水稻轉(zhuǎn)錄因子Os03g50310基因的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及水稻轉(zhuǎn)錄因子Os03g50310基因的應(yīng)用，其是利用轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP64與水稻轉(zhuǎn)錄因子Os03g50310基因融合構(gòu)建得到組成型轉(zhuǎn)錄因子，并轉(zhuǎn)化到農(nóng)作物如水稻中，從而增加產(chǎn)量，如株高增高、每穗粒數(shù)增加。對于詳細(xì)闡明調(diào)控水稻產(chǎn)量發(fā)育機(jī)理具有重要的理論價值，并且可以通過轉(zhuǎn)基因手段，改良水稻的產(chǎn)量，具有良好的市場應(yīng)用前景。
【專利說明】水稻轉(zhuǎn)錄因子0s03g50310基因的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及水稻轉(zhuǎn)錄因子0s03g50310基因的應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 水稻（Oryza sativa L.)是我國和全世界最重要的三大糧食作物之一，是世界一 半以上人口的主食，也是一個重要的功能基因研究的模式植物。與其相關(guān)的遺傳學(xué)和分子 生物學(xué)研究一直倍受研究者的重視，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是基因表達(dá)調(diào)控的重要方式。當(dāng)前水 稻增產(chǎn)的研究較依賴于有限的水稻種質(zhì)資源，傳統(tǒng)的雜交育種優(yōu)勢正在逐漸減弱，而水稻 轉(zhuǎn)基因技術(shù)有可能發(fā)掘水稻進(jìn)一步增產(chǎn)的潛力。
[0003] 水稻產(chǎn)量是一個復(fù)雜的農(nóng)藝性狀，由有效穗數(shù)、穗實粒數(shù)及粒重構(gòu)成，多數(shù)表現(xiàn)為 數(shù)量性狀，從植物學(xué)角度來說，分蘗與穗部發(fā)育都包括頂端生長和分枝，株型及穗型的最終 構(gòu)成取決于這兩者之間的平衡和協(xié)調(diào)，受到了基因型、激素、光周期、內(nèi)部的發(fā)育信號及環(huán) 境因子等構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。粒重由稻谷的長、寬、厚以及充實度共同決定。迄今為止， 報道單株產(chǎn)量QTL (數(shù)量性狀位點）的數(shù)量比較少，這可能是由于多數(shù)QTL同時具有正負(fù)效 應(yīng)導(dǎo)致產(chǎn)量未發(fā)生變化，另外與產(chǎn)量的遺傳力低有關(guān)。Xiao等在馬來西亞普通野生稻中檢 測到2個正效QTL，yldl. 1和yld2. 1可分別提高產(chǎn)量18%、17%。李德軍等在東鄉(xiāng)普通野生 稻的第2和11染色體上發(fā)現(xiàn)2個高產(chǎn)QTL，貢獻(xiàn)率分別為17%、12%，He等對位于第2染色 體上的高產(chǎn)QTL進(jìn)行了精細(xì)定位。相比較而言，以產(chǎn)量構(gòu)成因子作為表型進(jìn)行定位和克隆 的報道則較多，如基因Ghd7在長日下表達(dá)增強(qiáng)，從而延遲抽穗，使植株增高、穗粒數(shù)增多、 莖桿粗壯抗倒，從而提高單株產(chǎn)量。位于第1染色體短臂上的Gnla基因編碼細(xì)胞分裂素氧 化/脫氫酶，能降解細(xì)胞分裂素含量Gnla是一個負(fù)向調(diào)控因子，表達(dá)量的降低可引起花序 分生組織中細(xì)胞分裂素的積累，促進(jìn)生殖器官數(shù)量的增加，從而增加穎花數(shù)量，最終提高產(chǎn) 量。
[0004] VP64是4個VP16功能域基序融合在一起組成的，是一類增強(qiáng)子。VP16最早在動 物病毒基因中發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用到植物中，主要用于植物基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究中。轉(zhuǎn) 錄因子在體內(nèi)的作用大體上可以分成兩種：一種為轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，另一種為轉(zhuǎn)錄抑制子。當(dāng)轉(zhuǎn) 錄因子和VP16功能域基序融合之后，它就會增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子的功能，從而在轉(zhuǎn)基因植株中出 現(xiàn)更明顯的表型變化。
[0005] C0NSTANS-LIKE蛋白家族是一個轉(zhuǎn)錄因子家族，在擬南芥中含有17個基因成員， 含有2個保守區(qū)，B-box和CCT(C0, COL和T0C1)區(qū)。在擬南芥中C0NSTANS-LIKE家族多個 基因共同調(diào)節(jié)光周期途徑開花時間。目前C0NSTANS-LIKE家族轉(zhuǎn)錄因子0s03g50310對作 物產(chǎn)量調(diào)控機(jī)制的研究及認(rèn)識很少，因此該轉(zhuǎn)錄因子的研究在理論上為進(jìn)一步理解作物產(chǎn) 量調(diào)控的分子機(jī)理提供了新的線索；在實踐上也將為作物高產(chǎn)育種提供理論基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供水稻轉(zhuǎn)錄因子0s03g50310基因的應(yīng)用。
[0007] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明首先提供了一種融合蛋白，該融合蛋白為（VP16) n-Linker_0s03g50310 ;其中，n為彡1的整數(shù)；Linker由1?50個柔性氨基酸串聯(lián)而成； VP16為來自單純皰疫病毒（Herpes simplex virus)的VP16蛋白；0s03g50310為水稻轉(zhuǎn)錄 因子 0s03g50310。
[0008] 進(jìn)一步地，所述融合蛋白為（VP16)4-Linker-0s03g50310 ;其中，Linker由39個柔 性氨基酸串聯(lián)而成。
[0009] 所述水稻轉(zhuǎn)錄因子0s03g50310的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，其氨基酸序列 如 SEQ ID No. 2 所示。
[0010] 其中，Linker由39個柔性氨基酸串聯(lián)而成，其序列如SEQ ID No. 9所示，其核苷 酸序列如SEQ ID No. 3所示；VP16為來自單純皰疹病毒的VP16蛋白；0s03g50310為水稻轉(zhuǎn) 錄因子 0s03g50310。
[0011] 所述水稻轉(zhuǎn)錄因子0s03g50310的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，或該序列經(jīng)替 換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列也屬于本發(fā)明的保護(hù) 范圍。
[0012] 其中，（VP16) 4 即 VP64,是由 4個VP16 功能域基序（Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu)以Gly Ser兩個氨基酸間隔融合在一起組成的增強(qiáng)子，其序列如SEQ ID No. 10所示，其核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。
[0013] 本發(fā)明還提供含有編碼所述融合蛋白的基因的載體。
[0014] 所述載體的構(gòu)建方法如下：
[0015] (1)在植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫中找到0s03g50310基因，根據(jù)其序列設(shè)計PCR擴(kuò)增引 物對，其為正向引物 F :5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGGCGAGCGCCGCCGCGGCG-3' 和反向引物 R : 5,-CAAGAAAGCTGGGTCAAAACGGTAGCGCCCGTG ;
[0016] (2)以野生日本晴水稻總cDNA為模板，進(jìn)行PCR獲得0s03g50310全序列；
[0017] (3)將PCR產(chǎn)物克隆到連接pDONER克隆載體上，經(jīng)測序鑒定得到與目的基因完全 相同的序列；
[0018] (4)以雙元表達(dá)載體左右邊界包含的序列為骨架序列，通過體外重組，將ubi promoter_Gateway-VP64 表達(dá)單兀、35S promoter-asRED 表達(dá)單兀和 35S promoter-bar 表 達(dá)單元與之融合構(gòu)建，得到載體cVP64-bar_asRED的全序列如SEQ ID No. 5所示；
[0019] (5)通過LR反應(yīng)將0s03g50310構(gòu)建到融合了 VP64標(biāo)簽的植物表達(dá)載體 cVP64-bar-asRED 上，獲得載體 ubi: :0s03g50310-VP64,載體全序列如 SEQ ID No. 6 所示。
[0020] 攜帶有編碼所述融合蛋白的基因的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、植物病毒載體、 直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞中（Weissbach，1998， Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第 411-463 頁； Geiserson 和 Corey, 1998, Plant Molecular Biology,2nd Edition)。
[0021] 本發(fā)明還提供含有編碼所述融合蛋白的基因的工程菌。
[0022] 本發(fā)明還提供一種轉(zhuǎn)基因水稻植株的構(gòu)建方法，具體為，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法， 將前述載體轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織中，用含誘導(dǎo)劑和農(nóng)桿菌的AAM轉(zhuǎn)化液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的 材料經(jīng)過共培養(yǎng)-篩選-分化-生根-轉(zhuǎn)基因苗的鍛煉和移栽，篩選轉(zhuǎn)基因水稻植株。
[0023] 本發(fā)明還提供編碼所述融合蛋白的基因在改良水稻產(chǎn)量(如增加每穗粒數(shù)）中的 應(yīng)用。
[0024] 本發(fā)明還提供了用于擴(kuò)增水稻轉(zhuǎn)錄因子0s03g50310基因的引物對，其為正向引物 F :5' -CAAAAAAGCAGGCTTC ATGGCGAGCGCCGCCGCGGCG-3' 和反向引物 R :5' -CAAGAAAGCTGGGTC AAAACGGTAGCGCCCGTG-3,。
[0025] 本發(fā)明還進(jìn)一步提供水稻轉(zhuǎn)錄因子0s03g50310基因在調(diào)控水稻產(chǎn)量性狀中的應(yīng) 用。
[0026] 前述的應(yīng)用，是將水稻轉(zhuǎn)錄因子0s03g50310基因的CDS序列通過Gateway系統(tǒng)構(gòu) 建到4個轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP16的下游，轉(zhuǎn)化水稻，從而改良轉(zhuǎn)基因水稻產(chǎn)量的性狀。
[0027] 本發(fā)明首次利用轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP64 (即4個轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP16)與水 稻轉(zhuǎn)錄因子0s03g50310基因融合構(gòu)建得到組成型轉(zhuǎn)錄因子，并轉(zhuǎn)化到水稻中，從而改良水 稻產(chǎn)量性狀，如增加每穗的粒數(shù)、增加單株產(chǎn)量。對于詳細(xì)闡明調(diào)控產(chǎn)量發(fā)育機(jī)理具有重要 的理論價值，并且可以通過轉(zhuǎn)基因手段，增加水稻的產(chǎn)量，因此在生產(chǎn)實踐中也具有重要意 義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 圖1為本發(fā)明實施例1中cVP64-bar-asRED載體圖譜。
[0029] 圖2為本發(fā)明實施例1中ubi: :0s03g50310-VP64載體圖譜。
[0030] 圖3為本發(fā)明Q-PCR檢測0s03g50310-VP64轉(zhuǎn)基因陽性株系，其中WT為野生型水 稻 'kitaake'，0E4、0E7 為 0s03g50310-VP64 轉(zhuǎn)基因水稻株系。

【具體實施方式】
[0031] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0032] 實施例0s03g50310基因的分離和植物表達(dá)載體構(gòu)建
[0033] 在植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫中找到0s03g50310基因，根據(jù)其序列設(shè)計PCR擴(kuò)增引物， 根據(jù)其序列設(shè)計PCR擴(kuò)增引物(正向引物F :5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGGCGAGCGCCGCCGCGG CG-3'和反向引物R :5' -CAAGAAAGCTGGGTCAAAACGGTAGCGCCCGTG。以野生型日本晴水稻總 cDNA為模板，進(jìn)行PCR獲得0s03g50310全序列，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0034] 按照PrimeSTAR聚合酶擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序進(jìn)行PCR。此過程中包含兩輪PCR，第 一輪PCR的引物用加部分adaptor attB接頭的基因引物F和引物R，而第二輪的模板用第 一輪的 PCR 產(chǎn)物，并且引物用完整的 adaptor attB 引物（attB5' adaptor :5' -GTGGGGACAAG TTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC-3'，attB3' adaptor :5' -GTGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3 '。）。將PCR產(chǎn)物連接到pDONER克隆載體(購自Invitrogen)上，經(jīng)測序鑒定得到與目的基 因完全相同的序列。通過LR反應(yīng)將0s03g50310構(gòu)建到cVP64-bar_asRED (圖1，載體全序 列如3￡〇10此.5所示）上，獲得載體111^::〇8〇385031〇- ￥?64(圖2，載體全序列如5￡〇10 No. 6所示）。
[0035] 實施例2轉(zhuǎn)基因水稻植株的獲得
[0036] 取水稻'kitaake'成熟種子，人工或機(jī)械脫殼，挑選飽滿光潔無菌斑的種子經(jīng)消毒 之后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。選擇外觀良好，生長力好的水稻愈傷組織為受體 材料，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Ubi : : 0s03g50310-VP64轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織中，用含有100 i! M的 乙酰丁香酮和〇. D.值為0. 7的農(nóng)桿菌的AAM轉(zhuǎn)化液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化液浸泡過的愈傷組織 置于共培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)，25°C暗培養(yǎng)3d后置于篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)約30d，每IOd繼代一 次。然后將篩出的抗性愈傷轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上分化約20d，每IOd繼代一次。將分化出綠 色小苗的抗性愈傷轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上生根，約7d長出發(fā)達(dá)根系后煉苗，并計算轉(zhuǎn)化所獲 轉(zhuǎn)基因苗數(shù)。煉苗7d后轉(zhuǎn)移至大田生長。
[0037] 其中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為：N6大量+B5微量+NB有機(jī)+鐵鹽+銅鈷母液+2. 5mg/ L2, 4D+0. 6g/L酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制， 調(diào)pH至5. 8?5. 9后加入植物凝膠4g/L。
[0038] 共培養(yǎng)基配方為：N6大量+B5微量+NB有機(jī)+鐵鹽+2. 5mg/L2, 4D+0. 5g/L谷氨酰 胺+0. 6g/L酸水解酪蛋白+10g/L葡萄糖+30g/L鹿糖，以水配制，調(diào)pH至5. 2后加入植物 凝膠4g/L。滅菌后，50°C左右加入AS (乙酰丁香酮）100?200iig/mL。
[0039] 篩選培養(yǎng)基配方為：N6大量+B5微量+NB有機(jī)+鐵鹽+銅鈷母液+2. 5mg/ L2, 4D+0. 6g/L酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制， 調(diào)pH至5. 8?5. 9后加入植物凝膠4g/L。滅菌后加入35mg/L潮霉素(購自上海紐津生物 技術(shù)有限公司）。
[0040] 分化培養(yǎng)基配方為：MS無機(jī)+MS-B5微量+MS有機(jī)+鐵鹽+MS-銅鈷母液+0. 05mg/ L NAA+2.0mg/L Kinetin (激動素）+30g/L山梨醇+2g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖，以水配 制，調(diào)pH至5. 8?5. 9后加入植物凝膠4g/L。
[0041] 實施例3轉(zhuǎn)基因陽性株系的鑒定
[0042] 為檢測ubi: :0s03g50310-VP64基因在實施例2方法中的T2代轉(zhuǎn)基因水稻中的過 表達(dá)情況，利用Q-PCR進(jìn)行鑒定。實時定量PCR采用ABISt印One進(jìn)行，利用SYBR Green I 檢測熒光信號。引物序列為：
[0043] Q3g50310-F:TTCGATCCCAGCGAGTCATG
[0044] Q3g503IO-R:GCACCTCGTACCGGATCTTCTT。
[0045] 1)反應(yīng)體系為15 ii 1 :
[0046]

【權(quán)利要求】
1. 一種融合蛋白，其特征在于，該融合蛋白為（VP16)n-Linker-0 S03g50310 ;其中，η為 彡1的整數(shù)；Linker由1?50個柔性氨基酸串聯(lián)而成；VP16為來自單純皰疹病毒（Herpes simplex virus)的 VP16 蛋白；0s03g50310 為水稻轉(zhuǎn)錄因子 0s03g50310。
2. 如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白為（VP16) 4-Linker-0s03g50310 ;其中，Linker由39個柔性氨基酸串聯(lián)而成。
3. 如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述水稻轉(zhuǎn)錄因子0s03g50310的氨基 酸序列如SEQ ID No. 2所示。
4. 編碼權(quán)利要求1-3任一項所述融合蛋白的基因。
5. 含有權(quán)利要求4所述基因的載體。
6. 含有權(quán)利要求4所述基因的工程菌。
7. -種轉(zhuǎn)基因水稻的構(gòu)建方法，其特征在于，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將權(quán)利要求5所 述的載體轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織中，用含誘導(dǎo)劑和農(nóng)桿菌的AAM轉(zhuǎn)化液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的材 料經(jīng)過共培養(yǎng)-篩選-分化-生根-轉(zhuǎn)基因苗的鍛煉和移栽，篩選轉(zhuǎn)基因水稻植株。
8. 用于擴(kuò)增水稻轉(zhuǎn)錄因子0s03g50310基因的引物對，其為： 正向引物 F :5'-CAAAAAAGCAGGCTTCATGGCGAGCGCCGCC GCGGCG-3' ； 反向引物 R :5' -CAAGAAAGCTGGGTCAAAACGGTAGCGCCC GTG-3'。
9. 水稻轉(zhuǎn)錄因子0s03g50310基因在調(diào)控水稻產(chǎn)量性狀中的應(yīng)用。
10. 如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，其是將水稻轉(zhuǎn)錄因子0s03g50310基因的 ⑶S序列通過Gateway系統(tǒng)構(gòu)建到4個轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP16的下游，轉(zhuǎn)化水稻，從而改良 轉(zhuǎn)基因水稻產(chǎn)量的性狀。
【文檔編號】C07K19/00GK104292336SQ201310296096
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年7月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月15日
【發(fā)明者】萬建民, 程志軍, 劉軍, 趙濤, 劉斌, 李宏宇, 林辰濤 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所