一種用于治療乳腺癌的抗ErbB2雙特異性抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術領域】，提供了一類用于治療乳腺癌的雙特異性抗體。一類用于治療乳腺癌的抗ErbB2雙特異性抗體，其抗原結(jié)合區(qū)是由Trastuzumab抗體和Pertuzumab抗體的抗原結(jié)合區(qū)組成，本發(fā)明利用生物工程技術構建一類靶向ErbB2分子不同表位的雙特異性抗體。本發(fā)明還提供了編碼這類抗體的DNA序列，含有這種DNA序列的表達載體和含有這種表達載體的宿主細胞。本發(fā)明提供的一類用于治療乳腺癌的雙特異性抗體，可特異性與ErbB2分子細胞外II區(qū)和IV區(qū)結(jié)合，并且具有顯著體外和體內(nèi)抗乳腺癌的作用。
【專利說明】-種用于治療乳腺癌的抗ErbB2雙特異性抗體

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術領域】，更具體地，本發(fā)明公開了一類抗人ErbB2分子不同表 位雙特異性抗體、其制備方法及其在制備抗腫瘤藥物中的應用。

【背景技術】
[0002] 腫瘤尤其是惡性腫瘤是當今世界嚴重危害人類健康的疾病，在各種疾病所致死亡 中高居第二位。而且近年來，其發(fā)病率呈明顯上升趨勢。惡性腫瘤治療效果差，晚期轉(zhuǎn)移率 高，預后多不佳。目前臨床上所采用的常規(guī)治療方法如放、化療和手術治療雖然在很大程 度上緩解了病痛，延長了生存時間，但這些方法均存在很大的局限性，其療效難以進一步提 商。
[0003] 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，20%_30%的原發(fā)性乳腺癌患者中存在 ErbB2 (HER2)基因的擴增和蛋白的過度表達。曲妥珠單抗（Trastuzumab，商品名 Herceptin)是美國Genentech公司研制的針對ErbB2受體的人源化單克隆抗體，已于1998 年獲得美國FDA批準用于ErbB2高表達轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療。但Trastuzumab對ErbB2 低表達的轉(zhuǎn)移性乳腺癌不能顯示出抗腫瘤活性，即使對ErbB2高表達的轉(zhuǎn)移性乳腺癌， Trastuzumab單藥一線治療的客觀反應率在30%-50%。研制更為有效的ErbB2靶向治療性 抗體是臨床上的迫切需求。
[0004] 帕妥珠單抗（Pertuzumab，商品名Perjeta)是美國Genentech公司研制的針對 ErbB2受體的人源化單克隆抗體，是一種HER二聚化抑制劑，通過結(jié)合ErbB2分子，阻滯 ErbB2分子與其它HER受體的雜二聚，從而減緩了腫瘤的生長。帕妥珠單抗在2012年通過 了美國FDA認證，用于治療HER2陽性的轉(zhuǎn)移性乳腺癌。Pertuzumab是羅氏集團研發(fā)出來針 對治療對于激素療法幾乎無效的HER-2陽性乳腺癌的新藥物。
[0005] Pertuzumab是與ErbB2分子的細胞外II區(qū)結(jié)合，而Trastuzumab所針對的抗原表 位位于ErbB2受體的細胞外IV區(qū)。
[0006] 人類表皮生長因子受體（human epidermal growth factor receptor，HER/erbB) 家族有 4 個成員：EGFR/HER1、ErbB2/HER2、ErbB3/HER3 和 ErbB4/HER4。ErbB2 是具有酪氨 酸激酶活性的跨膜蛋白，它沒有天然配體，在單體狀態(tài)下無活性。ErbB2可與HER家族的其 他3個成員（EGFR、ErbB3、ErbB4)形成配體非依賴或配體依賴的異源二聚體而活化，導致下 游信號通路MPK和PI3K/Akt激活，最終導致腫瘤細胞增殖和存活。研究表明Trastuzumab 不能完全抑制ErbB2異源二聚體激活途徑，這可能是Trastuzumab耐藥產(chǎn)生的重要原因。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決以上問題，本發(fā)明的發(fā)明人進行了長期研究，經(jīng)大量試驗，利用基因工程 技術構建了一類靶向ErbB2分子不同表位的雙特異性抗體，這類雙特異性抗體同時含有 Trastuzumab (曲妥珠單抗）和Pertuzumab (帕妥珠單抗）的抗原表位結(jié)合區(qū)。
[0008] 本發(fā)明公開了 ： 1. 一類雙特異性抗體，為包含Trastuzumab和Pertuzumab的抗原結(jié)合區(qū)的抗體蛋白， 既可以結(jié)合人ErbB2受體的細胞外IV區(qū)，又可以結(jié)合ErbB2受體的細胞外II區(qū)。
[0009] 2. -類抗人ErbB2分子不同表位雙特異性抗體，為TPp具有SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列。
[0010] 3. -類抗人ErbB2分子不同表位雙特異性抗體，為TPs，具有SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列。
[0011] 4. 一類抗人ErbB2分子不同表位雙特異性抗體，為Ρ?Υ，具有SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
[0012] 5. -類抗人ErbB2分子不同表位雙特異性抗體，為PTs，具有SEQ ID NO: 22和SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列。
[0013] 6. -種分離的核酸分子，編碼上述1所述的雙特異性抗體。
[0014] 7. -種分離的核酸分子，編碼上述2所述的雙特異性抗體TPp具有SEQ ID NO: 9 和SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列。
[0015] 8. -種分離的核酸分子，編碼上述3所述的雙特異性抗體TPs，具有SEQ ID NO: 13 和SEQ ID NO: 15所示的核苷酸序列。
[0016] 9. 一種分離的核酸分子，編碼上述4所述的雙特異性抗體Ρ?Υ，具有SEQ ID NO: 17 和SEQ ID NO: 19所示的核苷酸序列。
[0017] 10. -種分離的核酸分子，編碼上述5所述的雙特異性抗體PTs，具有SEQ ID N0:21 和SEQ ID N0:23所示的核苷酸序列。
[0018] 11. 一種載體，含有上述6-10任一所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性 相連的表達調(diào)控序列，其中載體可以為pDRl，pcDNA3. 1 ( + )，pcDNA3. 1/ZE0 ( + )，pDHFR 之一。
[0019] 12.上述 11 所述的載體，為 pcDNA3. 1 ( + )或 pcDNA3. 1/ZE0 ( + )。
[0020] 13. -種宿主細胞，含有上述12所述的載體，為真核細胞。
[0021] 14.上述13所述的宿主細胞，為哺乳動物細胞。
[0022] 15.上述14所述的宿主細胞，為CHO細胞。
[0023] 16. -種制備上述1-5任一所述的雙特異性抗體的方法，該方法包括： a) 將Trastuzumab輕重鏈可變區(qū)基因以長度不同的連接序列連接到Pertuzumab抗體 輕重鏈基因上，分別構建出TPs和TP^的輕重鏈基因，將Pertuzumab輕重鏈可變區(qū)基因以 長度不同的連接序列連接到Trastuzumab抗體輕重鏈基因上，分別構建出PTs和PT li的輕 重鏈基因， b) 將雙特異性抗體TPs、TPp PTs和Ρ?Υ的輕重鏈基因分別克隆到真核表達載體 pcDNA3. 1 ( + )，轉(zhuǎn)染權利要求13-15任一所述的宿主細胞，篩選高表達克隆， c) 在表達條件下，培養(yǎng)上述13-15任一所述的宿主細胞，表達雙特異性抗體TPs、TPp PTs 和 PTL， d) 分離或純化所述的雙特異性抗體。
[0024] 17. -種組合物，含有上述1-5任一所述的雙特異性抗體和藥學上可接受的載體。
[0025] 18.上述1、2、3、4、5、17任一所述的雙特異性抗體或制劑在制備抗乳腺癌的藥物 中的用途。
[0026] 19.上述18所述的用途，還包括和其它的抗腫瘤藥物聯(lián)合使用。
[0027] 本發(fā)明中，任何合適的載體都可以使用，可以為pDRl，pcDNA3. 1 ( + )，pcDNA3. 1/ ZEO ( + )，pDHFR之一，表達載體中包括連接有合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列的融合DNA序列。
[0028] 哺乳動物或昆蟲宿主細胞培養(yǎng)系統(tǒng)可用于本發(fā)明的雙特異性抗體的表達，COS， CHO, NSO, sf9及sf21等細胞均可適用于本發(fā)明。
[0029] 可用的宿主細胞為含有上述載體的原核細胞，可以為DH5a，BL21 (DE3)，TGl之一。
[0030] 本發(fā)明中公開的用于治療乳腺癌的抗EebB2雙特異性抗體的制備方法為在表達 條件下，培養(yǎng)上述的宿主細胞，從而表達雙特異性抗體，分離或純化所述的雙特異性抗體。
[0031] 可以利用親和層析的方法對本發(fā)明公開的雙特異性抗體進行分離純化，根據(jù)所利 用的親和柱的特性，可以使用常規(guī)的方法例如高鹽緩沖液、改變PH等方法洗脫結(jié)合在親和 柱上的雙特異性抗體。
[0032] 利用上述方法，可以將雙特異性抗體純化為基本均一的物質(zhì)，例如在SDS-PAGE電 泳上為單一條帶。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，一類雙特異性抗體包含Trastuzumab和 Pertuzumab的抗原結(jié)合區(qū)的抗體蛋白四種，分別為TPp TPS、PIY、PTs。
[0034] 一類雙特異性抗體包含Trastuzumab和Pertuzumab的抗原結(jié)合區(qū)的抗體是通過 以下方法得到的： TPs/L是將Trastuzumab的重鏈可變區(qū)（VH)及輕鏈可變區(qū)（VL)通過overlap PCR的 方法經(jīng)由Linker分別串聯(lián)到Pertuzumab的重鏈及輕鏈的N端。
[0035] PTs/L結(jié)構與TPs/L相類似，將Pertuzumab的重鏈可變區(qū)（VH)及輕鏈可變區(qū)（VL) 通過overlap PCR的方法經(jīng)由Linker分別串聯(lián)到Trastuzumab的重鏈及輕鏈的N端。
[0036] 其中上述linker分為短Linker(SL)及長Linker(LL)，重鏈可變區(qū)間的SL及LL 氨基酸分別為AST及ASTKGPSVF，輕鏈可變區(qū)間的SL及LL氨基酸分別為TVA及TVAAPSVFI。
[0037] 將上述構建好的重、輕鏈可變區(qū)基因通過overlap PCR方法分別與人IgGl抗體的 重輕鏈恒定區(qū)連接，構建出完整的重輕鏈基因。
[0038] 將上述構建好的完整的重、輕鏈基因分別裝入真核表達載體pcDNA3. 1 ( + ) (Invitrogen公司產(chǎn)品）。上述質(zhì)粒一起用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染CHO-Kl細胞（ATCC)，并用含 600 μ g/ml G418的選擇培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定表達雙特異性抗體的細胞克隆。利用Protein A層 析柱，通過親和層析從細胞培養(yǎng)物的上清中純化得到雙特異性抗體。
[0039] 根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，一類雙特異性抗體包含Trastuzumab和 Pertuzumab的抗原結(jié)合區(qū)的抗體蛋白為TP^ TPS、Ρ?Υ、PTs，競爭結(jié)合實驗表明TP^可有 效競爭抑制Trastuzumab和Pertuzumab與ErbB2分子的結(jié)合，即TP lj具有Trastuzumab 和Pertuzumab的雙特異結(jié)合活性。我們采用ELISA方法測定TP^的親和力，發(fā)現(xiàn)其與 Trastuzumab的親和力相似但明顯高于Pertuzumab的親和力。藥代動力學實驗表明TPlj 的藥代動力學參數(shù)與傳統(tǒng)IgG分子相似，提示其具有高度穩(wěn)定的結(jié)構。與Trastuzumab和 Pertuzumab聯(lián)用相比，TPlj能夠更為有效地阻斷配體非依賴和配體依賴的ErbB2異源二聚 體的形成。TP lj還顯示出比Trastuzumab和Pertuzumab聯(lián)用明顯增強的抑制ErbB2分子及 其下游信號通路激活的作用。
[0040] 利用ErbB2高表達乳腺癌細胞系（BT-474、SK-BR-3及HCC-1954)和ErbB2低 表達細胞系（MDA-MB-468、MDA-MB-231 及 MCF-7)，我們對 Trastuzumab、Pertuzumab、 Trastuzumab+Pertuzumab及1?^在配體非依賴和配體依賴條件下對腫瘤細胞的體外生長抑 制活性進行了評價。實驗結(jié)果表明，與其他ErbB2抗體相比，Th體現(xiàn)出顯著增強的體外抗 腫瘤作用。利用建立的BT-474、HCC-1954、MDA-MB-231及MCF-7乳腺癌荷瘤小鼠模型，我 們進一步對這些ErbB2抗體的體內(nèi)抗腫瘤作用進行了研究，實驗結(jié)果表明Th顯示出遠強 于其他ErbB2抗體的腫瘤生長抑制活性。
[0041] 因此，一類雙特異性抗體包含Trastuzumab和Pertuzumab的抗原結(jié)合區(qū)的抗體蛋 白優(yōu)選為TPp
[0042] 上述雙特異性抗體或制劑在制備抗乳腺癌的藥物中應用，還包括和其它的抗腫瘤 藥物聯(lián)合使用。
[0043] 本發(fā)明公開上述雙特異性抗體，可以和藥學上可以接受的輔料一起組成藥物制劑 組合物從而更穩(wěn)定地發(fā)揮療效，這些制劑可以保證本發(fā)明公開的雙特異性抗體氨基酸核心 序列的構像完整性，同時還要保護蛋白質(zhì)的多官能團防止其降解(包括但不限于凝聚、脫氨 或氧化)。通常情況下，對于液體制劑，通?？梢栽?° C-8° C條件下保存至少穩(wěn)定一年，對 于凍干制劑，在30° C至少六個月保持穩(wěn)定。在這里制劑可為制藥領域常用的混懸、水針、 凍干等制劑，優(yōu)選水針或凍干制劑，對于本發(fā)明公開的上述雙特異性抗體的水針或凍干制 齊U，藥學上可以接受的輔料包括表面活性劑、溶液穩(wěn)定劑、等滲調(diào)節(jié)劑和緩沖液之一或其組 合，其中表面活性劑包括非離子型表面活性劑如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯（吐溫20或80); poloxamer (如poloxamer 188);Triton;十二燒基硫酸鈉（SDS);月桂硫酸鈉；十四燒基、亞 油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics ;M0NAQUAT?等，其加入量應使雙特異性抗體的顆?；?趨勢最小，溶液穩(wěn)定劑可以為糖類，包括還原性糖和非還原性糖，氨基酸類包括谷氨酸單鈉 或組氨酸，醇類包括三元醇、高級糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其組合，溶液穩(wěn)定劑的加入 量應該使最后形成的制劑在本領域的技術人員認為達到穩(wěn)定的時間內(nèi)保持穩(wěn)定狀態(tài)，等滲 調(diào)節(jié)劑可以為氯化鈉、甘露醇之一，緩沖液可以為TRIS、組氨酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液之一。
[0044] 上述制劑為包含雙特異性抗體的組合物，在對包括人在內(nèi)的動物給藥后，抗腫瘤 效果明顯。具體來講，對腫瘤的預防和/或治療有效，可以作為抗腫瘤藥物使用。
[0045] 本發(fā)明中雙特異性抗體及其組合物在對包括人在內(nèi)的動物給藥是，給藥劑量因病 人的年齡和體重，疾病特性和嚴重性，以及給藥途徑而異，可以參考動物實驗的結(jié)果和種種 情況，總給藥量不能超過一定范圍。具體講靜脈注射的劑量是0. 1?3000mg/天。
[0046] 本發(fā)明所指的乳腺癌，是指erbB2陽性的乳腺癌，包括高表達erbB2的乳腺癌和低 表達erbB2的乳腺癌。
[0047] 本發(fā)明所稱的抗腫瘤藥物，指具有抑制和/或治療腫瘤的藥物，可以包括伴隨腫 瘤生長相關癥狀發(fā)展的延遲和/或這些癥狀嚴重程度的降低，它進一步還包括已存在的腫 瘤生長伴隨癥狀的減輕并防止其他癥狀的出現(xiàn)，還也減少或防止轉(zhuǎn)移。
[0048] 本發(fā)明公開的雙特異性抗體及其組合物還可以和其他的抗腫瘤藥聯(lián)合給藥，用于 腫瘤的治療，這些抗腫瘤藥包括1、細胞毒類藥物（1)作用于DNA化學結(jié)構的藥物：烷化 劑如氮芥類、亞硝尿類、甲基磺酸酯類；鉬類化合物如順鉬、卡鉬和草酸鉬等；絲裂霉素 (MMC) ; (2)影響核酸合成的藥物：二氫葉酸還原酶抑制劑如甲氨喋呤（MTX)和Alimta 等；胸腺核苷合成酶抑制劑如氟尿嘧啶類（5FU、FT - 207、卡培他濱）等；嘌呤核苷合成酶 抑制劑如6 -巰基嘌呤（6 - MP)和6 - TG等；核苷酸還原酶抑制劑如羥基脲（HU)等；DNA 多聚酶抑制劑如阿糖胞苷(Ara-C)和健擇（Gemz)等；（3)作用于核酸轉(zhuǎn)錄的藥物：選擇性作 用于DNA模板，抑制DNA依賴RNA聚合酶，從而抑制RNA合成的藥物如：放線菌素 D、柔紅霉 素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光輝霉素等；（4)主要作用于微管蛋白合成的藥物：紫 杉醇、泰索帝、長春花堿、長春瑞濱、鬼白鹼類、高三尖杉酯堿；（5)其他細胞毒藥：門冬酰胺 酶主要抑制蛋白質(zhì)的合成；2、激素類抗雌激素：三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦等；芳香 化酶抑制劑：氨魯米特、蘭特隆、來曲唑、瑞寧德等；抗雄激素：氟它氨RH-LH激動劑/拮抗 齊U :諾雷德、依那通等；3、生物反應調(diào)節(jié)劑：主要通過機體免疫功能抑制腫瘤干擾素；白 細胞介素一 2 ;胸腺肽類；4、單克隆抗體：美羅華（MabThera) ; Cetuximab (C225);赫賽 汀（Trastuzumab) Bevacizumab (Avastin) ;5、其他括一些目前機制不明和有待進一步 研究的藥物；細胞分化誘導劑如維甲類；細胞凋亡誘導劑。本發(fā)明公開的雙特異性抗體 及其組合物可以和上述的抗腫瘤藥物之一或其組合聯(lián)合用藥。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0049] 圖1.雙特異性抗體結(jié)構示意圖。
[0050] 圖2.雙特異性抗體SDS-PAGE圖。
[0051] 圖3.雙特異性抗體競爭結(jié)合實驗。
[0052] 圖4.雙特異性抗體阻斷異源二聚體。
[0053] 圖5.雙特異性抗體阻斷信號通路。
[0054] 圖6.雙特異性抗體體外增殖抑制。
[0055] 圖7.雙功能抗體抑制乳腺癌細胞腫瘤生成曲線。

【具體實施方式】
[0056] 以下實施例、實驗例對本發(fā)明進行進一步的說明，不應理解為對本發(fā)明的限制。實 施例不包括對傳統(tǒng)方法的詳細描述，如那些用于構建載體和質(zhì)粒的方法，將編碼蛋白的基 因插入到這樣的載體和質(zhì)粒的方法或?qū)①|(zhì)粒引入宿主細胞的方法.這樣的方法對于本領 域中具有普通技術的人員是眾所周知的，并且在許多出版物中都有所描述，包括Sambrook， J., Fritschj E.F.and Maniais, T.(1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd edition，Cold spring Harbor Laboratory Press. 實施例I.人抗體輕、重鏈恒定區(qū)和Fe區(qū)基因的克隆 用淋巴細胞分離液分離健康人淋巴細胞，用Trizol試劑（Invitrogen公司產(chǎn)品）提 取總 RNA，根據(jù)文獻（Cell, 1980, 22 :197-207)和文獻（Nucleic Acids Research，1982,10 : 4071-4079)報道的序列分別設計引物擴增抗體重鏈和輕鏈恒定區(qū)基因，PCR反應均采用熱 啟動，反應條件：94°C 3分鐘；94°C 45秒，60°C 45秒，72°C 1分10秒，30個循環(huán)；72°C 10 分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收并克隆到pGEM-T載體（Promega公司產(chǎn)品）中， 測序驗證后確認獲得了正確的克隆。SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2分別顯示了重鏈恒定區(qū) (CH)的核苷酸和氨基酸序列。SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4分別顯示了輕鏈恒定區(qū)（CL) 的核苷酸和氨基酸序列。本例中的正確克隆記作pGEM-T/CH、pGEM-T/CL。
[0057] 實施例2:新型雙功能抗體的構建 具體構建方法：我們依據(jù)Trastuzumab[Carter P，Presta L，Gorman CM，Ridgway JB， Henner D, Wong WL, et al. Humanization of an anti-pl85HER2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci USA 1992;89:4285-9]及 Pertuzumab[Adams CW, Allison DE, Flagella K, Presta L, Clarke J, Dybdal N, et al. Humanization of a recombinant monoclonal antibody to produce a therapeutic HER dimerization inhibitor, pertuzumab. Cancer Tmmunol Immunother 2006; 55:717-27]兩個抗體的可變 區(qū)的串聯(lián)順序及短肽氨基酸數(shù)目的不同分別構建了如下四種雙特異性四價抗體：TPs、TPp PTs和Ρ?Υ。為了驗證我們構建抗體功能的增強是否是由于四價而引起，構建了 Τ?Υ和P&兩 個四價抗體。TPs人是將Trastuzumab的重鏈可變區(qū)（VH)及輕鏈可變區(qū)（VL)通過不同數(shù) 目氨基酸的短肽分別將其串聯(lián)Pertuzumab的重鏈及輕鏈的N端，隨后為抗體的恒定區(qū)。同 理，PTs人結(jié)構與TPs人相類似，將Pertuzumab的重鏈可變區(qū)（VH)及輕鏈可變區(qū)（VL)通過 不同數(shù)目氨基酸的短肽分別將其串聯(lián)Trastuzumab的重鏈及輕鏈的N端。Τ?Υ及P&為分 別將自身的輕重鏈的可變區(qū)分別串聯(lián)至親本抗體的輕重鏈的N端。簡單講我們將X抗體的 重輕鏈可變區(qū)通過overlap PCR的方法經(jīng)由Linker分別串聯(lián)到Y(jié)抗體重輕鏈可變區(qū)的的 5' 端。X、Y 抗體分別代表 Trastuzumab 及 Pertuzumab，其中 linker 分為短 Linker(SL)及 長Linker (LL)，重鏈可變區(qū)間的SL及LL氨基酸分別為AST及ASTKGPSVF，輕鏈可變區(qū)間 的SL及LL氨基酸分別為TVA及TVAAPSVFI。將構建好的重輕鏈可變區(qū)基因分別與人IgGl 抗體的重輕鏈恒定區(qū)連接，構建出完整的重輕鏈基因。
[0058] 將上述重、輕鏈基因分別裝入真核表達載體pcDNA3. I (Invitrogen公司產(chǎn)品）。上 述質(zhì)粒一起用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染CHO-Kl細胞(ATCC)，并用含600 μ g/ml G418的選擇培養(yǎng)基篩 選穩(wěn)定表達雙特異性抗體的細胞克隆。利用Protein A柱通過親和層析從細胞培養(yǎng)物的上 清中純化雙特異性抗體。
[0059] 構建如下六個基因工程抗體： Tf*S (Vtrastuzumab SL Vpertuzumab constant) , TPl (V trastuzumab _LL-Vpertuzumab-constant); PTs (Vpertuzumab SL Vtrastuzumab constsuit)，Ρ?γ (Vpertuzumab LL Vtrastuzumab constsuit)， TTl (Vtrastuzumab-LL-V trastuzumab -constant) ; PPl CVpertuzumab-LL-Vpertuzumab-Constant)。
[0060] 下面以TP^為例詳細說明雙特異抗體構建表達過程： TP1的重鏈和輕鏈可變區(qū)為TPJH和TPJL，經(jīng)Overlap PCR合成后回收目的條帶并克隆 至IJ pGEM-T載體中，篩選陽性克隆測序，分別得到pGEM-T/TPJH(核苷酸序列和氨基酸序列如 SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示）和pGEM-T/TPJL (核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示)。PCR采用Roche公司的高保真擴增系統(tǒng)，反應條件均為：95°C 5 分鐘；94°C 45 秒，55°C45 秒，72°C 55 秒，30 個循環(huán)；72°C 7 分鐘。
[0061] 采用 Overlap PCR 方法將 pGEM-T/TP中的 pGEM-T/TP基因與質(zhì)粒 pGEM-T/CH 中的重鏈恒定區(qū)基因連接，并克隆到pGEM-Τ載體中，挑選正確克隆后以Hind III和EcoR I 酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收目的片段，與同酶切的質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+)用T4 DNA連接 酶進行連接，構建成真核表達載體pcDNA3. I (+) (TPJHCH)(核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO: 10 所示）。
[0062] 同理，采用Overlap PCR方法將pGEM-T/TPJL中的pGEM-T/TPJL基因中的輕鏈恒 定區(qū)基因相連，并克隆到pGEM-Τ載體中，挑選正確克隆后以Hind III和EcoR I酶切，經(jīng)瓊 脂糖凝膠電泳純化回收目的片段，與同酶切的質(zhì)粒pcDNA3. I (+)載體相連，構建成真核表 達載體pcDNA3.1 (TPJLCL)(核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12 所示)。
[0063] 同理TPS、PIY、PTS、TIY、PPL按照如上構建方式，其序列分別為： TPs序列如下所示： pcDNA3.1(+) (TPsVHCH)(核苷酸序列和氨基酸序列如 SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 所示)。
[0064] pcDNA3. I (TPlVLCLK核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO: 15 和SEQ ID NO: 16 所示） PIV序列如下所示： pcDNA3.1(+) (PIYVHCH)(核苷酸序列和氨基酸序列如 SEQ ID NO: 17 和 SEQ ID NO: 18 所示)。
[0065] pcDNA3. I (PTlVLCLK核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO: 19 和SEQ ID NO:20 所示） PTs序列如下所示： pcDNA3.1(+) (PTsVHCH)(核苷酸序列和氨基酸序列如 SEQ ID NO:21 和 SEQ ID NO:22 所示)。
[0066] pcDNA3. I (PTsVLCLK核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO:23 和SEQ ID NO:24 所示） τι;序列如下所示： pcDNA3.1(+) (TIYVHCH)(核苷酸序列和氨基酸序列如 SEQ ID NO:25 和 SEQ ID NO:26 所示)。
[0067] pcDNA3. I (TTlVLCLK核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO:27 和SEQ ID NO:28 所示)。
[0068] PPl序列如下所示： pcDNA3.1(+) (PPJHCH)(核苷酸序列和氨基酸序列如 SEQ ID NO:29 和 SEQ ID NO:30 所示)。
[0069] pcDNA3. I (PPlVLCLK核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO:31 和SEQ ID NO:32 所示)。
[0070] 以TP1抗體轉(zhuǎn)染為例，于3. 5cm細胞培養(yǎng)皿中接種3 X IO5 CH0-K1細胞，細胞 培養(yǎng)至70%-80%融合時進行轉(zhuǎn)染：取質(zhì)粒IOyg(質(zhì)粒pcDNA3. 1(+) (TPJHCH)4yg，質(zhì)粒 pcDNA3.1 (+) (TPlVLCL) 6 μ g)和 20 μ I Lipofectamine2000 Reagent9 (Invitrogen 公司 產(chǎn)品）分別溶于500 μ I無血清DMEM培養(yǎng)基，室溫靜置5分鐘，將以上2種液體混合，室溫 孵育20分鐘以使DNA-脂質(zhì)體復合物形成，其間用3ml無血清的DMEM培養(yǎng)基替換培養(yǎng)皿中 的含血清培養(yǎng)基，然后將形成的DNA-脂質(zhì)體復合物加入到板中，CO 2孵箱培養(yǎng)4小時后補加 2ml含10%血清的DMEM完全培養(yǎng)基，置于CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染進行24h后細胞換含 600 μ g/ml G418選擇培養(yǎng)基篩選抗性克隆。將篩選得到的高表達克隆用無血清培養(yǎng)基擴大 培養(yǎng)，用Protein A親和柱（GE公司產(chǎn)品）分離純化雙特異性抗體TPp將TP^用PBS進行 透析，最后以紫外吸收法定量。TP^的結(jié)構如圖1所示。圖1中還顯示了 tps、piy、pts、tiy、 PP^的結(jié)構。
[0071] 實驗例I =SDS-PAGE方法鑒定雙特異抗體分子量及結(jié)構完整性 在還原條件下SDS-PAGE，Trastuzumab抗體和Pertuzumab抗體均呈現(xiàn)為分子量大小約 55KDa和25KDa的重鏈和輕鏈條帶。雙可變區(qū)抗體Τ?Υ、PP^ TPs、PTs、TP1及Ρ?Υ則呈現(xiàn)為 分子量大小約64KDa和36KDa的重鏈和輕鏈條帶。在非還原條件下，所有抗體均呈現(xiàn)一條 帶，Trastuzumab 抗體和 Pertuzumab 抗體為 150KDa，雙可變區(qū)抗體 Τ?γ、PPL、TPs、PTs、TPlj 及 Ρ?Υ 為 200kDa (圖 2)。
[0072] 實驗例2 :雙特異性抗體TP^的競爭結(jié)合實驗 競爭結(jié)合實驗表明TPlj可有效競爭抑制Trastuzumab及Pertuzumab與ErbB2分子的 結(jié)合，即TPlj具有Trastuzumab和Pertuzumab的雙特異性。PTs雖對Trastuzumab有部 分抑制作用，但不能競爭抑制Pertuzumab與ErbB2分子的結(jié)合，；TPs雖可有效競爭抑制 Trastuzumab及Pertuzumab結(jié)合ErbB2分子，但其相對親和力明顯弱于Trastuzumab及 Pertuzumab ;相似的是PTli抗體也可有效競爭抑制Trastuzumab及Pertuzumab的結(jié)合，但 其相對親和力稍弱于Trastuzumab和Pertuzumab(圖3)。值得注意的是，TP lj不僅可有效競 爭抑制Trastuzumab和Pertuzumab的結(jié)合，且其親和力分別與Trastuzumab和Pertuzumab 相似(表1)。因此，我們將選擇TP^進行下一步實驗。
[0073] 實驗例3 :雙功能抗體TPl親和力測定 ErbB2-E⑶蛋白即ErbB2分子的膜外區(qū)，用其檢測靶向ErbB2抗體的親和力。ELISA 方法檢測TPl與Trastuzumab的親和力相似但明顯高于Pertuzumab的親和力，表明結(jié)構的 改變并未影響其親和力。另外我們構建的單特異性四價抗體Τ?Υ及PP^的親和力分別與其 親本抗體Trastuzumab及Pertuzumab相似(表1) 表1 :抗ErbB2抗體親和力檢測

【權利要求】
1. 一類雙特異性抗體，為包含Trastuzumab和Pertuzumab的抗原結(jié)合區(qū)的抗體蛋白， 既可以結(jié)合人ErbB2受體的細胞外IV區(qū)，又可以結(jié)合ErbB2受體的細胞外II區(qū)。
2. 權利要求1所述一類抗人ErbB2分子不同表位雙特異性抗體，為TPp具有SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列。
3. 權利要求1所述一類抗人ErbB2分子不同表位雙特異性抗體，為TPS，具有SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列。
4. 權利要求1所述一類抗人ErbB2分子不同表位雙特異性抗體，為PIY，具有SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
5. 權利要求1所述一類抗人ErbB2分子不同表位雙特異性抗體，為PTS，具有SEQ ID NO: 22和SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列。
6. -種分離的核酸分子，編碼權利要求1所述的雙特異性抗體。
7. -種分離的核酸分子，編碼權利要求2所述的雙特異性抗體TPy具有SEQ ID NO: 9 和SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列。
8. -種分離的核酸分子，編碼權利要求3所述的雙特異性抗體TPS，具有SEQ ID NO: 13 和SEQ ID NO: 15所示的核苷酸序列。
9. 一種分離的核酸分子，編碼權利要求4所述的雙特異性抗體PIY，具有SEQ ID NO: 17 和SEQ ID NO: 19所示的核苷酸序列。
10. -種分離的核酸分子，編碼權利要求5所述的雙特異性抗體PTS，具有SEQ ID N0:21 和SEQ ID N0:23所示的核苷酸序列。
11. 一種載體，含有權利要求6-10任一所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性 相連的表達調(diào)控序列，其中載體可以為pDRl，pcDNA3. 1 ( + )，pcDNA3. 1/ZEO ( + )，pDHFR之 〇 12?權利要求11所述的載體，為pcDNA3. 1 ( + )或pcDNA3. 1/ZE0 ( + )。
13. -種宿主細胞，含有權利要求12所述的載體，為真核細胞。
14. 權利要求13所述的宿主細胞，為哺乳動物細胞。
15. 權利要求14所述的宿主細胞，為CH0細胞。
16. -種制備權利要求1-5任一所述的雙特異性抗體的方法，該方法包括： a) 將Trastuzumab輕重鏈可變區(qū)基因以長度不同的連接序列連接到Pertuzumab抗體 輕重鏈基因上，分別構建出TPs和TP^的輕重鏈基因，將Pertuzumab輕重鏈可變區(qū)基因以 長度不同的連接序列連接到Trastuzumab抗體輕重鏈基因上，分別構建出PTs和PIY的輕 重鏈基因； b) 將雙特異性抗體TPs、TPp PTs和PIY的輕重鏈基因分別克隆島真核表達載體 pcDNA3. 1 ( + )，轉(zhuǎn)染權利要求13-15任一所述的宿主細胞，篩選高表達克??； c) 在表達條件下，培養(yǎng)權利要求13-15任一所述的宿主細胞，表達雙特異性抗體TPs、 TPL、PTs 和 PTL ; d) 分離或純化所述的雙特異性抗體。
17. -種組合物，含有權利要求1-5任一所述的雙特異性抗體和藥學上可接受的載體。
18. 權利要求1、2、3、4、5、17任一所述的雙特異性抗體或制劑在制備抗乳腺癌的藥物 中的用途。
19.權利要求18所述的用途，還包括和其它的抗腫瘤藥物聯(lián)合使用。
【文檔編號】C07K16/46GK104418952SQ201310396323
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月4日 優(yōu)先權日:2013年9月4日
【發(fā)明者】錢衛(wèi)珠 申請人:上海張江生物技術有限公司, 上海海思太科藥業(yè)有限公司