一種能夠抗氧化的縊蟶多肽的制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種縊蟶酶解多肽的制備方法，其特征在于步驟為：將縊蟶去殼、洗凈絞碎，按料液質(zhì)量比1∶1～4加水勻漿，調(diào)節(jié)pH值至7～8；加入蛋白酶進(jìn)行酶解，蛋白酶的加入量為縊蟶質(zhì)量的0.2％～0.3％，酶解溫度為60～70℃，酶解時間2～6小時；酶解后滅酶處理，再離心取上清液即為酶解液；將酶解液經(jīng)超濾、G-25凝膠色譜柱層析、反相高效液相色譜洗脫得到所需的縊蟶酶解多肽。本發(fā)明制備工藝簡單，制得的縊蟶酶解多肽敏感性高、穩(wěn)定性好及副作用少，縊蟶酶解多肽對羥自由基清除率、DPPH自由清除率及氧化還原力較高，可用于體外抗氧化，本發(fā)明制備工藝簡單，制得的縊蟶酶解多肽敏感性高、穩(wěn)定性好及副作用少，在體外有顯著的抗氧化作用，對于進(jìn)一步研究與開發(fā)以縊蟶酶解多肽為基礎(chǔ)的功能性食品和藥物，提高縊蟶的經(jīng)濟(jì)價值具有重大意義。
【專利說明】一種能夠抗氧化的縊蟶多肽的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于海洋功能食品類，具體是一種能抗氧化的海洋功能食品及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]海洋貝類資源豐富且富含許多生理活性物質(zhì)，因而逐漸被廣泛研究和應(yīng)用?？O蟶(Sinonovacula constricta)俗名経子，屬瓣觸綱、異齒亞綱、簾蛤目、燈塔蛤科、纟益経屬，在我國沿海均有分布，產(chǎn)量較大，為我國四大養(yǎng)殖貝類之一[安賢惠，李聯(lián)泰?？O蟶研究現(xiàn)狀及發(fā)展前景[J].科學(xué)養(yǎng)魚，2005 (I):4-6.]，縊蟶肉味鮮美，營養(yǎng)豐富，富含人體生命活動所需的各種必需氨基酸、不飽和脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)[李太武，林葉，蘇秀榕，不同群體縊蟶營養(yǎng)成分的多元性分析[J]，食品科學(xué)，2008，29 (11) =548-551 ；Remacha, Trivino A，Anadon.Reproductive cycle of the razor clam Solen marginat us(Pulteney 1799)inSpain:acomparative study in three different locations[J], Journal of shellfishresearch, 2006, 25 (3):869-876 ;安賢惠，幾種纟益経的營養(yǎng)性和健康性分析評價[J]，海洋湖沼通報,2005(4):99-103 ;李太武，林葉，蘇秀榕，不同群體縊蟶營養(yǎng)成分的多元性分析[J]，食品科學(xué)，2008,29(11):548-551 ;林葉，蘇秀榕，孫蓓等，不同種群縊蟶氨基酸及脂肪酸比較研究[J]，食品科學(xué)，2006，27 (12):675-678]。
[0003]縊蟶性寒、可補(bǔ)陰去邪熱，治煩悶、冷痢、熱痢、婦人產(chǎn)后虛損、虛熱等癥，具有較高的藥用食用價值[蔣忠妙，鄭國平，陳木森.舟山群島海洋藥用動物資源及民間應(yīng)用的調(diào)查[J].中國海洋藥物，200 2，85 (I):35.;蘇晶，蘇明翥編著，水產(chǎn)品藥用巧治百病[M].沈陽:遼寧科學(xué)技術(shù)出版社，2000，187.];縊蟶的活性成分還具有較高的研究價值，如雷曉凌等[雷曉凌，吳紅棉，范秀萍等，縊蟶糖胺聚糖的提取分離及其體外抗腫瘤活性的初步研究[J]，藥物生物技術(shù)，2004，11(3) =146-149]，對縊蟶肉的酶解條件進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)提取得到的糖胺聚糖對體外培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞均有一定抑制作用，且隨著用量增加抑制作用增強(qiáng)。
[0004]活性多肽由于具有敏感性高、穩(wěn)定性好及副作用少等優(yōu)點(diǎn)，已被用作抗氧化藥物開發(fā)的一個重要來源。研究已經(jīng)證實(shí)，食物蛋白通過蛋白酶酶解方式，可以得到功能多樣的活性多肽[鄭惠娜，章超樺，曹文紅.海洋蛋白酶解制備生物活性肽的研究進(jìn)展[J].水產(chǎn)科學(xué)，2008，27 (7):370.]。對于縊蟶，在抗氧化方面的研究還很少，特別是利用酶解技術(shù)提取多肽在抗氧化方面的研究并未見報道。
[0005]本研究通過正交實(shí)驗確定胰蛋白酶水解縊蟶的最佳酶解條件，并研究酶解多肽的體外抗氧化活性，為該領(lǐng)域的進(jìn)一步研究提供科學(xué)依據(jù)，并且對于進(jìn)一步研究與開發(fā)以縊蟶酶解多肽為基礎(chǔ)的功能性食品和藥物，提高縊蟶的經(jīng)濟(jì)價值具有重大意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種縊蟶酶解多肽的制備方法，以DPPH清除率為指標(biāo)，通過正交實(shí)驗進(jìn)行酶解，獲得DPPH清除率最大的酶解條件。在此酶解條件下進(jìn)行酶解，得到縊蟶酶解多肽，具有制備工藝簡單、易操作等特點(diǎn)。
[0007]本發(fā)明所要解決的第二個技術(shù)問題是提供一種縊蟶酶解多肽的應(yīng)用，縊蟶酶解多肽敏感性高、穩(wěn)定性好及副作用少，具有體外抗抗氧化的作用。
[0008]本發(fā)明解決上述第一個技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:一種縊蟶酶解多肽的制備方法，其特征在于步驟為:
[0009]I)前處理:將縊蟶去殼、洗凈絞碎，按料液質(zhì)量比1:1~4加水勻漿，調(diào)節(jié)pH值至7~8 ; [0010]2)酶解:加入蛋白酶進(jìn)行酶解，蛋白酶的加入量為縊蟶質(zhì)量的0.2%~0.3%，酶解溫度為60~70°C，酶解時間2~6小時；
[0011]3)酶解后滅酶處理，再離心取上清液即為酶解液；
[0012]4)將酶解液經(jīng)超濾、G-25凝膠色譜柱層析后收集的各個洗脫峰濃縮后冷凍干燥，將干燥后得到的各個峰組分采用DPPH清除率進(jìn)行抗氧化實(shí)驗，確定目標(biāo)肽所在的洗脫峰，并對該峰大量收集，濃縮并冷凍干燥；
[0013]5)最后，采用反相高效液相色譜進(jìn)行洗脫純化得到所需的縊蟶酶解多肽。
[0014]作為優(yōu)選，所述步驟I)的料液質(zhì)量比1: 2，pH值為8。
[0015]作為優(yōu)選，所述步驟2)的蛋白酶為胰蛋白酶，蛋白酶的加入量為900U/g，酶解溫度為30°C，酶解時間6小時。
[0016]作為改進(jìn)，所述步驟3)的滅酶處理是在80~95°C，加熱10~15min，離心是在5000 ~7000r/min 下離心 10 ~20min。
[0017]再改進(jìn)，所述步驟4)的超濾是將酶解液加入超濾杯，用3KD的超濾膜進(jìn)行超濾，收集3KD分子量以下的酶解液，進(jìn)行冷凍干燥；
[0018]G-25凝膠色譜柱層析的具體步驟為:采用濕法裝柱，柱高為80cm，直徑為2.6cm,裝柱完畢后用去離子水進(jìn)行平衡，樣品的濃度為200mg/mL，每次上樣量為3mL，洗脫液為去離子水，洗脫速度為2.3mL/min，蛋白檢測儀280nm進(jìn)行檢測，對各洗脫峰分別進(jìn)行收集，濃縮后冷凍干燥，將干燥后得到的各個峰組分采用DPPH清除率進(jìn)行抗氧化實(shí)驗，進(jìn)一步確定目標(biāo)肽所在的洗脫峰，并對該峰大量收集，濃縮并冷凍干燥；
[0019]最后，所述步驟5)的反相高效液相色譜洗脫純化的具體工藝參數(shù)為:色譜條件:C18反相柱；柱型:10 X 250mm ；乙腈/水為流動相，流速為0.8mL/min,上樣體積為20 μ L，檢測波長220nm ;洗脫條件:乙腈濃度為15%，洗脫20min。
[0020]本發(fā)明解決上述第二個技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:一種根據(jù)上述制備方法得到的縊蟶酶解多肽在體外抗氧化的應(yīng)用。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:通過正交實(shí)驗確定最佳酶解條件，以DPPH清除率為指標(biāo)，通過正交實(shí)驗進(jìn)行酶解，獲得DPPH清除率最大的酶解條件。
[0022]本發(fā)明制備工藝簡單，制得的縊蟶酶解多肽敏感性高、穩(wěn)定性好及副作用少，在體外有顯著的抗氧化作用，對于進(jìn)一步研究與開發(fā)以縊蟶酶解多肽為基礎(chǔ)的功能性食品和藥物，提高縊蟶的經(jīng)濟(jì)價值具有重大意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1是S印hadex G25凝膠色譜柱峰譜圖；[0024]圖2是高效液相檢測縊蟶酶解多肽純度
[0025]圖3是縊蟶酶解液的DPPH自由基清除率
[0026]圖4是縊蟶酶解液的還原力
[0027]圖5是縊蟶酶解液的羥自由基清除率
【具體實(shí)施方式】
[0028]以下結(jié)合附圖實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0029]1.材料與儀器
[0030]1.1主要材料與試劑
[0031 ] 縊蟶購自浙江省舟山市南珍市場；
[0032]胰蛋白酶，美國SIGMA公司；
[0033]DPPH、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、雙氧水、鐵氰化鉀，北京亞太恒信生物科技有限公司
[0034]其余試劑均為分析純。
[0035]1.2主要儀器
[0036]DS-1型高速組織搗碎機(jī)，上海標(biāo)本模型廠；
[0037]BSA124S型電子天平，德國Sartorius AG公司；
[0038]SSW型微電腦電熱恒溫槽，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；
[0039]PHS_250pH計，上海理達(dá)儀器廠；
[0040]CF16RXII高速冷凍離心機(jī)，日本HITACHI公司；
[0041]752FC紫外分光光度計，上海光譜儀器有限公司；
[0042]LGJ-18冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；
[0043]2.實(shí)驗方法
[0044]2.1胰蛋白酶酶解條件的優(yōu)化以酶解溫度A (30°C、35°C、40°C、45°C )，pH值B (7.0、
7.5、8.0、8.5)，料水比 C(1: 0、1: 1、1: 2、1: 3)，時間 D(2、4、6、8h)，加酶量E(300U/g、600U/g、900U/g、1200U/g)為因素，以DPPH為指標(biāo)，通過實(shí)驗數(shù)據(jù)確定最佳酶解條件，設(shè)計L9(34)正交實(shí)驗。
[0045]2.2Sephadex G-25凝膠層析:將Sephadex G-25凝膠顆粒采用濕法裝柱,柱高為80cm,直徑為2.6cm,裝柱完畢后用去離子水進(jìn)行平衡。樣品的濃度為200mg/ml,每次上樣量為3ml，洗脫液為去離子水，洗脫速度為2.3ml/min，蛋白檢測儀280nm進(jìn)行檢測，對各洗脫峰分別進(jìn)行收集，濃縮后冷凍干燥。將干燥后得到的各個峰組分采用DPPH清除率實(shí)驗，進(jìn)一步確定目標(biāo)肽所在的洗脫峰，并對該峰大量收集，濃縮并冷凍干燥。
[0046]2.3反相高效液相色譜(RT-HPLC)
[0047]RT-HPLC進(jìn)行純化。色譜條件:C18反相柱；柱型:10 X 250mm ；乙腈/水為流動相，流速為0.8mL/min,上樣體積為20 μ L，檢測波長220nm。洗脫條件:乙腈濃度為15%，洗脫20min，重復(fù)上樣。
[0048]2.4酶解產(chǎn)物的抗氧化活性測定
[0049]2.4.1DPPH 法
[0050]向試管中加入2ml酶解液，再加入2πι120μπιΟ1/1 DPPH的乙醇溶液，震蕩搖勻，室溫避光反應(yīng)30min后，用無水乙醇作參比在517nm處測定其吸光度As。[0051]相同條件下，取2mL20 μ mol/L的DPPH溶液與用2ml乙醇溶液混合，震蕩搖勻，室溫避光反應(yīng)30min后，測得吸光度Ac.[0052]取2ml樣品與2ml乙醇溶液混合，震蕩搖勻，室溫避光反應(yīng)30min后，測得吸光度Ao0
[0053]其中，DPPH清除率(% ) = [1-(As-Ao)/Ac] X 100%
[0054]Ac:2ml乙醇與2mlDPPH溶液的吸光度
[0055]As:2ml樣品與2mlDPPH溶液的吸光度
[0056]AO:2ml樣品與2ml乙醇的吸光度。
[0057]2.4.2 羥自由
[0058]取0.5mL0.75mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液于試管中，依次加入ImL0.15mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH7.40)和0.5mL去離子水，充分混勻后，加入0.5mL0.75mmol/L
[0059]硫酸亞鐵溶液(FeSO4)混勻后，加入0.5mL 0.0I %雙氧水(H2O2)，于37 °C水浴60min后,在536nm測定吸光度,所測得的數(shù)據(jù)為損傷管的吸光值A(chǔ)損。未損傷管以0.5mL蒸餾水代替損傷管中0.5mL0.01 %雙氧水(H202)，操作方法同損傷管，可測得536nm未損傷管的吸光值A(chǔ)未，樣品管以0.5mL樣品代替損傷管中的0.5mL蒸餾水，操作方法同損傷管，可測得536nm樣品管的吸光值A(chǔ)，按下式計算樣品對.0H的清除率:
[0060]清除率I (% ) = (A-A 損)/ (A 未-A 損)X 100
[0061]2.4.3 還原力
[0062]在2.5ml不同濃度提取液中，加入2.5ml (0.2mol/L, pH = 6.6)的磷酸緩沖溶液，再加入2.5ml的10g/L鐵氰化鉀，混勻，50°C恒溫20min，迅速冷卻，加2.5mll0%的三氯乙酸，混勻后，離心IOmin (3000r/min),取上清液2.5ml,加2.5ml蒸懼水,再加0.5ml0.1%H氯化鐵溶液，于700nm波長下檢測吸光度重復(fù)三次，取平均值。吸光值越大，還原能力越強(qiáng)
[0063]3 結(jié)果
[0064]3.1胰蛋白酶的正交實(shí)驗結(jié)果
[0065]胰蛋白酶對縊蟶進(jìn)行酶解的影響因素順序為:溫度 > 加酶量 > 時間 > 料水比>PH值，最佳的酶解條件為:溫度為30°C，料水比為1: 2，加酶量為900U/g，時間為6h時，對DPPH清除率最大，達(dá)到68.54%。取500縊蟶按最佳酶解條件進(jìn)行酶解，進(jìn)行下一步活性測試。
[0066]表1胰蛋白酶L16 (45)正交表
[0067]
【權(quán)利要求】
1.一種縊蟶酶解多肽的制備方法，其特征在于步驟為: 1)前處理:將縊蟶去殼、洗凈絞碎，按料液質(zhì)量比1:0~4加水勻漿，調(diào)節(jié)pH值至7.0 ~8.5 ; 2)酶解:加入蛋白酶進(jìn)行酶解，蛋白酶的加入量600U/g~1200U/g，酶解溫度為30~45°C，酶解時間2~8小時； 3)酶解后滅酶處理，再離心取上清液即為酶解液； 4)將酶解液經(jīng)超濾、G-25凝膠色譜柱層析后收集的各個洗脫峰濃縮后冷凍干燥，將干燥后得到的各個峰組分采用DPPH清除率進(jìn)行抗氧化實(shí)驗，確定目標(biāo)肽所在的洗脫峰，并對該峰大量收集，濃縮并冷凍干燥； 5)最后，采用反相高效液相色譜進(jìn)行洗脫純化得到所需的縊蟶酶解多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟I)的料液質(zhì)量比1:2，pH值為8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟I)的蛋白酶為胰蛋白酶，蛋白酶的加入量為900U/g，酶解溫度為30°C，酶解時間6小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟3)的滅酶處理是在溫度85~95°C下加熱8~12min,離心是在4000~6000r/min下離心8~12min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟4)的超濾是將酶解液加入超濾杯，用3KD的超濾膜進(jìn)行超濾，收集3KD分子量以下的酶解液，進(jìn)行冷凍干燥。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟4)的G-25凝膠色譜柱層析的具體步驟為:采用濕法裝柱，柱高為80cm，直徑為2.6cm，裝柱完畢后用去離子水進(jìn)行平衡，樣品的濃度為200mg/mL，每次上樣量為3mL，洗脫液為去離子水，洗脫速度為2.3mL/min,蛋白檢測儀280nm進(jìn)行檢測，對各洗脫峰分別進(jìn)行收集，濃縮后冷凍干燥，將干燥后得到的各個峰組分采用DPPH清除率進(jìn)行抗氧化實(shí)驗，進(jìn)一步確定目標(biāo)肽所在的洗脫峰，并對該峰大量收集，濃縮并冷凍干燥。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟5)的反相高效液相色譜洗脫的具體工藝參數(shù)為:色譜條件:C18反相柱；柱型:10X250mm ;乙腈/水為流動相，流速為0.8mL/min，上樣體積為20 μ L，檢測波長220nm ;洗脫條件:乙腈濃度為15%，洗脫20min。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法得到的縊蟶酶解多肽在體外抗氧化的應(yīng)用。
【文檔編號】C07K1/22GK103740792SQ201310249321
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年6月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月7日
【發(fā)明者】黃芳芳, 丁國芳, 楊最素, 郁迪 申請人:浙江海洋學(xué)院