿菌K12中構(gòu)建的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)子各缺陷株生長曲線即0D600nm變化情況。
[0030]圖1B所不為將木糖轉(zhuǎn)運(yùn)子cacl530 (sym3)和cac3422 (sym4)分別異源功能互補(bǔ)大腸桿菌木糖轉(zhuǎn)運(yùn)子缺陷株K12/ Δ xylEG后所得菌株的生長曲線即0D600nm變化情況。
[0031]圖2A所示為在丙酮丁醇梭菌ATCC824中分別敲除木糖轉(zhuǎn)運(yùn)子cacl530 (sym3)和cac3422 (sym4)后所得突變株824sym3和824sym4與野生型824在0.5%含量木糖培養(yǎng)基中發(fā)酵殘?zhí)呛蜕L曲線。
[0032]圖2B所示為突變株824sym3和824sym4與野生型824在2%含量木糖培養(yǎng)基中發(fā)酵殘?zhí)呛蜕L曲線。
[0033]圖3A所示為在丙酮丁醇梭菌ATCC824中過表達(dá)cacl530(sym3)和cac3422 (sym4)后所得菌株824thl-sym3和824thl-sym4與野生型824在6%含量木糖培養(yǎng)基中發(fā)酵殘?zhí)呛孔兓€。
[0034]圖3B所示為菌株824thl-sym3和824thl_sym4與野生型824在6%含量木糖培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)生丙酮、乙醇、丁醇、乙酸和丁酸的含量變化。
[0035]圖4A所示為菌株824thl-sym3和824thl_sym4與野生型824在含有4%葡萄糖和2%木糖的混糖培養(yǎng)基中發(fā)酵殘?zhí)呛孔兓€，其中實線表示葡萄糖的殘?zhí)呛?，虛線表示木糖的殘?zhí)呛俊?br> [0036]圖4B所示為菌株824thl-sym3和824thl_sym4與野生型824在含有4%葡萄糖和2%木糖的混糖培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)生丙酮、乙醇、丁醇、乙酸和丁酸的含量變化。

【具體實施方式】
[0037]發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，出乎意料地發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌木糖轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷株中異源互補(bǔ)預(yù)測的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不僅能夠恢復(fù)對木糖的利用能力，還提高了在高木糖濃度下該菌株對木糖的利用率，加快了菌株對木糖的利用速度和產(chǎn)溶劑以及酸回用速度；更出乎意料的是，在加快菌株對木糖利用的同時加快了葡萄糖的利用速度；而在丙酮丁醇梭菌中敲除和過表達(dá)該木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白得到的菌株對于木糖的利用能力以及產(chǎn)酸產(chǎn)溶劑能力發(fā)生了相應(yīng)的變化，從而獲得對木糖和匍萄糖利用率均提聞的丙麗丁醇梭菌，進(jìn)而能提聞相應(yīng)生物燃料，例如丁醇的產(chǎn)量。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0038]CAC1530 和 CAC3422 蛋白
[0039]本文所用的術(shù)語“CAC1530”、“CAC1530蛋白”、“CAC3422” 或“CAC3422 蛋白”具有相同的意義，在本文可以互換使用，均表示氨基酸序列如SEQ ID N0:1或2所示的蛋白質(zhì)，其編碼序列如SEQ ID N0:3或4所示。
[0040]本文所用的術(shù)語“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。因此，本文所用的術(shù)語“分離的CAC1530蛋白”或“分離的CAC3422蛋白”是指所述蛋白基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化CAC1530蛋白或CAC3422蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。
[0041]然而，鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)以及現(xiàn)有技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)明白“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”還應(yīng)包括所述蛋白的變異形式，所述變異形式具有與“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”相同或相似的功能，但其氨基酸序列與SEQ ID NO:1或2所示氨基酸序列有少量差異。這些變異形式包括(但不限于):一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個，還更佳如1-8個、1-5個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或多個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代，例如，異亮氨酸與亮氨酸相互取代時，不會改變所得蛋白質(zhì)的功能。再例如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸，例如為便于分離而添加的標(biāo)簽通常不會改變所得蛋白質(zhì)的功能。
[0042]多肽的變異形式包括:同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)格性條件下能與“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”的編碼DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還包括其他多肽，如包含“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還應(yīng)包括“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”的可溶性片段。通常，該片段具有“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”序列的至少約20個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
[0043]本發(fā)明還提供“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”的類似物。這些類似物與天然“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的蛋白并不限于上述例舉的代表性蛋白。
[0044]修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括:體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的蛋白。
[0045]在本發(fā)明中，“CAC1530蛋白”或“CAC3422蛋白”的保守性變異多肽指與SEQ IDNO:1或2所示氨基酸序列相比，有至多20個，較佳地至多10個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。
[0046]因此，鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)和現(xiàn)有技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)，例如下表所示進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生保守性變異的突變體。
[0047]

【權(quán)利要求】
1.一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含: (i)氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示的蛋白的編碼序列；或 (?)由SEQ ID N0:1或2所示氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的且具有氨基酸序列如SEQ ID N0:1或2所示蛋白功能的衍生蛋白的編碼序列。
2.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體包含SEQID N0:3或4所示的多核苷酸序列。
3.包含權(quán)利要求1或2所述表達(dá)載體或基因組上整合有以下編碼序列的宿主細(xì)胞: (i)氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示的蛋白的編碼序列；或 (?)由SEQ ID N0:1或2所示氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的且具有氨基酸序列如SEQ ID N0:1或2所示蛋白功能的衍生蛋白的編碼序列。
4.如權(quán)利要求3所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)。
5.以下蛋白或包含其編碼序列的表達(dá)載體或包含所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞的用途，其特征在于，用于產(chǎn)生生物燃料: (i)氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示的蛋白；或 (?)由SEQ ID N0:1或2所示氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的且具有氨基酸序列如SEQ ID N0:1或2所示的蛋白功能的由(i)衍生的蛋白。
6.如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述生物燃料是乙醇、丙酮或丁醇。
7.如權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述生物燃料是乙醇或丁醇。
8.—種產(chǎn)生生物燃料的方法，所述方法包括以下步驟: i)對權(quán)利要求3或4所述的宿主細(xì)胞進(jìn)行發(fā)酵，使所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生生物燃料；和 ?)從i)的體系中獲得所述生物燃料。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述生物燃料是乙醇、丙酮或丁醇。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述生物燃料是乙醇或丁醇。
【文檔編號】C07K14/33GK104177480SQ201310192979
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年5月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月22日
【發(fā)明者】楊晟, 徐舒, 孫喆, 顧陽, 姜衛(wèi)紅 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院