一種豬gapdh蛋白抗體及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬GAPDH抗體及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明通過表達(dá)純化豬的GAPDH蛋白，制備免疫原，免疫純種新西蘭兔，制備兔抗豬GAPDH蛋白的抗體，彌補(bǔ)了豬特異性抗體缺乏的空白，為豬遺傳育種科學(xué)研究提供了材料；而且本發(fā)明制備的抗豬的GAPDH抗體能夠很好的識別豬和鼠的GAPDH蛋白；而市場上購買的抗人的GAPDH抗體僅能夠有限的識別鼠的GAPDH蛋白，對豬的GAPDH蛋白基本不能識別。
【專利說明】—種豬GAPDH蛋白抗體及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種豬GAPDH蛋白抗體及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]目前國內(nèi)外針對豬的抗體制備非常稀少，而隨著豬分子遺傳育種工作的深入開展，對豬特異性抗體的需求愈加強(qiáng)烈。在以豬為實(shí)驗(yàn)材料的研究中，經(jīng)常會(huì)遇到檢測某一蛋白的表達(dá)時(shí)找不到合適的抗體的情況，使得許多研究無法全面的展開。因此，制備豬的蛋白抗體十分緊迫。
[0003]GAPDH基因是一種非常重要的內(nèi)參基因，在mRNA和蛋白檢測中作為標(biāo)準(zhǔn)廣泛應(yīng)用。GAPDH抗體在人和小鼠身上都已經(jīng)有了很成熟的研究，如譚翔文等(2008)曾克隆了人的GAPDH基因的部分片段，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pUC18-GAPDH，且小鼠的GAPDH單克隆抗體已經(jīng)開始了商業(yè)化生產(chǎn)，但是豬GAPDH抗體卻極度缺乏。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中豬抗體資源的不足，提供一種豬GAPDH蛋白抗體；彌補(bǔ)了豬特異性抗體缺乏的空白，為豬遺傳育種科學(xué)研究提供了材料。
[0005]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種豬GAPDH蛋白抗體的制備方法。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種豬GAPDH蛋白抗體的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的:
一種豬GAPDH蛋白抗體，以豬的GAPDH蛋白作為抗原免疫動(dòng)物，分離動(dòng)物抗血清，純化得到豬GAPDH蛋白抗體。
[0008]一種豬GAPDH蛋白抗體的制備方法，包括以下步驟:
51.克隆得到豬GAPDH基因，將豬GAPDH基因進(jìn)行原核表達(dá)得到豬GAPDH蛋白；
52.將豬GAPDH蛋白與等劑量的免疫佐劑均勻混合，制成免疫原，皮下注射純種新西蘭兔，經(jīng)過四次免疫后，收集兔血清，通過蛋白A瓊脂糖凝膠純化獲得GAPDH抗體。
[0009]步驟S2所述免疫原的制備方法為:將400μ?純化的豬GAPDH蛋白和600μ? PBS溶液和ImL完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑相互混合，攪拌20min混勻后得到的白色油乳劑即為免疫原。
[0010] 步驟SI原核表達(dá)時(shí)，確定IPTG誘導(dǎo)濃度為0.0lmM，誘導(dǎo)時(shí)間為5小時(shí)。
[0011]如上所述豬GAPDH蛋白抗體的應(yīng)用，所述豬GAPDH蛋白抗體能夠高效特異識別豬GAPDH蛋白，應(yīng)用于通過ELISA、Western blot檢測豬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。
[0012]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
(I)本發(fā)明首次用豬GAPDH蛋白為抗原，制備GAPDH抗體。目前市場上GAPDH抗體主要是以人或鼠源GAPDH蛋白制備，而本發(fā)明制備的GAPDH抗體能夠更特異的識別豬GAPDH蛋白，在以豬為研究對象的科學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。[0013](2)通過檢測試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明制備的GAPDH抗體效價(jià)達(dá)到1:4000，能夠很好的應(yīng)
用于科學(xué)研究。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1.本發(fā)明兔抗豬GAPDH抗體制備流程圖。
[0015]圖2.豬GAPDH基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果；M.DNA marker ; I~4為以豬肌肉cDNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；5.陰性對照。
[0016]圖3.含有PMD18-T-GAPDH重組質(zhì)粒的陽性候選克隆PCR鑒定結(jié)果；M.DNAmarker ；1-2為單克隆菌落。
[0017]圖4.豬GAPDH蛋白序列信號肽預(yù)測結(jié)果。
[0018]圖5.pET-28a ( + )質(zhì)粒的雙酶切結(jié)果，1.完整的pET_28a ( + )質(zhì)粒作為對照；2.雙酶切后的pET_28a ( + )質(zhì)粒；3.Marker。
[0019]圖6.pMD18-T-GAPDH 質(zhì)粒的雙酶切結(jié)果；1.Marke ；2.完整的 pMD18_T_GAPDH 質(zhì)粒；3.雙酶切后的pMD18-T-GAPDH質(zhì)粒。
[0020]圖7.重組質(zhì)粒pET-28a( + )_GAPDH雙酶切鑒定結(jié)果；M.Marker ；1.雙酶切前的質(zhì)粒；2.雙酶切后的質(zhì)粒。
[0021]圖8.不同誘導(dǎo)時(shí)間下蛋白表達(dá)量檢測；M.蛋白Marker ;C.不加IPTG誘導(dǎo)；1~5.加入IPTG誘導(dǎo)后lh，2h，3h，4h，5h的蛋白表達(dá)情況。
[0022]圖9.不同誘導(dǎo)濃度下蛋白表達(dá)量檢測；M.蛋白Marker ;C.不加IPTG對照；1飛.1PTG 濃度依次為 0.01 mM,0.05 mM,0.1 mM,0.5 mM，ImM 的表達(dá)產(chǎn)物。
[0023]圖10.N1-NTA層析柱純化GAPDH蛋白結(jié)果；1.純化后所得蛋白上清；2.上清與沉淀混合；3.菌液濾液；4.lysis buffer ；5.wash buffer?
[0024]圖11.蛋白A瓊脂糖凝膠純化GAPDH抗體結(jié)果；M.蛋白Marker ; 1.購買的GAPDH抗體；2.純化后GAPDH抗體；3.過濾液。
[0025]圖12.Elisa檢測GAPDH抗體效價(jià)。
[0026]圖13.Westernblot檢測GAPDH抗體，I~5泳道均為GAPDH抗原蛋白。
[0027]圖14.本發(fā)明所述抗豬GAPDH的抗體與市售抗人GAPDH的抗體的特異性比較;A.抗豬GAPDH的抗體；B.抗人GAPDH的抗體；PSCs為豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞；C2C12為鼠成肌細(xì)胞。
【具體實(shí)施方式】[0028]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，但實(shí)施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。
[0029]實(shí)施例1
S1.克隆豬GAPDH基因:本發(fā)明中，首先提取豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以此為模板克隆得到豬GAPDH基因。
[0030]Sll.豬總骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞總RNA的提取參照TAKARA公司的RNAiso Plus總RNA提取試劑使用說明書。
[0031]S12.總RNA的反轉(zhuǎn)錄:RNA的反轉(zhuǎn)錄參照TIANGEN公司的TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進(jìn)行操作，具體步驟如下:
在冰浴的無核酸酶的離心管中加入如下反應(yīng)混合物:
【權(quán)利要求】
1.一種豬GAPDH蛋白抗體，其特征在于，以豬的GAPDH蛋白作為抗原免疫動(dòng)物，分離動(dòng)物抗血清，純化得到豬GAPDH蛋白抗體。
2.權(quán)利要求1所述豬GAPDH蛋白抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 51.克隆得到豬GAPDH基因，將豬GAPDH基因進(jìn)行原核表達(dá)得到豬GAPDH蛋白； 52.將豬GAPDH蛋白與等劑量的免疫佐劑均勻混合，制成免疫原，皮下注射純種新西蘭兔，經(jīng)過四次免疫后，收集兔血清，通過蛋白A瓊脂糖凝膠純化獲得GAPDH抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述制備方法，其特征在于，步驟S2所述免疫原的制備方法為:將400μ?純化的豬GAPDH蛋白和600μ? PBS溶液和ImL完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑相互混合，攪拌20min混勻后得到的白色油乳劑即為免疫原。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述制備方法，其特征在于，步驟SI原核表達(dá)時(shí)，確定IPTG誘導(dǎo)濃度為0.0lmM，誘導(dǎo)時(shí)間為5小時(shí)。
5.權(quán)利要求1所述豬GAPDH蛋白抗體的應(yīng)用，其特征在于，所述豬GAPDH蛋白抗體能夠高效特異識別豬GAPDH蛋白 ，應(yīng)用于通過ELISA、WeStern blot檢測豬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。
【文檔編號】C07K16/18GK103450358SQ201310349356
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月12日
【發(fā)明者】王翀, 徐建, 田志浩, 區(qū)錦馨, 曾芳, 童雄, 李加琪, 吳珍芳, 張哲
申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)