一種微藻三酰甘油合成調(diào)控基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種微藻三酰甘油合成調(diào)控基因及其編碼蛋白與應(yīng)用，該基因是來源于萊茵衣藻，是下列核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ?ID?NO：1DNA序列；2)編碼序列表中SEQ?ID?NO：2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ?ID?NO：1限定的DNA序列具有90％以上同源性且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。該基因的編碼蛋白是具有序列表中SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，蛋白ID為159133，由410個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。該CrBbox基因可應(yīng)用于改變?nèi)R茵衣藻的中性脂含量，可以應(yīng)用于新型高油脂含量藻株的培育。
【專利說明】—種微藻三酰甘油合成調(diào)控基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種能顯著改變微藻中性脂含量的基因，特別涉及一種能顯著改變?nèi)R茵衣藻中性脂含量的調(diào)控基因及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]進入21世紀，經(jīng)濟飛速發(fā)展，人類對石油等化石燃料的消耗日益增加，并且使用化石燃料帶來了嚴重環(huán)境污染問題，世界各國都在尋找安全的可再生能源。生物能源可以間接或者直接利用植物或微生物的光合作用，將太陽能固定為化學(xué)能，是可再生能源的首選。生物柴油和燃料乙醇是目前可以作為汽油添加劑進入市場的生物能源，其中生物柴油的成分更接近汽油，并且來源廣泛，成本低，是最有可能解決石油危機的可再生能源之一。
[0003]生物柴油的制備主要是通過三酰甘油(TAG)與甲醇(乙醇)通過酯交換工藝制成。近年來生物柴油的產(chǎn)量在不斷增加，2008年全球生物柴油總量達到1110萬噸，預(yù)計到2016年生物柴油總產(chǎn)量達到12100萬噸，但是生物柴油的價格至今仍是居高不下。原料成本占據(jù)了生物柴油總生產(chǎn)成本的60-70 %。目前生物柴油的原料有餐飲廢棄油、動植物油脂和微藻。利用微藻生產(chǎn)生物柴油具有無可比擬的優(yōu)勢，已成為制備生物柴油的主要途徑。
[0004]利用微藻來生產(chǎn)生物柴油有很多工藝步驟，其中優(yōu)良藻種的選育是關(guān)鍵。最理想的生物柴油生產(chǎn)藻株要求生長迅速、含油量高且脂肪酸組成適宜制備生物柴油。目前的研究工作主要集中在藻種的分離，藻種含油量的測定，藻種脂肪酸成分的分析以及藻種的大規(guī)模培養(yǎng)上。與高等植物相比，微藻的TAG生物合成和積累的分子機制研究還很薄弱，關(guān)于TAG代謝網(wǎng)絡(luò)中相關(guān)基因功能研究報告更為稀少。萊茵衣藻是模式單細胞生物，基因組測序已經(jīng)完成，在缺氮條件下油脂可以積累達到胞質(zhì)的60%，是研究TAG代謝基因的理想藻株。
[0005]B-Box-type z inc finger:大約有40個氨基酸殘基的長度?？煞譃閮深?其中類型I和2型B-Box在他們的共有序列中有所不同并在7-8鋅結(jié)合殘基也不同。一些蛋白質(zhì)包含兩種類型I和2的B-box,說明在這兩個類型B-box有一定程度的協(xié)同。B_box結(jié)構(gòu)域從各種生物被發(fā)現(xiàn)在超過1500種蛋白質(zhì)。B-box結(jié)構(gòu)域主要是2型。許多2型B-box參與蛋白泛素化。含B-box鋅指結(jié)構(gòu)域的蛋白包括轉(zhuǎn)錄因子，核糖和原癌基因蛋白；例如MIDI，MID2, TRIM9, TNL, TR頂36，TRIM63, TRIFIC, NCLl 和 C0NSTANS-1 ike proteins。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種能改變微藻中三酰甘油含量的基因及其應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明所提供的能提高藻類三酰甘油含量的基因名稱為CrBbox(Chlamydomonasreinhardtii B-Box-type zinc finger),該基因在JGI萊茵衣藻基因數(shù)據(jù)庫的名稱為acegs_kg.scaffold_38000029,位于 chromosome_13:4746249-4749429 區(qū)域，含 5 個外顯子。蛋白ID159133,編碼B-box zinc finger protein,是根據(jù)JGI萊茵衣藻基因數(shù)據(jù)庫上公布的CrBbox基因為模板設(shè)計特異性引物，擴增cDNA獲得全長序列，根據(jù)該堿基序列分析而推測編碼CrBbox蛋白的序列。對其研究發(fā)現(xiàn)該基因過量表達可以降低萊茵衣藻中性脂含量，而通過RNAi干涉將該基因敲除可顯著提高萊茵衣藻中性脂含量。本發(fā)明所述CrBbox基因，來源于萊茵衣藻，是下列核苷酸序列之一:
[0008]I)序列表中 SEQ ID NO:1DNA 序列；
[0009]2)編碼序列表中SEQ ID NO:2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；
[0010]3)與序列表中SEQ ID NO:1限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
[0011]能改變微藻中性脂含量的基因CrBbox的編碼蛋白B-box鋅指蛋白，是具有序列表中SEQ ID NO:2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID NO:2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO:2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID NO:2衍生的蛋白質(zhì)。
[0012]序列表中序列2氨基酸殘基是由410個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。
[0013]含有本發(fā)明基因的表達載體及至少有15個核苷酸與由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列或其互補鏈組成的DNA互補的DNA均屬本發(fā)明的保護范圍。該CrBbox基因應(yīng)用于顯著改變?nèi)R茵衣藻的中性脂含量及應(yīng)用于新型高油脂含量藻株的培育。
[0014]采用植物表達的載體，將本發(fā)明的CrBbox基因轉(zhuǎn)入萊茵衣藻導(dǎo)致中性脂含量減少；采用RNAi干涉的方法，將CrBbox基因片段轉(zhuǎn)入萊茵衣藻導(dǎo)致中性脂含量升高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為CrBbox的RT-PCR擴增結(jié)果1:DL2000DNA分子量標準；5 =CrBbox擴增結(jié)果;
[0016]圖2為CrBbox過量表達轉(zhuǎn)基因`藻株生物量的變化情況；
[0017]圖3為CrBbox過量表達轉(zhuǎn)基因藻株中性脂含量的變化情況；
[0018]圖4為pAMBIA1302空載體轉(zhuǎn)化子、pCAMBIA1302-CrBbox基因藻株第六天時尼羅紅染色后熒光觀察圖；
[0019]圖5 為 pAMBIA1302 空載體轉(zhuǎn)化子、CC425 和 pCAMBIA1302_CrBbox 基因藻株 RNA 表達分析圖；
[0020]圖6為CrBbox RNAi干涉轉(zhuǎn)基因藻株的生物量含量變化圖；
[0021]圖7為CrBbox RNAi干涉轉(zhuǎn)基因藻株的油脂含量變化圖；
[0022]圖8為Maa7/XIR空載體轉(zhuǎn)化子和CrBbox RNAi干涉轉(zhuǎn)基因藻株尼羅紅染色后熒光觀察圖；
[0023]圖9為Maa7/XIR空載體轉(zhuǎn)化子、CC425及CrBbox RNAi干涉轉(zhuǎn)基因藻株RNA表達分析圖
【具體實施方式】
[0024]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。Marker均購自大連寶生物公司。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。[0025]實施例1CrBbox的克隆
[0026]I)萊茵衣藻總RNA勺提取
[0027]萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)藻株 CC425,培養(yǎng)于 24°C光照培養(yǎng)箱，100 μ molm_2sec_1白光,全光照條件下,待生長至對數(shù)生長期,取藻液50mL, 10000r/min離心lmin收集藻體，液氮速凍后碾磨成粉末，按照Trizol的方法提取總RNA ；
[0028]2)引物設(shè)計
[0029]根據(jù)DOE JGI Chlamydomonas database上公布的CrBbox基因為模板，設(shè)計如下特異性引物，進行PCR擴增:
[0030]CrBbox全長擴增引物引物序列(5 ’ 一 3 ’)
[0031]正向引物ATGTCGAGTTGCGTCGTGTGCG
[0032]反向引物TTAGCACTCAGCGTCCAGGACCTCG
[0033]3) cDNA 的合成
[0034]按照寶生物工程(大連)有限公司提供的Takara的試劑盒,使RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
[0035]4)制備 PCR Master 混合物
[0036]
試劑每管加入量(MJL)
cDNA第一鏈I`
10X PCR緩沖液5.dNTP Mix ( IOmM)I
正向引物I
反向引物I
PCR 級水4 0.5
LA Taq 酶0.5
[0037]
[0038]5)進行PCR擴增:
[0039]940C 5min ；35 個循環(huán):94°C lmin,55°C lmin,72°C lmin ；72°C IOmin0
[0040]取8 μ L進行I %瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果如圖1，-20 V保存。
[0041]6) PCR產(chǎn)物的純化和膠回收
[0042]按照上海華舜生物工程有限公司的小量膠回收試劑盒回收DNA片斷，PCR產(chǎn)物連接到pGEM-T Vector (promega公司)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑選陽性克隆測序。
[0043]實施例2過量表達CrBbox基因的轉(zhuǎn)化子獲得
[0044]I)植物表達載體的構(gòu)建[0045]設(shè)計帶有Bgl II和Spe I酶切位點的引物(正向:5’ -AAAGATCTAATGTCGAGTTGCGTCGTGTG-3’ ；反向:5’ -AAACTAGITTAGCACTCAGCGTCCAGGA-3’)，PCR 擴增 CrBbox 基因全長。BglII和Spe I雙酶切修飾后的CrBbox產(chǎn)物和pCAMBIA1302的BGl II和SpeI雙酶切載體大片段進行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，PCR鑒定陽性克隆，提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定。提取正確的重組表達質(zhì)粒pCAMBIA1302-CrBbox，用于轉(zhuǎn)化。
[0046]2)過量表達CrBbox萊茵衣藻轉(zhuǎn)化子的獲得(電轉(zhuǎn)化法)
[0047]萊茵衣藻(藻株CC425，購自中國科學(xué)院水生生物研究所)，培養(yǎng)于24°C光照培養(yǎng)箱，IOOiimol m^sec-1白光，全光照條件下，待生長至藻細胞數(shù)為2 X IO7個/mL ;2000rpm離心5min，收集藻細胞；無菌去離子水洗滌沉淀并重復(fù)3次，用含60mM蔗糖的TAP液體培養(yǎng)基(2.42g/L Tris-base+lml/L冰醋酸+119mg/L K2HP04+61mg/LKH2P04+0.4g/L NH4Cl+0.lg/LMgSO4 ? 7H20+50mg/LCaCl2 ? 2H20+lml/L Trace)重懸沉淀；冰浴 IOmin ;取藻液加入重組質(zhì)粒，混勻后轉(zhuǎn)移至電擊杯中，室溫靜置5min ；1.5kV, 10 u F, 200 Q , 6msec條件下電擊,室溫靜置lOmin，加入5mL TAP液體培養(yǎng)基，22°C，lOOrpm，昏暗光線復(fù)蘇8h ；2000rpm,離心5min,收集藻細胞,調(diào)節(jié)藻細胞數(shù)目到I X IO6個/mL ;轉(zhuǎn)移藻液至含1.5mML_色氨酸、5iig/mL L-paromomycin的TAP固體選擇培養(yǎng)基上,緩慢傾斜旋轉(zhuǎn),使藻液分布均勻；關(guān)閉光源，吹干，24°C光照培養(yǎng)箱，IOOymol H1-2Sec-1白光，全光照條件下培養(yǎng)至形成單個藻落。
[0048]實時熒光定量PCR確定CrBbox基因的過量表達:RNA提取參照實例一，實時熒光定量PCR參照TaKaRa公司的SYBR? Premix Ex Taq?試劑操作說明進行。結(jié)果見圖5。
[0049]3)對照萊茵衣藻 的獲得
[0050]用pCMBIA1302代替pCMBIA1302_CrBbox，用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化萊茵衣藻(藻株CC425，購自中國科學(xué)院水生研究所)，方法同步驟2，得到轉(zhuǎn)空載體的藻株。
[0051]實施例3CrBbox過量表達藻株的生理表型觀察
[0052]轉(zhuǎn)pCMBIA1302空載體組、CrBbox過量表達組、原始藻株CC425，各選100個藻株，培養(yǎng)于24 °C光照培養(yǎng)箱，IOOymol m^sec-1白光，全光照條件下，待生長至對數(shù)生長期，2000rpm，離心5min，雙蒸水重懸，按10 %接種量接種到不含抗生素的HSM-N液體培養(yǎng)基(2g/LNaAc ? 3H20+1.44g/L K2HP04+0.72g/L KH2P04+0.54 6 7g/L NaCl+20mg/LMgSO4 *7H20+10mg/LCaCl2 *2H20+lml/L Trace-N)，連續(xù)震蕩培養(yǎng) 6 天。每 24h 測量以下生理值。
[0053]I)生物量統(tǒng)計
[0054]按照Harris于1989年描述的方法使用血球計數(shù)板計數(shù)，并計算出生物量。結(jié)果顯示過量表達CrBbox基因的藻株與非轉(zhuǎn)基因藻株CrCC425和轉(zhuǎn)空載體藻株生物量無明顯差異。(圖2)。
[0055]2)中性脂含量測定
[0056]使用酸水解法測定中性脂含量:藻液低溫冷凍干燥成藻粉，各取0.1g藻粉，加入無菌蒸懼水，混勻后加入IOml鹽酸，80°C水浴25min,加入10111195%乙醇,混勻。冷卻后加入IOml乙醚,加蓋振搖Imin,之后開蓋放出氣體。4000rpm離心3min,取上清液移至恒重的錐形瓶中，重復(fù)洗滌離心管中的殘渣，然后將上清液轉(zhuǎn)移至原先的錐形瓶中。將錐形瓶置于水浴上蒸干，再轉(zhuǎn)移至100°C烘箱中干燥2h，取出冷卻后稱重。另取藻液，經(jīng)終濃度為IOiig/mL尼羅紅染色IOmin后,使用突光顯微鏡在激發(fā)光為480nm,發(fā)散光為560nm-600nm下進行觀察及拍照，也可見過量表達CrBbox基因中性脂含量明顯下降(圖3)。
[0057]實施例4CrBbox基因RNAi干涉表達載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因藻株的獲得
[0058]l)RNAi干涉表達載體的構(gòu)建
[0059]設(shè)計特異性弓丨物(正向:5’ -AGCTGCTACGCACGAGACCG-3’ ；反向:5，-GCCCATGTCGAGCCAGTTGT-3’ )擴增CrBbox基因410bp片段用于干涉研究。正義片段分別用HindIII和BamHII雙酶切擴增的PCR產(chǎn)物和RNAi中間載體T282，連接，轉(zhuǎn)化，鑒定，測序確定正確的陽性克隆。反義片段分別用XbaI和SalI雙酶切PCR產(chǎn)物和已連接正義片段的T282載體連接，轉(zhuǎn)化，鑒定獲得CrBbox反向重復(fù)序列插入的中間載體T282_CrBbox。EcoRI酶切Maa7/XIR載體并去磷酸化與同樣經(jīng)EcoRI酶切的T282_CrBbox載體連接，轉(zhuǎn)化，鑒定得到用于RNA干涉的最終載體Maa7/XIR-CrBbox。
[0060]2) CrBbox RNAi干涉表達轉(zhuǎn)基因藻株的獲得
[0061]采用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化萊茵衣藻(藻株CC425，購自中國科學(xué)院水生研究所)，具體步驟參見實例2中步驟2。
[0062]3)對照萊茵衣藻的獲得
[0063]用Maa7/XIR代替Maa7/XIR_CrBbox用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化萊茵衣藻(藻株CC425，購自中國科學(xué)院水生研究所)，方法同步驟2，得到轉(zhuǎn)空載體的藻株。
[0064]實施例5CrBbox RNAi干涉表達轉(zhuǎn)基因藻株的生理表型觀察
[0065]CrBbox RNAi干涉表達組，待長出單個藻落后，接種到含1.5mM L-色氨酸、5 μ M5-FI的TAP固體選 擇培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)Maa7/XIR空載體組直接接種到含1.5mM L-色氨酸、5 μ g/mL paromomycin的TAP固體選擇培養(yǎng)基上，培養(yǎng)于24 °C光照培養(yǎng)箱，IOOymol n^sec—1白光，全光照條件下，待第三次長出單個藻落，挑取陽性轉(zhuǎn)化子，接種到HSM 液體培養(yǎng)基(2g/LNaAc.3H20+1.44g/L K2HP04+0.72g/L KH2P04+0.5g/LNH4Cl+20mg/LMgSO4.7H20+10mg/LCaCl2.2H20+lml/L Trace)中，連續(xù)震蕩培養(yǎng) 9 天。每 24h 測量以下生理值。
[0066]生物量和中性脂含量的測定參照實例3。結(jié)果CrBbox RNAi干涉表達的藻株生物量變化不是很明顯(圖6);中性脂含量呈升高趨勢，在第10天時升高最多，(圖7)，CrBboxRNAi干涉表達組的中性脂含量上升也可以通過尼羅紅染色后照相明顯可見(圖8)。其mRNA表達水平參照實例二，CrBbox基因的RNA表達明顯被抑制(圖9)。
【權(quán)利要求】
1.一種微藻三酰甘油合成調(diào)控基因，其特征在于該基因具有下列核苷酸序列之一: 1)序列表中SEQID NO:1DNA序列或其互補序列； 2)編碼序列表中SEQID NO:2蛋白質(zhì)序列的核苷酸序列； 3)與序列表中SEQID NO:1限定的DNA序列具有90%以上同源性，優(yōu)選為95%以上同源性且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列或其互補序列。
2.—種權(quán)利要求1所述的基因的編碼蛋白，其特征在于是具有序列表中SEQ ID NO:2所不的氣基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
3.—種權(quán)利要求2所述的編碼蛋白的衍生蛋白質(zhì)，其特征是將SEQ ID NO:2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO:2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID NO:2衍生的蛋白質(zhì)。
4.一種載體，其含有權(quán)利要求1所述的微藻三酰甘油合成調(diào)控基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因或權(quán)利要求5所述的載體在調(diào)控微藻的油脂合成中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因或權(quán)利要求5所述的載體用于改變?nèi)R茵衣藻的中性脂含量或應(yīng)用于高油脂含量藻 株的培育。
【文檔編號】C07K14/405GK103589737SQ201310342931
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年8月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月5日
【發(fā)明者】鄧曉東, 費小雯 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所