Isl1基因及其表達產物在促進HCN4表達中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了Isl1基因及其表達產物在促進HCN4表達中的應用。具體地，本發(fā)明提供了一種Isl1基因、蛋白或其促進劑的用途，用于制備促進HCN4基因或蛋白表達的藥物組合物，或用于制備HCN4的轉錄激活劑。本發(fā)明還提供了誘導型表達Isl1的重組動物細胞，以及一種構建心臟病模型動物的方法。本發(fā)明可用于先天性心臟病動物模型的研究，以及用于先天性心臟病的早期干預。
【專利說明】IsM基因及其表達產物在促進HCN4表達中的應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及先天性心臟病診斷治療領域，具體地，本發(fā)明涉及Isll基因、蛋白在 診斷竇房結異常相關疾病中的應用。

【背景技術】
[0002] 心臟起搏傳導系統(tǒng)是一種特殊的心肌組織，其產生和傳播電脈沖，在調控心臟的 節(jié)律性收縮中起重要作用。起搏傳導系統(tǒng)發(fā)育和功能的異?？蓪е滦穆墒С＜靶脑葱遭?死。
[0003] 在中國，每年有超過50萬例發(fā)生心源性猝死。而心律失常是心源性猝死的首要原 因。
[0004] 心臟起搏傳導系統(tǒng)由起搏器（竇房結/SAN)、房室節(jié)（AVN)和浦肯野纖維組成。在 小鼠，在胚胎第8天（E8. 0)心臟流入道開始記錄到心臟起搏信號。在胚胎第9. 5天（E9. 5)， 心臟流入道的靜脈竇（sinus venosus)為原始起搏區(qū)域。而形態(tài)學上的起搏器在E11. 5形 成，其后進一步成熟，形成為一個功能完整的起搏器。起搏器的形成是一個復雜的、精細調 節(jié)的過程，涉及多種不同來源的心臟譜系。
[0005] 近年來，對心臟傳導系統(tǒng)形成的分子調控機制的研究取得了顯著進展。研究表明， 來源于心室內膜和冠狀動脈的Endothelin-I在浦肯野纖維的誘導分化中起著關鍵性的作 用。Notch和Neuregulin信號通路在斑馬魚的AV(房-室)傳導系統(tǒng)的形成中發(fā)揮重要作 用。在心臟和心肌細胞體外培養(yǎng)中，Neuregulin-I和Endothelin-I能夠誘導小鼠心肌細 胞分化為起搏傳導系統(tǒng)細胞。轉錄因子Nkx2. 5、Tbx5和GATA4相互作用，形成一個重要的 心臟轉錄調控網絡，在心臟的發(fā)育，包括AV傳導系統(tǒng)的形成和功能中起重要作用。這些因 子的變異導致了人類先天性心臟病，伴有AV傳導系統(tǒng)異常。
[0006] 但相對而言，由于已知與起搏相關基因的缺失會造成胚胎大量早期死亡，起搏器 細胞在組織結構上也難以分辨，且起搏細胞數(shù)量有限，難以分離純化，造成了現(xiàn)有技術中對 心臟起搏傳導系統(tǒng)，特別是對心臟起搏細胞形成和功能調節(jié)機制的了解非常有限。
[0007] 因此，為了深入了解人類心律失常發(fā)生機理，有助于優(yōu)生優(yōu)育以及提供治療手段， 本領域迫切需要開發(fā)與心臟系統(tǒng)發(fā)育和功能相關的基因及其調控通路。


【發(fā)明內容】

[0008] 本發(fā)明的目的就是提供一種與心臟系統(tǒng)發(fā)育和功能相關的基因及其調控通路和 應用。
[0009] 本發(fā)明第一方面，提供了一種Isll基因、蛋白或其促進劑的用途，用于制備促進 HCM基因或蛋白表達的藥物組合物，或用于制備HCM的轉錄激活劑。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物或轉錄激活劑還用于預防或治療竇房結 (SAN)異常相關疾病。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述的Isll基因或蛋白來自于哺乳動物，更佳地來源于小鼠、 大鼠或人。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述的Isll基因、蛋白或其促進劑包括的Isll基因表達產物、 促進型microRNA、促進型轉錄調控因子、或促進型靶向小分子化合物。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物包括所述Isll基因、蛋白或其促進劑以及藥 學上可接受的載體。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物還含有HCM蛋白或激活HCM蛋白活性的促 進劑（活性促進劑）。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述的竇房結細胞異常相關疾病包括：病竇綜合征或心臟傳導 系統(tǒng)相關心律失常。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述的心臟傳導系統(tǒng)相關心律失常包括房顫、房撲、房早、室早、 預激綜合征、竇性心律不齊。
[0017] 本發(fā)明第二方面，提供了一種用于促進HCM基因或蛋白表達的藥物組合物，所述 的藥物組合物含有Isll基因、蛋白或其促進劑以及藥學上可接受的載體。
[0018] 本發(fā)明第三方面，一種篩選用于促進HCM基因或蛋白表達和/或活性的化合物的 方法，包括步驟：
[0019] ⑴在實驗組，向細胞培養(yǎng)體系中添加測試化合物，并測定細胞培養(yǎng)體系中Isll 表達量和/或活性；在對照組，向相同的細胞培養(yǎng)體系中不添加測試化合物，并測定細胞培 養(yǎng)體系中Isll表達量和/或活性；
[0020] 其中，如果實驗組中的Isll表達量和/或活性大于對照組，則說明該測試化合物 為用于促進HCM基因或蛋白表達和/或活性的化合物。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，還包括步驟：
[0022] (ii)對⑴中獲得的化合物，進一步測定其對HCM表達量和/或活性的促進作 用；其中，如果實驗組中HCM的表達量和/或活性明顯大于對照組，則說明該化合物為用于 促進HCM基因或蛋白表達和/或活性的化合物。
[0023] 本發(fā)明第四方面，提供了一種基因重組的動物細胞，所述動物細胞含有一誘導型 表達盒，所述誘導型表達盒包括誘導型啟動子，以及與所述誘導型啟動子操作性連接的 Isll編碼序列和終止密碼子，從而可以在誘導條件下表達所述的Isll蛋白，并且Isll蛋白 表達量與誘導條件相關；
[0024] 并且，所述動物細胞不是組成型表達Isll編碼序列的細胞。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述的動物細胞包括心肌細胞、起搏細胞、和心內膜細胞、肺動 脈和主動脈的平滑肌細胞。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述的動物細胞為體細胞。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述的誘導型表達盒是外源的表達盒。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述的Isll蛋白表達量與誘導條件呈正相關。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述的Isll蛋白表達量與誘導劑的水平或濃度呈正相關。
[0030] 本發(fā)明第五方面，一種體外非治療性的處理方法，包括步驟：
[0031] (a)在一定濃度的誘導劑存在下，培養(yǎng)本發(fā)明第四方面所述的基因重組的動物細 胞，從而誘導所述動物細胞中表達Isll蛋白；和
[0032] (b)檢測所述動物細胞中蛋白的表達情況和/或活性水平。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，步驟（b)中，所述的蛋白包括：Isll蛋白、HCM蛋白、或其他蛋 白。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，步驟（b)中，還包括檢測所述動物細胞中與心臟細胞功能（尤其 是起搏細胞功能）相關的參數(shù)。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（a)中，在對應于預定表達水平的誘導劑濃度下，培養(yǎng)所 述動物細胞，其中所述的預定表達水平是，與組成型表達Isll蛋白的且相同類型的野生型 動物細胞中Isll蛋白表達水平相比，Isll蛋白表達水平為野生型的約25%、30%、40%、 50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、110%、或120%。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，所述誘導劑為他莫昔芬。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述一定濃度的誘導劑為l-50mg/ml，更佳地，為5_20mg/ml。
[0038] 本發(fā)明第六方面，一種構建心臟病模型動物的方法，包括步驟：
[0039] (a)提供一動物細胞,所述動物細胞不是組成型表達Isll編碼序列的細胞,并且 所述動物細胞含有一誘導型表達盒，所述誘導型表達盒包括誘導型啟動子，以及與所述誘 導型啟動子操作性連接的Isll編碼序列和終止密碼子，從而可以在誘導條件下表達所述 的Isll蛋白，并且Isll蛋白表達量與誘導條件相關；和
[0040] (b)將所述動物細胞再生成動物，從而制得心臟病模型動物。
[0041] 應理解，在本發(fā)明范圍內中，本發(fā)明的上述各技術特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優(yōu)選的技術方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0042] 圖1顯示了小鼠胚胎發(fā)育和出生后Isll在竇房結（SAN)起搏細胞中的表達
[0043] E9. 5天，Isll和HCM同時表達于靜脈竇（SV)心肌層中（圖1A)，在E10. 5到P7 天則主要表達于SAN細胞中（圖1B-E，圖II)。在E10. 5天，Tbx3和Isll共表達于SV，包 括SAN的頭尾區(qū)域和靜脈瓣（vv)(圖1F，G)。Cx40表達于心房心肌層，與Isll共表達（圖 1H，J)。在圖中方框區(qū)域內的K值如圖II和圖IJ所示。Isll的表達在小鼠胚胎發(fā)育和出 生后的過程中是逐漸降低的（圖1L)。
[0044] 圖2顯示了 Isll的表達降低導致胚胎心律失常和SAN細胞的減少
[0045] Isll-nLacZ表達于SV心肌層，包括SAN區(qū)域（紅箭頭)，E9·5(圖2A，A'）和Ell·5 (圖2D，D'）背中胚層和心系膜。Isll和HCM在ISLl突變鼠 SV中的表達顯著降低（圖2C， C'）。Isll的表達和Isll陽性細胞在ISLl突變鼠 E9. 5(圖2B，B'）和E11.5(圖2E，E'）胚 胎SV心肌層，包括SAN(紅色箭頭)，心房心肌層和心系膜中顯著降低。BrdU染色顯示ISLl 突變鼠 E9. 5胚胎SV心肌層細胞增殖顯著降低（圖2F，F(xiàn)'）。TUNEL染色顯示ISLl突變鼠 E10. 5胚胎SV細胞凋亡顯著增加（圖2G，G'）。超聲心動圖結果表明ISLl突變鼠 E9. 5和 E11. 5胚胎心率顯著降低（圖2H)。
[0046] 圖3顯示了 ISLl突變鼠胚胎SAN的HCN4, Tbx3和Shox2表達降低
[0047] HCM和Shox2表達于小鼠胚胎E9. 5天SV，包括SAN (圖3A，A'，B，B'，紅箭頭)。 Tbx3表達于SV周圍的間葉細胞（圖3C，C'，箭頭)。在Isl 1突變鼠胚胎，SV和SAN中HCN4， Shox2和Tbx3的表達都明顯的降低（圖3F，F(xiàn)'，G，G'，H，H'，紅箭頭）。Cx40和Nkx2. 5在心 肌層表達，不表達于SAN中（圖3D，D'，E，E'，紅箭頭)。在Isll突變鼠胚胎，Cx40和Nkx2.5 在心房心肌層中顯著降低，但是Cx40和Nkx2. 5在SAN中并無異位表達（圖31，Γ，J，J'， 紅箭頭)。
[0048] 圖4顯示了胚胎早期使用HCN4-CreERT2在SAN中敲除Isll可導致心律失常和 SAN細胞數(shù)量減少
[0049] Isll 突變鼠（HCN4-CreERT2 ;Isllf/f)和對照組（HCH4-CreERT2 ;Isllf/+or+/+) 胚胎在E9. 5灌胃給予他莫昔芬，在給藥后32小時和48小時分析胚胎表型。心臟超聲心 動圖顯示Isll突變鼠胚胎在Ell天比ElL 5天心率降低更為明顯（圖4A)。整體和切片 X-gal染色顯示在ElL 5天Isll突變鼠胚胎SAN中X-gal陽性細胞的數(shù)量（圖4C，cl，c2， 紅箭頭和D)少于對照組（圖4B，bl，b2,紅箭頭)。而HCM陽性細胞在Ell天突變鼠胚胎 SAN區(qū)域中的數(shù)量無明顯改變（圖4E，F(xiàn)，紅色箭頭)。Isll突變鼠（Ell)中，Isll，HCM和 Tbx3在SV的表達，包括SAN區(qū)域（紅箭頭)。Isll突變鼠（圖4H，J，L)相對對照組（圖 4G，I，K)有明顯的減弱但是Isll在咽部和背心系膜區(qū)域的表達量是正常的。
[0050] 圖5顯示了在SAN形態(tài)發(fā)育晚期敲除Isll可導致心動過緩，Tbx3和HCM在SAN 中表達降低
[0051] 在El L 5天敲除Isll可導致突變體小鼠在E12. 5和E14. 5出現(xiàn)心率降低（圖5A)。 在胚胎發(fā)育中，胚胎心率隨胚胎發(fā)育逐漸增加（圖5B)。當Isll在E13. 5胚胎敲除后，使用 心臟超聲監(jiān)測突變小鼠心率，在最初24小時突變小鼠心率未見明顯改變，但24h后Isll突 變小鼠出現(xiàn)心率逐漸降低。整體和切片X-gal染色顯示Isll突變胚胎SAN中X-gal陽性 細胞（圖OT，D'）較對照組胚胎（圖5C，C'）稍有減少。定量分析表明，Isll突變胚胎SAN 區(qū)域中X-gal陽性細胞數(shù)量（175. 5± 11. 7/切片，每個SAN計數(shù)10個切片）（D'）較對照 組（205·6±17·6/切片）（圖 5C'）減少 15% (圖 5E-H)。Isll，HCN4 和 Tbx3 在 Isll 突變胚 胎中的表達相對于對照組胚胎（圖5E-G)顯著降低（圖5F，H)。
[0052] 圖6顯示了敲除Isll導致細胞周期相關基因、轉錄因子和離子通道的表達的降 低。
[0053] qPCR顯示（圖6A)敲除Isll導致細胞周期相關基因和Bcl-2的表達降低；Shox2， Mef2C，Tbx3和Nkx2. 5表達降低（圖6B); -系列的離子通道，connexins和Myh6的表達 改變（圖6C)。小鼠及人類Tbx3和HCM基因組區(qū)域對比圖（E1-7:外顯子為藍色；未編碼 區(qū)為黃色；保守區(qū)域為紅色和粉紅色）（圖6D，E)。Nano-ChIP法檢測出2個Isll分別在 Tbx3(Tbxl-l，-2)和 HCM (HCN4-l，-2)的可能的結合位點。qPCR 分析驗證 Nano-ChIP 法 檢測得2個Isll分別在Tbx3(Tbxl-l，-2)和HCM (HCN4-1，-2)的結合位點（圖6F)。
[0054] 圖7顯示了 cTnT-Cre敲除Isll小鼠（cTnT-Cre ;Isll小鼠系）和Isll復合型突 變鼠的表現(xiàn)型類似，該突變鼠在胚胎期早期即E9. 5-E11. 5死亡，突變胚胎表現(xiàn)出明顯的心 率變慢和早搏。
[0055] 圖8A-圖81顯示了在HCM表達的SAN區(qū)域中，TUNEL標記的細胞數(shù)量顯著增加， 而BrdU標記的細胞數(shù)量減少（箭頭處）。

【具體實施方式】
[0056] 本發(fā)明人經過廣泛而深入的研究，首次克服了胚胎發(fā)育早期Isll基因缺失造成 動物模型大量死亡的技術難題，建立了 Isletl低表達和條件敲除的小鼠模型，經過對該表 達模型的實驗研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎發(fā)育中晚期，Isletl的低表達可導致了嚴重的心率減慢或 心律不齊，這類胚胎大多可以存活至出生。
[0057] 實驗證明，即使Isll基因廣泛表達于胚胎發(fā)育期間，但其早期表達與中晚期表 達所起的調控作用不同，胚胎中晚期低表達Isll會造成出生子代嚴重的先天性心律失常， 這種后果較早期Isll低表達或缺失造成的胚胎死亡，會為家庭和社會帶來更大的痛苦和 負擔。
[0058] 此外，本發(fā)明人還利用了 HCN4-CreERT2小鼠系在起搏器中特異性敲除Isletl，實 驗表明，在發(fā)育早期（E9. 5)敲除Isletl導致了與Isletl低表達小鼠相似的表型，伴有起 搏細胞的丟失。在發(fā)育中晚期（E12. 5)敲除Isletl，變異小鼠表現(xiàn)出嚴重的心率緩慢和心 律不齊而不伴有起搏器起搏細胞的丟失，這說明Isletl對起心臟傳導系統(tǒng)功能有重要的 調控作用。由此證實了，Isl 1基因作為HCM通路的上游基因，在起搏細胞的中晚期發(fā)育中， 起到了重要的調控作用。在此基礎上，完成了本發(fā)明。
[0059] 術語
[0060] 如本文所用，術語"第二心臟領域"指心臟的形成和發(fā)育過程中，有部分心臟前體 細胞來源于前背側中胚層，并將這一區(qū)域定義為第二心臟領域。
[0061] 術語"第二心臟領域前體細胞"指來源于第二心臟領域可以進一步分化發(fā)育成為 成熟心臟細胞的細胞群。
[0062] 術語"起搏器前體細胞"指的是能進一步分化發(fā)育成為成熟起搏器細胞的細胞群。 [0063] 如本文所用，術語"竇房結異常"指在病理或生理因素下，竇房結細胞的起搏自主 性和節(jié)律性受到影響導致的竇房結功能不全，并引起相關病理癥狀的情況。竇房結異常通 常由先天性因素以及自主神經影響因素等造成。
[0064] 如本文所用，術語"竇房結異常相關疾病"指在與竇房結起搏及傳導相關的心律失 常。通常竇房結異常相關疾病包括病竇綜合征、或心臟傳導系統(tǒng)相關心律失常。
[0065] 如本文所用，術語"心臟傳導系統(tǒng)相關心律失常"指直接或間接由于竇房結異?；?功能不全而影響心臟節(jié)律以及傳導并引起心律失常的病理疾病，包括房顫、房撲、房早、室 早、預激綜合征、竇性心律不齊。
[0066] 如本文所用，術語"Cre"、"Cre酶"可互換使用，均指Cre重組酶，為細菌噬菌體Pl 的I型拓撲異構酶，用于催化IoxP位點間的DNA進行位點特異性重組。本發(fā)明中，主要用 于敲除LoxP位點之間的特定基因。
[0067] 如本文所用，術語"胚胎發(fā)育早期"指早期胚胎發(fā)育包括受精、卵裂、囊胚和植入、 原腸胚和胚層形成、胚層分化與胚體雛型形成等若干階段。對應的嚙齒類動物胚胎發(fā)育早 期即E7. 5-E11. 5,對應的人類胚胎發(fā)育早期為1-3月。
[0068] 如本文所用，術語"胚胎發(fā)育中晚期"是指幾乎全部組織器官形成和成熟直至出生 的時期。對應的嚙齒類動物胚胎發(fā)育中晚期即E12.5-E21，對應的人類胚胎發(fā)育中晚期為 4-9 月。
[0069] 術語"Tbxl8譜系" ：TbxlS轉錄因子在前心外膜細胞及心外膜細胞中表達，對心臟 的發(fā)育形成起重要的調節(jié)作用，因此可以特異性標志心臟的，并將心臟的前心外膜細胞及 心外膜細胞譜系定義為Tbxl8譜系。
[0070] 如本文所用，術語"Isll復合型突變小鼠"指Isll復合型突變鼠（IsllnLacZ/ fne°)，即通過將IsllfNe°/+鼠系和Isll nLacZ/+鼠系雜交獲得的小鼠模型。
[0071] "他莫昔芬"（他莫昔芬)是一種外源性雌激素類似物，可以與嵌合重組酶中的雌激 素受體相結合使Cre進入細胞核和LoxP位點結合以敲除特定基因。
[0072] 術語"Tbxl8譜系" ：TbxlS轉錄因子在前心外膜細胞及心外膜細胞中表達，對心臟 的發(fā)育形成起重要的調節(jié)作用，因此可以特異性標志心臟的，并將心臟的前心外膜細胞及 心外膜細胞譜系定義為Tbxl8譜系。
[0073] Isletl
[0074] Isll基因來源于第5號染色體長臂，全長大約2. 4kb，編碼349個氨基酸、來源于 編碼序列（Genbank登錄號BC132609. 1)、蛋白信息（Genbank登錄號AAI32610. 1)
[0075] Isletl是一個同源結構域轉錄因子，全身敲除Isletl導致來源于Isletl前體細 胞的心臟結構的完全缺失和胚胎早期死亡（E9. 5-10. 5)，這阻礙了對Isletl在起搏器中作 用的進一步研究。
[0076] 本發(fā)明Isll在多物種中有著高度的同源性，可用于本發(fā)明的Isll可來自于任何 哺乳動物，包括（但并不限于）：人、嚙齒動物（如小鼠、大鼠)、黑猩猩、牛、犬、貓等。此外， Isll包括野生型Isll和突變型Isll及其活性片段。
[0077] HCM
[0078] HCN4 (hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel 4)基因來源于第9號染色體，mRNA全長3. 7kb，編碼1201個氨基酸，其核苷酸序列如 SEQ ID Ν0·:3 所示（gene ID NM_001081192·)，其編碼的蛋白序列如 SEQ ID Ν0·:4 所示 (NP_001074661. 1)〇
[0079] 在心臟新月期（Cardiac Crescent) HCM就已表達。在發(fā)育期及成人的心臟中， HCM特異性地標志竇房結。
[0080] 在人類，HCM的變異導致心率過緩。在小鼠等模型動物中，完全敲除HCM導致 嚴重的頻發(fā)性竇性心跳停搏，以及胚胎早期死亡（E9. 5-10. 5)。然而在成年小鼠心臟敲除 HCM并不導致小鼠死亡，變異小鼠的基礎心率/律正常，但有間歇性心跳驟停。這些研究表 明HCM對早期的心臟起搏功能是必需的。HCM和鈣流時鐘（Calcium clock)決定了起搏 細胞的高自主節(jié)律性，在心臟的竇性自主節(jié)律的產生和心跳速率的調節(jié)中起著關鍵作用。 在成年期，其他的機制包括鈣流鐘及其相關的調節(jié)蛋白可能共同發(fā)揮作用。
[0081] 檢測方法和試劑盒
[0082] 本發(fā)明還涉及定量和定性檢測人Isll蛋白水平或mRNA水平的診斷試驗方法。這 些試驗是本領域所熟知的。試驗中所檢測的人Isll蛋白水平，可以用于檢測或預測竇房結 異常相關疾病。
[0083] -種檢測樣品中是否存在Isll蛋白的方法是利用Isll蛋白的特異性抗體進行檢 測，它包括：將樣品與Isll蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復 合物就表不樣品中存在Isl 1蛋白。
[0084] Isll蛋白或其多核苷酸可用于Isll蛋白相關疾病的診斷和治療。本發(fā)明的多核 苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列或DNA芯片上，用于分析組織中基因的差異 表達分析和基因診斷?？笽sll的抗體可以固定在蛋白質芯片上，用于檢測樣品中的Isll 蛋白。
[0085] 本發(fā)明還提供了一種檢測竇房結異常相關疾病的試劑盒，它含有特異性擴增Isll 的引物對和/或Isll特異性抗體以及標簽或說明書。
[0086] 其中，所述的標簽或說明書注明以下內容：Isll基因或蛋白的表達和/或活性顯 著低于正常人群，則說明，該檢測對象患有竇房結異常相關疾病的概率高于正常人群。
[0087] 本發(fā)明方法和試劑盒可用于檢測人羊水樣品、組織樣品、血液樣品、血清樣品或體 液樣品，用于早期篩查竇房結異常有關的先天性心律失常，有利于優(yōu)生優(yōu)育。
[0088] 促進劑和藥物組合物
[0089] 利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與Isll蛋白發(fā)生相互作用的 物質，尤其是促進劑等。
[0090] 本發(fā)明Isll蛋白的促進劑，當在治療上進行施用（給藥）時，可促進Isll蛋白的 表達和/或活性，進而促進HCM基因或蛋白表達，或激活HCM的轉錄。在另一優(yōu)選例中， 所述的Isll促進劑包括的Isll基因表達產物、促進型microRNA、促進型轉錄調控因子、或 促進型靶向小分子化合物。
[0091] 通常，可將這些促進劑配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中， 其中pH通常約為5-8,較佳地pH約為6-8,盡管pH值可隨被配制物質的性質以及待治療的 病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括（但并不限 于）：肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、皮內、或局部給藥。
[0092] 本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明Isll蛋白或其促 進劑以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括（但并不限于）：鹽水、緩沖液、葡 萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以 被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制 備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、 溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微 克-10毫克/千克體重。
[0093] 通用方法
[0094] 轉基因小鼠
[0095] Isll-nLacZ基因敲入小鼠（記為IsllnLacZ/+)的構建可通過常規(guī)方法，小鼠 1對染色體的其中一條于Isll起始位點插入nLacZ，一種優(yōu)選的構建方法可見Song, M. R. , Sun, Y. , Bryson, A. , Gill, G. N. , Evans, S. M. , and Pfaffj S. L. 2009. Islet-t〇-LM0 stoichiometries control the function of transcription complexes that specify motor neuron and V2a interneuron identity. Developmentl36: 2923-2932。在該小鼠中， 一條染色體的Isll不能正常表達，另一條染色體可正常表達Isll。
[0096] TnT-Cre小鼠系（記為cTnT-Cre)、cTnT-Cre通過定點敲入的方法將小鼠1對染 色體的其中一條于cTnT的起始位點后插入重組酶基因 cre，Cre受cTnT啟動子的調控只在 分化的心肌中表達。在該小鼠中，一條染色體能表達重組酶基因 ere。此小鼠購自上海南方 模式生物科技有限公司。
[0097] Isllfloxed 小鼠系的構建見 Jiao, K.，Kulessa，H.，Tompkins，K.，Zhou，Y.， Batts,L., Baldwin,H.S. , and Hogan,B.L. 2003. An essential roleof Bmp4in the atrioventricular septation of the mouse heart. Genes&development 17:2362-2367. 該鼠系通過同源重組的方法在小鼠 I對染色體的Isll第四外顯子替換為兩端帶有LoxP位 點的第四外顯子。
[0098] cTnT-Cre ;Isll小鼠系：是通過cTnT-Cre小鼠系和Isllfloxed小鼠系雜交所獲 得。雜交小鼠可以表達重組酶基因 Cre可以識別插入Isll第四外顯子兩端的Ioxp位點從 而將Isll第四個外顯子刪除，使Isll基因無法正常表達。這種小鼠是cTnT-Cre小鼠系和 Isll floxed小鼠系雜交所獲得。
[0099] Isll低表達（記為IsllfNe°/+)小鼠系的構建可通過同源重組將isll第四個外 顯子替換為帶有Ioxp位點以及篩選基因 neo的第四外顯子。一種優(yōu)選的構建方法可見 Sun, Y. , Dykes, I. Μ. , Liang, X. , Eng, S. R. , Evans, S. Μ. , and Turner, Ε. Ε. 2008. A central role for Isletlin sensory neuron development linking sensory and spinal gene regulatory programs. Nature neuroscience 11:1283-1293.在該小鼠中 neo 會干擾 neo 所在的Isll等位基因的正常表達，雜合小鼠中由于另外一條染色體的代償作用Isll表達 正常；但在純和小鼠中使Isll的表達水平顯著降低，出生后Pl天死亡。
[0100] 他莫昔芬誘導型HCM-Cre ERT2 (記為HCN4-CreERT2)小鼠構建可用同源重組技 術進行。一種優(yōu)選的方法是將一個包含CreERT2序列的cDNA片斷在緊靠 HCM基因起始 密碼子（ATG)的部位插入，構建轉基因動物模型。一種優(yōu)詵的構津方法可見Liang X, Wang G, Lin L, Lowe T. Zhang Q, Bu L, Chen YH, Chen T. Sun Y, Evans SM. HCN4 Dynamically Marks the First HeartField and Conduction System Precursors. Circ Res. 2013 Jun 6. Epublication此小鼠其中一條染色體可表達CreERT2,另一條表達HCN4。
[0101] Isll 復合型突變鼠（記為 IsllnLacZ/fNe。）:通過將 IsllfNe。/+ 鼠系和 IsllnLacZ/+ 鼠系雜交獲得。雜交獲得的小鼠1對染色體，其中一條在Isll起始位點插入nLacZ，使Isll 不能正常表達。另一條染色體中Isll基因的內含子中插入neo基因，干擾Isll的表達。
[0102] HCN4-CreERT2/Rosa_LacZ、YFP 小鼠：HCN4_CreERT2 小鼠系與具有 Rosa-LacZ 或 YFP遺傳背景的Isll flox/flox小鼠系雜交，以便得到HCN4-CreERT2/Rosa-YFP或LacZ小 鼠。此小鼠可表達CreERT2可識別Rosa-YFP或Rosa-LacZ中間的IoxP位點并將其中間基 因序列刪除，是Rosa可啟動YFP或LacZ的表達。
[0103] 為了誘導HCN4-CreERT2小鼠系的Cre酶活性，給不同胚胎期的懷孕母鼠在所需時 間點口服給予150_300ul他莫昔芬（10mg/ml)。對胚胎早期，他莫昔芬在小鼠胚胎E9. 5給 藥，胚胎樣品在給藥后32-36小時，約胚胎期Ell天收獲。對胚胎晚期，他莫昔芬在小鼠胚 胎ElL 5給藥，胚胎樣品在給藥后約胚胎期E14. 5天收獲。轉基因小鼠具有的Rosa26-YFP 遺傳背景使能在他莫昔芬誘導Cre表達后觀察到HCN4-CreERT2的表達。
[0104] 免疫熒光染色和RNA原位雜交
[0105] X-gal染色，免疫熒光和RNA原位雜交的方法可用常規(guī)方法進行，代表性的方法可 見：
[0106] Liang, X. , Zhou, Q. , Li, X. , Sun, Y. , Lu, Μ. , Dalton, Ν. , Ross, J. , Jr. , and Chen, J. 2005. PINCHlplays an essential role in early murine embryonic development but is dispensable in ventricular cardiomyocytes. Molecular and cellular biology25:3056-3062 ；
[0107] Liang, X. , Sun, Y. , Schneider, J. , Ding, J. H. , Cheng, H. , Ye, M. , Bhattacharya, S. ,Rearden, A. , Evans, S. , and Chen, J. 2007. Pinchl is required for normal development of cranial and cardiac neural crest-derived structures. Circ Res 100:527-535。
[0108] 使用一抗如下：小鼠 anti-Isletl/2 單克隆抗體（DSHB),兔 anti-Isletl(abcam), 大鼠 anti_HCN4 (abeam),兔 anti_Cx40 (Santa Cruz),羊 anti_Tbx3 (Santa Cruz),小 鼠 anti_Nkx2.5 (Santa Cruz)，大鼠 anti-Brdu (abeam)。二抗使用了 Alexa 488 or 594 labeled (Invitrogen)。TUNEL染色法使用了試劑盒手冊（購自Roche)。
[0109] BrdU染色法：特定時間點的懷孕母鼠腹腔注射500 μ I BrdU(預混和液，Ambion) 3次，間隔3小時，BrdU染色可通過常規(guī)方法進行，代表性的方法見Sun, Y.，Dykes, I. Μ. , Liang, X. , Eng, S. R. , Evans, S. Μ. , and Turner, Ε. Ε. 2008. A central role for Isletl in sensory neuron development linking sensory and spinal gene regulatory programs. Nature neuroscience 11:1283-1293。
[0110] 細胞計數(shù)：對特定發(fā)育期的心臟SAN區(qū)域樣品切片，切片厚度10um，每個樣品選取 4張連續(xù)切片進行染色并計數(shù)陽性細胞。細胞增殖實驗和細胞凋亡實驗中，對突變胚胎和對 照胚胎右側靜脈竇和SAN區(qū)域的BrdU陽性和TUNEL陽性細胞進行計數(shù)。為了研究Isll在 發(fā)育過程中的表達情況，Isll陽性和HCM陽性細胞被計數(shù)，用以計算Isll和HCM陽性細 胞的比例。對每個時間點的不同樣品，每個樣品最少分析4至6個相對應的切片，每個實驗 最少分析3對樣品。
[0111] Nano-ChIP 和實時定量 PCR (qPCR):
[0112] 本發(fā)明Nano-ChIP和實時定量PCR (qPCR)可通過常規(guī)方法進行，代表性的方法如 下：
[0113] 采用 FACS-sorted 法，分離 HCN4-CreERT2 ;Isllf/f 突變鼠胚胎和 HCN4-CreERT2 ; Isll對照組胚胎（Rosa-YFP背景）SAN起搏細胞用于qPCR分析。收獲并手術分離Ell天 YFP 陽性的 Isll 突變和對照組胚胎 SANs,使用 collagenase/dispase (lmg/ml，Roche)/ trypsin (0. 1%)混合消化液消化10分鐘。收集起搏消化液中懸濁的起搏細胞（YFP陽性)， FACS sorted(BD FACSAria)分離細胞并儲存于-80C。RNA 使用 RNeasy Mini kit(Qiagen) 制備。qPCR使用SYBR green法。
[0114] Nano-ChIP實驗方法：HCN4-nEGFP胚胎SAN細胞在胚胎晚期收集（E13. 5 to E18. 5)，細胞收集和FACS-sorted方法如前所述。大約40, OOOSAN細胞使用l%formaldehyde 在室溫交聯(lián)10分鐘。細胞使用甘氨酸冷淬5分鐘并用冰水預冷PBS沖洗2遍。Chromatin 使用超聲波碎裂成200-800bp大小片斷，并使用1 μ g Isll抗體（39. 4D5, DSHB)共沉淀。 隨后反向交聯(lián)并純化，ChIP DNA和輸入的DNA被擴增（60)。擴增后DNA使用qPCR鑒定，相 關調控區(qū)域通過分析數(shù)據(jù)后確認。
[0115] 超聲心動儀檢測：
[0116] 懷孕小鼠使用isof Iurane麻醉。所使用超聲心動儀型號為Visualsonics VeV〇770高解析度超聲系統(tǒng)，使用RMV704 (40MHz)探頭。每個胚胎都單獨檢測，并獲得獨立 的圖像和數(shù)據(jù)。通過獲得B-mode和脈沖多普勒圖像得到心率和各項心臟功能參數(shù)。超聲心 動儀檢測后，解剖出胚胎，分別和超聲心動儀檢測結果對應，并進行基因型和表現(xiàn)型檢測。
[0117] 統(tǒng)計分析法
[0118] 所有數(shù)據(jù)使用平均值（mean) 土SEMb表示，t-test使用2組獨立測試結果相互驗 證。當P〈0. 05時認為實驗結果有顯著性差異.
[0119] 本發(fā)明的有益效果
[0120] 1.本發(fā)明證實了在胚胎發(fā)育過程中，Isll基因或蛋白對竇房結細胞整個發(fā)育周 期中的形成及功能調節(jié)起到重要作用，尤其是對于竇房結細胞中晚期的形成和功能而言， Isll的缺失或變異不會造成胚胎死亡，而是造成出生后的胎兒患有以心律不齊為主要癥狀 的各種先天性心臟病。
[0121] 2.本發(fā)明還證實了作為HCM的上游基因，Isll對HCM的調控起到重要作用，從 而調控胚胎竇房結細胞的中晚期發(fā)育。
[0122] 3.本發(fā)明可用于先天性心臟病，尤其是以心律不齊為主要癥狀的各種先天性心臟 病的產前篩查和診斷，有利于優(yōu)生優(yōu)育。
[0123] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照 常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨裕∟ew York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否 則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。
[0124] 實施例IIsll和HCM在心臟SAN細胞中表達
[0125] 為了研究Isll在SAN形成和功能中的作用，首先分析了 Isll在SAN發(fā)育過程中 的表達，并使用數(shù)個SAN細胞和心房心肌細胞抗體（HCN4 Tbx3 Cx40購自abeam公司）作 為標記。
[0126] HCM是起搏細胞通道蛋白，在心臟發(fā)育早期開始表達，在SAN分化發(fā)育過程中起 了關鍵作用。在￡9.5，1811表達于心肌層的靜脈竇（8；[11118￥61108118(5\0)，早期胚胎的起 搏細胞生發(fā)區(qū)域高表達HCM (圖1A)。
[0127] 在E10. 5, Isll和HCM共表達于胚胎SAN頭部（圖1B)和尾部（圖1C)，靜脈瓣 (vv)，以及圍繞背心系膜的心房心肌層（DM)(圖1A，B，箭頭)。
[0128] 在胚胎發(fā)育晚期和出生后早期，Isll和HCM共表達于竇房結細胞（圖1D，E，I)。
[0129] Isll在SAN中的表達隨著年齡逐漸降低。Isll和HNC4共表達的起搏細胞數(shù)量比 例在出生后2周顯著降低，并隨著年齡增加逐漸降低（圖1L)。
[0130] Tbx3和CX40共染色可標記出SAN和心房心肌層之間的界限。發(fā)現(xiàn)在胚胎E10. 5 天，Tbx3在SAN頭部和尾部以及靜脈瓣中和Isll共表達（圖1F，G)。Cx40表達在心房心 肌層而Isll表達于SAN (圖1H，J)。
[0131] 結果表明了 Isll在SAN發(fā)育和功能中的起著重要的作用。
[0132] 實施例2在Isll復合型突變鼠胚胎中Isll表達的降低導致竇性心律不齊和SAN 細胞的減少
[0133] 2. 1構建一個Isll不完全表達的Isll復合型突變小鼠模型（IsllnLacZ/fNe°+)，其 表現(xiàn)型較全身敲除小鼠為輕，能存活稍長時間（E12. 5天死亡），但較Isll不完全表達小鼠 系表現(xiàn)型更重。
[0134] Isll復合型突變小鼠模型使用Isll核LacZ敲入小鼠系（Isl-nLacZ)，和Isll低 表達小鼠系（Isllf ne°/+，該小鼠 Isll內含子中含有neomycin位點，能夠干擾Isll正常表 達）雜交而成。
[0135] 結果：Isll復合型突變小鼠 （Isll nLacZ/fne°)較Isll不完全表達小鼠系表達更 少量的Isll，可導致胚胎在ElL 5死亡（54)。組織切片X-gal染色顯示Isll-nLaz小鼠中 IslΙ-nLaz顯色和內源性Isll的表達部位完全一致。
[0136] 與圖1所示一致，在E9. 5Isll_nLacZ在背心系膜，SAN和SAN周圍心房內膜表達 (圖2A，A'箭頭)。
[0137] 在 ElL 5, Isll-nLacZ 表達于 SAN (圖 2D，D'）。
[0138] 在E9. 5和E11.5Isll復合型突變體小鼠在SV心肌層，SAN，背心系膜部位的 Isll-nLacZ陽性細胞數(shù)量顯著減少（圖2B，B'，E，E'，箭頭)。
[0139] I s11和HCM抗體進行免疫熒光染色表明在E9. 5天I s11復合型突變體SV中I s11 和HCM陽性細胞顯著減少（圖2C，C'）。
[0140] 結論：Isll對SAN細胞，SV心肌細胞，心臟后部的心臟祖細胞的增殖和存活都是必 須的。為此，使用BrdU作為細胞增殖標記，使用TUNEL染色觀察細胞凋亡。發(fā)現(xiàn)在E9. 5胚 胎，SV心肌層BrdU標記細胞數(shù)量顯著減少，SV右角細胞凋亡數(shù)量顯著增加（圖2G，G'）。
[0141] 2. 2為了進一步研究Isll復合型突變體起搏細胞的功能，應用超聲心動儀檢測突 變小鼠 E9. 5至ElL 5的心率變化。標記了每個胚胎在子宮中的位置并檢測每個胚胎心率。
[0142] 結果：Isll復合型突變體在E9. 5的心率和對照組E9. 5的心率相比明顯變慢，在 Isll復合型突變體ElL 5心率減慢更加顯著（圖2H)。同時發(fā)現(xiàn)Isll復合型突變胚胎會 出現(xiàn)間歇性的心臟早搏，其發(fā)生頻率隨著胚胎的發(fā)育而增加。在實驗檢測過程中有部分胚 胎發(fā)生長時間心臟停搏。
[0143] 結論：Isll早期低表達的突變鼠死于心律失常。
[0144] 實施例3Isll復合型突變胚胎中Isll表達降低引起SNA功能相關的關鍵基因表 達降低
[0145] RNA原位雜交結果顯示，HCN4，Shox2和Tbx3在對照組E9. 5的SV中表達（圖3A-C， A'-C'，箭頭)，而在Isll復合型突變體E9. 5的SV中表達顯著降低（圖3F-H，F(xiàn)'-H'，箭頭)。
[0146] Cx40和Nkx2. 5在對照組胚胎心肌層表達，但不表達于SAN(圖3D，D'，E，E'，箭 頭)。在Isll復合型突變胚胎中發(fā)現(xiàn)Shox2和Tbx3出現(xiàn)異位表達，而沒有發(fā)現(xiàn)CX40和 NKX2. 5出現(xiàn)異位表達的現(xiàn)象（圖31，Γ，J，J'，箭頭)。
[0147] 結論：Isll復合型突變胚胎中Isll表達降低可造成HCN4, Shox2和Tbx3等SNA 功能相關的基因表達降低，Isll調控了這些基因的表達，為其上游基因。
[0148] 實施例4Isll對已分化心肌細胞仍是必需的
[0149] 在Isll復合型突變胚胎中，已分化SAN起搏細胞（E9. 5-E11. 5)，第二心區(qū)心臟祖 細胞和SV，SAN心肌層中Isll的表達都顯著降低。因此，使用Troponin-Cre (CTnT-Cre) 小鼠在已分化心肌細胞中特異性敲除Isll,用以觀察Isll在已分化竇房結細胞中的作用。
[0150] cTnT-Cre敲除Isll小鼠（cTnT-Cre ;Isll小鼠系）和Isll復合型突變鼠的表現(xiàn) 型類似，該突變鼠在胚胎期早期即E9. 5-E11. 5死亡，突變胚胎表現(xiàn)出明顯的心率變慢和早 搏，見圖7。
[0151] 結論：實驗表明，即使心肌細胞已經成熟，Isll的表達對心肌細胞的起搏功能仍 是必需的。
[0152] 實施例5在E9. 5使用HCN4-CreERT2敲除小鼠 SAN細胞ISll可導致胚胎Ell. 5 竇性心律不齊，竇房結細胞減少和胚胎期致死
[0153] 由于Isll在SAN中持續(xù)表達且表達時間要長于cTnT-Cre ;因此需要使用其他方 法研究發(fā)育晚期Isll在SAN中的作用。
[0154] 5. 1在E9. 5天，SV作為心臟的主要起搏區(qū)域，而SAN最早在ElL 5天形成可分 辨的組織結構，在E13. 5天成熟并行使功能。因此主要研究的是以上所述的SAN發(fā)育階 段。通過他莫昔芬誘導，HCN4-Cre可在心臟傳導系統(tǒng)中表達。使用HCN4-CreERT2和帶 有Rosa26-LacZ或YFP背景的Isllf/f小鼠雜交，以追蹤Cre的表達部位。采用可誘導的 HCMCre小鼠系（HCN4-CreERT2)構建特異性的Isll在SAN起搏細胞中的基因敲除小鼠模 型。
[0155] 結果：通過在E9. 5天給予他莫昔芬后每天用超聲心動儀檢測胚胎心率。發(fā)現(xiàn)， 和對照組相比，HCN4-CreERT2 ;Isll突變鼠心率在E10. 5天顯著變慢。HCN4-CreERT2 ; Isll突變體心率隨著發(fā)育過程逐漸降低，在Ell. 5天發(fā)生心臟長時間停跳，大多數(shù)的 HCM-CreERT2 ;Isll突變體胚胎在ElL 5天死亡（圖4A)。
[0156] 5. 2為了檢測SAN細胞在HCN4_CreERT2 ;Isll中分布情況，使用Rosa-LacZ染色 來跟蹤SAN細胞發(fā)育和分布情況。在胚胎E9. 5給予他莫昔芬后，于E10. 5-E11和ElL 5取 胚胎進行X-gal染色（圖4B-F)。
[0157] 結果：在對照組E10. 5和11. 5胚胎，HCN4-CreERT2所標記的X-gal陽性細胞存 在于SV和SAN(圖4B，E，紅箭頭，bl，b2)，這個和內源性HCMmRNA的表達部位一致（圖 3A)。但是在E10. 5-E11突變胚胎，SV區(qū)域內的部分X-gal陽性細胞缺失（圖4E，F(xiàn))。在 ElL 5, X-gal+陽性細胞分布區(qū)域和對照組相似，但是SV中HCN4-CreERT2陽性細胞數(shù)量顯 著減少（圖 4B，C，紅箭頭，bl，b2, cl，c2, D)。
[0158] 5. 3應用免疫熒光染色檢測在SAN細胞丟失前的Ell天Isll的表達情況。
[0159] 結果：在E9. 5天他莫昔芬的誘導顯著降低了 Isll在SV和SAN中的表達（圖4G， H)，而同時Isll在咽部和背心系膜區(qū)域的表達未見改變。
[0160] HCN4-CreERT2 ;Isll突變胚胎的SV和SAN區(qū)域中HCM和Tbx3的表達則顯著降 低（圖4I-L)，這表明Isll同時調控了 HCM和Tbx3的表達。
[0161] 此外，實驗證明，在HCM表達的SAN區(qū)域中，TUNEL標記的細胞數(shù)量顯著增加（圖 8),而BrdU標記的細胞數(shù)量減少。
[0162] 結論：Isll在SAN細胞的存活和增殖過程發(fā)育早期中都發(fā)揮了重要作用。
[0163] 實施例6使用HCN4-CreERT2在ElL 5胚胎SAN細胞中敲除Isll可導致竇性心律 不齊，減少SAN細胞的增殖。
[0164] 為了研究Isll在SAN發(fā)育晚期和其起搏功能中的作用，在SAN發(fā)育晚期敲除了 Isll0
[0165] 6. 1在ElL 5天給予他莫昔芬，Isll突變胚胎心率在24和72小時后的心超檢測 中顯著變緩（圖5A)。但是和胚胎早期敲除Isll不同，晚期敲除Isll后大部分的突變胚胎 仍然可以存活。
[0166] 在E13. 5天給予他莫昔芬，發(fā)現(xiàn)突變胚胎心率在48小時后顯著降低（圖5B)。研 究還發(fā)現(xiàn)在小鼠胚胎發(fā)育過程中對照組胚胎心率是逐漸增加的，但是HCN4-CreERT2 ;Isll 突變胚胎心率未見增加，并表現(xiàn)出心率變化不規(guī)則。（圖5B)。
[0167] 對E14. 5天心臟（E1L 5他莫昔芬誘導）整體和切片的X-gal和galactosidase 免疫熒光共染色顯示，Isll突變胚胎SAN中X-gal陽性細胞數(shù)量（圖D'，H)較對照組 (圖5C，C'，G)略降低。定量分析顯示（每個SAN計數(shù)10個切片)，Isl突變胚胎的SAN中 X-gal陽性細胞的數(shù)量（175. 5± 11. 7/切片）（圖）較對照組（205. 6± 17. 6/切片）（圖 5C'）減少了 15%。
[0168] 結論：SAN發(fā)育晚期敲除Isll后，大部分胚胎可以存活，但仍會造成嚴重的心律失 堂 巾。
[0169] 6. 2Isll 突變胚胎 SAN 中 HCN4-CreERT2 ;Rosa-YFP 陽性細胞的增殖細胞（BrdU+) 明顯減少。相反的，在發(fā)育早期，HCN4-CreERT2 ;Isll突變胚胎SAN細胞凋亡未見增多。
[0170] HCN4-CreERT2 ;Isll突變鼠的SAN切片免疫熒光染色結果顯示Isll，HCN4和Tbx3 的表達顯著降低（圖5E-H)。但是盡管Tbx3的表達降低，并無證據(jù)顯示Isll突變體SAN中 有NKX2. 5的異位表達。
[0171] 結論：Isll的減少造成了多個基因（如HCN4)的減少，因此，Isll在心臟傳導系統(tǒng) 中可能起到了重要的上游調控作用。
[0172] 實施例7Isll調控了 SAN發(fā)育和功能必須的關鍵轉錄因子，離子通道，以及細胞周 期，細胞存活基因的表達。
[0173] 為了研究可能導致前述Isll突變鼠表現(xiàn)型的Isll潛在的下游靶基因，使用 qRT-PCR對ElL 5天HCN4-CreERT2 ;Isll突變鼠和對照組SAN細胞進行了分析（他莫昔芬 在E9. 5進行了誘導）（圖6A-C)。選擇與Isll相關或與Isll表現(xiàn)型相關的基因進行分析。
[0174] 7. 1實驗發(fā)現(xiàn)，一系列信號通路基因表達下調，包括細胞增殖（Ccndl，Ccnd2， Ccnel，Ccnbl，Plkl，Aurka and Cdknl),細胞存活（Bcl2)(圖 6A)和心臟以及 SAN 發(fā)育 所必需的轉錄因子（Shox2，Isll，Mef2c，Tbx3)(圖6B)。在這些基因中，Ccndl (encoding cyclin Dl)和Mef2c已被證明是Isll的直接下游祀基因。同時，還有一系列和傳導系統(tǒng)功 能相關的離子通道基因的表達下調（Atplbl，Atplb2, Atp2al，Kcnel，Kcna5和Cacnalh)。 Gja5和Gjd3 (分別編碼了 Cx40和Cx30. 2)的表達也明顯降低。Gjal和Gja4 (分別編碼了 Cx43和Cx37)的表達則有增高（圖6C)。此外，還發(fā)現(xiàn)和人類病竇綜合征相關的基因 Myh6 在Isll突變胚胎SAN中的表達降低（圖6C)。
[0175] 7. 2SAN發(fā)育過程中的關鍵因子HCM和Tbx3在HCN4-CreERT2 ;Isll突變胚胎SAN 中的表達顯著降低。為了研究這2個基因是否是Isll的直接下游靶基因，對FACS純化后 E14. 5 至 E17. 5HCN4-nEGFP 突變鼠 SAN 細胞進行了 nano-ChIP 分析（60) (51)。
[0176] qPCR分析ChIP結果中不同DNA的表達豐度。為了鑒定Isll在進化保守區(qū)域 (ECRs)可能的結合位點（YTAATR)，檢查了小鼠 HCM和Tbx3基因組上游和下游各5kb的 區(qū)域。
[0177] 結果：2個ECRs可能包含了 Isll結合位點（圖6D，F(xiàn))。 Tbx3-l(chr5:119671762-119672016)位于Tbx3的5'非編碼區(qū)域，在轉錄起始位點（TSS) 下游 1271bp 和 1270bp 包含有 2 個相鄰的 TAAT 位點。Tbx3-2(chr5:119684628-119685046) 在一個Tbx33'端相鄰的465bp的ECR中，含有多個潛在的Isll結合位點。
[0178] ChIP-PCR 在 HCM 也發(fā)現(xiàn)了 2 個高豐度位點 locus (圖 6E，F(xiàn))。HCN4-2 (chr9:58842538-58842979)定位于一個442bp內含子ECR中，該位點已被證明為是一個有 效的增強子，該區(qū)域有多個Isll結合位點。HCM-I (chr9:58820136-58820197)位于一個 非保守區(qū)域內，位于HCM轉錄起始位點上游3376bp處，包含有一個潛在的I s11結合位點。 [0179] 在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范 圍。
【權利要求】
1. 一 種 LIM 同源結構域轉錄因子（LIM homeodomain transcription factor， Isletl，Isll)基因、蛋白或其促進劑的用途，其特征在于，用于制備促進HCN4基因 或蛋白表達的藥物組合物，或用于制備HCN4 (超極化激活性環(huán)核苷酸門控性通道4， hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel 4)的轉錄激活劑。
2. 如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的Isll基因或蛋白來自于哺乳動物，更 佳地來源于小鼠、大鼠或人。
3. 如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的Isll基因、蛋白或其促進劑包括的 Isll基因表達產物、促進型microRNA、促進型轉錄調控因子、或促進型靶向小分子化合物。
4. 如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的藥物組合物包括所述Isll基因、蛋白 或其促進劑以及藥學上可接受的載體。
5. 如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的竇房結細胞異常相關疾病包括：病竇 綜合征或心臟傳導系統(tǒng)相關心律失常。
6. -種用于促進HCN4基因或蛋白表達的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物 含有Isll基因、蛋白或其促進劑以及藥學上可接受的載體。
7. -種篩選用于促進HCN4基因或蛋白表達和/或活性的化合物的方法，其特征在于， 包括步驟： (i) 在實驗組，向細胞培養(yǎng)體系中添加測試化合物，并測定細胞培養(yǎng)體系中Isll表達 量和/或活性；在對照組，向相同的細胞培養(yǎng)體系中不添加測試化合物，并測定細胞培養(yǎng)體 系中Isll表達量和/或活性； 其中，如果實驗組中的Isll表達量和/或活性大于對照組，則說明該測試化合物為用 于促進HCN4基因或蛋白表達和/或活性的化合物。
8. 如權利要求7所述的方法，其特征在于，還包括步驟： (ii) 對⑴中獲得的化合物，進一步測定其對HCN4表達量和/或活性的促進作用；其 中，如果實驗組中HCN4的表達量和/或活性明顯大于對照組，則說明該化合物為用于促進 HCN4基因或蛋白表達和/或活性的化合物。
9. 一種基因重組的動物細胞，其特征在于，所述動物細胞含有一誘導型表達盒，所述誘 導型表達盒包括誘導型啟動子，以及與所述誘導型啟動子操作性連接的Isll編碼序列和 終止密碼子，從而可以在誘導條件下表達所述的Isll蛋白，并且Isll蛋白表達量與誘導條 件相關； 并且，所述動物細胞不是組成型表達Isll編碼序列的細胞。
10. -種體外非治療性的處理方法，其特征在于，包括步驟： (a) 在一定濃度的誘導劑存在下，培養(yǎng)權利要求9所述的基因重組的動物細胞，從而誘 導所述動物細胞中表達Isll蛋白；和 (b) 檢測所述動物細胞中蛋白的表達情況和/或活性水平。
11. 一種構建心臟病模型動物的方法，其特征在于，包括步驟： (a)提供一動物細胞，所述動物細胞不是組成型表達Isll編碼序列的細胞，并且所 述動物細胞含有一誘導型表達盒，所述誘導型表達盒包括誘導型啟動子，以及與所述誘導 型啟動子操作性連接的Isll編碼序列和終止密碼子，從而可以在誘導條件下表達所述的 Isll蛋白，并且Isll蛋白表達量與誘導條件相關；和 (b)將所述動物細胞再生成動物，從而制得心臟病模型動物。
【文檔編號】C07K14/47GK104338149SQ201310326495
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年7月30日 優(yōu)先權日:2013年7月30日
【發(fā)明者】孫云甫, 梁興群 申請人:上海市東方醫(yī)院（同濟大學附屬東方醫(yī)院）