人α-乳清白蛋白單克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種人α-乳清白蛋白單克隆抗體。由保藏號(hào)為CGMCC No.7459的小鼠雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生。本發(fā)明還提供所述人α-乳清白蛋白單克隆抗體的制備方法及應(yīng)用。所述單克隆抗體可用于檢測轉(zhuǎn)基因牛奶與奶粉中的人α-乳清白蛋白。本發(fā)明的人α-乳清白蛋白單克隆抗體純度高，效價(jià)高，靈敏度高，無交叉反應(yīng)，專一性強(qiáng)，可特異性識(shí)別轉(zhuǎn)基因樣品，直接對(duì)外源表達(dá)蛋白進(jìn)行檢測，避免了基因提取費(fèi)時(shí)費(fèi)力且容易污染的問題；本發(fā)明檢測成本低廉，結(jié)果迅速，靈敏可靠，可以穩(wěn)定、方便地提供準(zhǔn)化的試劑，便于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。CGMCC No745920130426
【專利說明】人Ct-乳清白蛋白單克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及單克隆抗體的制備與應(yīng)用，尤其涉及一種人α-乳清白蛋白單克隆抗 體及其制備方法與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] α -乳清白蛋白（a -LA)是分子量小、酸性的、高親和性的Ca2+結(jié)合蛋白。它幾乎 存在于所有的哺乳動(dòng)物乳汁中。人α-乳清白蛋白的分子量為14. 1KD。α-乳清白蛋白是 人乳中的重要組成成分，約占總蛋白含量的25-35%，而在牛奶中只占總蛋白含量的2-5%。 α -乳清白蛋白可與Ca2+、Zn2+等多種二價(jià)陽離子結(jié)合，能促進(jìn)微量元素的吸收。在乳腺分 泌細(xì)胞中，α-乳清白蛋白作為調(diào)節(jié)亞基通過與半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶相互作用催化乳糖的合成。 最近還發(fā)現(xiàn)人α-乳清白蛋白的不同折疊突變體具有殺菌和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的功能，還 能與油酸形成復(fù)合物殺死皮膚的乳突淋瘤，具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0003] 由于α-乳清白蛋白具有如此重要的功能，人α-乳清白蛋白可以被開發(fā)成嬰幼 兒食品，保健品，運(yùn)動(dòng)飲料以及抗菌、抗腫瘤藥物等。據(jù)FAO預(yù)測，全球每年嬰幼兒食品市場 為58億美元，人α-乳清白蛋白已成為這些產(chǎn)品的重要成分，加上其它產(chǎn)品開發(fā)，人α-乳 清白蛋白的市場前景非常巨大。但是目前市場上供應(yīng)的α-乳清白蛋白主要是從牛奶中純 化的牛α-乳清白蛋白，不過由于牛α-乳清白蛋白在牛乳中含量低（1.2g/L)，純化工藝復(fù) 雜，而且成本偏高，生產(chǎn)的α-乳清白蛋白無法滿足市場需求。更重要的是，牛α-乳清白 蛋白并不具備人α-乳清白蛋白的一些營養(yǎng)價(jià)值和重要功能，因此人α-乳清白蛋白具有 廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。但是由于來源有限，限制了人α-乳清白蛋白作為藥用蛋白和保健 品的使用，因此人們開始利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物即動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)高效表達(dá)重組人α-乳清白 蛋白。
[0004] 同時(shí)，與轉(zhuǎn)基因相伴而生的生物安全問題引起了公眾和管理部門的強(qiáng)烈關(guān)注和重 視。建立精準(zhǔn)、快速的檢測技術(shù)并科學(xué)、系統(tǒng)地進(jìn)行生物安全評(píng)價(jià)，可防止轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或產(chǎn) 品在研究、生產(chǎn)、銷售時(shí)發(fā)生擴(kuò)散、污染等安全隱患進(jìn)行檢測和監(jiān)測技術(shù)儲(chǔ)備和支撐。這不 僅是維護(hù)消費(fèi)者知情權(quán)和在國際貿(mào)易中維護(hù)國家利益的必要手段，也是我國履行國際義 務(wù)、維護(hù)國家形象的重要保障。
[0005] 乳鐵蛋白的檢測方法有很多，其中ELISA檢測法以其快速、準(zhǔn)確、靈敏且一次能處 理多個(gè)樣而倍受關(guān)注。目前國內(nèi)外用于ELISA檢測的抗體為多克隆抗體，而以單克隆抗體 為基礎(chǔ)建立起的免疫學(xué)檢測試劑盒很少。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種人α-乳清白蛋白單 克隆抗體。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明首先提供一株能分泌產(chǎn)生所述人α -乳清白蛋白 單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[0008] 雜交瘤細(xì)胞ZZY hLY7El，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 (簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編 碼：100101 )，保藏日期為2013年4月26日，保藏編號(hào)為CGMCC No. 7459。
[0009] 本發(fā)明還提供了人α-乳清白蛋白單克隆抗體，其由所述雜交瘤細(xì)胞株分泌獲 得。
[0010] 本發(fā)明還提供了人α-乳清白蛋白單克隆抗體的制備方法，用重組蛋白a-LF免 疫雌性BALB/c小鼠，取脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，經(jīng)ELISA法進(jìn)行陽性克隆篩選、 通過有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，獲得穩(wěn)定分泌抗a-LA的5株細(xì)胞1C7、5E8、5G9、6E6、7E1。取 雜交瘤細(xì)胞(效價(jià)較高同時(shí)細(xì)胞狀態(tài)好)注射至小鼠腹腔，收集腹水，親和柱純化得人α -乳 清白蛋白單克隆抗體。
[0011] 經(jīng)鑒定腹水制備前細(xì)胞上清效價(jià)檢測顯示細(xì)胞7Ε1效價(jià)最高。7Ε1細(xì)胞亞型為 IgGl。7Ε1細(xì)胞能與免疫原α-LA反應(yīng)，不與篩選原牛乳鐵蛋白（bLA)反應(yīng)。用細(xì)胞7Ε1制 備腹水，檢測腹水效價(jià)為1:81000,腹水純化檢測單克隆抗體效價(jià)為1:81000,抗體純度高 于 95%。
[0012] 本發(fā)明還提供前述人a-乳清白蛋白單克隆抗體在檢測轉(zhuǎn)基因牛奶與奶粉中人 a-乳清白蛋白中的應(yīng)用。
[0013] 所述人a -乳清白蛋白單克隆抗體可用于檢測轉(zhuǎn)基因牛奶中表達(dá)量數(shù)量級(jí)為g/L 的人a-乳清白蛋白。Western Blot檢測顯示抗體7E1只與轉(zhuǎn)基因牛奶及奶粉反應(yīng)，不與 非轉(zhuǎn)基因牛奶及奶粉反應(yīng)。
[0014] 本發(fā)明還提供前述人a-乳清白蛋白單克隆抗體在制備用于檢測轉(zhuǎn)基因牛奶與 奶粉中人a-乳清白蛋白試劑盒中的應(yīng)用。
[0015] 所述人a-乳清白蛋白的夾心ELISA檢測試劑盒還包括以下試劑中的一種或多 種：
[0016] 1)洗滌液；
[0017] 2)底物顯色液；
[0018] 3)反應(yīng)終止液；
[0019] 4)人a -乳清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。
[0020] 所述洗滌液為PBST，所述底物顯色液為TMB，所述反應(yīng)終止液為2mol/L H2S04。
[0021] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明的人a-乳清白蛋白單克隆抗體純度高，效價(jià)高，靈敏 度高，無交叉反應(yīng)，專一性強(qiáng)，可特異性識(shí)別轉(zhuǎn)基因樣品，可直接對(duì)外源表達(dá)蛋白進(jìn)行檢測， 同時(shí)避免了核酸檢測方法中，基因提取費(fèi)時(shí)費(fèi)力且容易污染的問題。檢測成本低廉，結(jié)果迅 速，靈敏可靠，而且可以穩(wěn)定、方便地提供準(zhǔn)化的試劑，便于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1為免疫抗原（6his-MBP-CCG343)及檢測抗原（PGEX-6P-1-CCG343)的表達(dá)純 化；
[0023] 其中，la :6his-MBP-CCG343 樣品；lb :6his-MBP-CCG343 穿柱液；Ic : 6his-MBP-CCG343 洗脫 I ;ld :6his-MBP-CCG343 洗脫 2 ;2a :PGEX-6P-1-CCG343 樣品；2b : PGEX-6P-1-CCG343 穿柱；2c :PGEX-6P-1-CCG343 洗脫 I ;2d :PGEX-6P-1-CCG343 洗脫 2 ;
[0024] 圖2為實(shí)施例2Western_blot檢測結(jié)果圖；
[0025] 其中，1 為 PGEX-6P-1-CCG343 ;2 為 6his-MBP-CCG343 ;
[0026] 圖3為雜交瘤細(xì)胞上清與樣品Wester-blot試驗(yàn)結(jié)果；
[0027] 其中，3 :轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白基因奶牛牛奶樣品；5:牛乳清白蛋白；4:轉(zhuǎn)人α-乳清白 蛋白基因奶粉樣品；
[0028] 圖4為轉(zhuǎn)基因牛奶及奶粉樣品Western Blot檢測；
[0029] 其中，1:轉(zhuǎn)人α-乳清白蛋白基因牛奶樣品；2:轉(zhuǎn)人α-乳清白蛋白基因奶粉樣 品；3 :三元極致牛奶樣品；4 :人α -乳清白蛋白；5 :牛α -乳清白蛋白；6 :三元極致牛奶樣 品；
[0030] 圖5為轉(zhuǎn)基因牛奶樣品的檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0031] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0032] 轉(zhuǎn)人α-乳清白蛋白基因奶牛樣品來自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí) 驗(yàn)室；單克隆抗體和多克隆抗體由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；日本大耳白 兔購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；人α-乳清白蛋白購自Sigma公司。
[0033] 酶標(biāo)板購自宏捷成生物公司；HRP標(biāo)記試劑盒（CatNo31488)購自Pierce公司；山 羊抗小鼠 IgG-HRP、山羊抗兔IgG-HRP購自中杉金橋生物公司；TMB (可溶型）購自天根生 物公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、96孔酶標(biāo)板購自北京宏捷成生物科技有限公司； IgG純化試劑盒購自嘉興行建生物科技有限公司，石蠟油購自BBI公司。
[0034] 層析柱購自Phamacia公司；潤旋儀購自江蘇海門市其林貝爾公司；高速微量離心 機(jī)購自美國Sigma公司；ElixRMilliQRBiocelTM純水系統(tǒng)購自美國Millipore公司；舒適 性恒溫儀購自eppendorf公司；臺(tái)式冷凍離心機(jī)、真空濃縮儀購自eppendorf公司；電熱恒 溫水浴鍋購自PolyScience公司；NanoDroplOOO紫外/可見分光光度計(jì)購自NanoDrop公 司；恒溫鼓風(fēng)干燥箱、搖床購自中國智成公司；紫外凝膠成像系統(tǒng)購自UVP公司；PYY-6C型 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、DYCP-31C微型水平電泳槽購自北京六一廠；高壓滅菌鍋、-80°C冰箱購自 日本三洋公司；混合型球磨儀購自Retsch公司；酶標(biāo)儀，BI0-RAD。
[0035] 轉(zhuǎn)基因牛奶、奶粉樣品來自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，非轉(zhuǎn)基 因牛奶及脫脂奶粉購自超市。
[0036] 實(shí)施例1原核表達(dá)人α -乳清白蛋白
[0037] 1、委托寶生物工程(大連）有限公司合成429bp的人α-乳清白蛋白基因連接到 ρΜΒΡ 和 pGEX-6P-l 載體，分別命名為 6his-MBP-CCG343 和 pGEX-6P-l-CCG343,表達(dá)并純化 兩種蛋白，其中6his-MBP-CCG343為制備單克隆抗體的免疫抗原，PGEX-6P-1-CCG343為制 備單克隆抗體的檢測抗原，蛋白純化見圖1。其中洗脫1+洗脫2作為免疫抗原，共IOmL (0· 8mg/ml)，洗脫1+洗脫3作為檢測抗原共4mL (0· 7mg/ml)。
[0038] 實(shí)施例2制備人乳清白蛋白多克隆抗體，并對(duì)原核表達(dá)的兩種蛋白進(jìn)行驗(yàn)證
[0039] 1、兔免疫血清的制備
[0040] 選擇同一批次健康的雌性日本大耳白兔4只，隨機(jī)分為2組，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí) 驗(yàn)組3只免疫h(yuǎn)LA (sigma)，對(duì)照組1只用PBS緩沖液代替hLA免疫，每只兔子皮下注射總 量為2mL用佐劑乳化好的抗原，每只兔子5mg，在第3次加強(qiáng)免疫，每只兔子5mg，后7天，耳 靜脈采血,檢測血清中抗體滴度（間接ELISA法)，如滴度未達(dá)到1:104, ODLO以上，則再加 強(qiáng)免疫。在抗體滴度已達(dá)到I: IO4后的第10天，心臟采集兔血，分離血清，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0041] 2、多克隆抗體的提取
[0042] 采用IgG的純化提取試劑盒，按說明書提取血清中的IgG，具體操作如下：
[0043] (I) IOmL平衡緩沖液平衡柱子，流速為lmL/min ;
[0044] (2) ImL注射器將抗體推入純化柱中上樣；
[0045] (3) IOmL的結(jié)合緩沖液沖洗柱子，流出的液體收集在EP管中；
[0046] (4) 4mL洗脫液進(jìn)行洗脫，每mL洗脫蛋白加0. ImL中和緩沖液。
[0047] (5)收集的液體用考馬斯亮藍(lán)測定濃度，-20°C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> [0048] 純化結(jié)果通過考馬斯亮藍(lán)驗(yàn)證，洗脫管2和洗脫管3能滿足要求，濃度約為2mg/ Π?Τ, η
[0049] 3、多克隆抗體與原核表達(dá)載體Western-blot試驗(yàn)
[0050] 選擇1號(hào)管和2號(hào)管的兔血清分別與PGEX-6P-1-CCG343和6his-MBP-CCG343進(jìn) 行Western-blot試驗(yàn)，結(jié)果在相應(yīng)位置均有目的條帶，見圖2。
[0051] 由于多克隆抗體的免疫抗原與原核表達(dá)的抗原來源不同，前者來源于人奶(產(chǎn)品 編號(hào)L7269 I CAS號(hào)9051-29-0 I Sigma)此結(jié)果證實(shí)表達(dá)的抗原具有結(jié)合相應(yīng)抗體的能力，可 用于制備單克隆抗體，前期工作中也嘗試使用編號(hào)為L7269的抗原制備單克隆抗體，但結(jié) 果未篩選到特異性的單克隆抗體，所以后期使用原核表達(dá)的抗原制備單克隆抗體。
[0052] 實(shí)施例3單克隆抗體抗體的制備
[0053] 1、小鼠抗體的制備
[0054] 選擇6周齡同一批次健康的雌性Balb/c小鼠10只作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，隨機(jī)分為2組， 實(shí)驗(yàn)組5只（1#、2#、3#、4#、5#小鼠)，對(duì)照組2只。實(shí)驗(yàn)組用6his-MBP-CCG343作為免疫 原進(jìn)行免疫，用PBS緩沖液代替hLA進(jìn)行免疫作為陰性對(duì)照。每只小鼠皮下注射總量為 100 μ L用佐劑乳化好的抗原（250 μ LPBS溶解Img抗原后與250 μ L弗氏不完全佐劑混合， 共500 μ L，每只小鼠注射100 μ L)。第一次基礎(chǔ)免疫劑量為每只小鼠200 μ g，加強(qiáng)免疫免 疫劑量為每只小鼠200μ g，基礎(chǔ)免疫時(shí)使用弗氏完全佐劑乳化，加強(qiáng)免疫時(shí)用弗氏不完全 佐劑乳化。基礎(chǔ)免疫后間隔10天進(jìn)行加強(qiáng)免疫。共免疫3次，小鼠在第3次加強(qiáng)免疫后7 天,尾靜脈采血,檢測血清中抗體滴度（間接ELISA法)，如滴度未達(dá)到1:10 4, ODL 0以上，則 再加強(qiáng)免疫。在抗體滴度達(dá)到I: IO4后的第10天眼眶采血，分離血清，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0055] 2、間接ELISA法檢測免疫小鼠的抗體水平
[0056] 以PGEX-6P-1-CCG343作為包被抗原，包被濃度：10 μ g/mL，利用間接ELISA法檢測 血清抗體水平。實(shí)驗(yàn)組血清稀釋倍數(shù)依次為：1:1000、1:3000、1:9000、1:27000、1:81000、 1:240000、1:720000 ;對(duì)照組血清 1:3000 稀釋。
[0057] hLA間接ELISA法測定的基本操作步驟如下：
[0058] (1)包被：將PGEX-6P-1-CCG343用包被液(磷酸緩沖液ρΗ9· 6)稀釋至10 μ g/mL， 用微量加樣器吸取稀釋后的抗原加入96孔酶標(biāo)板，100 μ L/孔，置4°C冰箱過夜。
[0059] (2)洗滌：取出ELISA板，棄去孔內(nèi)液體，在紙巾上輕輕叩打以除去殘留液體，加入 PBST洗滌液，300 μ L/孔，靜置Imin，重復(fù)操作3?5次。
[0060] (3)封閉：用微量加樣器按200 μ L/孔加1%BSA，放入37°C溫箱2h。
[0061] (4)洗滌：同步驟2)。
[0062] (5)加待檢樣本：用PBS緩沖液將血清稀釋，血清稀釋倍數(shù)依次為：1:400、1:800、 1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600 ;放入 37?溫箱 Ih ;
[0063] (6)洗滌：同步驟2)。
[0064] (7)加酶標(biāo)抗體：用PBST洗滌液將HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗稀釋到工作濃度 1:5000,每孔加 100 μ L，37°C溫箱孵育 45min。
[0065] (8)洗滌：同步驟2)。
[0066] (9)加底物溶液：避光按100 μ L/孔加入TMB底物溶液，室溫孵育15min。
[0067] (10)終止反應(yīng)：室溫下加終止液50 μ L/孔,終止反應(yīng)。
[0068] (11)測0D450值：檢測450nm波長下的OD值，檢測結(jié)果見表1。
[0069] 表1.經(jīng)三次免疫后小鼠血清效價(jià)的測定結(jié)果
[0070]

【權(quán)利要求】
1. 雜交瘤細(xì)胞株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)， 保藏日期為2013年4月26日，保藏編號(hào)為CGMCC NO. 7459。
2. 人a _乳清白蛋白單克隆抗體，其特征在于，其由權(quán)利要求1所述雜交瘤細(xì)胞株分泌 獲得。
3. 權(quán)利要求2所述人a-乳清白蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于，用重組蛋 白a -LF免疫雌性BALB/c小鼠，取脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，經(jīng)ELISA法進(jìn)行陽 性克隆篩選、通過有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，獲得穩(wěn)定分泌抗a -LA的雜交瘤細(xì)胞，注射至小 鼠腹腔，收集腹水，親和柱純化即得。
4. 權(quán)利要求2所述的人a -乳清白蛋白單克隆抗體在制備用于檢測轉(zhuǎn)基因牛奶與奶粉 中人a-乳清白蛋白試劑盒中的應(yīng)用。
5. 權(quán)利要求2所述的人a-乳清白蛋白單克隆抗體在檢測轉(zhuǎn)基因牛奶與奶粉中人 a _乳清白蛋白中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K16/18GK104419685SQ201310395917
【公開日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年9月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月3日
【發(fā)明者】林祥梅, 朱振營, 王勤, 劉建, 付偉, 李曉琳, 孫敏, 薛振華 申請(qǐng)人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院