腫瘤抗原性多肽及其作為腫瘤疫苗的用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了具有SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列的人類粘蛋白-1腫瘤抗原性多肽或其變體，其可結(jié)合HLA?I并被CD8+T細(xì)胞識(shí)別。本發(fā)明還提供了編碼上述多肽的核酸。本發(fā)明還提供了可在細(xì)胞表面呈遞上述多肽的抗原呈遞細(xì)胞，以及可識(shí)別上述多肽或抗原呈遞細(xì)胞的免疫效應(yīng)細(xì)胞。本發(fā)明還提供了所述多肽或其變體，核酸，抗原呈遞細(xì)胞或免疫效應(yīng)細(xì)胞在用于制備治療或預(yù)防癌癥的疫苗或藥物組合物中的用途。本發(fā)明提供的腫瘤疫苗在較大的人群中有良好的治療效果，尤其是適合亞洲人種，例如中國(guó)人。
【專利說明】腫瘤抗原性多肽及其作為腫瘤疫苗的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及癌癥免疫領(lǐng)域。具體的，本發(fā)明涉及人類粘蛋白-1腫瘤抗原性多肽和其作為腫瘤多肽疫苗的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]在危害人類健康的疾病中，腫瘤已經(jīng)成為造成人類死亡的主要原因。全球范圍內(nèi)每年受癌癥影響的人數(shù)超過1000萬，根據(jù)世界衛(wèi)生組織的《世界癌癥報(bào)告》預(yù)計(jì)到2020年，每年發(fā)病將達(dá)1500萬人，死亡1000萬人。國(guó)內(nèi)腫瘤的死亡率在城市已上升為第一位。這意味著腫瘤治療面臨的形勢(shì)十分嚴(yán)峻。目前臨床上對(duì)于癌癥的治療仍是以手術(shù)為主，化療和放療為輔，但治療的特異性不足，常常對(duì)正常組織和器官造成損傷，并且手術(shù)治療仍存在術(shù)后高度復(fù)發(fā)及易轉(zhuǎn)移的問題。腫瘤疫苗的免疫治療可以產(chǎn)生針對(duì)腫瘤的特異性反應(yīng)，甚至能清除殘余的腫瘤病灶，并產(chǎn)生免疫記憶?，F(xiàn)已成為繼手術(shù)、化療和放療之后的第四種腫瘤治療方式，且與三大常規(guī)療法有明顯的互補(bǔ)性。
[0003]腫瘤疫苗是免疫治療的一種方式。其中利用多肽制作疫苗是利用腫瘤特異性抗原及其它免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞來治療和預(yù)防腫瘤?？鼓[瘤免疫反應(yīng)過程中先由抗原遞呈細(xì)胞(APC)將腫瘤抗原加工處理并遞呈給T細(xì)胞而激發(fā)的。樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cell，DC)作為人體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職APC，具有典型樹突狀形態(tài)，膜表面高表達(dá)HLA 1、HLA 11類分子，能高效地?cái)z取、處理和遞呈抗原，啟動(dòng)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng),因而成為抗腫瘤免疫反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)。應(yīng)用負(fù)載腫瘤抗原的DC，能夠激發(fā)體內(nèi)腫瘤特異性T細(xì)胞，從而能有效殺傷腫瘤細(xì)胞，并且能夠建立起持久的抗腫瘤特異性免疫應(yīng)答。
[0004]人粘蛋白I (MUCl)是一種高度O-糖基化和含有連續(xù)重復(fù)肽序列為特征的高分子量糖蛋白，存在于多種上皮組織，具有多種功能。粘蛋白在癌組織中異常表達(dá)，表達(dá)量豐富。人粘蛋白I(MUCl)是一種腫瘤相關(guān)抗原(Tumor associated antigen, TAA),存在于90%癌細(xì)胞表面的分子。健康的人體細(xì)胞中也含有粘蛋白1，但數(shù)量很少，無法觸發(fā)免疫反應(yīng)。免疫系統(tǒng)遭遇粘蛋白I濃度高的癌細(xì)胞可能觸發(fā)免疫反應(yīng)，激活的毒性T淋巴細(xì)胞可攻擊和殺死癌細(xì)胞。
[0005]人粘蛋白I具有信號(hào)肽。信號(hào)肽常指新合成多肽鏈中用于指引蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)移的N-末端的氨基酸序列。一般由15~30個(gè)氨基酸組成。信號(hào)肽包括三個(gè)區(qū):一個(gè)帶正電的N末端，稱為堿性氨基末端:一個(gè)中間疏水序列，以中性氨基酸為主，能夠形成一段β螺旋結(jié)構(gòu)，它是信號(hào)肽的主要功能區(qū)；一個(gè)較長(zhǎng)的帶負(fù)電荷的C末端，含小分子氨基酸，是信號(hào)序列切割位點(diǎn)，也稱加工區(qū)。
[0006]在腫瘤免疫治療中，清除腫瘤細(xì)胞依靠T細(xì)胞的免疫作用。T細(xì)胞對(duì)抗原的識(shí)另IJ，并不是完整的抗原分子。在抗原遞呈細(xì)胞(APC)中，腫瘤相關(guān)抗原被酶分解成多肽，然后再在肽鏈轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的參與下被轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔與新合成的HLA分子(human leukocyteantigen，人類白細(xì)胞抗原，包括HLA I分子或HLA II分子)結(jié)合并移至APC表面，形成HLA/抗原肽復(fù)合物，T細(xì)胞通過其表面特異的TCR識(shí)別抗原呈遞細(xì)胞表面的HLA/抗原肽復(fù)合物后，再收到協(xié)同刺激信號(hào)(B7分子與CD28分子相互作用)。在雙信號(hào)刺激下，T細(xì)胞被激活并發(fā)生增殖，大部分進(jìn)而分化成效應(yīng)細(xì)胞。其中CD8+T細(xì)胞有殺傷力，使外源細(xì)胞破裂而死亡。OT8+T細(xì)胞分泌白介素等細(xì)胞因子使CD8+T細(xì)胞、Mq)以及各種有吞噬能力的白細(xì)胞集中于腫瘤細(xì)胞周圍，將腫瘤細(xì)胞消滅。其中一部分T淋巴細(xì)胞，成為記憶細(xì)胞，再次遇到相同抗原刺激時(shí)，它將更迅速地增殖分化為效應(yīng)細(xì)胞。少數(shù)記憶細(xì)胞再次分裂為記憶細(xì)胞，持久地執(zhí)行特異性免疫功能。
[0007]1991年,Rotzschke等用X射線晶體衍射揭示,HLA I類分子頂部α I和α 2鏈組成的抗原肽結(jié)合區(qū)呈凹槽狀結(jié)構(gòu)，可容納8~12個(gè)氨基酸殘基組成的短肽。凹槽內(nèi)氨基酸組成在不同型別的HLA I分子中高度保守，可與表位肽N端殘基和C端殘基形成穩(wěn)定而強(qiáng)大的氫鍵，保證了 HLA I分子可以識(shí)別特殊表位。在不同基因型HLA I的凹槽內(nèi)氨基酸可以有各種變化，這是形成HLA I多態(tài)性的基礎(chǔ)。雖然抗原肽與HLA I類分子的結(jié)合有一定的選擇性，但與抗體和抗原結(jié)合的機(jī)理不一樣，只要被結(jié)合的多肽有2~3個(gè)關(guān)鍵的有相似化學(xué)性質(zhì)的氨基酸殘基(錨定位點(diǎn))，就能恰當(dāng)?shù)剡B接到凹槽內(nèi)的多肽結(jié)合基序(bindingmotif)的相應(yīng)位置上。多肽與之結(jié)合后，并被運(yùn)送到細(xì)胞表面遞呈給⑶8+τ細(xì)胞。ra8+T細(xì)胞通過其表面的T細(xì)胞受體(TCR)特異性識(shí)別抗原呈遞細(xì)胞表面的HLA/抗原肽復(fù)合物后，被激活化并增殖，進(jìn)而分化成效應(yīng)細(xì)胞。正是這一結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，所以每個(gè)HLA I分子能與一定數(shù)量的不同多肽結(jié)合。這為不同型別的分子結(jié)合肽的序列進(jìn)行表位預(yù)測(cè)提供了理論基礎(chǔ)，從而使計(jì)算機(jī)輔助手段進(jìn)行CTL表位的預(yù)測(cè)成為可能。
[0008]HLA-DP、DQ、DR等HLA II類分子是由HLA II類基因編碼的α鏈和β鏈非共價(jià)連接的糖蛋白組成。α鏈和β鏈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分別合成后，各自盤繞成一個(gè)α螺旋和β片層構(gòu)成凹槽。凹槽內(nèi)也有錨定位點(diǎn)，凹槽與抗原肽結(jié)合形成HLA/多肽復(fù)合體。由于它的末端是開放的，故可容納較長(zhǎng)的多 肽(約12~20個(gè)氨基酸)。當(dāng)HLA II的凹槽與抗原肽結(jié)合形成MHC/多肽復(fù)合體，并被運(yùn)送到細(xì)胞表面遞呈給CD4+T細(xì)胞。ra4+T細(xì)胞通過其表面TCR特異性識(shí)別抗原呈遞細(xì)胞表面的HLA/抗原肽復(fù)合物后，被活化和發(fā)生增殖，進(jìn)而分化成效應(yīng)細(xì)胞。ra8+T細(xì)胞必須要有刺激cd4+t細(xì)胞的信號(hào)，才能產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)。激活的ra4+T細(xì)胞能有效促進(jìn)CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生記憶細(xì)胞，從而使機(jī)體產(chǎn)生長(zhǎng)期的抗腫瘤的CTL反應(yīng)。除此之外，激活的cd4+t細(xì)胞也可直接殺傷腫瘤細(xì)胞。
[0009]HLA不同基因座位或同基因同一座位的不同等位基因之間結(jié)構(gòu)上的差異，可形成不同的HLA分子凹槽的結(jié)構(gòu)。由此造成不同HLA等位基因編碼分子對(duì)各種抗原肽的結(jié)合具有選擇性。而且，能夠和同一類HLA分子結(jié)合的抗原肽，其錨定位點(diǎn)和錨定殘基往往相同或相似。這表明，特定的HLA分子可憑借所需要的共同性基序選擇性地結(jié)合抗原肽，在這個(gè)意義上，兩者的結(jié)合具有一定的選擇性。事實(shí)上，不同HLA分子可選擇性地結(jié)合具有不同錨定位和殘基的肽段，故不同HLA等位基因產(chǎn)物有可能提呈同一抗原分子的不同表位，造成不同個(gè)體(帶有相異的MHC等位基因)對(duì)同一抗原的應(yīng)答在強(qiáng)度上出現(xiàn)差異。這上是HLA以其多態(tài)性參與和調(diào)控免疫應(yīng)答的一種重要機(jī)制。
[0010]深入研究還發(fā)現(xiàn)，HLA分子對(duì)抗原肽的識(shí)別并非呈現(xiàn)嚴(yán)格的一對(duì)一關(guān)系。這一可變通性可表現(xiàn)在不同方面:一，組成共同性基礎(chǔ)序列的抗原肽，其順序和結(jié)構(gòu)可變；二，同一HLA分子(如HLA II分子)所要求的錨定殘基往往不止一種氨基酸，結(jié)果是對(duì)應(yīng)的特定共同基礎(chǔ)序列的肽鏈數(shù)量可以相當(dāng)?shù)囟?，造成一種HLA分子可結(jié)合多種抗原肽，激活多個(gè)特異T細(xì)胞克隆；三，不同HLA分子接納的抗原肽，可擁有相似的共同基序。例如，在HLA I類分子中至少已知A2、A3、B4、B44四個(gè)家族，這些家族中的成員(各種等位基因產(chǎn)物)可選擇性地共同識(shí)別擁有相同或相似錨定殘基的抗原肽。這意味著能夠被某一 HLA分子所識(shí)別和提呈的抗原肽，也可能被其所屬家族中的其它分子所提呈。這對(duì)應(yīng)用多肽疫苗，體外致敏樹突狀細(xì)胞疫苗或T細(xì)胞疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防和免疫治療提供了便利。同時(shí)也為鑒定和改造腫瘤疫苗的多肽順序提供依據(jù)。
[0011]不僅每個(gè)HLA I分子能與一定數(shù)量的不同多肽結(jié)合，T細(xì)胞也具有交叉反應(yīng)現(xiàn)象，即單一的T細(xì)胞能夠識(shí)別兩個(gè)或兩個(gè)以上不同的多肽抗原與MHC的蛋白質(zhì)復(fù)合體。這又在另一個(gè)層面上提供了鑒定和改造腫瘤疫苗的多肽序列的依據(jù)。
[0012]研究表明，克服HLA多態(tài)性的障礙，尋找有效的覆蓋大部分人群的腫瘤表位疫苗已成為腫瘤特異性多肽疫苗免疫治療研究的重要前提。
[0013]據(jù)統(tǒng)計(jì)，僅僅HLA A2(包括 A*0201、A*0202、A*0204、A*0205、A*0206、A*0207 和A*0208)與HLA A3 (包括A*0301、A*1101、A*3101和A*6801)兩個(gè)大型在中國(guó)人的總平均
分布頻率超過85%。同一大型識(shí)別的肽序列非常相似。
[0014]本領(lǐng)域還需要更有效的覆蓋大部分人群的腫瘤疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]本發(fā)明提供了可被HLA I和HLA II識(shí)別并進(jìn)而激發(fā)腫瘤相關(guān)T細(xì)胞的人類粘蛋白I的抗原決定簇。這些抗原決定簇在亞洲人，特別是中國(guó)人中占了大多數(shù)(大于50%)，SP出現(xiàn)的頻率較高。本發(fā)明還提供了根據(jù)這些人類粘蛋白I的抗原決定簇制備得到的多肽和相關(guān)腫瘤多肽疫苗。這些制備得到的腫瘤多肽疫苗在較大的人群中有良好的治療效果。
[0016]具體的，本發(fā)明 提供了一種分離的多肽或其變體，所述多肽包含與下列(a)或(b)的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列:
[0017](a) SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
[0018](b)所述(a)的氨基酸序列的片段。
[0019]SEQ ID NO:1 所示的氨基酸序列為 MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTGS。
[0020]本發(fā)明的多肽或其變體可結(jié)合HLA I或HLA II分子并被OT8+T細(xì)胞或OT4+T細(xì)胞識(shí)別。
[0021]本發(fā)明中，術(shù)語“分離”是指非天然的形式。
[0022]在本發(fā)明中，術(shù)語“變體”或“多肽的變體”是指與所述多肽在蛋白活性，例如抗原性上，表位上或免疫學(xué)上等同或具有更好活性的變體。在一些實(shí)施方案中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過改變所述多肽上不破壞其活性的部分，例如取代、缺失、插入、增加該多肽的氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到所述變體。在一些實(shí)施方案中，可以通過鑒定相似多肽之間保守的分子的殘基和部分而對(duì)所述多肽進(jìn)行相關(guān)氨基酸的替換而得到所述變體。本領(lǐng)域技術(shù)人員還能分析與相似多肽中的結(jié)構(gòu)相關(guān)的三維結(jié)構(gòu)和氨基酸序列。根據(jù)這樣的信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以預(yù)測(cè)抗原三維結(jié)構(gòu)的氨基酸序列比對(duì)，由此制備在各個(gè)期望的氨基酸殘基處包含單一氨基酸取代作用的試驗(yàn)變體。然后可以應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的活性測(cè)定來對(duì)這些變體進(jìn)行篩選。
[0023]在本發(fā)明中，表述“多肽包含某氨基酸序列”中的“包含”包括“具有”的含義。[0024]本發(fā)明提供的多肽包括具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的多肽的片段(免疫原性片段)，即具有所述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的一個(gè)連續(xù)部分，該部分能產(chǎn)生識(shí)別SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的多肽的免疫應(yīng)答。優(yōu)選的片段包括，例如，具有SEQ IDNO:1的一部分連續(xù)的氨基酸序列的截短多肽。
[0025]在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了上述多肽，其中(b)中所述片段為包含或具有SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列中連續(xù)8個(gè)，9個(gè)或10個(gè)氨基酸的片段。在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，提供了上述多肽，其中(b)中所述片段為包含或具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中連續(xù)10個(gè)氨基酸的片段。
[0026]在本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供了上述多肽，其具有FLLLLLTVLT (SEQ ID NO:2),LLLLLTVLTV (SEQ ID NO:3), LLLLTVLTVV (SEQ ID NO:4), FFLLLLLTVL (SEQ ID NO:5),GTQSPFFLLL (SEQ ID NO:6)，TQSPFFLLLL (SEQ ID NO:7)的氨基酸序列。
[0027]在本發(fā)明的一個(gè)方面，上述多肽可結(jié)合HLA I分子并被ra8+T細(xì)胞識(shí)別。OT8+T細(xì)胞也被稱為細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)。在本發(fā)明的又一個(gè)方面，其中所述HLA I為HLA A2或HLA A3 型。
[0028]在本文，“基本上相同的氨基酸序列”是指氨基酸序列中一個(gè)到幾個(gè)(例如2、3、4或5個(gè))氨基酸被置換、缺失、添加或插入，其與該氨基酸序列相比具有相同或相似或更好的活性。在本發(fā)明中，所述活性可以是指，例如，被HLA I和HLA II識(shí)別并進(jìn)而激發(fā)腫瘤相關(guān)T細(xì)胞的活性。
[0029]可依照在常規(guī)肽化學(xué)中使用的方法合成本發(fā)明的多肽。這些已知方法包括例如在下列文獻(xiàn)中描述的方法:Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966。
[0030]也可以通過常規(guī)的基因工程制備本發(fā)明的多肽。例如，可使用常規(guī)DNA合成和基因工程方法制備的編碼所述多肽的核苷酸來制備所述多肽。即通過下述方法制備所述多肽:將上述多核苷酸插入常用的表達(dá)載體；用得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)化體；和從培養(yǎng)物中收集所述`多肽?？蓞⒄绽缫韵挛墨I(xiàn)中描述的方法進(jìn)行:Molecular Cloning, Τ.Maniatis 等人，CSH Laboratory (1983)。
[0031]本發(fā)明還提供了由編碼本發(fā)明的上述多肽的堿基序列組成的分離的核酸。本發(fā)明的核酸可為cDNA、mRNA或DNA/RNA嵌合體，優(yōu)選DNA。所述核酸可以是雙鏈或單鏈。當(dāng)所述核酸是雙鏈的，它可以是雙鏈DNA、雙鏈RNA或DNA: RNA雜合體。當(dāng)本發(fā)明的多核苷酸為雙鏈時(shí)，可將其插入表達(dá)載體以產(chǎn)生用于表達(dá)本發(fā)明的肽的重組表達(dá)載體。因此，本發(fā)明的核酸包含通過將本發(fā)明的雙鏈多核苷酸插入表達(dá)載體得到的重組表達(dá)載體。
[0032]編碼本發(fā)明的上述信號(hào)肽的堿基序列不受特別限制，只要它在翻譯之后產(chǎn)生本發(fā)明的上述多肽的氨基酸序列的任何一個(gè)。編碼所述氨基酸序列的堿基序列可以通過PCR方法等以含有粘蛋白序列的基因組DNA或RNA作為I旲板而獲得。另一方面，考慮到在宿主細(xì)胞中的表達(dá)效率，通常優(yōu)選選擇非常經(jīng)常用于所用宿主細(xì)胞的密碼子。在各種生物品種中密碼子的使用頻率數(shù)據(jù)可以從遺傳密碼使用頻率數(shù)據(jù)庫獲得。本發(fā)明的核酸的也可通過DNA/RNA自動(dòng)合成儀進(jìn)行化學(xué)合成。
[0033]在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了含有上述本發(fā)明的多肽或核酸的疫苗和藥物組合物。在本發(fā)明提供的所述疫苗和藥物組合物可用于治療或預(yù)防癌癥。上述本發(fā)明的多肽可用作治療或預(yù)防癌癥的疫苗和藥物組合物。上述本發(fā)明的核酸也可用作治療或預(yù)防癌癥的疫苗和藥物組合物。本發(fā)明的核酸可以通過慣用的方式表達(dá)從而得到本發(fā)明的多肽，進(jìn)而用于上述用途。
[0034]本發(fā)明的多肽可被呈遞至抗原呈遞細(xì)胞的HLA抗原，因此可治療或預(yù)防患者的腫瘤。本發(fā)明的多肽可被呈遞至抗原呈遞細(xì)胞的HLA，特異性激發(fā)能識(shí)別HLA抗原和呈遞的多肽的結(jié)合的復(fù)合物的T細(xì)胞，特別是CD8+T細(xì)胞，可增殖從而殺死腫瘤細(xì)胞，因此可被用于治療或預(yù)防患者的腫瘤。
[0035]包含本發(fā)明的多肽作為活性成分的用于誘導(dǎo)T細(xì)胞，特別是CD8+T細(xì)胞的試劑可與藥學(xué)上可接受的載體例如合適的佐劑混合或組合施用，從而有效建立細(xì)胞免疫?？墒褂玫淖魟┑睦影ㄔ谖墨I(xiàn)Clin.Microbiol.Rev.,7:277-289, 1994 (其在此處引入作為參考)中描述的那些。[0036]本發(fā)明的多肽能夠在HLA A2與HLA A3兩個(gè)大型中特別有效地被呈遞和誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞(CTL)。HLA A2 型包括 A*0201、A*0202、A*0204、A*0205、A*0206、A*0207和A*0208。HLA A3包括A*0301、A*1101、A*3101和A*6801。這兩個(gè)大型在中國(guó)人的總平均分布頻率超過85%。因此，本發(fā)明的多肽和基于本發(fā)明的多肽的預(yù)防和治療腫瘤的疫苗或藥物組合物能夠有效的覆蓋大部分人群。優(yōu)選的，本發(fā)明的多肽能夠在HLA A2型中有效地被呈遞和誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)。更優(yōu)選的，本發(fā)明的多肽能夠在A*0201、A*0202型中有效地被呈遞和誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)。
[0037]包含本發(fā)明的多肽或衍生物作為活性成分的用于誘導(dǎo)預(yù)防或治療性免疫反應(yīng)的疫苗可與藥學(xué)上可接受的載體例如合適的佐劑混合或組合施用，從而更有效建立免疫反應(yīng)。
[0038]可使用的佐劑的實(shí)例包括，例如，微生物來源的成分或其衍生物，細(xì)胞因子，植物來源的成分或其衍生物，海洋生物來源的成分或其衍生物，礦物質(zhì)凝膠例如氫氧化鋁、溶血卵磷脂，表面活性劑例如多元醇，聚陰離子，肽，油性乳化劑(乳化劑制劑)等等。另外也可考慮脂質(zhì)體制劑，與具有幾微米直徑的珠連接的納米微粒制劑，具有連接的脂的制劑，微球制劑，微膠囊制劑等等。
[0039]本發(fā)明的上述疫苗或藥物組合物的施用的方法包括皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、靜脈施用等等。在制劑中的本發(fā)明的肽的劑量可根據(jù)待治療的疾病，患者的年齡和體重等適當(dāng)?shù)卣{(diào)整。通常，本發(fā)明的肽在制劑中的劑量為0.0001至lOOOmg，優(yōu)選0.001至lOOOmg，更優(yōu)選
0.1至10mg，優(yōu)選地每幾天或I至幾個(gè)月施用I次。
[0040]上述本發(fā)明的疫苗和藥物組合物也可通過體外方法用于治療腫瘤患者。換句話說，本發(fā)明的多肽或核酸可在體外與抗原呈遞細(xì)胞和/或免疫效應(yīng)細(xì)胞接觸，產(chǎn)生能夠識(shí)別本發(fā)明抗原或抗原復(fù)合體的抗原呈遞細(xì)胞，從而誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞，特別是cd8+t細(xì)胞，然后返回患者體內(nèi)以用于預(yù)防或治療癌癥。本發(fā)明提供了通過在體外將來源于腫瘤患者的外周血淋巴細(xì)胞和本發(fā)明的多肽或核酸接觸而誘導(dǎo)的T細(xì)胞，特別是cd8+t細(xì)胞，以及產(chǎn)生上述細(xì)胞的方法。
[0041]在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了產(chǎn)生抗原呈遞細(xì)胞的方法。在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，所述方法包括將上述本發(fā)明的多肽與具有抗原呈遞能力的細(xì)胞接觸的步驟。在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，所述方法包括將上述本發(fā)明的核酸與具有抗原呈遞能力的細(xì)胞接觸的步驟。如上所述的本發(fā)明的多肽和核酸可與具有抗原呈遞能力的細(xì)胞接觸，可以產(chǎn)生抗原呈遞細(xì)胞。將本發(fā)明的多肽或核酸與具有抗原呈遞能力的細(xì)胞接觸，可以產(chǎn)生抗原呈遞細(xì)胞。本發(fā)明的多肽和核酸可在體外使用，用于預(yù)防或治療腫瘤。例如，通過在體外將本發(fā)明的多肽或核酸與具有抗原呈遞能力的細(xì)胞接觸，可以產(chǎn)生抗原呈遞細(xì)胞。本發(fā)明的多肽和核酸也可在體內(nèi)使用，用于預(yù)防或治療腫瘤。
[0042]在本發(fā)明中，具有抗原呈遞能力的細(xì)胞是在所述細(xì)胞表面表達(dá)呈遞多肽的HLA抗原的細(xì)胞。其中一種具有抗原呈遞能力的細(xì)胞是樹突細(xì)胞。
[0043]本發(fā)明提供了一種抗原呈遞細(xì)胞，在所述細(xì)胞表面表達(dá)呈遞本發(fā)明的多肽的HLA抗原的細(xì)胞。其中一種具有抗原呈遞能力的細(xì)胞是樹突細(xì)胞。本發(fā)明的抗原呈遞細(xì)胞可以通過將本發(fā)明的多肽或核酸加入上述具有抗原呈遞能力的細(xì)胞而制備。
[0044]本發(fā)明的抗原呈遞細(xì)胞可通過下述方法獲得:從腫瘤患者中分離具有抗原呈遞能力的細(xì)胞，用本發(fā)明的多肽在體外刺激細(xì)胞，并允許抗原呈遞細(xì)胞呈遞HLA抗原和多肽的復(fù)合物。當(dāng)使用樹突細(xì)胞時(shí)，可從腫瘤患者的外周血中分離淋巴細(xì)胞、去除不能粘附培養(yǎng)皿的細(xì)胞、在GM-CSF和IL-4的存在下培養(yǎng)粘附細(xì)胞以誘導(dǎo)樹突細(xì)胞、和培養(yǎng)并用本發(fā)明的肽刺激樹突細(xì)胞而制備本發(fā)明的抗原呈遞細(xì)胞。
[0045]在通過將本發(fā)明的核酸加入到具有抗原呈遞能力的細(xì)胞中而制備本發(fā)明的抗原呈遞細(xì)胞。所述核酸可為DNA或RNA形式。所述核酸可在具有抗原呈遞能力的細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的多肽。
[0046]本發(fā)明提供了一種免疫效應(yīng)細(xì)胞，所述細(xì)胞能夠特異性識(shí)別表面表達(dá)呈遞了本發(fā)明的多肽和HLA抗原復(fù)合物的呈遞細(xì)胞，并被激活并發(fā)生增殖，分化成效應(yīng)細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞包括各種T細(xì)胞，例如CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種免疫效應(yīng)細(xì)胞，其為CD8+T細(xì)胞，對(duì)癌癥細(xì)胞有殺傷力，使癌癥細(xì)胞破裂而死亡，還成為記憶細(xì)胞，再次遇到相同抗原刺激時(shí)，它將更迅速地增殖分化為效應(yīng)細(xì)胞。
[0047]本發(fā)明的免疫效應(yīng)細(xì)胞可以通過將本發(fā)明的多肽或核酸加入具有抗原呈遞能力的細(xì)胞，然后將呈遞了本發(fā)明的多肽和HLA抗原復(fù)合物的呈遞細(xì)胞與具有免疫效應(yīng)能力的細(xì)胞接觸而制備。
[0048]本發(fā)明提供的上述本發(fā)明的抗原呈遞細(xì)胞可用作治療或預(yù)防癌癥的疫苗或藥物組合物。本發(fā)明的抗原呈遞細(xì)胞具有免疫誘導(dǎo)活性，可用于制備誘導(dǎo)抗原特異性效應(yīng)細(xì)胞的試劑。被誘導(dǎo)的cd8+t細(xì)胞能夠通過細(xì)胞毒性作用和淋巴因子的產(chǎn)生發(fā)揮抗腫瘤作用。因此，本發(fā)明的抗原呈遞細(xì)胞可為用于治療或預(yù)防腫瘤的疫苗或藥物組合物的活性成分。包含抗原呈遞細(xì)胞作為活性成分的用于誘導(dǎo)CTL的疫苗可包含鹽水、磷酸鹽緩沖液(PBS)、培養(yǎng)基等等以穩(wěn)定地維持抗原呈遞細(xì)胞。施用的方法包括靜脈內(nèi)施用?？蓪乖蔬f細(xì)胞作為活性成分的用于誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞的試劑返回患者的體內(nèi)，因此可在對(duì)本發(fā)明多肽有反應(yīng)的患者體內(nèi)有效誘導(dǎo)特異性CD8+T細(xì)胞，結(jié)果可治療或預(yù)防腫瘤。
[0049]本發(fā)明的免疫效應(yīng)細(xì)胞可用作治療或預(yù)防癌癥的疫苗或藥物組合物。本發(fā)明的效應(yīng)細(xì)胞包括各種T細(xì)胞，例如cd8+t細(xì)胞。本發(fā)明的cd8+t細(xì)胞能夠通過細(xì)胞毒性作用和淋巴因子的產(chǎn)生發(fā)揮抗腫瘤作用。因此，本發(fā)明的免疫效應(yīng)細(xì)胞可為用于治療或預(yù)防腫瘤的疫苗或藥物組合物的活性成分。包含抗原呈遞細(xì)胞作為活性成分的免疫效應(yīng)細(xì)胞的疫苗可包含鹽水、磷酸鹽緩沖液(PBS)、培養(yǎng)基等等以穩(wěn)定地維持免疫效應(yīng)細(xì)胞。施用的方法包括靜脈內(nèi)施用?？蓪庖咝?yīng)細(xì)胞作為活性成分的試劑返回患者的體內(nèi)，結(jié)果可治療或預(yù)防腫瘤。
[0050] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了含有上述本發(fā)明的抗原呈遞細(xì)胞或免疫效應(yīng)細(xì)胞的疫苗和藥物組合物。在本發(fā)明提供的所述疫苗和藥物組合物可用于治療或預(yù)防癌癥。上述本發(fā)明的抗原呈遞細(xì)胞或免疫效應(yīng)細(xì)胞可用作治療或預(yù)防癌癥的疫苗和藥物組合物。
[0051]上述本發(fā)明的含有抗原呈遞細(xì)胞或免疫效應(yīng)細(xì)胞的疫苗和藥物組合物可通過體外方法用于治療腫瘤患者。本發(fā)明的多肽或核酸可在體外與抗原呈遞細(xì)胞和/或免疫效應(yīng)細(xì)胞接觸，產(chǎn)生能夠識(shí)別本發(fā)明抗原或抗原復(fù)合體的抗原呈遞細(xì)胞，從而誘導(dǎo)特異性效應(yīng)細(xì)胞，例如T細(xì)胞(特別是CD8+T細(xì)胞)，然后將所述抗原呈遞細(xì)胞和/或免疫效應(yīng)細(xì)胞返回患者體內(nèi)以用于預(yù)防或治療癌癥。在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述患者為HLA I型，優(yōu)選為HLAA2或HLA A3型，更優(yōu)選為HLA A2型，最優(yōu)選為A*0201或A*0202型。
[0052]本發(fā)明的免疫效應(yīng)細(xì)胞，例如T細(xì)胞(特別是CD8+T細(xì)胞)，可用作用于治療或預(yù)防腫瘤的疫苗或藥物組合物的活性成分。
[0053]上述本發(fā)明的多肽或核酸，以及上述本發(fā)明的抗原呈遞細(xì)胞或免疫效應(yīng)細(xì)胞，可用于預(yù)防或治療癌癥。所述癌癥包括血癌、實(shí)體瘤等，更具體地講，包括肺癌、惡性淋巴瘤(例如網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤、淋巴肉瘤、霍奇金病(Hodgkin’s disease)等)、消化器官癌(例如胃癌、膽囊癌、膽管癌、胰腺癌、肝癌、結(jié)腸癌、直腸癌等)、乳腺癌、卵巢癌、肌與骨骼肉瘤(musculoskeletal sarcoma)(例如骨肉瘤(osteosarcoma)等)、膀胱癌、白血病(例如急性白血病，包括慢性髓細(xì)胞性白血病急性發(fā)作)、腎癌、前列腺癌等，優(yōu)選為消化器官癌，例如胃癌、膽囊癌、膽管癌、胰腺癌、肝癌、結(jié)腸癌、直腸癌等。優(yōu)選的，為肝癌。
[0054]本發(fā)明還提供了如前所述的本發(fā)明的多肽或其變體，或如前所述的本發(fā)明的核酸，或如前所述的本發(fā)明的抗原呈遞細(xì)胞，或如前所述的本發(fā)明的免疫效應(yīng)細(xì)胞在用于制備治療或預(yù)防癌癥的疫苗或藥物組合物中的用途。所述癌癥包括血癌、實(shí)體瘤等，更具體地講，包括肺癌、惡性淋巴瘤(例如網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤、淋巴肉瘤、霍奇金病(Hodgkin’s disease)等)、消化器官癌(例如胃癌、膽囊癌、膽管癌、胰腺癌、肝癌、結(jié)腸癌、直腸癌等)、乳腺癌、卵巢癌、肌與骨骼肉瘤(musculoskeletal sarcoma)(例如骨肉瘤(osteosarcoma)等)、膀胱癌、白血病(例如急性白血病，包括慢性髓細(xì)胞性白血病急性發(fā)作)、腎癌、前列腺癌等，優(yōu)選為消化器官癌，例如胃癌、膽囊癌、膽管癌、胰腺癌、肝癌、結(jié)腸癌、直腸癌等。優(yōu)選的，為肝癌。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0055]圖1a細(xì)胞系MUCl蛋白表達(dá)western免疫印跡檢測(cè)；
[0056]圖1b細(xì)胞系HLA-A2蛋白表達(dá)western免疫印跡檢測(cè)；
[0057]圖2a受呈遞本發(fā)明多肽的樹突細(xì)胞激發(fā)的T細(xì)胞增殖；
[0058]圖2b對(duì)照組的T細(xì)胞形態(tài)；
[0059]圖2c荷載了抗原肽的DCs刺激的T細(xì)胞形態(tài)；
[0060]圖3T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞效果；
[0061]圖4T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞效果；
[0062]圖5T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞效果；
[0063]圖6T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞效果；[0064]圖7T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞效果；
[0065]圖8Τ細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFNy ；
[0066]圖9成熟DC細(xì)胞表面標(biāo)記；
[0067]圖1Oa T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞效果；
[0068]圖1Ob T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞效果；
[0069]圖11細(xì)胞系MUCl蛋白表達(dá)western免疫印跡檢測(cè)；
[0070]圖12a抗原肽在小鼠體內(nèi)治療腫瘤效果；
[0071]圖12b抗原肽在小鼠體內(nèi)預(yù)防腫瘤效果。
【具體實(shí)施方式】
[0072]通過以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但這些實(shí)施例不在任何方面限制本發(fā)明。
[0073]實(shí)施例1抗原肽的合成
[0074]人工合成多肽MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTGS (SEQ ID NO:1)，以下簡(jiǎn)稱為抗原肽。合成的多肽純化至97%。將凍干的抗原肽溶解于二甲亞砜(25mM)，儲(chǔ)存于_80°C。
[0075]用同樣方法合成多肽FLLLLLTVLT (SEQ ID NO:2), LLLLLTVLTV (SEQ ID NO:3),LLLLTVLTVV (SEQ ID NO:4), FFLLLLLTVL (SEQ ID NO:5), GTQSPFFLLL (SEQ ID NO:6),TQSPFFLLLL (SEQ ID NO:7)，分別簡(jiǎn)稱為抗原肽1、抗原肽2、抗原肽3、抗原肽4、抗原肽5和抗原肽6。
[0076]實(shí)施例2樹突細(xì)胞(Dendritic Cells，DCs)的制備
[0077]外周血中單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，其體積、形狀比重為
1.075左右。用比重為1.077的Ficol1-Hypaque分離液進(jìn)行密度梯度離心，使一定比重的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布，可將各種血細(xì)胞加以分離。
[0078]從香港紅十字血液中心取得健康志愿者的白細(xì)胞濃縮液，用PBS將其稀釋適當(dāng)倍數(shù)，然后加入到Ficoll-Hypaque分離液表面上，18_20°C, 800g密度梯度離心30min,離心完畢，離心管內(nèi)容物分為三層，上層為血漿(內(nèi)含血小板)，中間層為分離液，底層為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞，在上、中層液分界面處可見到乳白色渾濁的PBMC層。取出PBMC層，重懸于PBS中，400g離心lOmin，重復(fù)上步，將細(xì)胞沉淀重懸于含有10%胎牛血清的RPMI1640中，37°C培養(yǎng)2小時(shí)，取出非貼壁細(xì)胞，用于分離T細(xì)胞，向貼壁的細(xì)胞中加入含1000U/ml hGM-CSF和500U/ml hIL-4的RPMI1640培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)I周，誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為DCs，其中每?jī)商鞊Q一次培養(yǎng)基和細(xì)胞因子，收獲非吸附的及吸附較松的細(xì)胞，即為DCs。
[0079]實(shí)施例3T細(xì)胞的制備(尼龍棉法)
[0080]T細(xì)胞表面絨毛短而少，B細(xì)胞絨毛多而長(zhǎng)，由于細(xì)胞表面光滑程度不同，B細(xì)胞在37°C時(shí)易戮附于尼龍棉纖維上，而T細(xì)胞則不具有此能力。利用這一特性，可分離T細(xì)胞和B細(xì)胞。
[0081]尼龍棉柱的制備:lg尼龍棉/柱滅菌處理后，加入RPMI1640培養(yǎng)基，37°C放置2小時(shí)，讓RPMI1640流出。將上述的非貼壁細(xì)胞重懸于適當(dāng)體積的RPMI1640中，使得細(xì)胞濃度為0.5-1.0x107ml，然后加入到所制備的尼龍棉柱中，2ml/柱，37°C保溫I小時(shí)，向尼龍棉柱中加入RPMI1640，IOml/柱，洗脫未吸附到尼龍棉上的細(xì)胞，收集洗脫液，即為T細(xì)胞懸液。400g離心5min，將細(xì)胞沉淀重懸于細(xì)胞凍存液中，凍存?zhèn)溆谩0082]實(shí)施例4T細(xì)胞增殖測(cè)定(3H_TdR摻入法)
[0083]細(xì)胞增殖的前提是細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的復(fù)制，一般一個(gè)細(xì)胞周期大致分為4個(gè)時(shí)期，即Gl期、S期、G2期、M期。其中，S期是DNA合成期，主要功能是進(jìn)行DNA合成。3H_TdRSP (甲基-3H)胸腺嘧啶核苷酸是DNA合成的前體，將其加入細(xì)胞培養(yǎng)液中后，會(huì)被細(xì)胞攝取，可作為DNA合成的原料。細(xì)胞合成的DNA越多，所摻入的3H-TdR也越多，檢測(cè)所摻入的3H-TdR就可反映出細(xì)胞增殖的程度。
[0084]向DCs的培養(yǎng)液中加入適當(dāng)濃度的抗原如本實(shí)驗(yàn)的各抗原肽，37°C溫育4小時(shí)，收獲DCs，并用PBS洗一次，按照一定的細(xì)胞比例，將來自同一志愿者的DCs和T細(xì)胞加入到96孔平底培養(yǎng)板中，37°C共培養(yǎng)5天后，加入3H-TdR，IuCi/孔，37°C保溫18小時(shí)，利用多頭細(xì)胞收集器，將細(xì)胞收集到玻璃纖維濾紙上，并依次用PBS、5%三氯乙酸和無水乙醇洗滌各三次，烘干濾紙，將濾紙放入到閃爍液中，在β液閃計(jì)數(shù)儀上測(cè)定cpm值。
[0085]實(shí)施例5細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTLs)測(cè)定(LDH法)
[0086]乳酸脫氫酶(LDH)是活細(xì)胞的胞漿內(nèi)含酶之一，正常情況下不能透過細(xì)胞膜，但當(dāng)靶細(xì)胞受到效應(yīng)細(xì)胞攻擊而受損時(shí)，細(xì)胞膜的通透性改變，LDH就會(huì)釋放到介質(zhì)中。而LDH在催化乳酸生成丙酮酸的過程中，可使氧化輔酶I(NAD)變成還原輔酶I (NADH)，后者再通過遞氫體吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)還原碘硝基氯化四氧唑(INT)，INT接受H2+被還原成紫紅色的甲肷化合物，該化合物在490nm處有一高吸收峰，利用讀取的A490nm作為指標(biāo)，可知靶細(xì)胞被效應(yīng)細(xì)胞殺傷的程度。
[0087]向DCs的培養(yǎng)液中加入適當(dāng)濃度的抗原如本實(shí)驗(yàn)的各抗原肽，37°C溫育4小時(shí)，收獲DCs，并用PBS洗一次，按照一定的比例，將來自同一志愿者的DCs和T細(xì)胞加入到24孔培養(yǎng)板中，37°C共培養(yǎng)7-10天，其中培養(yǎng)液中加入20U/ml hIL_2，利用Ficoll-Hypaque密度梯度離心收集T細(xì)胞以作為效應(yīng)細(xì)胞。5mM EDTA消化腫瘤細(xì)胞系(例如SMMC-7721或K562)細(xì)胞以作為靶細(xì)胞。
[0088]分別將效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞重懸于一定體積的分析培養(yǎng)基(含1%BSA的RPMI1640)中，按不同的比例，將效應(yīng)細(xì)胞(IOOul)和靶細(xì)胞(IOOul)加入到96孔圓底培養(yǎng)板中，37°C保溫5小時(shí)，取出上清IOOul/孔，并加入到96孔酶標(biāo)板中，加入IOOul/孔LDH反應(yīng)液，室溫下暗處反映30min，加入IMHCL終止液，50ul/孔，測(cè)定A490nm，A630nm作為參照波長(zhǎng)。計(jì)算細(xì)胞毒性:細(xì)胞毒性(%)=[(殺傷試驗(yàn)孔-靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放孔)/ (最大釋放孔-靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔)]X100%。
[0089]注:殺傷實(shí)驗(yàn)孔為效應(yīng)細(xì)胞+靶細(xì)胞；靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔為靶細(xì)胞+分析培養(yǎng)基；效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放孔為效應(yīng)細(xì)胞+分析培養(yǎng)基；最大釋放孔為靶細(xì)胞+2%TritionX100。
[0090]實(shí)施例6ELISA_spot (ELISPOT)法測(cè)定 IFNy
[0091]細(xì)胞因子ELISP0T法用于測(cè)定單細(xì)胞懸液中細(xì)胞因子分泌細(xì)胞的數(shù)量，它檢測(cè)速度快，具有很高的靈敏度，且易于操作。其原理是先將高親和力的抗細(xì)胞因子的抗體包被于ELISP0T板上，當(dāng)將待測(cè)細(xì)胞加入到ELISP0T板中后，其所分泌的細(xì)胞因子就會(huì)被所包被的抗體捕捉到，這樣在除掉待測(cè)細(xì)胞懸液后，加入標(biāo)記的另一種抗細(xì)胞因子的抗體，然后加入相應(yīng)的顯色試劑后，就可以在ELISP0T板上產(chǎn)生表示細(xì)胞因子分泌數(shù)量和位置的斑點(diǎn)。
[0092]向DCs的培養(yǎng)液中加入適當(dāng)濃度的抗原如本實(shí)驗(yàn)的各抗原肽，37°C溫育4小時(shí)，收獲DCs，并用PBS洗一次，按照一定的比例，將來自同一志愿者DCs和T細(xì)胞加入24孔培養(yǎng)板中，37°C共培養(yǎng)7-10天，其中培養(yǎng)液中加入20U/ml hIL_2，利用Ficol1-Hypaque密度梯度離心并收集T細(xì)胞以作為效應(yīng)細(xì)胞，利用5mM EDTA消化SMMC-7721，并用、射線輻射處理以作為靶細(xì)胞，分別將效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞重懸于一定體積的培養(yǎng)基中，按一定的比例，將效應(yīng)細(xì)胞(IOOul)和靶細(xì)胞(IOOul)加入到預(yù)先包被了 IFNy抗體的96孔ELISP0T反應(yīng)板中，37°C溫育18小時(shí)，去除細(xì)胞懸液，PBST洗10次，加入生物素標(biāo)記的IFNy抗體，37°C溫育2小時(shí)，PBST洗10次，加入酶標(biāo)記的抗生物素的抗體，37’ C溫育2小時(shí)，PBST洗10次，加入底物溶液，室溫下暗處反應(yīng)15-30min，利用ELISP0T自動(dòng)讀數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)。[0093]實(shí)施例7流式細(xì)胞測(cè)定(FACS)[0094]制備單細(xì)胞懸液:收獲待測(cè)細(xì)胞，并用冷的PBS洗滌細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于50ul/管PBS中，加入相應(yīng)的抗體，冰上放置I小時(shí)，用冷PBS洗滌2次，加入FITC標(biāo)記的二抗，冰上放置30min，用冷PBS洗滌2次，將細(xì)胞重懸于2%多聚甲醛中，用于流式細(xì)胞測(cè)定。[0095]實(shí)施例8Western法鑒定具有MUCl蛋白和HLA-A2蛋白的腫瘤細(xì)胞系[0096]采用本領(lǐng)域通用的SDS-PAGE和Western免疫印跡法，即蛋白質(zhì)經(jīng)單向電泳后分離后被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維濾膜上，然后用放射性或酶標(biāo)記的特異抗體來檢測(cè)相應(yīng)抗原的存在的方法，來鑒定腫瘤細(xì)胞含有的蛋白。[0097]實(shí)驗(yàn)使用了腫瘤細(xì)胞系SMMC-7721和SMMC-7721-0201。SMMC-7721是上海細(xì)胞生物學(xué)研究所提供的可商購的肝癌腫瘤細(xì)胞系(參見Lu J.,Xu R.B.and Doung R.C.(1985)The glucocorticoid receptors and the induction of tyrosine aminotransferase byglucocorticoid in the human liver cancer cell line(SMMC-7721)in vitr0.Shi YanSheng Wu Xue Baol8:231-238)。SMMC-7721-0201 是通過在 SMMC-7721 轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定表達(dá)人類HLA-0201基因的細(xì)胞系。[0098]先用0.25%胰蛋白酶消化腫瘤細(xì)胞SMMC-7721和SMMC-7721-0201，然后用1640完全培養(yǎng)基(含10%FBS和1%青-鏈霉素)吹散細(xì)胞，收集于15ml離心管中。lOOOrpm，離心5min，棄去上清液。用80 μ I PBS重懸細(xì)胞(細(xì)胞量多可以適當(dāng)增加PBS體積)，再加入5 X SDS-PAGE上樣Buffer，混勻后沸水浴煮5min。[0099]樣品處理后按常規(guī)方法進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)和 Western 免疫印跡實(shí)驗(yàn)。Western 免疫印跡實(shí)驗(yàn)中的一抗分別為抗Mucl單抗和抗HLA-A2單抗(BB7.2細(xì)胞上清)，二抗為羊抗鼠 IgG-HRP。[0100]圖1a和圖1b為SDS-PAGE和Western免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果。[0101]其中圖1a的第I泳道為SMMC-7721-0201細(xì)胞株樣品，第二泳道為SMMC-7721細(xì)胞株樣品。[0102]其中圖1b的第一泳道為SMMC-7721-0201細(xì)胞株樣品，第二泳道為SMMC-7721細(xì)胞株樣品。[0103]如圖1a所示，腫瘤細(xì)胞株SMMC-7721和SMMC-7721-0201都表達(dá)了 MUCl蛋白。[0104]如圖1b 所示，腫瘤細(xì)胞株 SMMC-7721 為 HLA-A2 陰性；SMMC-7721-0201 為 HLA-A2陽性。[0105]另外的實(shí)驗(yàn)還測(cè)試了 SMMC-7721和SMMC-7721-0201中MHC I的表達(dá)情況，證明細(xì)胞株 SMMC-7721 和 SMMC-7721-0201 是 MHC I 陽性。[0106]實(shí)施例9荷載了各抗原肽的DCs刺激T細(xì)胞的增殖
[0107]利用實(shí)施例1 中制備的抗原肽，即 MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTGS (SEQ ID NO:1)來刺激DCs，然后利用得到的荷載了抗原肽的DCs來刺激自身的T細(xì)胞，測(cè)定荷載了抗原肽的DCs能否刺激自身T細(xì)胞的增殖。
[0108]用10ug/ml抗原肽來荷載DCs，荷載條件是37°C溫育4小時(shí)，然后DCs與自身T細(xì)胞以不同的比例(DCs:T=1: 10和DCs:T=1:3)進(jìn)行共培養(yǎng)，5天后，加入3H_TdR，18小時(shí)后測(cè)定3H-TdR的攝入，以測(cè)定T細(xì)胞的增殖狀況。作為對(duì)照，T細(xì)胞與未荷載抗原肽的DCs共培養(yǎng)，或T細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)。如圖2a所示，各組T細(xì)胞的增殖水平是明顯不同的，在DCs:T=l: 10時(shí)，荷載了抗原肽的DCs所刺激的T細(xì)胞的增殖水平是未荷載DCs所刺激的T細(xì)胞增殖水平的10倍，及單獨(dú)培養(yǎng)的T細(xì)胞的15倍；當(dāng)將DCs:T提高到1:3時(shí)，T細(xì)胞的增殖水平也明顯升高。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:荷載了抗原肽的DCs能夠有效的刺激自身T細(xì)胞的增殖，而未荷載抗原肽的DCs則不能刺激自身T細(xì)胞的增殖。
[0109]另外，如圖2b和2c所示，在形態(tài)上，經(jīng)荷載了抗原肽的DCs刺激的T細(xì)胞明顯不同于對(duì)照組的T細(xì)胞，呈現(xiàn)明顯的激活狀態(tài)，如細(xì)胞體積增大、數(shù)目增多等。
[0110]對(duì)抗原肽1、抗原肽2、抗原肽3、抗原肽4、抗原肽5和抗原肽6進(jìn)行相同測(cè)試，荷載了抗原肽的DCs能夠有效的刺激自身T細(xì)胞的增殖。
[0111]實(shí)施例10荷載了各抗原肽的DCs能夠激活腫瘤細(xì)胞特異性的CTLs
[0112]在機(jī)體抗腫瘤的免疫應(yīng)答中，CTLs發(fā)揮著極其重要的作用。利用實(shí)施例1中制備的抗原肽來刺激DCs，然后利用制得的荷載了抗原肽的DCs來刺激自身的T細(xì)胞，測(cè)定荷載了抗原肽的DCs能否激活腫瘤細(xì)胞特異性的CTLs。
[0113]用不同濃度的抗原肽來荷載DCs,37°C溫育4小時(shí)，然后DCs與T細(xì)胞以DCs: T=1: 5的比例進(jìn)行共培養(yǎng)，7-10天后，利用LDH法測(cè)定T細(xì)胞對(duì)表達(dá)MUCl蛋白的肝癌細(xì)胞SMMC-7721-0201的殺傷力。實(shí)驗(yàn)中，T細(xì)胞與荷載抗原肽的DCs共培養(yǎng)，作為對(duì)照，T細(xì)胞與未荷載抗原肽的DCs共培養(yǎng)、或T細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)。如圖3所示，經(jīng)荷載了抗原肽的DCs所刺激的T細(xì)胞能夠有效的殺傷表達(dá)MUCl蛋白的腫瘤細(xì)胞，而與未荷載抗原肽的DCs共培養(yǎng)的T細(xì)胞及單獨(dú)培養(yǎng)的T細(xì)胞則不能殺傷腫瘤細(xì)胞。如圖4所示，當(dāng)增加荷載DCs的抗原肽的濃度時(shí)，經(jīng)此DCs所刺激的T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力也隨之增強(qiáng)。
[0114]為了測(cè)定效應(yīng)細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力是由于激活了腫瘤細(xì)胞特異的CTLs而不是由于非特異性殺傷細(xì)胞NK細(xì)胞的存在，在細(xì)胞毒性測(cè)定中，利用可商購的NK細(xì)胞敏感性細(xì)胞系K562(ATCC.Cat.n0.:CCL_243)作為靶細(xì)胞，如圖5所示，經(jīng)荷載了抗原肽的DCs刺激的T細(xì)胞能夠有效的殺傷表達(dá)MUCl蛋白的肝癌細(xì)胞SMMC-7721，而SMMC-7721正是抗原肽的來源細(xì)胞。但經(jīng)荷載了抗原肽的DCs刺激的T細(xì)胞不能殺傷K562細(xì)胞。表明殺傷肝癌細(xì)胞的是特異性的CTLs而不是非特異的NK細(xì)胞。 [0115]為了進(jìn)一步測(cè)定對(duì)肝癌細(xì)胞殺傷活性的特異性，在細(xì)胞毒性測(cè)定中，利用了人的肝癌細(xì)胞系SMMC-7721-0201和SMMC-7721作為靶細(xì)胞，另外，為了測(cè)定殺傷活性是否是MHCI限制性的，將靶細(xì)胞表面的MHC I用抗MHC I的抗體封閉，如實(shí)施例8的結(jié)果所述，其中SMMC-7721-0201和SMMC-7721都是MHC I和抗原肽陽性。如圖6實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CTLs對(duì)SMMC-7721-0201的殺傷活性明顯高于對(duì)SMMC-7721的殺傷活性，當(dāng)SMMC-7721-0201表面的MHC I被封閉后，CTLs對(duì)其的殺傷力也消失了，相反的，當(dāng)SMMC-7721表面的MHC I被封閉后，CTLs對(duì)其的殺傷力卻沒有明顯變化。這表明CTLs對(duì)SMMC-7721的殺傷力是MHC I限制性，從而說明了對(duì)SMMC-7721的殺傷活性是由CTLs介導(dǎo)的。
[0116]由于作為抗原來源的細(xì)胞SMMC-7721和作為效應(yīng)細(xì)胞的T細(xì)胞不是來自同一個(gè)體，所以T細(xì)胞對(duì)SMMC-7721的殺傷活性可能是同種異型反應(yīng)(allogeneic response)。為了排除這種同種異型反應(yīng)的可能性，在細(xì)胞毒性測(cè)定中，利用荷載了抗原肽的DCs及未荷載的DCs作為靶細(xì)胞。如圖7所示，由于DCs和T細(xì)胞是來自于同一個(gè)體，因此T細(xì)胞對(duì)未荷載的DCs沒有殺傷活性，相反的，T細(xì)胞對(duì)荷載了抗原肽的DCs表現(xiàn)出明顯的殺傷活性，這是由于荷載了抗原肽的DCs對(duì)抗原肽所結(jié)合的腫瘤多肽進(jìn)行了加工呈遞，在細(xì)胞表面表達(dá)腫瘤抗原，這表明CTLs對(duì)SMMC-7721的殺傷活性是特異于腫瘤抗原的抗腫瘤免疫應(yīng)答而不是同種異型反應(yīng)。
[0117]以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:抗原肽所結(jié)合腫瘤抗原被DCs成功的加工并呈遞給T細(xì)胞，從而有效的激活了腫瘤細(xì)胞特異的CTLs。
[0118]對(duì)抗原肽1、抗原肽2、抗原肽3、抗原肽4、抗原肽5和抗原肽6進(jìn)行相同測(cè)試，其能有效激活腫瘤細(xì)胞特異的CTLs。
[0119]實(shí)施例11荷載了抗原肽的DCs能夠刺激T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFNy
[0120]在抗腫瘤的免疫應(yīng)答中，細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤應(yīng)答起著關(guān)鍵作用，其中，CTLs反應(yīng)和IFNy的分泌是細(xì)胞應(yīng)答的主要特征。
[0121]測(cè)定了荷載了抗原肽的DCs能否刺激自身T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFNy。按實(shí)施例6描述的方法，用40ug/ml的抗原肽荷載DCs，37°C溫育4小時(shí)，然后DCs與T細(xì)胞以DCs: T=1: 5的比例進(jìn)行共培養(yǎng)，7-10天后，測(cè)定T細(xì)胞分泌IFN Y的狀況。作為對(duì)照，T細(xì)胞與未荷載抗原肽的DCs共培養(yǎng)，或T細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)。刺激過的自身T細(xì)胞通過梯度離心收獲，IFNy分泌用ELISP0T測(cè)定。自身T細(xì)胞和未荷載抗原肽DCs共培養(yǎng)及自身T細(xì)胞自身作為對(duì)照。如圖8所示，經(jīng)荷載了抗原`肽的DCs所刺激的T細(xì)胞在遇到靶細(xì)胞SMMC-7721時(shí)，能夠分泌高水平的IFN Y，而經(jīng)未荷載抗原肽的DCs刺激的T細(xì)胞及單獨(dú)培養(yǎng)的T細(xì)胞在遇到靶細(xì)胞SMMC-7721時(shí)，則沒有明顯的IFNy分泌。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述的CTLs實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，表明荷載了抗原肽的DCs能夠激活腫瘤細(xì)胞特異的T細(xì)胞，該T細(xì)胞能夠分泌高水平的細(xì)胞因子IFNy。
[0122]實(shí)施例12抗原肽刺激DCs成熟
[0123]如上所述，荷載了抗原肽的DCs能夠激活腫瘤細(xì)胞特異性的CTLs，這表明DCs已經(jīng)加工呈遞了抗原肽所結(jié)合的腫瘤抗原，并引發(fā)了特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答。由于DCs的表型轉(zhuǎn)變，即由不成熟DCs轉(zhuǎn)變成成熟DCs，是DCs發(fā)揮作用的前提，所以可以推出荷載了抗原肽的DCs必定發(fā)生了表型轉(zhuǎn)變。為了檢測(cè)這一推論，測(cè)定了抗原肽能否刺激DCs的成熟。
[0124]DCs在與40ug/ml的抗原肽于37°C溫育4小時(shí)后，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，然后利用流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定DCs表面的HLA-DR、⑶80、⑶86、⑶83和⑶40的表達(dá)狀況。如圖9所示，經(jīng)抗原肽刺激后，DCs表面的HLA-DR、共刺激分子⑶80和⑶86、及細(xì)胞成熟標(biāo)志分子⑶83和CD40的表達(dá)水平明顯提高。這表明，抗原肽能夠有效的刺激DCs成熟，是DCs的有效活化分子。
[0125]以上各實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從腫瘤細(xì)胞中分離純化的各抗原肽結(jié)合了腫瘤抗原，能夠有效的刺激DCs的成熟；而且荷載了抗原肽的DCs能夠有效的加工呈遞腫瘤抗原，并激活腫瘤細(xì)胞特異性的抗腫瘤細(xì)胞免疫應(yīng)答，其中包括刺激T細(xì)胞的增殖、激活腫瘤細(xì)胞特異的CTLs和刺激T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN Y等。
[0126]實(shí)施例13荷載了抗原肽的DCs能夠激活腫瘤細(xì)胞特異性的CTLs并有效攻擊腫瘤細(xì)胞
[0127]本實(shí)驗(yàn)測(cè)試了本發(fā)明的各抗原肽的HLA表型特異性。
[0128]實(shí)驗(yàn)采用了購自PerkinElmer (AD0116)的試劑盒進(jìn)行細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的殺傷性測(cè)定:
[0129]用0.25%胰蛋白酶消化靶細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞SMMC-7721和SMMC-7721-020，其中 SMMC-7721 和 SMMC-7721-0201 都為 MUCl 蛋白陽性；SMMC-7721 為 HLA-A2 陰性；SMMC-7721-0201為HLA-A2陽性)后用1640完全培養(yǎng)基(含10%FBS和1%青-鏈霉素)洗滌一次；再用1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)到lX106cells/ml。取Iml細(xì)胞加入I μ I BATDA, 37°C，5%C02培養(yǎng)箱中放置15min。然后200g，離心5min，棄去上清，用含2%FBS的PBS洗滌5次，每次200g離心5min。最后用1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5 X 104cells/ml。
[0130]通過如實(shí)施例9描述的方法向DCs的培養(yǎng)液中分別加入適當(dāng)濃度的抗原，包括抗原肽和抗原肽2來刺激DCs，然后利用得到的荷載了所述抗原肽的DCs來刺激自身的T細(xì)胞。
[0131]收集已被刺激的⑶8+T細(xì)胞，1000rpm離心，棄上清，用1640完全培養(yǎng)基重懸CD8+T細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)到lX106cells/ml。
[0132]取100 μ I CD8+T細(xì)胞和100 μ I腫瘤細(xì)胞(BATDA-loaded)加入至Ij 96孔板中。同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組(培養(yǎng)基對(duì)照)，腫瘤細(xì)胞自發(fā)釋放組(100 μ I腫瘤細(xì)胞+100 μ I培養(yǎng)基)和腫瘤細(xì)胞最大釋放組(10 μ I裂解液+90 μ I培養(yǎng)基+100 μ I腫瘤細(xì)胞)，τ細(xì)胞設(shè)立未刺
激組。實(shí)驗(yàn)組需要設(shè)立3個(gè)重復(fù)孔。
[0133]將96孔板放于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h后，200g離心5min，吸取20 □ I上清到Elisa板中(試劑盒自帶),并加入200 □ I Europium Solution,室溫水平搖動(dòng)15min。使用PerkinElmer公司的檢測(cè)儀器(Victor2V multilabel counter)進(jìn)行檢測(cè),激發(fā)濾光片(emission filter)選擇 615nm。
[0134]實(shí)驗(yàn)結(jié)果的計(jì)算:
[0135]
【權(quán)利要求】
1.一種分離的多肽或其變體，所述多肽包含與下列(a)或(b)的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列: (a)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列； (b)所述(a)的氨基酸序列的片段。
2.權(quán)利要求1的多肽或其變體，所述多肽或其變體可結(jié)合HLAI或HLA II分子并被ra8+T細(xì)胞或ra4+T細(xì)胞識(shí)別。
3.權(quán)利要求1或2的多肽或其變體，其中(b)中所述片段為包含SEQID NO:1所示的氨基酸序列中連續(xù)8-10個(gè)氨基酸的片段。
4.權(quán)利要求3的多肽或其變體，其中(b)中所述片段為包含SEQID NO:1所示的氨基酸序列中連續(xù)10個(gè)氨基酸的片段。
5.權(quán)利要求4的多肽或其變體，所述片段具有FLLLLLTVLT，LLLLLTVLTV，LLLLTVLTVV,FFLLLLLTVL, GTQSPFFLLL, TQSPFFLLLL 的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的多肽或其變體，所述片段可結(jié)合HLAI分子并被CD8+T細(xì)胞識(shí)別。
7.權(quán)利要求6的多肽或其變體，其中所述HLAI為HLA A2或HLA A3型，優(yōu)選為HLAA2，更優(yōu)選為A*0201。
8.一種分離的核酸，其基本上由編碼權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的多肽的堿基序列組成。
9.抗原呈遞細(xì)胞，其可在細(xì)胞表面呈遞權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的多肽或其變體，優(yōu)選的，所述抗原呈遞細(xì)胞為樹突細(xì)胞。
10.免疫效應(yīng)細(xì)胞，其可識(shí)別權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的多肽或其變體或在細(xì)胞表面呈遞權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的多肽或其變體的抗原呈遞細(xì)胞，優(yōu)選的，所述免疫效應(yīng)細(xì)胞為T細(xì)胞，例如CD8+T細(xì)胞或CD4+T細(xì)胞。
11.產(chǎn)生抗原呈遞細(xì)胞的方法，所述方法包括將權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的多肽或其變體與具有抗原呈遞能力的細(xì)胞接觸的步驟，或是包括將權(quán)利要求8中的核酸在具有抗原呈遞能力的細(xì)胞中表達(dá)的步驟，優(yōu)選的，所述具有抗原呈遞能力的細(xì)胞為樹突細(xì)胞。
12.產(chǎn)生免疫效應(yīng)細(xì)胞的方法，所述方法包括將權(quán)利要求9的抗原呈遞細(xì)胞與具有免疫效應(yīng)能力的細(xì)胞接觸的步驟，優(yōu)選的，所述抗原呈遞細(xì)胞為樹突細(xì)胞，以及，優(yōu)選的，其中所述免疫效應(yīng)細(xì)胞為T細(xì)胞，例如CD8+T細(xì)胞或CD4+T細(xì)胞。
13.—種在患者中治療或預(yù)防癌癥的疫苗或藥物組合物，其包括權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的多肽或其變體，或包括權(quán)利要求8的核酸，或包括權(quán)利要求9的抗原呈遞細(xì)胞，或包括權(quán)利要求10的免疫效應(yīng)細(xì)胞。
14.權(quán)利要求13的疫苗或藥物組合物，其中所述患者的HLA為HLAI型，優(yōu)選為HLA A2或HLA A3型，優(yōu)選為HLA A2型，更優(yōu)選為A*0201或A*0202型。
15.權(quán)利要求13或14的疫苗或藥物組合物，其中所述癌癥為血癌、實(shí)體瘤等，優(yōu)選為肺癌、惡性淋巴瘤(例如網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤、淋巴肉瘤、霍奇金病等)、消化器官癌(例如胃癌、膽囊癌、膽管癌、胰腺癌、肝癌、結(jié)腸癌、直腸癌等)、乳腺癌、卵巢癌、肌與骨骼肉瘤(例如骨肉瘤等)、膀胱癌、白血病(例如急性白血病，包括慢性髓細(xì)胞性白血病急性發(fā)作)、腎癌、前列腺癌。
16.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的多肽或其變體，或權(quán)利要求8的核酸，或權(quán)利要求9的抗原呈遞細(xì)胞，或權(quán)利要求10的免疫效應(yīng)細(xì)胞在用于制備治療或預(yù)防癌癥的疫苗或藥物組合物中的用途。`
【文檔編號(hào)】C07K14/47GK103570818SQ201310320965
【公開日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年7月27日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月27日
【發(fā)明者】謝雍, 杜琳 申請(qǐng)人:北京智飛綠竹生物制藥有限公司