一種多肽及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及多肽合成領(lǐng)域，特別涉及一種多肽及其制備方法和用途。該多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，多肽的N端經(jīng)乙?；揎?；從N端起，多肽中第22位的X8主鏈與第25位的X9側(cè)鏈進(jìn)行酰胺鍵環(huán)化。本發(fā)明提供的多肽保留了Astressin B的生物學(xué)活性，其代謝穩(wěn)定性更高，可有效預(yù)防和治療脫發(fā)；該多肽的制備方法具有生產(chǎn)成本低、收率高的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】一種多肽及其制備方法和用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及多肽合成領(lǐng)域，特別涉及一種多肽及其制備方法和用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 脫發(fā)是指頭發(fā)脫落的現(xiàn)象，包括生理性脫發(fā)和病理性脫發(fā)。生理性脫發(fā)是指處于 退行期及休止期的毛發(fā)脫落的現(xiàn)象，由于進(jìn)入退行期與新進(jìn)入生長期的毛發(fā)不斷處于動態(tài) 平衡，故能維持正常數(shù)量的頭發(fā)。病理性脫發(fā)是指頭發(fā)異常或過度的脫落，主要原因是人 體血液內(nèi)的熱毒排不出來，從而使人體出現(xiàn)某些病癥，表現(xiàn)在頭發(fā)上就是毛囊萎縮，頭發(fā)脫 落，易斷，油多無彈性，較為嚴(yán)重的情況是普脫、全脫。按發(fā)病機(jī)制不同，病理性脫發(fā)主要分 為神經(jīng)性脫發(fā)、內(nèi)分泌脫發(fā)、營養(yǎng)性脫發(fā)、物理性脫發(fā)、化學(xué)性脫發(fā)、感染性脫發(fā)、癥狀性脫 發(fā)、先天性脫發(fā)、免疫性脫發(fā)、季節(jié)性脫發(fā)等。脫發(fā)會影響患者的形象，進(jìn)而影響到人際關(guān)系 和心理健康，給患者帶來極大的痛苦。
[0003] 目前，治療脫發(fā)的藥物主要有米諾地爾、非那雄胺等，但這兩種藥物均會引發(fā)嚴(yán)重 的不良反應(yīng)。其中，米諾地爾用于內(nèi)服可起降血壓的作用，如果外部大劑量使用，該藥經(jīng)皮 膚吸收滲透到體內(nèi)，易導(dǎo)致頭痛、低血壓；長期內(nèi)服非那雄胺片治療脫發(fā)可能會導(dǎo)致的副作 用包括：男性胸部增大，乳頭發(fā)育，男性陽痿，陰莖紅腫，陰囊疼痛，較嚴(yán)重的是可能導(dǎo)致永 久性的內(nèi)生殖器官突變，影響精子質(zhì)量，最終導(dǎo)致胎兒發(fā)育畸形，部分人長期服用后會產(chǎn)生 抑郁癥等副作用。因此，開發(fā)新型、安全的治療脫發(fā)的藥物依然是目前藥學(xué)研究的熱點(diǎn)。
[0004] Astressin B是新近發(fā)現(xiàn)的可預(yù)防和治療脫發(fā)的多肽類藥物，分子式為 C199H298N52049，分子量為 3962.65，其結(jié)構(gòu)如式I所示，其中，從N端起第22位的Glu和第25 位的Lys通過側(cè)鏈進(jìn)行酰胺鍵環(huán)化。
[0005] Ac-Asp1-Leu2-Thr3-D-Phe4-His 5-Leu6-Leu7-Arg8-Glu9-Val 10-Leu11-Glu12-Nle13-Al a 14-Arg15-Ala16-Glu17-Gln 18-Gml19-Ala20-Gln21-cyclo (Glu22-Ala23-His24-Lys25) -Asn26-Arg27-Lys28-Leu29-Nle 30-Glu31-Cml32-Ile33-NH2
[0006] 式 I
[0007] 在Astressin B的合成過程中，一般采用Fmoc固相合成策略進(jìn)行合成。Astressin B中存在Cml殘基，在合成過程中用到的氨基酸殘基原料為Fmoc-Cml-OH，它的市場價(jià)格較 為昂貴，且在偶聯(lián)過程中存在偶聯(lián)困難的情況，導(dǎo)致Astressin B的收率偏低；從N端起 Astressin B的第22位氨基酸為Glu，該Glu和25位的Lys通過側(cè)鏈進(jìn)行酰胺鍵環(huán)化，在 固相合成過程中用到的氨基酸殘基原料為Fmoc-Glu (0A11)-0H，它的市場價(jià)格也較昂貴?；?于這兩點(diǎn)原因，使得Astressin B的生產(chǎn)成本高，且收率較低。因此，對于生產(chǎn)成本低、收率 高的可預(yù)防和治療脫發(fā)的多肽類藥物仍有需求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 有鑒于此，本發(fā)明提供了一種多肽及其制備方法和用途。該多肽在保留了 Astressin B的生物學(xué)活性的同時(shí)，其代謝穩(wěn)定性更高，可有效預(yù)防和治療脫發(fā)；該多肽的 制備方法具有生產(chǎn)成本低、收率高的優(yōu)點(diǎn)。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0010] 本發(fā)明提供了一種多肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0 :1所示，具體為：
[0011] Asp-Leu-Thr-X^His^-Leu-Arg-Xg-Val-Leu-X^Xg-Ala-Arg-Ala-Xg-Gln-Xy-Ala _Gln_X8_Ala_His _X9_X10_Arg_Lys _Leu_Xn_Glu_X 7_Ile ;
[0012] 其中，X7 為 N_Me_Leu ;
[0013] X8 為 γ-Glu 或 β-Asp ;
[0014] 父丨為 D-Phe 或 Phe ;
[0015] X2 為 lie 或 Leu;
[0016] X3 為 Asp 或 Glu;
[0017] X4 為 Asp 或 Glu;
[0018] X5Slle*Nle;
[0019] X6 為 Asp 或 Glu;
[0020] X9 為 Orn 或 Lys ;
[0021] Xi。為 Gin 或 Asn;
[0022] XnSlle*Nle;
[0023] 多肽的N端經(jīng)乙?；揎棧?br> [0024] 從N端起，多肽中第22位的X8主鏈與第25位的X9側(cè)鏈進(jìn)行酰胺鍵環(huán)化。
[0025] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，多肽的氨基酸序列中X8為Y -Glu，Xi為D-Phe，X2 為 Leu, X3 為 Glu，X4 為 Glu，X5 為 Nle，X6 為 Glu，X9 為 Lys, X1(l 為 Asn，Xn 為 Nle，其氨基酸 序列如SEQ ID NO :2所示。
[0026] 在本發(fā)明提供的另一些實(shí)施例中，多肽的氨基酸序列中X8為Y -Glu，Xi為Phe，X2 為 Leu, X3 為 Glu，X4 為 Glu，X5 為 Nle，X6 為 Glu，X9 為 Lys, X1(l 為 Asn，Xn 為 Nle，其氨基酸 序列如SEQ ID NO :3所示。
[0027] 在本發(fā)明提供的另一些實(shí)施例中，多肽的氨基酸序列中X8為Y -GluJ為D-Phe， X2 為 lie, X3 為 Glu，X4 為 Glu，X5 為 Nle，X6 為 Glu，X9 為 Lys, X1(l 為 Asn，Xn 為 Nle，其氨基 酸序列如SEQ ID NO :4所示。
[0028] 在本發(fā)明提供的另一些實(shí)施例中，多肽的氨基酸序列中X8為Y -GluJ為D-Phe， X2 為 Leu, X3 為 Asp, X4 為 Glu，X5 為 Nle，X6 為 Glu，X9 為 Lys, X1(l 為 Asn，Xn 為 Nle，其氨基 酸序列如SEQ ID NO :5所示。
[0029] 在本發(fā)明提供的另一些實(shí)施例中，多肽的氨基酸序列中X8為Y -GluJ為D-Phe， X2 為 Leu, X3 為 Glu，X4 為 Asp, X5 為 Nle，X6 為 Glu，X9 為 Lys, X1(l 為 Asn，Xn 為 Nle，其氨基 酸序列如SEQ ID NO :6所示。
[0030] 在本發(fā)明提供的另一些實(shí)施例中，多肽的氨基酸序列中X8為Y -GluJ為D-Phe， X2 為 Leu, X3 為 Glu，X4 為 Glu，X5 為 lie, X6 為 Glu，X9 為 Lys, X1(l 為 Asn，Xn 為 Nle，其氨基 酸序列如SEQ ID NO :7所示。
[0031] 在本發(fā)明提供的另一些實(shí)施例中，多肽的氨基酸序列中X8為Y-GluJ為D-Phe， X2 為 Leu, X3 為 Glu，X4 為 Glu，X5 為 Nle，X6 為 Asp, X9 為 Lys, X1(l 為 Asn，Xn 為 Nle，其氨基 酸序列如SEQ ID NO :8所示。
[0032] 在本發(fā)明提供的另一些實(shí)施例中，多肽的氨基酸序列中X8為β -Aspji為D-Phe， X2 為 Leu, X3 為 Glu，X4 為 Glu，X5 為 Nle，X6 為 Glu，X9 為 Lys，X1(l 為 Asn，Xn 為 Nle，其氨基 酸序列如SEQ ID NO :9所示。
[0033] 在本發(fā)明提供的另一些實(shí)施例中，多肽的氨基酸序列中X8為Y -GluJ為D-Phe， X2 為 Leu，X3 為 Glu，X4 為 Glu，X5 為 Nle，X6 為 Glu，X9 為 Orn，X1Q 為 Asn，Xn 為 Nle，其氨基 酸序列如SEQ ID NO :10所示。
[0034] 在本發(fā)明提供的另一些實(shí)施例中，多肽的氨基酸序列中X8為Y -GluJ為D-Phe， X2 為 Leu，X3 為 Glu，X4 為 Glu，X5 為 Nle，X6 為 Glu，X9 為 Lys，X1Q 為 Gln，Xn 為 Nle，其氨基 酸序列如SEQ ID NO :11所示。
[0035] 在本發(fā)明提供的另一些實(shí)施例中，多肽的氨基酸序列中X8為Y -GluJ為D-Phe， X2 為 Leu, X3 為 Glu，X4 為 Glu，X5 為 Nle，X6 為 Glu，X9 為 Lys，X1(l 為 Asn，Xn 為 lie,其氨基 酸序列如SEQ ID NO :12所示。
[0036] 本發(fā)明還提供了一種本發(fā)明提供的多肽的制備方法，包括如下步驟：
[0037] 步驟A :取lie與樹脂偶聯(lián)，得到lie-樹脂；
[0038] 步驟B :取lie-樹脂經(jīng)逐步偶聯(lián)，得到多肽片段-樹脂；
[0039] 步驟C :多肽片段-樹脂的N端經(jīng)乙?；揎棧?br> [0040] 步驟D:脫除從N端起第22位和第25位氨基酸殘基的保護(hù)基，經(jīng)環(huán)化、裂解、純化、 凍干，即得；
[0041] 從N端起，多肽第22位氨基酸原料采用Fmoc-Asp-〇A11或Fmoc-Glu-〇A11 ;
[0042] 多肽片段-樹脂中的多肽的序列如SEQ ID NO : 1所示。
[0043] 作為優(yōu)選，步驟C中乙酰化修飾采用的試劑為醋酸酐和DIEA的混合物。
[0044] 作為優(yōu)選，步驟C中乙?；揎棽捎玫脑噭┐姿狒cDIEA的摩爾比為1: 2。
[0045] 作為優(yōu)選，步驟D中脫除采用的試劑為苯基硅烷和Pd(PPh3)4的混合物。
[0046] 作為優(yōu)選，步驟D中環(huán)化采用的試劑為PyBOP、HOBt和DIEA的混合物。
[0047] 作為優(yōu)選，步驟D中環(huán)化采用的試劑中PyBOP、HOBt與DIEA的摩爾比為5:6:10。
[0048] 作為優(yōu)選，步驟D中裂解采用的試劑為TFA。
[0049] 本發(fā)明還提供了本發(fā)明提供的多肽在制備防治脫發(fā)藥物中的應(yīng)用。
[0050] 本發(fā)明還提供了一種藥物制劑，由本發(fā)明提供的多肽和藥學(xué)上可接受的輔料組 成。
[0051] 作為優(yōu)選，藥物制劑的劑型為粉針劑、注射液、微球、微囊、脂質(zhì)體、微乳、片劑、丸 齊U、膠囊劑、顆粒劑或散劑。
[0052] 本發(fā)明提供了一種多肽及其制備方法和用途。該多肽的氨基酸序列如SEQ ID N0 : 1 所不，具體為：Asp-Leu-Thr-XfHis-^-Leu-Arg-Xs-Val-Leu-^-Xs-Ala-Arg-Ala-Xg-Gln -Xy-Ala-Gln-Xg-Ala-His-Xg-Xid-Arg-Lys-Leu-Xn-Glu-Xy-Ile ;其中，X7 為 N_Me_Leu ;X8 為 Y -Glu 或 β -Asp % 為 D-Phe 或 Phe ;X2 為 lie 或 Leu ;X3 為 Asp 或 Glu ;X4 為 Asp 或 Glu ;X5 為 lie 或 Nle ;X6 為 Asp 或 Glu ;X9S〇rn 或 Lys ;X1(I 為 Gin 或 Asn ;XnS lie 或 Nle ;多肽的 N端經(jīng)乙?；揎?；從N端起，多肽中第22位的&主鏈與第25位的&側(cè)鏈進(jìn)行酰胺鍵環(huán)化。 通過在體外對細(xì)胞內(nèi)cAMP活性的影響研究可知，Astressin B和本發(fā)明提供的多肽均可劑 量依賴式地增加 PC-12細(xì)胞內(nèi)cAMP含量，表明本發(fā)明提供的多肽保留了 Astressin B的生 物學(xué)活性；通過對多肽的代謝穩(wěn)定性研究可知，本發(fā)明提供的多肽的半衰期要比Astressin B時(shí)間更長，表明其代謝穩(wěn)定性更高；通過藥效研究可知，處于較高的壓力狀態(tài)下的小鼠分 別注射本發(fā)明提供的多肽和Astressin B12周后，試驗(yàn)小鼠脫發(fā)面積均只占整個(gè)背部面積 的20%左右，而僅注射生理鹽水的小鼠對照組幾乎整個(gè)背部毛發(fā)全部脫光，表明本發(fā)明提 供的多肽可有效預(yù)防脫發(fā)，且與Astressin B的預(yù)防脫發(fā)效果基本一樣；通過對脫發(fā)小鼠 的藥效研究可知，毛發(fā)脫光的小鼠在注射本發(fā)明提供的多肽12周后，毛發(fā)的生長率為75% 左右，單純注射生理鹽水的小鼠毛發(fā)的生長率仍舊維持在5%左右，注射Astressin B的小 鼠毛發(fā)的生長率為70%左右，結(jié)果表明本發(fā)明提供的多肽可有效治療脫發(fā)，且治療脫發(fā)的 效果與Astressin B治療脫發(fā)的效果基本一致或略好一些；本發(fā)明提供的多肽的氨基酸序 列中，采用N-Me-Leu取代Astressin B肽序中的Cml，采用γ-Glu或β-Asp取代Astressin B肽序中成環(huán)的Glu，可降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品的收率。由此可見，本發(fā)明提供的多肽保留 了 Astressin B的生物學(xué)活性，其代謝穩(wěn)定性更高，可有效預(yù)防和治療脫發(fā)；該多肽的制備 方法具有生產(chǎn)成本低、收率高的優(yōu)點(diǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0053] 圖1示實(shí)施例1制得的多肽粗品的HPLC圖譜；
[0054] 圖2示實(shí)施例1制得的多肽精品的HPLC圖譜；
[0055] 圖3示實(shí)施例1制得的多肽精品的質(zhì)譜圖；
[0056] 圖4示實(shí)施例12提供的Astressin B和實(shí)施例1制得的多肽對細(xì)胞內(nèi)cAMP活性 的影響；其中，線1示Astressin B對細(xì)胞內(nèi)cAMP活性的影響；線2示實(shí)施例1制得的多肽 對細(xì)胞內(nèi)cAMP活性的影響。

【具體實(shí)施方式】
[0057] 本發(fā)明公開了一種多肽及其制備方法和用途，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi) 容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員 來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施 例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和 應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0058] 說明書和權(quán)利要求書中所使用的縮寫具體含義如下：
[0059] 縮寫及英文 含義
[0060] Alloc 烯丙氧羰基
[0061] All 烯丙基
[0062] Cml C- α -甲基-亮氨酸
[0063] N-Me-Leu N-甲基亮氨酸
[0064] Biotin 生物素
[0065] DIC 二異丙基碳二亞胺
[0066] DIEA 二異丙基乙胺
[0067] DMF N, N-二甲基甲酰胺
[0068] DCM 二氯甲烷
[0069] EDTA 乙二胺四乙酸
[0070] Fmoc 9_芴甲氧羰基
[0071] HBTU 0-苯并三唑-N，N，Ν'，Ν' -四甲基脲鎗六氟磷
[0072] 酸鹽
[0073] HOBt 1-羥基苯并三唑
[0074] mPEG 聚乙二醇單甲醚
[0075] mPEG-NH2 氨基聚乙二醇單甲醚
[0076] Pd (PPh3) 4 四三苯基膦鈀
[0077] PhSiH3 苯硅烷
[0078] PyBOP (苯并三唑_1_氧）三吡咯烷子基磷鎗六氟磷
[0079] 酸鹽
[0080] TFA 三氟乙酸
[0081] 本發(fā)明提供的多肽及其制備方法和用途中所用原料、輔料和試劑均可由市場購 得。
[0082] 下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：
[0083] 實(shí)施例1多肽的制備
[0084] 用Rink Amide樹脂類型的固相載體，選用Fmoc保護(hù)氨基策略合成，其操作步驟 為：
[0085] 稱取Rink Amide樹脂25g (lOmmol)，加入到固相反應(yīng)柱，用DMF洗漆2?3次， 用DMF溶脹30分鐘。用體積比為1 :4的哌啶和DMF混合液100 mL，脫除Fmoc保護(hù)基20分 鐘，用茚三酮方法檢測Fmoc是否脫除完全，樹脂有顏色，表明Fmoc已脫除。
[0086] 稱取Fmoc-Ile-〇H 10. 6g，DIEA為激活劑，活化3?5分鐘，加入反應(yīng)柱反應(yīng)1? 3 小時(shí)，得到 Fmoc-Ile-Rink Amide 樹脂。
[0087] 用體積比為1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脫除Fmoc保護(hù)基20分鐘，用茚三酮 方法檢測Fmoc是否脫除完全，樹脂有顏色，表明Fmoc已脫除。
[0088] 按照上述偶聯(lián)Fmoc-Ile-ΟΗ的方法，在Fmoc-Ile-Rink Amide樹脂上依次偶聯(lián) Fmoc-N-Me-Leu-〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys (Boc) -0H、 Fmoc-Arg (Pbf)-〇H> Fmoc-Asn (Trt)-〇H> Fmoc-Lys (A1 loc)-〇H> Fmoc-His (Trt)-〇H> Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu-OAll、Fmoc-Gln(Trt)-〇H、Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-N-Me-Leu-〇H、 Fmoc-Gln (Trt) -〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-Arg (Pbf) -〇H、Fmoc_Ala-〇H、 Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-〇H、Fmoc-Glu (OtBu)-〇H、 Fmoc-Arg (Pbf)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His (Trt)-〇H、Fmoc-D-Phe-〇H、 Fmoc-Thr (tBu) -〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp (OtBu) -〇H。
[0089] 加入15m mol的醋酸酐和20m mol的DIEA，完成N-端的乙?；?。
[0090] 脫除賴氨酸Alloc側(cè)鏈保護(hù)基和谷氨酸主鏈上的0A11保護(hù)基，具體操作為：DCM 洗3次，加入400mmol苯基硅燒，反應(yīng)5分鐘，加入2mmolPd (PPh3) 4,反應(yīng)120分鐘，用茚三 酮方法檢測，樹脂有顏色，表明Alloc已脫除。
[0091] 分子內(nèi)醜胺鍵環(huán)化，加入50mmol PyB0P，60mmol HOBt，lOOmmol DIEA，偶聯(lián)6小時(shí)， 收縮，抽干，得到肽樹脂。
[0092] 將肽樹脂用TFA裂解，反應(yīng)1?5小時(shí)，將多肽從樹脂上裂解下來，同時(shí)脫除側(cè)鏈 保護(hù)基。
[0093] 對裂解下來的多肽溶液用乙醚沉淀，得到多肽粗品，多肽的序列如SEQ ID N0 :2所 示，用HPLC方法檢測其純度和含量，其HPLC圖譜如圖1所示；檢測結(jié)果為：多肽粗品的純度 為78%，收率為98. 6%，含量為69. 5%。
[0094] 用C18色譜柱，用常規(guī)的流動相洗脫，收集組分，凍干得到多肽精品，用HPLC方法 檢測其純度和含量，用質(zhì)譜和Edman降解分析其序列，其HPLC圖譜如圖2所示，其質(zhì)譜圖如 圖3所示。檢測結(jié)果為：多肽精品的純度為96. 8%，總收率為64. 5%，含量為93. 7%，質(zhì)譜的 檢測結(jié)果為3962. 058 (目標(biāo)分子量為3962. 65)。
[0095] 實(shí)施例2多肽的制備
[0096] 用Rink Amide樹脂類型的固相載體，選用Fmoc保護(hù)氨基策略合成，其操作步驟 為：
[0097] 稱取Rink Amide樹脂25g，加入到固相反應(yīng)柱，用DMF洗滌2?3次，用DMF溶脹 30分鐘。用體積比為1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脫除Fmoc保護(hù)基20分鐘，用茚三酮 方法檢測Fmoc是否脫除完全，樹脂有顏色，表明Fmoc已脫除。
[0098] 稱取Fmoc-Ile-0H10. 6g，DIEA為激活劑，活化3?5分鐘，加入反應(yīng)柱反應(yīng)1?3 小時(shí)，得到 Fmoc-Ile-Rink Amide 樹脂。
[0099] 用體積比為1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脫除Fmoc保護(hù)基20分鐘，用茚三酮 方法檢測Fmoc是否脫除完全，樹脂有顏色，表明Fmoc已脫除。
[0100] 按照上述偶聯(lián)Fmoc-Ile-ΟΗ的方法，在Fmoc-Ile-Rink Amide樹脂上依次偶聯(lián) Fmoc-N-Me-Leu-〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys (Boc) -0H、 Fmoc-Arg (Pbf)-〇H> Fmoc-Asn (Trt)-〇H> Fmoc-Lys (A1 loc)-〇H> Fmoc-His (Trt)-〇H> Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-Glu-OAll、Fmoc-Gln(Trt)-〇H、Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-N-Me-Leu-〇H、 Fmoc-Gln (Trt) -〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-Arg (Pbf) -〇H、Fmoc_Ala-〇H、 Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-〇H、Fmoc-Glu (OtBu)-〇H、 Fmoc-Arg (Pbf)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His (Trt)-〇H、Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Thr(tBu) -〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-〇H。
[0101] 加入15mmol的醋酸酐和20mmol的DIEA,完成N-端的乙?；?。
[0102] 脫除賴氨酸Alloc側(cè)鏈保護(hù)基和谷氨酸主鏈上的0A11保護(hù)基，具體操作為：DCM 洗3次，加入400mmol苯基硅烷，反應(yīng)5分鐘，加入2mmol Pd (PPh3) 4,反應(yīng)120分鐘，用茚三 酮方法檢測，樹脂有顏色，表明Alloc已脫除。
[0103] 分子內(nèi)醜胺鍵環(huán)化，加入50mmol PyB0P，60mmol HOBt，lOOmmol DIEA，偶聯(lián)6小時(shí)， 收縮，抽干，得到肽樹脂。
[0104] 將肽樹脂用TFA裂解，反應(yīng)1?5小時(shí)，將多肽從樹脂上裂解下來，同時(shí)脫除側(cè)鏈 保護(hù)基。
[0105] 對裂解下來的多肽溶液用乙醚沉淀，得到多肽粗品，多肽的序列如SEQ ID N0 :3所 示，用HPLC方法檢測其純度和含量。檢測結(jié)果為：多肽粗品的純度為76. 5% ;收率為99. 7% ; 含量為65. 5%。
[0106] 用C18色譜柱，用常規(guī)的流動相洗脫，收集組分，凍干得到多肽精品，用HPLC方 法檢測其純度和含量，用質(zhì)譜和Edman降解分析其序列。檢測結(jié)果為：多肽精品的純度 為98. 8%，總收率為62. 5%，含量為90. 6%，質(zhì)譜的檢測結(jié)果為3963. 051 (目標(biāo)分子量為 3962. 65)。
[0107] 實(shí)施例3多肽的制備
[0108] 用Rink Amide樹脂類型的固相載體，選用Fmoc保護(hù)氨基策略合成，其操作步驟 為：
[0109] 稱取Rink Amide樹脂25g，加入到固相反應(yīng)柱，用DMF洗滌2?3次，用DMF溶脹 30分鐘。用體積比為1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脫除Fmoc保護(hù)基20分鐘，用茚三酮 方法檢測Fmoc是否脫除完全，樹脂有顏色，表明Fmoc已脫除。
[0110] 稱取Fmoc-Ile-0H10. 6g，DIEA為激活劑，活化3?5分鐘，加入反應(yīng)柱反應(yīng)1?3 小時(shí)，得到 Fmoc-Ile-Rink Amide 樹脂。
[0111] 用體積比為1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脫除Fmoc保護(hù)基20分鐘，用茚三酮 方法檢測Fmoc是否脫除完全，樹脂有顏色，表明Fmoc已脫除。
[0112] 按照上述偶聯(lián)Fmoc-Ile-ΟΗ的方法，在Fmoc-Ile-Rink Amide樹脂上依次偶聯(lián) Fmoc-N-Me-Leu-〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys (Boc) -0H、 Fmoc-Arg (Pbf)-〇H> Fmoc-Asn (Trt)-〇H> Fmoc-Lys (A1 loc)-〇H> Fmoc-His (Trt)-〇H> Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu-OAll、Fmoc-Gln(Trt)-〇H、Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-N-Me-Leu-〇H、 Fmoc-Gln (Trt) -〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-Arg (Pbf) -〇H、Fmoc_Ala-〇H、 Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-〇H、Fmoc-Glu (OtBu)-〇H、 Fmoc-Arg (Pbf)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-His (Trt)-〇H、Fmoc-D-Phe-〇H、 Fmoc-Thr (tBu) -〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp (OtBu) -〇H。
[0113] 加入15mmol的醋酸酐和20mmol的DIEA,完成N-端的乙?；?。
[0114] 脫除賴氨酸Alloc側(cè)鏈保護(hù)基和谷氨酸主鏈上的0A11保護(hù)基，具體操作為：DCM 洗3次，加入400mmol苯基硅烷，反應(yīng)5分鐘，加入2mmol Pd (PPh3) 4,反應(yīng)120分鐘，用茚三 酮方法檢測，樹脂有顏色，表明Alloc已脫除。
[0115] 分子內(nèi)醜胺鍵環(huán)化，加入 50mmol PyBOP，60mmol HOBt，lOOmmol DIEA，偶聯(lián)6 小時(shí)， 收縮，抽干，得到肽樹脂。
[0116] 將肽樹脂用TFA裂解，反應(yīng)1?5小時(shí)，將多肽從樹脂上裂解下來，同時(shí)脫除側(cè)鏈 保護(hù)基。
[0117] 對裂解下來的多肽溶液用乙醚沉淀，得到多肽粗品，多肽的序列如SEQ ID N0 :4所 示，用HPLC方法檢測其純度和含量。檢測結(jié)果為：多肽粗品的純度為72. 5% ;收率為96. 7% ; 含量為60. 3%。
[0118] 用C18色譜柱，用常規(guī)的流動相洗脫，收集組分，凍干得到多肽精品，用HPLC方 法檢測其純度和含量，用質(zhì)譜和Edman降解分析其序列。檢測結(jié)果為：多肽精品的純度 為96. 9%，總收率為61. 5%，含量為88. 4%，質(zhì)譜的檢測結(jié)果為3962. 854 (目標(biāo)分子量為 3962. 65)。
[0119] 實(shí)施例4多肽的制備
[0120] 用Rink Amide樹脂類型的固相載體，選用Fmoc保護(hù)氨基策略合成，其操作步驟 為：
[0121] 稱取Rink Amide樹脂25g，加入到固相反應(yīng)柱，用DMF洗滌2?3次，用DMF溶脹 30分鐘。用體積比為1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脫除Fmoc保護(hù)基20分鐘，用茚三酮 方法檢測Fmoc是否脫除完全，樹脂有顏色，表明Fmoc已脫除。
[0122] 稱取Fmoc-Ile-0H10. 6g，DIEA為激活劑，活化3?5分鐘，加入反應(yīng)柱反應(yīng)1?3 小時(shí)，得到 Fmoc-Ile-Rink Amide 樹脂。
[0123] 用體積比為1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脫除Fmoc保護(hù)基20分鐘，用茚三酮 方法檢測Fmoc是否脫除完全，樹脂有顏色，表明Fmoc已脫除。
[0124] 按照上述偶聯(lián)Fmoc-Ile-ΟΗ的方法，在Fmoc-Ile-Rink Amide樹脂上依次偶聯(lián) Fmoc-N-Me-Leu-〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys (Boc) -0H、 Fmoc-Arg (Pbf)-〇H> Fmoc-Asn (Trt)-〇H> Fmoc-Lys (A1 loc)-〇H> Fmoc-His (Trt)-〇H> Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-Glu-OAll、Fmoc-Gln(Trt)-〇H、Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-N-Me-Leu-〇H、 Fmoc-Gln (Trt) -〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-Arg (Pbf) -〇H、Fmoc_Ala-〇H、 Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-〇H、Fmoc-Asp (OtBu)-〇H、 Fmoc-Arg (Pbf)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His (Trt)-〇H、Fmoc-D-Phe-〇H、 Fmoc-Thr (tBu) -〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp (OtBu) -〇H。
[0125] 加入15mmol的醋酸酐和20mmol的DIEA,完成N-端的乙酰化。
[0126] 脫除賴氨酸Alloc側(cè)鏈保護(hù)基和谷氨酸主鏈上的0A11保護(hù)基，具體操作為：DCM 洗3次，加入400mmol苯基硅烷，反應(yīng)5分鐘，加入2mmol Pd (PPh3) 4,反應(yīng)120分鐘，用茚三 酮方法檢測，樹脂有顏色，表明Alloc已脫除。
[0127] 分子內(nèi)醜胺鍵環(huán)化，加入50mmol PyB0P，60mmol HOBt，lOOmmol DIEA，偶聯(lián)6小時(shí)， 收縮，抽干，得到肽樹脂。
[0128] 將肽樹脂用TFA裂解，反應(yīng)1?5小時(shí)，將多肽從樹脂上裂解下來，同時(shí)脫除側(cè)鏈 保護(hù)基。
[0129] 對裂解下來的多肽溶液用乙醚沉淀，得到多肽粗品，多肽的序列如SEQ ID N0 :5所 示，用HPLC方法檢測其純度和含量。檢測結(jié)果為：多肽粗品的純度為77. 2% ;收率為96. 7% ; 含量為59. 6%。
[0130] 用C18色譜柱，用常規(guī)的流動相洗脫，收集組分，凍干得到多肽精品，用HPLC方 法檢測其純度和含量，用質(zhì)譜和Edman降解分析其序列。檢測結(jié)果為：多肽精品的純度 為96. 8%，總收率為59. 4%，含量為88. 9%，質(zhì)譜的檢測結(jié)果為3949. 135 (目標(biāo)分子量為 3948.62)。
[0131] 實(shí)施例5多肽的制備
[0132] 用Rink Amide樹脂類型的固相載體，選用Fmoc保護(hù)氨基策略合成多肽，其操作步 驟為：
[0133] 稱取Rink Amide樹脂25g，加入到固相反應(yīng)柱，用DMF洗滌2?3次，用DMF溶脹 30分鐘。用體積比為1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脫除Fmoc保護(hù)基20分鐘，用茚三酮 方法檢測Fmoc是否脫除完全，樹脂有顏色，表明Fmoc已脫除。
[0134] 稱取Fmoc-Ile-0H10. 6g，DIEA為激活劑，活化3?5分鐘，加入反應(yīng)柱反應(yīng)1?3 小時(shí)，得到 Fmoc-Ile-Rink Amide 樹脂。
[0135] 用體積比為1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脫除Fmoc保護(hù)基20分鐘，用茚三酮 方法檢測Fmoc是否脫除完全，樹脂有顏色，表明Fmoc已脫除。
[0136] 按照上述偶聯(lián)Fmoc-Ile-ΟΗ的方法，在Fmoc-Ile-Rink Amide樹脂上依次偶聯(lián) Fmoc-N-Me-Leu-〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -OH、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys (Boc) -0H、 Fmoc-Arg (Pbf)-〇H> Fmoc-Asn (Trt)-〇H> Fmoc-Lys (A1 loc)-〇H> Fmoc-His (Trt)-〇H> Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu-OAll、Fmoc-Gln(Trt)-〇H、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-N-Me-Leu-〇H、 Fmoc-Gln (Trt) -OH、Fmoc-Glu (OtBu) -OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg (Pbf) -OH、Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-〇H、Fmoc-Asp (OtBu)-OH、 Fmoc-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His (Trt)-OH、Fmoc-D-Phe-〇H、 Fmoc-Thr (tBu) -OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp (OtBu) -OH。
[0137] 加入15mmol的醋酸酐和20mmol的DIEA，完成N-端的乙?；?br> [0138] 脫除賴氨酸Alloc側(cè)鏈保護(hù)基和谷氨酸主鏈上的0A11保護(hù)基，具體操作為：DCM 洗3次，加入400mmol苯基硅烷，反應(yīng)5分鐘，加入2mmol Pd (PPh3) 4,反應(yīng)120分鐘，用茚三 酮方法檢測，樹脂有顏色，表明Alloc已脫除。
[0139] 分子內(nèi)醜胺鍵環(huán)化，加入50mmol PyB0P，60mmol HOBt，lOOmmol DIEA，偶聯(lián)6小時(shí)， 收縮，抽干，得到肽樹脂。
[0140] 將肽樹脂用TFA裂解，反應(yīng)1?5小時(shí)，將多肽從樹脂上裂解下來，同時(shí)脫除側(cè)鏈 保護(hù)基。
[0141] 對裂解下來的多肽溶液用乙醚沉淀，得到多肽粗品，多肽的序列如SEQ ID N0 :6所 示，用HPLC方法檢測其純度和含量。檢測結(jié)果為：多肽粗品的純度為80. 3%，收率為94. 7%， 含量為68. 5%。
[0142] 用C18色譜柱，用常規(guī)的流動相洗脫，收集組分，凍干得到多肽精品，用HPLC方 法檢測其純度和含量，用質(zhì)譜和Edman降解分析其序列。檢測結(jié)果為：多肽精品的純度 為97. 8%，總收率為66. 5%，含量為93. 7%，質(zhì)譜的檢測結(jié)果為3949. 209 (目標(biāo)分子量為 3948.62)。
[0143] 實(shí)施例6多肽的制備
[0144] 用Rink Amide樹脂類型的固相載體，選用Fmoc保護(hù)氨基策略合成，其操作步驟 為：
[0145] 稱取Rink Amide樹脂25g，加入到固相反應(yīng)柱，用DMF洗滌2?3次，用DMF溶脹 30分鐘。用體積比為1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脫除Fmoc保護(hù)基20分鐘，用茚三酮 方法檢測Fmoc是否脫除完全，樹脂有顏色，表明Fmoc已脫除。
[0146] 稱取Fmoc-Ile-0H10. 6g，DIEA為激活劑，活化3?5分鐘，加入反應(yīng)柱反應(yīng)1?3 小時(shí)，得到 Fmoc-Ile-Rink Amide 樹脂。
[0147] 用體積比為1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脫除Fmoc保護(hù)基20分鐘，用茚三酮 方法檢測Fmoc是否脫除完全，樹脂有顏色，表明Fmoc已脫除。
[0148] 按照上述偶聯(lián)Fmoc-Ile-ΟΗ的方法，在Fmoc-Ile-Rink Amide樹脂上依次偶聯(lián) Fmoc-N-Me-Leu-〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys (Boc) -0H、 Fmoc-Arg (Pbf)-〇H、Fmoc-Asn (Trt)-〇H、Fmoc-Lys (Alloc)-〇H、Fmoc-His (Trt)-〇H、 Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-Glu-OAll、Fmoc-Gln (Trt)-〇H、Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-N-Me-Leu-〇H、 Fmoc-Gln (Trt) -〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg (Pbf) -〇H、Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Ile-OH、Fmoc_Glu(OtBu)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc_Glu(OtBu)-〇H、 Fmoc_Arg(Pbf)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His(Trt)-〇H、Fmoc-D-Phe-OH、 Fmoc-Thr (tBu) -OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp (OtBu) -OH。
[0149] 加入15mmol的醋酸酐和20mmol的DIEA,完成N-端的乙?；?br> [0150] 脫除賴氨酸Alloc側(cè)鏈保護(hù)基和谷氨酸主鏈上的0A11保護(hù)基，具體操作為：DCM 洗3次，加入400mmol苯基硅烷，反應(yīng)5分鐘，加入2mmol Pd (PPh3) 4,反應(yīng)120分鐘，用茚三 酮方法檢測，樹脂有顏色，表明Alloc已脫除。
[0151] 分子內(nèi)醜胺鍵環(huán)化，加入 50mmol PyBOP，60mmol HOBt，lOOmmol DIEA，偶聯(lián)6 小時(shí)， 收縮，抽干，得到肽樹脂。
[0152] 將肽樹脂用TFA裂解，反應(yīng)1?5小時(shí)，將多肽從樹脂上裂解下來，同時(shí)脫除側(cè)鏈 保護(hù)基。
[0153] 對裂解下來的多肽溶液用乙醚沉淀，得到多肽粗品，多肽的序列如SEQ ID N0 :7所 示，用HPLC方法檢測其純度和含量。檢測結(jié)果為：多肽粗品的純度為77. 5%，收率為96. 7%， 含量為64. 8%。
[0154] 用C18色譜柱，用常規(guī)的流動相洗脫，收集組分，凍干得到多肽精品，用HPLC方 法檢測其純度和含量，用質(zhì)譜和Edman降解分析其序列。檢測結(jié)果為：多肽精品的純度 為96. 9%，總收率為59. 8%，含量為86. 4%，質(zhì)譜的檢測結(jié)果為3962. 817 (目標(biāo)分子量為 3962. 65)。
[0155] 實(shí)施例7多肽的制備
[0156] 用Rink Amide樹脂類型的固相載體，選用Fmoc保護(hù)氨基策略合成多肽，其操作步 驟為：
[0157] 稱取Rink Amide樹脂25g，加入到固相反應(yīng)柱，用DMF洗滌2?3次，用DMF溶脹 30分鐘。用體積比為1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脫除Fmoc保護(hù)基20分鐘，用茚三酮 方法檢測Fmoc是否脫除完全，樹脂有顏色，表明Fmoc已脫除。
[0158] 稱取Fmoc-Ile-0H10. 6g，DIEA為激活劑，活化3?5分鐘，加入反應(yīng)柱反應(yīng)1?3 小時(shí)，得到 Fmoc-Ile-Rink Amide 樹脂。
[0159] 用體積比為1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脫除Fmoc保護(hù)基20分鐘，用茚三酮 方法檢測Fmoc是否脫除完全，樹脂有顏色，表明Fmoc已脫除。
[0160] 按照上述偶聯(lián)Fmoc-Ile-ΟΗ的方法，在Fmoc-Ile-Rink Amide樹脂上依次偶聯(lián) Fmoc-N-Me-Leu-〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys (Boc) -0H、 Fmoc-Arg (Pbf)-〇H> Fmoc-Asn (Trt)-〇H> Fmoc-Lys (A1 loc)-〇H> Fmoc-His (Trt)-〇H> Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-Glu-OAll、Fmoc-Gln(Trt)-〇H、Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-N-Me-Leu-〇H、 Fmoc-Gln (Trt) -〇H、Fmoc-Asp (OtBu) -〇H、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg (Pbf) -〇H、Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-〇H、Fmoc-Glu (OtBu)-〇H， Fmoc-Arg (Pbf)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His (Trt)-〇H、Fmoc-D-Phe-〇H、 Fmoc-Thr (tBu) -〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp (OtBu) -〇H。
[0161] 加入15mmol的醋酸酐和20mmol的DIEA,完成N-端的乙?；?。
[0162] 脫除賴氨酸Alloc側(cè)鏈保護(hù)基和谷氨酸主鏈上的0A11保護(hù)基，具體操作為：DCM 洗3次，加入400mmol苯基硅烷，反應(yīng)5分鐘，加入2mmol Pd (PPh3) 4,反應(yīng)120分鐘，用茚三 酮方法檢測，樹脂有顏色，表明Alloc已脫除。
[0163] 分子內(nèi)酰胺鍵環(huán)化，加入50mmol PyB0P，60mmol H0Bt，100mmol DIEA，偶聯(lián)6小時(shí)， 收縮，抽干，得到肽樹脂。
[0164] 將肽樹脂用TFA裂解，反應(yīng)1?5小時(shí)，將多肽從樹脂上裂解下來，同時(shí)脫除側(cè)鏈 保護(hù)基。
[0165] 對裂解下來的多肽溶液用乙醚沉淀，得到多肽粗品，多肽的序列如SEQ ID N0 :8所 示，用HPLC方法檢測其純度和含量。檢測結(jié)果為：多肽粗品的純度為68. 8%，收率為99. 2%， 含量為56. 5%。
[0166] 用C18色譜柱，用常規(guī)的流動相洗脫，收集組分，凍干得到多肽精品，用HPLC方 法檢測其純度和含量，用質(zhì)譜和Edman降解分析其序列。檢測結(jié)果為：多肽精品的純度 為97. 2%，總收率為58. 1%，含量為91. 8%，質(zhì)譜的檢測結(jié)果為3948. 906 (目標(biāo)分子量為 3948.62)。
[0167] 實(shí)施例8多肽的制備
[0168] 用Rink Amide樹脂類型的固相載體，選用Fmoc保護(hù)氨基策略合成，其操作步驟 為：
[0169] 稱取Rink Amide樹脂25g，加入到固相反應(yīng)柱，用DMF洗滌2?3次，用DMF溶脹 30分鐘。用體積比為1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脫除Fmoc保護(hù)基20分鐘，用茚三酮 方法檢測Fmoc是否脫除完全，樹脂有顏色，表明Fmoc已脫除。
[0170] 稱取Fmoc-Ile-0H10. 6g，DIEA為激活劑，活化3?5分鐘，加入反應(yīng)柱反應(yīng)1?3 小時(shí)，得到 Fmoc-Ile-Rink Amide 樹脂。
[0171] 用體積比為1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脫除Fmoc保護(hù)基20分鐘，用茚三酮 方法檢測Fmoc是否脫除完全，樹脂有顏色，表明Fmoc已脫除。
[0172] 按照上述偶聯(lián)Fmoc-Ile-ΟΗ的方法，在Fmoc-Ile-Rink Amide樹脂上依次偶聯(lián) Fmoc-N-Me-Leu-〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys (Boc) -0H、 Fmoc-Arg (Pbf)-〇H> Fmoc-Asn (Trt)-〇H> Fmoc-Lys (A1 loc)-〇H> Fmoc-His (Trt)-〇H> Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp-〇A11、Fmoc-Gln(Trt)-〇H、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-N-Me-Leu-〇H、 Fmoc-Gln (Trt) -〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-Arg (Pbf) -〇H、Fmoc_Ala-〇H、 Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-〇H、Fmoc_Leu-〇H、Fmoc-Val-〇H、Fmoc-Glu (OtBu)-〇H、 Fmoc-Arg (Pbf)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His (Trt)-〇H、Fmoc-D-Phe-〇H、 Fmoc-Thr (tBu) -〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp (OtBu) -〇H。
[0173] 加入15mmol的醋酸酐和20mmol的DIEA，完成N-端的乙?；?br> [0174] 脫除賴氨酸Alloc側(cè)鏈保護(hù)基和谷氨酸主鏈上的0A11保護(hù)基，具體操作為：DCM 洗3次，加入400mmol苯基硅烷，反應(yīng)5分鐘，加入2mmol Pd (PPh3) 4,反應(yīng)120分鐘，用茚三 酮方法檢測，樹脂有顏色，表明Alloc已脫除。
[0175] 分子內(nèi)醜胺鍵環(huán)化，加入50mmol PyB0P，60mmol HOBt，lOOmmol DIEA，偶聯(lián)6小時(shí)， 收縮，抽干，得到肽樹脂。
[0176] 將肽樹脂用TFA裂解，反應(yīng)1?5小時(shí)，將多肽從樹脂上裂解下來，同時(shí)脫除側(cè)鏈 保護(hù)基。
[0177] 對裂解下來的多肽溶液用乙醚沉淀，得到多肽粗品，多肽的序列如SEQ ID N0 :9所 示，用HPLC方法檢測其純度和含量。檢測結(jié)果為：多肽粗品的純度為71. 8%，收率為96. 3%， 含量為64. 3%。
[0178] 用C18色譜柱，用常規(guī)的流動相洗脫，收集組分，凍干得到多肽精品，用HPLC方 法檢測其純度和含量，用質(zhì)譜和Edman降解分析其序列。檢測結(jié)果為：多肽精品的純度 為96. 9%，總收率為64. 1%，含量為89. 7%，質(zhì)譜的檢測結(jié)果為3949. 005 (目標(biāo)分子量為 3948.62) 。
[0179] 實(shí)施例9多肽的制備
[0180] 用Rink Amide樹脂類型的固相載體，選用Fmoc保護(hù)氨基策略合成，其操作步驟 為：
[0181] 稱取Rink Amide樹脂25g，加入到固相反應(yīng)柱，用DMF洗滌2?3次，用DMF溶脹 30分鐘。用體積比為1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脫除Fmoc保護(hù)基20分鐘，用茚三酮 方法檢測Fmoc是否脫除完全，樹脂有顏色，表明Fmoc已脫除。
[0182] 稱取Fmoc-Ile-0H10. 6g，DIEA為激活劑，活化3?5分鐘，加入反應(yīng)柱反應(yīng)1?3 小時(shí)，得到 Fmoc-Ile-Rink Amide 樹脂。
[0183] 用體積比為1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脫除Fmoc保護(hù)基20分鐘，用茚三酮 方法檢測Fmoc是否脫除完全，樹脂有顏色，表明Fmoc已脫除。
[0184] 按照上述偶聯(lián)Fmoc-Ile-ΟΗ的方法，在Fmoc-Ile-Rink Amide樹脂上依次偶聯(lián) Fmoc-N-Me-Leu-〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys (Boc) -0H、 Fmoc-Arg (Pbf)-〇H> Fmoc-Asn (Trt)-〇H> Fmoc-〇rn (Alloc)-〇H> Fmoc-His (Trt)-〇H> Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu-OAll、Fmoc-Gln(Trt)-〇H、Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-N-Me-Leu-〇H、 Fmoc-Gln (Trt) -〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg (Pbf) -〇H、Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-〇H、Fmoc-Glu (OtBu)-〇H， Fmoc-Arg (Pbf)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His (Trt)-〇H、Fmoc-D-Phe-〇H、 Fmoc-Thr (tBu) -〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp (OtBu) -〇H。
[0185] 加入15mmol的醋酸酐和20mmol的DIEA,完成N-端的乙酰化。
[0186] 脫除賴氨酸Alloc側(cè)鏈保護(hù)基和谷氨酸主鏈上的0A11保護(hù)基，具體操作為：DCM 洗3次，加入400mmol苯基硅烷，反應(yīng)5分鐘，加入2mmol Pd (PPh3) 4,反應(yīng)120分鐘，用茚三 酮方法檢測，樹脂有顏色，表明Alloc已脫除。
[0187] 分子內(nèi)醜胺鍵環(huán)化，加入50mmol PyB0P，60mmol HOBt，lOOmmol DIEA，偶聯(lián)6小時(shí)， 收縮，抽干，得到肽樹脂。
[0188] 將肽樹脂用TFA裂解，反應(yīng)1?5小時(shí)，將多肽從樹脂上裂解下來，同時(shí)脫除側(cè)鏈 保護(hù)基。
[0189] 對裂解下來的多肽溶液用乙醚沉淀，得到多肽粗品，多肽的序列如SEQ ID N0 : 10所示，用HPLC方法檢測其純度和含量。檢測結(jié)果為：多肽粗品的純度為72. 3%，收率為 97. 3%，含量為 65. 7%。
[0190] 用C18色譜柱，用常規(guī)的流動相洗脫，收集組分，凍干得到多肽精品，用HPLC方 法檢測其純度和含量，用質(zhì)譜和Edman降解分析其序列。檢測結(jié)果為：多肽精品的純度 為98. 9%，總收率為67. 4%，含量為92. 1%，質(zhì)譜的檢測結(jié)果為3949. 364 (目標(biāo)分子量為 3948.62) 。
[0191] 實(shí)施例10多肽的制備
[0192] 用Rink Amide樹脂類型的固相載體，選用Fmoc保護(hù)氨基策略合成，其操作步驟 為：
[0193] 稱取Rink Amide樹脂25g，加入到固相反應(yīng)柱，用DMF洗滌2?3次，用DMF溶脹 30分鐘。用體積比為1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脫除Fmoc保護(hù)基20分鐘，用茚三酮 方法檢測Fmoc是否脫除完全，樹脂有顏色，表明Fmoc已脫除。
[0194] 稱取Fmoc-Ile-0H10. 6g，DIEA為激活劑，活化3?5分鐘，加入反應(yīng)柱反應(yīng)1?3 小時(shí)，得到 Fmoc-Ile-Rink Amide 樹脂。
[0195] 用體積比為1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脫除Fmoc保護(hù)基20分鐘，用茚三酮 方法檢測Fmoc是否脫除完全，樹脂有顏色，表明Fmoc已脫除。
[0196] 按照上述偶聯(lián)Fmoc-Ile-ΟΗ的方法，在Fmoc-Ile-Rink Amide樹脂上依次偶聯(lián) Fmoc-N-Me-Leu-〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys (Boc) -0H、 Fmoc-Arg (Pbf)-〇H> Fmoc-Gln (Trt)-〇H> Fmoc-Lys (A1 loc)-〇H> Fmoc-His (Trt)-〇H> Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-Glu-OAll、Fmoc-Gln(Trt)-〇H、Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-N-Me-Leu-〇H、 Fmoc-Gln (Trt) -〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-Arg (Pbf) -〇H、Fmoc_Ala-〇H、 Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-〇H、Fmoc-Glu (OtBu)-〇H、 Fmoc-Arg (Pbf)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His (Trt)-〇H、Fmoc-D-Phe-〇H、 Fmoc-Thr (tBu) -〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp (OtBu) -〇H。
[0197] 加入15mmol的醋酸酐和20mmol的DIEA，完成N-端的乙?；?。
[0198] 脫除賴氨酸Alloc側(cè)鏈保護(hù)基和谷氨酸主鏈上的0A11保護(hù)基，具體操作為：DCM 洗3次，加入400mmol苯基硅烷，反應(yīng)5分鐘，加入2mmol Pd (PPh3) 4,反應(yīng)120分鐘，用茚三 酮方法檢測，樹脂有顏色，表明Alloc已脫除。
[0199] 分子內(nèi)醜胺鍵環(huán)化，加入50mmol PyB0P，60mmol HOBt，lOOmmol DIEA，偶聯(lián)6小時(shí)， 收縮，抽干，得到肽樹脂。
[0200] 將肽樹脂用TFA裂解，反應(yīng)1?5小時(shí)，將多肽從樹脂上裂解下來，同時(shí)脫除側(cè)鏈 保護(hù)基。
[0201] 對裂解下來的多肽溶液用乙醚沉淀，得到多肽粗品，多肽的序列如SEQ ID N0 : 11所示，用HPLC方法檢測其純度和含量。檢測結(jié)果為：多肽粗品的純度為79. 1%，收率為 96. 7%，含量為 59. 5%。
[0202] 用C18色譜柱，用常規(guī)的流動相洗脫，收集組分，凍干得到多肽精品，用HPLC方 法檢測其純度和含量，用質(zhì)譜和Edman降解分析其序列。檢測結(jié)果為：多肽精品的純度 為97. 8%，總收率為59. 5%，含量為89. 2%，質(zhì)譜的檢測結(jié)果為3976. 950 (目標(biāo)分子量為 3976.68)。
[0203] 實(shí)施例11多肽的制備
[0204] 用Rink Amide樹脂類型的固相載體，選用Fmoc保護(hù)氨基策略合成，其操作步驟 為：
[0205] 稱取Rink Amide樹脂25g，加入到固相反應(yīng)柱，用DMF洗滌2?3次，用DMF溶脹 30分鐘。用體積比為1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脫除Fmoc保護(hù)基20分鐘，用茚三酮 方法檢測Fmoc是否脫除完全，樹脂有顏色，表明Fmoc已脫除。
[0206] 稱取Fmoc-Ile-0H10. 6g，DIEA為激活劑，活化3?5分鐘，加入反應(yīng)柱反應(yīng)1?3 小時(shí)，得到 Fmoc-Ile-Rink Amide 樹脂。
[0207] 用體積比為1 :4的哌啶和DMF混合液100mL，脫除Fmoc保護(hù)基20分鐘，用茚三酮 方法檢測Fmoc是否脫除完全，樹脂有顏色，表明Fmoc已脫除。
[0208] 按照上述偶聯(lián)Fmoc-Ile-ΟΗ的方法，在Fmoc-Ile-Rink Amide樹脂上依次偶聯(lián) Fmoc-N-Me-Leu-〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys (Boc) -0H、 Fmoc-Arg (Pbf)-〇H> Fmoc-Asn (Trt)-〇H> Fmoc-Lys (A1 loc)-〇H> Fmoc-His (Trt)-〇H> Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu-OAll、Fmoc-Gln(Trt)-〇H、Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-N-Me-Leu-〇H、 Fmoc-Gln (Trt) -〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-Arg (Pbf) -〇H、Fmoc_Ala-〇H、 Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-〇H、Fmoc-Glu (OtBu)-〇H、 Fmoc-Arg (Pbf)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His (Trt)-〇H、Fmoc-D-Phe-〇H、 Fmoc-Thr (tBu) -〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp (OtBu) -〇H。
[0209] 加入15mmol的醋酸酐和20mmol的DIEA，完成N-端的乙?；?。
[0210] 脫除賴氨酸Alloc側(cè)鏈保護(hù)基和谷氨酸主鏈上的0A11保護(hù)基，具體操作為：DCM 洗3次，加入400mmol苯基硅燒，反應(yīng)5分鐘，加入2mmol Pd (PPh3) 4,反應(yīng)120分鐘，用茚三 酮方法檢測，樹脂有顏色，表明Alloc已脫除。
[0211] 分子內(nèi)醜胺鍵環(huán)化，加入50mmol PyB0P，60mmol HOBt，lOOmmol DIEA，偶聯(lián)6小時(shí)， 收縮，抽干，得到肽樹脂。
[0212] 將肽樹脂用TFA裂解，反應(yīng)1?5小時(shí)，將多肽從樹脂上裂解下來，同時(shí)脫除側(cè)鏈 保護(hù)基。
[0213] 對裂解下來的多肽溶液用乙醚沉淀，得到多肽粗品，多肽的序列如SEQ ID N0 : 12所示，用HPLC方法檢測其純度和含量。檢測結(jié)果為：多肽粗品的純度為73. 7%，收率為 98. 2%，含量為 64. 1%。
[0214] 用C18色譜柱，用常規(guī)的流動相洗脫，收集組分，凍干得到多肽精品，用HPLC方 法檢測其純度和含量，用質(zhì)譜和Edman降解分析其序列。檢測結(jié)果為：多肽精品的純度 為96. 9%，總收率為63. 8%，含量為88. 2%，質(zhì)譜的檢測結(jié)果為3963. 333 (目標(biāo)分子量為 3962. 65)。
[0215] 實(shí)施例12多肽在體外對細(xì)胞內(nèi)cAMP活性的影響
[0216] 將PC-12細(xì)胞（腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞）培養(yǎng)48小時(shí)，棄去培養(yǎng)液，并用緩沖液清 洗2?3次，加入lmL含有1%牛血清蛋白的緩沖液，將Astressin B和實(shí)施例1提供的多 肽分別與濃度為100 μ Μ的IBMX共同孵育半小時(shí)，棄去培養(yǎng)基，加入鹽酸終止酶對cAMP的 降解。收集細(xì)胞，超聲裂解細(xì)胞，按BCA檢測法測定細(xì)胞蛋白含量。按cAMP酶聯(lián)免疫試劑 盒說明進(jìn)行操作，設(shè)立不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品組以建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，反應(yīng)完成后在酶標(biāo)儀于450nm 波長下測定光吸收值，用該光吸收值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出對應(yīng)的cAMP濃度，最后計(jì)算樣品中 cAMP濃度，結(jié)果如圖4所示。
[0217] 由上述試驗(yàn)結(jié)果可知，Astressin B呈劑量依賴式地增加 PC-12細(xì)胞內(nèi)cAMP含量， 增加 cAMP 最大值（Emax)為 161·2±7·2ρπι〇1/10〇μ8 (蛋白），EC5。值為 1·7Χ10_9Μ;實(shí)施例 1 提供的多肽在體外對PC-12細(xì)胞內(nèi)cAMP的影響與Astressin Β非常相似，其增加 cAMP最 大值（Emax)為152.4±7.8ρπι〇1/10〇μ8 (蛋白），EC5Q值為2. 1X10_9M，結(jié)果表明實(shí)施例1提 供的多肽保留了 Astressin B的生物學(xué)活性。
[0218] 取實(shí)施例2?11制得的多肽進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)cAMP活性研究，結(jié)果顯示，實(shí)施例2?11 制得的多肽同樣可增加 PC-12細(xì)胞內(nèi)cAMP含量，且呈劑量依賴性，表明實(shí)施例2?11制得 的多肽也保留了 Astressin B的生物學(xué)活性。
[0219] 實(shí)施例13多肽的代謝穩(wěn)定性研究
[0220] 取Astressin B和實(shí)施例1制得的多肽，分別溶解在辛醇/水（1:1, v/v)的混合 溶劑中（0. 5mg/ml)，然后加入到25%大鼠血清溶液中，在37°C條件下培養(yǎng)，每隔30min取樣 進(jìn)行HPLC分析，測定Astressin B和實(shí)施例1制得的多肽完全降解的時(shí)間。
[0221] 結(jié)果顯不，Astressin B在2. 5h后已經(jīng)完全降解，而實(shí)施例1制得的多肽在3. 5h 后才完全降解。該結(jié)果表明，實(shí)施例1制得的多肽的半衰期要比Astressin B時(shí)間更長，其 代謝穩(wěn)定性更高。
[0222] 取實(shí)施例2?11制得的多肽進(jìn)行代謝穩(wěn)定性研究，結(jié)果顯示，實(shí)施例2?11制得 的多肽的半衰期均比Astressin B時(shí)間長，表明其代謝穩(wěn)定性高。
[0223] 實(shí)施例14多肽預(yù)防脫發(fā)的效果研究
[0224] 試驗(yàn)動物為雌性昆明小鼠(體重30?38g)，實(shí)驗(yàn)前小鼠不禁食禁水，隨機(jī)分為3 組，每組6只。然后分在第0、1、2、4、6、8、10、12周，單次通過腹腔注射等體積的生理鹽水 (10mL/kg)、Astressin B (5mg/kg)和實(shí)施例 1 制得的多肽（5mg/kg)。注射后，每 30min 對 鼠群進(jìn)行一次強(qiáng)光照射使得鼠群經(jīng)常處于驚嚇狀態(tài)下生活。然后每周觀察小鼠背部毛發(fā)的 變化。
[0225] 實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，在較高的壓力狀態(tài)(驚嚇狀態(tài)）下，對照組中單純注射生理鹽水 的小鼠群在2周后就開始發(fā)生脫發(fā)現(xiàn)象，4周后每只小鼠的平均脫發(fā)面積約占整個(gè)背部面 積的20%左右，而注射Astressin B和實(shí)施例1制得的多肽的小鼠在4周內(nèi)并沒有明顯的 脫發(fā)現(xiàn)象發(fā)生。12周后，僅注射生理鹽水的小鼠對照組幾乎整個(gè)背部毛發(fā)全部脫光，而注射 Astressin B和實(shí)施例1制得的多肽的試驗(yàn)組脫發(fā)面積均只占整個(gè)背部面積的20%左右。 上述試驗(yàn)結(jié)果表明，Astressin B和實(shí)施例1制得的多肽均有一定的預(yù)防脫發(fā)效果，實(shí)施例 1制得的多肽和Astressin B的預(yù)防脫發(fā)效果基本一樣。
[0226] 取實(shí)施例2?11制得的多肽進(jìn)行預(yù)防脫發(fā)效果研究，結(jié)果顯示，實(shí)施例2?11制 得的多肽均有一定的預(yù)防脫發(fā)效果，且與Astressin B的預(yù)防脫發(fā)效果基本一樣。
[0227] 實(shí)施例15多肽治療脫發(fā)的效果研究
[0228] 取4?8周大小的雌性昆明小鼠（體重25?32g)，實(shí)驗(yàn)前通過光照、噪音等外界 壓力刺激得到小鼠的毛發(fā)基本脫光。然后實(shí)驗(yàn)前小鼠不禁食禁水，隨機(jī)分為3組，每組6 只。然后分在第〇、1、2、4、6、8、10、12周，單次通過腹腔注射等體積的生理鹽水（10mL/kg)、 Astressin B (5mg/kg)和實(shí)施例1制得的多肽（5mg/kg)。注射后，保持小鼠在正常環(huán)境小 生活，每天定期供食供水。然后每周觀察小鼠背部毛發(fā)的變化。
[0229] 實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，1周后，注射有實(shí)施例1制得的多肽的小鼠均有少量毛發(fā)長出， 其余兩個(gè)對照組均無明顯變化；2周后，注射實(shí)施例1制得的多肽的小鼠背部已經(jīng)約長出2% 左右的毛發(fā)，而注射有Astressin B的小鼠也有少量毛發(fā)長出，單純注射生理鹽水的小鼠背 后無任何毛發(fā)長出；8周后，單純開始注射生理鹽水的小鼠有5%左右的毛發(fā)長出，而注射實(shí) 施例1制得的多肽的小鼠毛發(fā)的生長率約占整個(gè)背部面積的60%，注射Astressin B的小 鼠的毛發(fā)生長率約占整個(gè)背部面積的50% ;12周后，單純注射生理鹽水的小鼠毛發(fā)的生長 率仍舊維持在5%左右，而注射Astressin B的小鼠毛發(fā)的生長率為70%左右，注射實(shí)施例 1制得的多肽的小鼠毛發(fā)的生長率為75%左右。結(jié)果表明，Astressin B和實(shí)施例1制得的 多肽均有一定的治療脫發(fā)效果，同時(shí)實(shí)施例1制得的多肽治療脫發(fā)的效果比Astressin B 的治療脫發(fā)的效果略好一些。
[0230] 取實(shí)施例2?11制得的多肽進(jìn)行治療脫發(fā)效果研究，結(jié)果顯示，實(shí)施例2?11制 得的多肽均有一定的治療脫發(fā)效果，與Astressin B的預(yù)防脫發(fā)效果相比，效果基本一致或 略好一些。
[0231] 實(shí)施例16粉針劑的制備
[0232] 取實(shí)施例1制備的多肽與常規(guī)輔料混合，按照常規(guī)方法制備獲得粉針劑。
[0233] 實(shí)施例17注射液的制備
[0234] 取實(shí)施例2制備的多肽與常規(guī)輔料混合，按照常規(guī)方法制備獲得注射液。
[0235] 實(shí)施例18微球的制備
[0236] 取實(shí)施例3制備的多肽與常規(guī)輔料混合，按照常規(guī)方法制備獲得微球。
[0237] 實(shí)施例19微囊的制備
[0238] 取實(shí)施例4制備的多肽與常規(guī)輔料混合，按照常規(guī)方法制備獲得微囊。
[0239] 實(shí)施例20脂質(zhì)體的制備
[0240] 取實(shí)施例5制備的多肽與常規(guī)輔料混合，按照常規(guī)方法制備獲得脂質(zhì)體。
[0241] 實(shí)施例21微乳的制備
[0242] 取實(shí)施例6制備的多肽與常規(guī)輔料混合，按照常規(guī)方法制備獲得微乳。
[0243] 實(shí)施例22片劑的制備
[0244] 取實(shí)施例7制備的多肽與常規(guī)輔料混合，按照常規(guī)方法制備獲得片劑。
[0245] 實(shí)施例23丸劑的制備
[0246] 取實(shí)施例8制備的多肽與常規(guī)輔料混合，按照常規(guī)方法制備獲得丸劑。
[0247] 實(shí)施例24膠囊劑的制備
[0248] 取實(shí)施例9制備的多肽與常規(guī)輔料混合，按照常規(guī)方法制備獲得膠囊劑。
[0249] 實(shí)施例25顆粒劑的制備
[0250] 取實(shí)施例10制備的多肽與常規(guī)輔料混合，按照常規(guī)方法制備獲得顆粒劑。
[0251] 實(shí)施例26散劑的制備
[0252] 取實(shí)施例11制備的多肽與常規(guī)輔料混合，按照常規(guī)方法制備獲得散劑。
[0253] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種多肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示，具體為： Asp-Leu-Thr-X^His^-Leu-Arg-Xg-Val-Leu-X^Xg-Ala-Arg-Ala-Xg-Gln-Xy-Ala-Gln _X8_Ala_His_X 9_X10_Arg_Lys _Leu_Xn_Glu_X 7_Ile ; 其中，X7 為 N-Me-Leu ; X8 為 Y -Glu 或 β -Asp ; Xi 為 D-Phe 或 Phe ; X2 為 lie 或 Leu ; X3 為 Asp 或 Glu ; X4 為 Asp 或 Glu ; X5 為 lie 或 Nle ; X6 為 Asp 或 Glu ; X9 為 Orn 或 Lys ; X10 為 Gin 或 Asn ; Xn 為 lie 或 Nle ; 所述多肽的N端經(jīng)乙酰化修飾； 從N端起，所述多肽中第22位的X8主鏈與第25位的X9側(cè)鏈進(jìn)行酰胺鍵環(huán)化。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列中&為Y-Glu， Xi 為 D-Phe，X2 為 Leu，X3 為 Glu，X4 為 Glu，X5 為 Nle，X6 為 Glu，X9 為 Lys，X1Q 為 Asn，Xn 為 Nle，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列中&為Y-Gli^Xi 為 Phe，X2 為 Leu，X3 為 Glu，X4 為 Glu，X5 為 Nle，X6 為 Glu，X9 為 Lys，X1Q 為 Asn，Xn 為 Nle， 其氨基酸序列如SEQ ID NO :3所不。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列中&為Y-Glu， Xi 為 D-Phe，X2 為 lie，X3 為 Glu，X4 為 Glu，X5 為 Nle，X6 為 Glu，X9 為 Lys，X1Q 為 Asn，Xn 為 Nle，其氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列中&為Y-Glu， Xi 為 D-Phe，X2 為 Leu，X3 為 Asp，X4 為 Glu，X5 為 Nle，X6 為 Glu，X9 為 Lys，X1Q 為 Asn，Xn 為 Nle，其氨基酸序列如SEQ ID NO :5所示。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列中&為Y-Glu， Xi 為 D-Phe，X2 為 Leu，X3 為 Glu，X4 為 Asp，X5 為 Nle，X6 為 Glu，X9 為 Lys，X1Q 為 Asn，Xn 為 Nle，其氨基酸序列如SEQ ID NO :6所示。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列中&為Y-Glu， Xi 為 D-Phe，X2 為 Leu，X3 為 Glu，X4 為 Glu，X5 為 lie，X6 為 Glu，X9 為 Lys，X1Q 為 Asn，Xn 為 Nle，其氨基酸序列如SEQ ID NO :7所示。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列中&為Y-Glu， Xi 為 D-Phe，X2 為 Leu，X3 為 Glu，X4 為 Glu，X5 為 Nle，X6 為 Asp，X9 為 Lys，X1Q 為 Asn，Xn 為 Nle，其氨基酸序列如SEQ ID NO :8所示。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列中&為β-Asp， Xi 為 D-Phe，X2 為 Leu，X3 為 Glu，X4 為 Glu，X5 為 Nle，X6 為 Glu，X9 為 Lys，X1Q 為 Asn，Xn 為 Nle，其氨基酸序列如SEQ ID NO :9所示。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列中&為Y-Glu， Xi 為 D-Phe，X2 為 Leu，X3 為 Glu，X4 為 Glu，X5 為 Nle，X6 為 Glu，X9 為 Orn，X1Q 為 Asn，Xn 為 Nle，其氨基酸序列如SEQ ID NO :10所示。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列中&為Y-Glu， Xi 為 D-Phe，X2 為 Leu，X3 為 Glu，X4 為 Glu，X5 為 Nle，X6 為 Glu，X9 為 Lys，X1Q 為 Gln，Xn 為 Nle，其氨基酸序列如SEQ ID NO :11所示。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列中&為Y-Glu， Xi 為 D-Phe，X2 為 Leu，X3 為 Glu，X4 為 Glu，X5 為 Nle，X6 為 Glu，X9 為 Lys，X1Q 為 Asn，Xn 為 Ile，其氨基酸序列如SEQ ID NO :12所示。
13. -種如權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的多肽的制備方法，其特征在于，包括如下步 驟： 步驟A :取lie與樹脂偶聯(lián)，得到lie-樹脂； 步驟B :取所述lie-樹脂經(jīng)逐步偶聯(lián)，得到多肽片段-樹脂； 步驟C :所述多肽片段-樹脂的N端經(jīng)乙酰化修飾； 步驟D :脫除從N端起第22位和第25位氨基酸殘基的保護(hù)基，經(jīng)環(huán)化、裂解、純化、凍 干，即得； 從N端起，所述多肽第22位氨基酸原料采用Fmoc-Asp-OAll或Fmoc-Glu-OAll ; 所述多肽片段-樹脂中的多肽的序列如SEQ ID NO :1所示。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的制備方法，其特征在于，步驟C中所述乙酰化修飾采用的試 劑為醋酸酐和DIEA的混合物。
15. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的制備方法，其特征在于，步驟D中所述脫除采用的試劑為苯 基硅烷和Pd (PPh3) 4的混合物。
16. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的制備方法，其特征在于，步驟D中所述環(huán)化采用的試劑為 PyBOP、HOBt和DIEA的混合物。
17. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的制備方法，其特征在于，步驟D中所述裂解采用的試劑為 TFA。
18. 如權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的多肽在制備防治脫發(fā)藥物中的應(yīng)用。
19. 一種藥物制劑，其特征在于，由權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的多肽和藥學(xué)上可接 受的輔料組成。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的藥物制劑，其特征在于，所述藥物制劑的劑型為粉針劑、注 射液、微球、微囊、脂質(zhì)體、微乳、片劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑或散劑。
【文檔編號】C07K1/04GK104231059SQ201310243117
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月19日
【發(fā)明者】戴政清, 劉劍, 馬亞平, 袁建成 申請人:深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司