火木層孔菌中環(huán)二肽c5在抗禽流感h5n1病毒上的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從火木層孔菌Phellinus?igniarius(L?ex?Fr)Quel（裂蹄木層孔菌phellinus?linteus(Berk?et?Curt)Teng、鮑氏層孔菌Phellinus?baumii、哈蒂針層孔菌Phellinus?hartigii(Allesch?et?Schnabl)Imaz）發(fā)酵液和子實體中分離的具有抗禽流感活性的一種環(huán)二肽C5。本發(fā)明為抗禽流感藥物的研發(fā)提供了先導(dǎo)化合物，對開發(fā)利用藥用真菌資源具有重要意義。
【專利說明】火木層孔菌中環(huán)二肽C5在抗禽流感H5N1病毒上的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種抗禽流感H5N1病毒的火木層孔菌中活性物質(zhì)的提取制備方法，尤其涉及的火木層孔菌菌種，已于2013年8月26日保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏編號為CGMCC N0.8108，分類名稱為火木層孔菌Phellinusigniarius，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。
【背景技術(shù)】
[0002]通常生物學(xué)中所指的環(huán)肽是指以氨基酸肽鍵形成的化合物，在植物化學(xué)中這一概念被擴大成以酰胺鍵形成的一類化合物，因此范圍被擴大至包括有機胺類和大環(huán)生物堿類，根據(jù)成環(huán)與否分為環(huán)肽和直鏈肽。已報道的環(huán)肽類化合物具有多方面的生物活性，包括抗腫瘤、抗HIV、抗菌、抗瘧、安眠、抑制血小板聚集、降壓、抑制酪氨酸酶、抑制環(huán)氧化酶、抑制脂質(zhì)過氧化酶、雌性激素樣、免疫抑制等生物活性。
[0003]由于環(huán)肽的前體-直鏈肽所包含的氨基酸的數(shù)目和種類的千差萬別，造成了環(huán)肽合成方法的多樣化。對某種直鏈肽表現(xiàn)出高效，快速縮合作用的試劑和方法對另外一種肽鏈就可能變得低效或無效。
[0004]一種環(huán)二肽具有抗菌等多種重要的生理活性，如今，未見到有抗情流感病毒活性的報到。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明公開了一種從`藥用菌中分離的具有抗禽流感活性的一種環(huán)二肽C5。本發(fā)明首次公開了這種一種環(huán)二肽的一種新活性，證明其具有抗禽流感作用。
[0006]本方法較一般化合物應(yīng)用的優(yōu)點在于:發(fā)現(xiàn)了該種一種環(huán)二肽C5的新活性，具有抗禽流感病毒的作用。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
首先制備火木層孔菌粗提物，由下述方法制得:
(1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計是:
玉米淀粉1-5%葡萄糖 1-5%
蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5%
硫酸鎂0.1-0.5%磷酸二氫鉀0.01-0.05%
(2)將火木層孔菌菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內(nèi)，以20~35°C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為80~280r/min，pH 3~8條件下，震動培養(yǎng)7~15天；培養(yǎng)中當(dāng)pH值降到2.5~4時，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度20~35°C，發(fā)酵罐壓力0.1~0.2公斤/平方厘米，pH 3~8，通氣量0.5~1.lvvm,攪拌速度100~280轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7~15天，即可利用火木層孔菌菌絲體發(fā)酵全液制備火木層孔菌粗提物。
[0008](3)取步驟(2)中所得火木層孔菌菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2~1/5 ；(4)用體積百分比為60~95%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2~8倍，能夠使提取液中乙醇濃度達到60~90%，乙醇優(yōu)選為濃度65-95%的食用乙醇，所用體積優(yōu)選為濃縮液體積的3-6倍；
(5)對步驟(4)所得提取液在50~70°C條件下，加熱I~2小時；以常規(guī)方法進行分離，并通過二級過濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5~1/10 ；
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進行干燥，得火木層孔菌粗提物。
[0009]然后從火木層孔菌粗提物中環(huán)二肽C5，步驟如下:火木層孔菌粗提物一正相硅膠層析一氯仿與甲醇梯度洗脫一TLC檢測一甲醇凝膠層析一正相硅膠層析一TLC檢測一反相硅膠層析一中壓反相層析一HPCL檢測一減壓蒸干一環(huán)二肽C5。
[0010]具體步驟為:
(1)制備火木層孔菌粗提物；
(2)將上述步驟(1)所得的粗提物與正相硅膠混勻攪拌，并干燥，進行硅膠正相柱層析，用洗脫劑洗脫2-5次；
(3)收集上述步驟(2)所得的最后一次洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇溶解，甲醇凝膠柱層析，用洗脫劑洗脫，使用TLC檢測收集的洗脫液，適當(dāng)合并洗脫液，減壓干燥；
(4)將步驟(3)得到的產(chǎn)物再次進行一次正相硅膠層析，用洗脫劑洗脫；
(5)將步驟(4)得到的產(chǎn)物進行反相硅膠層析，用洗脫劑洗脫；` (6)將步驟(5)得到的產(chǎn)物進行中壓反相制備，用洗脫劑洗脫；
(7)收集洗脫液，HPLC檢測，減壓干燥，即為環(huán)二肽C5。
[0011]優(yōu)選的，提取步驟(2)中所述的拌樣硅膠為100-200目正相硅膠，洗脫劑為氯仿和甲醇。
[0012]提取步驟(3)中所述的洗脫劑為甲醇。
[0013]提取步驟(4)中所述的正相硅膠為200-300目。
[0014]提取步驟(5)所述的反相材料為C-18與C-8，洗脫劑為甲醇:水=20%_75%，反相層析次數(shù)為1-3次。
[0015]提取步驟(6)所述的中壓為中壓反相，洗脫劑為甲醇與水，所用反正硅膠為C-8。
[0016](四)【具體實施方式】 實例1:
火木層孔菌粗提物，由下述方法制得:
(1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計是:
玉米淀粉 1%葡萄糖 1%
蛋白胨 0.1%酵母膏 0.1%
硫酸鎂 0.1%磷酸二氫鉀0.01%
(2)將火木層孔菌菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內(nèi)，以25°C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為110r/min，pH 7條件下，震動培養(yǎng)7天；培養(yǎng)中當(dāng)PH值降到3時，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度25°C，發(fā)酵罐壓力0.1公斤/平方厘米，pH 3，通氣量0.5-1.lvvm，攪拌速度100轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7天，即可利用火木層孔菌菌絲體發(fā)酵全液制備火木層孔菌粗提物。
[0017](3)取步驟(2)中所得火木層孔菌菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/3 ；
(4)用體積百分比為70%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的5倍，能夠使提取液中乙醇濃度達到55% ；
(5)對步驟(4)所得提取液在70°C條件下，加熱I小時；以常規(guī)方法進行分離，并通過二級過濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 ；
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進行干燥，得火木層孔菌粗提物。
[0018]稱取上述粗提物100g與等體積100目正相硅膠混勻攪拌，進行硅膠正相柱層析。洗脫劑為氯仿:甲醇=1: 1，洗脫4次。將洗脫液減壓蒸干，與等體積硅膠拌樣，使用硅膠為100目正相硅膠，五倍體積硅膠層析，使用的硅膠為200目正相硅膠。洗脫劑為氯仿與甲醇。減壓濃縮洗脫液，使用甲醇溶解，甲醇凝膠柱層析。使用TLC檢測收集的洗脫液，適當(dāng)合并，減壓蒸干，15%甲醇溶解，進行反相硅膠層析，洗脫劑為甲醇與水，濃度為25%，然后進行中壓反相層析，使用的反相硅膠為C-8，洗脫劑為15%-75%甲醇溶液，HPLC檢測收集的洗脫液，條件為Omin:0%甲醇，IOmin:100%甲醇，出峰時間為5.21min。，適當(dāng)合并，甲醇凝膠層析，減壓干燥，進行1D-HNMR核磁共振分析，頻率為400MHZ，分析結(jié)果為δ 4.26 (t, J = 8.0Hz, 1H), 4.19 (dd, J = 13.0, 6.2 Hz, 1H)，3.51 (dd, J = 8.2, 5.0 Hz, 2H), 3.35-3.26 (m, 1H), 2.37 - 2.24 (m, 1H)，2.08 - 1.85 (m, 3H)，1.38 (d, J = 6.9Hz, 3H).證明是環(huán)二肽C5，即環(huán)(L-丙氨酸L-脯氨酸)。
[0019](7)采用步驟(6)得到的化合物進行對MDCK細胞毒性的測定，確定其半數(shù)中毒濃度(CC5tl)及最大安全濃度。
[0020]在96孔板上，100 μ I/孔加入ΑΧΙΟ^1濃度的MDCK細胞懸液，培養(yǎng)24 h后，在單層細胞上分別加入不同濃度的含樣維持液，每種濃度重復(fù)3孔，并設(shè)正常細胞對照。置370C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，棄培養(yǎng)液上清，100 μ I/孔加入5 mg.Hir1MTT的維持液，繼續(xù)培養(yǎng)Ih后，棄MTT上清，每孔加溶解液(DMSO) 100 μ 1，振蕩5_10 min，待結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)儀測492nm處的OD值。計算出樣品的半數(shù)中毒濃度(CC5tl)及最大安全濃度。當(dāng)加樣組的OD492值不顯著低于細胞對照組OD492時，此濃度即為樣品的最大安全濃度。
[0021]環(huán)二肽C5各質(zhì)量濃度組(n=12)
【權(quán)利要求】
1.環(huán)二肽C5在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于所述環(huán)二肽C5為環(huán)(L-丙氨酸L-脯氨酸)。
2.如權(quán)利要求1所述的環(huán)二肽C5在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于環(huán)二肽C5是從火木層孔菌中提取的，提取步驟順序如下: (1)制備火木層孔菌粗提物； (2)將上述步驟(1)所得的粗提物與正相硅膠混勻攪拌，并干燥，進行硅膠正相柱層析，用洗脫劑洗脫2-5次； (3)收集上述步驟(2)所得的最后一次洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇溶解，甲醇凝膠柱層析，用洗脫劑洗脫，使用TLC檢測收集的洗脫液，適當(dāng)合并洗脫液，減壓干燥； (4)將步驟(3)得到的產(chǎn)物再次進行一次正相硅膠層析，用洗脫劑洗脫； (5)將步驟(4)得到的產(chǎn)物進行反相硅膠層析，用洗脫劑洗脫； (6)將步驟(5)得到的產(chǎn)物進行中壓反相制備，用洗脫劑洗脫； (7)收集洗脫液，HPLC檢測，減壓干燥，即為環(huán)二肽C5。
3.如權(quán)利要求2所述的環(huán)二肽C5在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于所述火木層孔菌粗提物，由下述方法制得: (1)將火木層孔菌菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內(nèi)，以20~35°C溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為80~280r/min，pH 3~8條件下，震動培養(yǎng)7~15天；培養(yǎng)中當(dāng)pH值降到2.5~4時，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度20~35°C，發(fā)酵罐壓力0.1~0.2公斤/平方厘米，pH 3~8，通氣量0.5~1.lvvm,攪拌速度100~280轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7~15天，即可得到火木層孔菌菌絲體發(fā)酵全液； (2)取步驟(1)中所得火木層孔菌菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2~1/5 ； (3)用體積百分比為60~95%的乙醇對上述步驟(2)濃縮后的發(fā)酵液進行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2~8倍，能夠使提取液中乙醇濃度達到60~90% ； (4)對步驟(3)所得提取液在50~70°C條件下，加熱I~2小時；以常規(guī)方法進行分離，并通過二級過濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5~1/10 ； (5)將將步驟(4)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進行干燥，得火木層孔菌粗提物。
4.如權(quán)利要求3所述的環(huán)二肽C5在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于所述液體培養(yǎng)基配方以克/100毫升計是: 玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5% 蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5% 硫酸鎂 0.1-0.5%磷酸二氫鉀0.01-0.05%。
5.如權(quán)利要求3所述的環(huán)二肽C5在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于火木層孔菌粗提物制備步驟(3)的乙醇為濃度65%-95%食用乙醇，所用體積為3-6倍體積。
6.如權(quán)利要求2所述的環(huán)二肽C5在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于，步驟(2)中所述的拌樣硅膠為100-200目正相硅膠，洗脫劑為氯仿和甲醇。
7.如權(quán)利要求2所述的環(huán)二肽C5在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于，步驟⑶中所述的洗脫劑為甲醇。
8.如權(quán)利要求2所述的環(huán)二肽C5在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于，步驟(4)中所述的正相硅膠為200-300目。
9.如權(quán)利要求2所述的環(huán)二肽C5在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于，步驟(5)所述的反相材料為C-18與C-8，洗脫劑為甲醇:水=20%-75%，反相層析次數(shù)為1-3 次。
10.如權(quán)利要求2所述的環(huán)二肽C5在制備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應(yīng)用，其特征在于，步驟(6)所述的中壓為中壓反相，洗脫劑為甲醇與水，所用反正硅膠為C-8。
【文檔編號】C07D487/04GK103800330SQ201310401651
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2013年9月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月6日
【發(fā)明者】趙晨, 宋愛榮, 孔超, 黃芳, 孫效樂 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)