一種淡水小龍蝦swd蛋白酶抑制劑的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑的制備方法，屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明將淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑基因進(jìn)行大腸桿菌原核表達(dá)，通過蛋白酶抑制劑活性檢測試驗(yàn)，SWD蛋白酶抑制劑可以抑制細(xì)菌生長繁殖過程產(chǎn)生的蛋白酶的活性，而且具有廣譜蛋白酶活性抑制劑作用，其在食品行業(yè)的抗菌處理、醫(yī)藥行業(yè)的抗菌藥物開發(fā)等方面具有較大的應(yīng)用價值。
【專利說明】—種淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑的制備方法，屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]在動物進(jìn)化過程中，隨著外界環(huán)境不斷改變造成的各種挑戰(zhàn)，生物體自身的免疫系統(tǒng)在接受各種外界免疫刺激的同時也在不斷進(jìn)化，到目前為止，依據(jù)動物體所處進(jìn)化地位的高低，已經(jīng)形成了兩大類鮮明的免疫系統(tǒng)，一類是較為低等的先天免疫系統(tǒng)，另一類是后天形成的獲得性免疫系統(tǒng)。先天免疫系統(tǒng)主要存在于無脊椎動物體內(nèi)，然而，獲得性免疫系統(tǒng)主要存在于高等的脊椎動物體內(nèi)。對于不具有脊椎的甲殼類動物來說，先天免疫系統(tǒng)是它們防御細(xì)菌、真菌、病毒侵染的唯一防線，尤其是先天免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞免疫和體液免疫兩種方式擔(dān)負(fù)著所有的免疫防御功能。[0003]先天免疫系統(tǒng)中的體液免疫方式存在著多種免疫效應(yīng)分子，其中，抗菌肽分子是一類非常重要的能夠針對細(xì)菌和真菌的入侵發(fā)揮免疫效應(yīng)的分子，而且，抗菌肽分子也是甲殼類無脊椎動物與免疫反應(yīng)相關(guān)的多種信號通路的最終發(fā)揮清除作用的功能分子。目前，發(fā)現(xiàn)的抗菌肽分子種類繁多，其中有一類分子的結(jié)構(gòu)比較典型，在其氨基酸序列中存在著一個乳清酸性蛋白結(jié)構(gòu)域，簡稱WAP結(jié)構(gòu)域，這個結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)就是存在著由8個半胱氨酸殘基形成的4對二硫鍵。根據(jù)分子中存在的WAP結(jié)構(gòu)域的個數(shù)，我們?nèi)藶榈貙⑵浞譃榫哂袉蝹€WAP結(jié)構(gòu)域的抗菌肽分子或者稱為SWD抗菌肽分子、具有雙WAP結(jié)構(gòu)域的抗菌肽分子或者稱為DWD抗菌肽分子。
[0004]多數(shù)抗菌肽分子不僅可以在甲殼類動物體內(nèi)發(fā)揮清除細(xì)菌、真菌的作用，也可以在體外行使抗菌功能以及蛋白酶活性抑制劑作用，因此，其在食品行業(yè)的抗菌方面具有非常廣闊的應(yīng)用前景。此外，與目前我國醫(yī)療行業(yè)廣泛使用的抗生素不同，源于甲殼類動物的抗菌肽分子發(fā)揮抗菌作用的同時，不會引起耐藥性問題，因?yàn)榭咕姆肿影l(fā)揮作用的過程是直接作用于細(xì)菌、真菌細(xì)胞壁的某一部位的氨基酸序列，從而引起細(xì)菌、真菌細(xì)胞壁某一部位的水解產(chǎn)生漏洞因而引起細(xì)菌、真菌細(xì)胞的內(nèi)溶物外泄，使其死亡而被清除，所以，這類抗菌肽分子在醫(yī)藥行業(yè)也存在較大的應(yīng)用前景。
[0005]淡水小龍蝦在我國養(yǎng)殖規(guī)模非常大，是一類經(jīng)濟(jì)價值較高的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物，在科研研究方面也是一個十分典型的甲殼類模式生物。淡水小龍蝦的具有單個WAP結(jié)構(gòu)域的抗菌肽分子在動物體內(nèi)先天免疫系統(tǒng)中是一類重要的免疫效應(yīng)分子，而且，其抗菌功能與蛋白酶活性抑制劑作用在體外也可以發(fā)揮。尤其，SWD抗菌肽分子的蛋白酶活性抑制劑作用在體外可以抑制細(xì)菌繁殖過程中產(chǎn)生的蛋白酶的活性，從而將細(xì)菌分泌蛋白酶水解環(huán)境中的有機(jī)物從而獲得可吸收的營養(yǎng)物質(zhì)的途徑徹底切斷，將細(xì)菌活活餓死，而且這種蛋白酶活性抑制劑作用不存在專一性，SffD抗菌肽分子的蛋白酶活性抑制劑作用具有廣泛的抑制效果，凡是細(xì)菌繁殖過程中產(chǎn)生的蛋白酶的活性都可以被徹底抑制，因而，具有光譜抑制作用。所以，淡水小龍蝦SWD抗菌肽分子在食品抗菌、醫(yī)療抗生素方面具有良好的應(yīng)用空間。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑的制備方法，該方法制備的SWD蛋白酶抑制劑能夠抑制細(xì)菌分泌的蛋白酶的活性。
[0007]技術(shù)解決方案:
[0008]本發(fā)明的具體方法如下:
[0009]I)淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑的cDNA的克隆與表達(dá)片段擴(kuò)增:取體重約為20g-30g的冷凍保存的淡水小龍蝦3只，在實(shí)驗(yàn)室超凈工作臺的無菌條件下，解剖摘取肝臟組織各30mg-50mg,利用上海生工生物工程有限公司提供的Total RNA ExtractorCTrizol)動物總RNA快速抽提試劑盒進(jìn)行總RNA的提取，之后，利用上海生工生物工程有限公司生產(chǎn)的一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒(M-MuLV)進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成，并以此cDNA樣品作為模板，以表達(dá)引物 SWD-F:5' -tac tea gaa ttc cag cgc aca cac tat gct~3'與 SWD-R:5' -tac tea ctc gag cct gac ctt agt tea tgc ac~3'作為擴(kuò)增 SWD 蛋白酶抑制劑表達(dá)片段的前后引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件優(yōu)選為:94°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，53°C退火45s，72°C延伸30s，循環(huán)35圈，后延伸5min，獲得PCR反應(yīng)產(chǎn)物；
[0010]2)原核表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化克隆菌株DH5 a:將步驟(1)的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量體積比為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳處理，目的條帶所在的膠條回收之后利用瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒(美國普洛麥格Promega公司產(chǎn)品)進(jìn)行片段回收，之后利用EcoR I和Xho I核酸內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切處理，之后，將經(jīng)過EcoR I和Xho I核酸內(nèi)切酶雙酶切處理的pET-28a載體(TaKaRa公司產(chǎn)品)在16°C條件下連接10h_12h，連接酶為T4DNA連接酶(TaKaRa公司產(chǎn)品)，之后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a克隆菌株感受態(tài)細(xì)胞(TaKaRa公司產(chǎn)品)，轉(zhuǎn)化過程利用“熱激法”進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將LB固體培養(yǎng)基平板在37°C培養(yǎng)12h-14h，抗性為卡那霉素抗性，獲得轉(zhuǎn)化后LB固體培養(yǎng)基平板；
[0011]3)陽性重組子的篩選與質(zhì)粒提取:挑取步驟(3)的LB固體培養(yǎng)基平板表面的白色菌落作為模板，利用表達(dá)引物SWD-F:5/` -tac tea gaa ttc cag cgc aca cac tat gct~3/與SWD-R:5' -tac tea ctc gag cct gac ctt agt tea tgc ac~3'作為菌落PCR篩選陽性重組子的PCR反應(yīng)引物，進(jìn)行菌落PCR反應(yīng)，程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，53°C退火45s，72°C延伸30s，循環(huán)35圈，后延伸5min，根據(jù)PCR結(jié)果，將篩選得到的陽性克隆菌株利用LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，添加的卡那霉素的最終質(zhì)量體積濃度為IOOii g/mL，培養(yǎng)溫度為37°C，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm-200rpm，培養(yǎng)時間為12h_14h，取生長狀況良好的大腸桿菌菌株3mL，利用DNA質(zhì)粒小量提取試劑盒(美國普洛麥格Promega公司產(chǎn)品)進(jìn)行質(zhì)粒提取，獲得陽性重組質(zhì)粒；
[0012]4)轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21 (DE3)與陽性表達(dá)菌株的篩選:將步驟(3)的陽性重組質(zhì)粒利用“熱激法”轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)表達(dá)菌株感受態(tài)細(xì)胞(TaKaRa公司產(chǎn)品)，轉(zhuǎn)化過程利用“熱激法”進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將LB固體培養(yǎng)基平板在37°C培養(yǎng)12h-14h，抗性為卡那霉素抗性，之后，利用表達(dá)引物SWD-F:5/ -tac tea gaa ttc cag cgc aca cac tat gct~3/ 與SffD-R:5' -tac tea ctc gag cct gac ctt agt tea tgc ac~3'作為菌落 PCR 篩選陽性表達(dá)菌株的PCR反應(yīng)引物，挑取固體LB培養(yǎng)基表面的白色菌落作為模板，進(jìn)行菌落PCR反應(yīng)，程序?yàn)?941預(yù)變性51^11，941:變性30s，53。。退火45s，72。。延伸30s，循環(huán)35圈，后延伸5min，根據(jù)PCR結(jié)果，將篩選得到的陽性表達(dá)菌株利用液體LB培養(yǎng)基3mL_5mL進(jìn)行搖瓶震蕩培養(yǎng)，添加的卡那霉素的最終質(zhì)量體積濃度為IOOii g/mL，培養(yǎng)溫度為37°C，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm-200rpm，培養(yǎng)時間為12h_14h，獲得表達(dá)菌株培養(yǎng)液；
[0013]5) SWD蛋白酶抑制劑分子的誘導(dǎo)表達(dá):將步驟(4)中的表達(dá)菌株培養(yǎng)液在無菌條件下吸取lmL，轉(zhuǎn)接在新鮮的IOOmL液體LB培養(yǎng)基中，添加卡那霉素的濃度為100 u g/mL，培養(yǎng)溫度為37 °C，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm-200rpm，培養(yǎng)時間為3h_4h，之后加入異丙基-P -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，IPTG的最終物質(zhì)的量濃度為0.5mmol/L,其他條件不變的情況下誘導(dǎo)表達(dá)4h-5h之后,5000rpm-6000rpm條件下低速離心收集菌體，菌體沉淀利用IOmL的IXPBS 緩沖液重新懸起之后，冰浴上進(jìn)行超聲波破碎，破碎方法要求為:功率200w,破碎2s,間歇3s,全程60min,破碎后的液體經(jīng)過10000rpm-12000rpm條件下高速離心收集上清液，獲得菌體破碎后上清液；
[0014]6) SWD蛋白酶抑制劑分子的親和純化:取步驟(5)的菌體破碎后上清液5mL利用His-tag鎳柱(上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品)進(jìn)行親和純化，純化結(jié)果利用質(zhì)量體積比為15%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，根據(jù)電泳結(jié)果合并目的重組蛋白質(zhì)所在位置對應(yīng)的I X elute洗脫液，得到目的重組蛋白質(zhì)I X elute洗脫合并液；
[0015]7) SWD蛋白酶抑制劑分子的蛋白酶抑制劑活性的檢測:將步驟(6)中目的重組蛋白質(zhì)I X elute洗脫合并液，利用截留孔徑為3500Da的透析袋(上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品)對I XPBS緩沖液透析24h，12h期間更換一次I XPBS緩沖液，之后將透析后的淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑分子的蛋白透析液進(jìn)行蛋白酶活性抑制劑檢測試驗(yàn)，方法優(yōu)先:首選選擇在生長繁殖過程中能夠分泌蛋白酶的細(xì)菌，我們選擇一種革蘭氏陽性細(xì)菌一枯草芽孢桿菌和一種革蘭氏陰性細(xì)菌一綠膿桿菌，在不加抗生素的LB固體培養(yǎng)基上劃線37°C過夜培養(yǎng)，然后用經(jīng)過滅菌的牙簽挑去細(xì)菌的單克隆，在同一個固體脫脂奶粉培養(yǎng)基上按照十字對角的方式分別接種四個單菌落，在上面覆蓋一個經(jīng)過滅菌的直徑為Smm-1Omm的濾紙小圓片，然后，預(yù)留一個小圓片作為空白對照，在其他3個小圓片上分別滴加經(jīng)過濾膜過濾除菌的SWD重組蛋白透析液、過濾除菌的IXPBS緩沖液、過濾除菌的與SWD重組蛋白透析液的蛋白質(zhì)濃度相同的BSA蛋白溶液，28°C條件下培養(yǎng)10h-12h，觀察透明圈出現(xiàn)的情況。
[0016]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):利用本發(fā)明制備的淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑具有良好的蛋白酶抑制劑活性，可以廣泛抑制細(xì)菌生長繁殖過程中分泌到細(xì)胞外的蛋白酶的活性，從而切斷細(xì)菌的營養(yǎng)物質(zhì)的來源，達(dá)到抑制細(xì)菌生長的作用，其在食品抗菌方面具有較大的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]附圖1為重組淡水小龍蝦SWD蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與親和純化的蛋白電泳結(jié)果圖；
[0018]附圖2為重組淡水小龍蝦SWD蛋白的枯草芽孢桿菌分泌性蛋白酶活性抑制結(jié)果圖；
[0019]附圖3為重組淡水小龍蝦SWD蛋白的綠膿桿菌分泌性蛋白酶活性抑制結(jié)果圖。【具體實(shí)施方式】[0020]實(shí)施例1:淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑分子的重組表達(dá)與親和純化以及酶活抑制劑活性檢測
[0021]圖1中，I為誘導(dǎo)前大腸桿菌總蛋白，2為誘導(dǎo)后大腸桿菌總蛋白，3為純化后的重組淡水小龍蝦SWD蛋白，4為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量。
[0022]圖2中，I為濾紙片上不加任何物質(zhì)的對照，2為加15 ii LlXPBS的對照，3為加15uL BSA蛋白透析液對照，4為加15 ii L重組SWD蛋白透析液。
[0023]圖3中，I為濾紙片上不加任何物質(zhì)的對照，2為加15 ii LlXPBS的對照，3為加15uL BSA蛋白透析液對照，4為加15 ii L重組SWD蛋白透析液。
[0024]方法步驟如下:
[0025]I)淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑cDNA的克隆:取體重約為20g_30g的冷凍保存的淡水小龍蝦3只，在實(shí)驗(yàn)室超凈工作臺的無菌條件下，解剖摘取肝臟組織各30mg-50mg，利用上海生工生物工程有限公司提供的Total RNA Extractor (Trizol)動物總RNA快速抽提試劑盒進(jìn)行總RNA的提取，方法可以參照說明書進(jìn)行，之后，利用上海生工生物工程有限公司生產(chǎn)的一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒(M-MuLV)進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成，方法可以參照說明書進(jìn)行，并以此cDNA樣品作為模板，以表達(dá)引物SWD-F:5' -tac tea gaa ttc cag cgcaca cac tat gct~3'與SWD-R:5' -tac tea ctc gag cct gac ctt agt tea tgc ac~3'作為擴(kuò)增SWD表達(dá)片段的前后引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，53。。退火45s，72。。延伸30s，循環(huán)35圈，后延伸5min，獲得PCR反應(yīng)產(chǎn)物；
[0026]2)原核表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化克隆菌株DH5 a:將步驟(1)的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量體積比為1.5%的瓊脂糖凝膠 電泳處理，目的條帶所在的膠條切膠回收之后，利用瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒(美國普洛麥格Promega公司產(chǎn)品)進(jìn)行片段回收，并且利用EcoRI和Xho I核酸內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切處理之后，與經(jīng)過EcoR I和Xho I核酸內(nèi)切酶雙酶切處理的pET-28a載體(TaKaRa公司產(chǎn)品)在16°C條件下連接10h_12h，連接酶為T4DNA連接酶(TaKaRa公司產(chǎn)品)，之后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a克隆菌株感受態(tài)細(xì)胞(TaKaRa公司產(chǎn)品)，轉(zhuǎn)化過程利用“熱激法”進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將LB固體培養(yǎng)基在37°C培養(yǎng)12h-14h，抗性為卡那霉素抗性，獲得LB固體培養(yǎng)基平板；
[0027]3)陽性重組子的篩選與質(zhì)粒提取:挑去步驟(2)中的LB固體培養(yǎng)基平板表面的白色菌落作為模板，利用表達(dá)引物SWD-F:5' -tac tea gaa ttc cag cgc aca cac tatgct-31 與 SWD-R:5' -tac tea ctc gag cct gac ctt agt tea tgc ac~31 作為菌落 PCR篩選陽性重組子的PCR反應(yīng)引物，進(jìn)行菌落PCR反應(yīng)，程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，53°C退火45s，72°C延伸30s，循環(huán)35圈，后延伸5min，根據(jù)PCR結(jié)果，將篩選得到的陽性克隆菌株利用LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶震蕩培養(yǎng)，添加的卡那霉素的最終質(zhì)量體積濃度為100 ii g/mL，培養(yǎng)溫度為37°C，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm-200rpm，培養(yǎng)時間為12h_14h，之后，取生長狀況良好的大腸桿菌菌株3mL，利用DNA質(zhì)粒小量提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取，獲得陽性重組質(zhì)粒；
[0028]4)轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21 (DE3)與陽性表達(dá)菌株的篩選:將步驟(3)中的陽性重組質(zhì)粒利用“熱激法”轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)表達(dá)菌株感受態(tài)細(xì)胞，將LB固體培養(yǎng)基在37°C過夜12h_14h培養(yǎng)，抗性為卡那霉素抗性，利用表達(dá)引物SWD-F:5' -tac tea gaa ttccag cgc aca cac tat gct~3'與SWD-R:5' -tac tea ctc gag cct gac ctt agt tea tgcac-3/作為菌落PCR篩選陽性表達(dá)菌株的PCR反應(yīng)引物，挑去固體LB培養(yǎng)基表面的白色菌落作為模板，進(jìn)行菌落PCR反應(yīng)，程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，53°C退火45s，72°C延伸30s，循環(huán)35圈，后延伸5min，根據(jù)PCR結(jié)果，將篩選得到的陽性表達(dá)菌株利用液體LB培養(yǎng)基3mL-5mL進(jìn)行搖瓶震蕩培養(yǎng)，添加的卡那霉素的最終質(zhì)量體積濃度為100 u g/mL，培養(yǎng)溫度為37°C，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm-200rpm，培養(yǎng)時間為12h_14h，得到表達(dá)菌株培養(yǎng)液；
[0029]5)重組SWD蛋白酶抑制劑分子的誘導(dǎo)表達(dá):將步驟(4)中的表達(dá)菌株培養(yǎng)液在無菌條件下吸取lmL，轉(zhuǎn)接在新鮮的IOOmL液體LB培養(yǎng)基中，添加卡那霉素的最終質(zhì)量體積濃度為IOOii g/mL，培養(yǎng)溫度為37°C，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm-200rpm，培養(yǎng)時間為3h_4h，之后加入異丙基-P -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，IPTG的最終物質(zhì)的量濃度為0.5mmol/L,其他條件不變的情況下誘導(dǎo)表達(dá)4h_5h之后,5000rpm-6000rpm條件下低速離心收集菌體，收集到的菌體沉淀用無菌的移液器槍頭蘸取一小部分，用無菌水40 y L懸起，加入20 y L蛋白質(zhì)樣品處理液之后在沸水域中煮沸5min-10min,冷卻后作為質(zhì)量體積比為15%的聚丙烯酰胺凝膠電泳的樣品使用，聚丙烯酰胺凝膠電泳選擇120v電壓進(jìn)行1.5h-2h，并且，將剩余的菌體沉淀保存在4°C冰箱中；
[0030]6)重組SWD蛋白酶抑制劑分子的親和純化:取步驟(5)剩余的保存在4°C冰箱中的菌體沉淀利用IOmL的IXPBS緩沖液重新懸起之后，冰浴上進(jìn)行超聲波破碎，超聲波破碎的具體方法為:功率200w，破碎2s，間歇3s，全程60min，破碎后的液體經(jīng)過10000rpm-12000rpm條件下高速離心收集上清液，取上清液5mL利用His-tag鎳柱(上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品)進(jìn)行親和純化，具體方法為:先用IXPBS緩沖液IOmL反復(fù)緩慢沖洗柱子3次-5次，再用試劑盒中的I Xwash溶液5mL洗脫柱子，再用試劑盒中的I Xbinding溶液3mL洗脫柱子，接著將5mL超聲波破碎后上清液反復(fù)上樣3次-5次，目的是為了重組SWD蛋白能夠充分結(jié)合在柱子上，之后用試劑盒中的IXbinding溶液IOmL洗脫柱子，再用試劑盒中的I X wash溶液6mL洗脫柱子,最后用試劑盒中的I X elute溶液3mL洗脫柱子，并且此時收集洗脫液，目的重組SWD蛋白就在此I X elute洗脫溶液中，純化結(jié)果利用質(zhì)量體積比為15%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，最終根據(jù)電泳結(jié)果合并目的重組蛋白質(zhì)所在位置對應(yīng)的IXelute洗脫液，得到目的重組蛋白質(zhì)IXelute洗脫合并液；
[0031]7)重組SWD蛋白酶抑制劑分子的蛋白酶抑制劑活性的檢測:取步驟(6)中的3mL目的重組SWD蛋白質(zhì)的I X elute洗脫合并液，利用截留孔徑為3500Da的透析袋(上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品)對IXPBS緩沖液透析24h，透析溫度為4°C，并且，12h期間更換一次IXPBS緩沖液，之后將透析后的淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑分子的蛋白透析液進(jìn)行蛋白酶抑制劑活性的檢測試驗(yàn)，方法為:首選選擇在生長繁殖過程中能夠分泌蛋白酶的細(xì)菌，一種為革蘭氏陽性細(xì)菌一枯草芽孢桿菌，一種為革蘭氏陰性細(xì)菌一綠膿桿菌，在不加抗生素的LB固體培養(yǎng)基上劃線37°C過夜培養(yǎng)，然后用經(jīng)過滅菌的牙簽挑去細(xì)菌的單克隆，在同一個固體脫脂奶粉培養(yǎng)基(配方為1%的脫脂奶粉與1%的瓊脂)上按照十字對角的方式分別接種四個單菌落，在上面覆蓋一個經(jīng)過滅菌的直徑為Smm-1Omm的濾紙小圓片，然后，預(yù)留一個小圓片作為空白對照，在其他3個小圓片上分別滴加經(jīng)過濾膜過濾除菌的SWD重組蛋白透析液、過濾除菌的IX`PBS緩沖液、與SWD重組蛋白透析液的蛋白質(zhì)濃度相同的過濾除菌的BSA蛋白溶液，28°C條件下培養(yǎng)10h-12h，觀察透明圈出現(xiàn)的情況。[0032]結(jié)果顯示，重組淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑分子能夠充分抑制枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌分泌的蛋白酶的活性，在試驗(yàn)中滴加重組淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑分子的蛋白透析液 的位置都沒有出現(xiàn)因?yàn)榈鞍踪|(zhì)水解而產(chǎn)生的透明圈。
【權(quán)利要求】
1.一種淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑的制備方法，其特征在于:方法步驟如下: 1)淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑的cDNA的克隆與表達(dá)片段擴(kuò)增:取體重約為20g-30g的淡水小龍蝦，在無菌條件下，解剖摘取肝臟組織各30mg-50mg，進(jìn)行總RNA的提取，之后，進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成，并以此cDNA樣品作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲得PCR反應(yīng)產(chǎn)物； 2)原核表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化克隆菌株DH5a:將步驟(1)的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量體積比為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳處理，目的條帶所在的膠條切膠回收之后利用瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒進(jìn)行片段回收，利用EcoR I和Xho I核酸內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切處理，之后，將經(jīng)過EcoR I和Xho I核酸內(nèi)切酶雙酶切處理的pET-28a載體在16°C條件下連接10h_12h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a克隆菌株感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化過程利用“熱激法”進(jìn)行，獲得LB固體培養(yǎng)基平板； 3)陽性重組子的篩選與質(zhì)粒提取:挑去步驟(2)中的LB固體培養(yǎng)基平板表面的白色菌落作為模板，利用表達(dá)引物 SWD-F:5/ -tac tea gaa ttc cag cgc aca cac tat gct~3/與SWD-R:5' -tac tea ctc gag cct gac ctt agt tea tgc ac~31 作為菌落PCR篩選陽性重組子的PCR反應(yīng)引物，進(jìn)行菌落PCR反應(yīng)，程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，53°C退火45s，72°C延伸30s，循環(huán)35圈，后延伸5min，根據(jù)PCR結(jié)果，將篩選得到的陽性克隆菌株利用LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶震蕩培養(yǎng)10h-12h，取生長狀況良好的大腸桿菌菌株3mL，利用DNA質(zhì)粒小量提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取，獲得陽性重組質(zhì)粒； 4)轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21(DE3)與陽性表達(dá)菌株的篩選:將步驟(3)中的陽性重組質(zhì)粒利用“熱激法”轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)表達(dá)菌株感受態(tài)細(xì)胞，并且，利用表達(dá)引物SWD-F:5' -tac tea gaa ttc cag cgc aca cac tat gct~3/ 與SWD-R:5' -tac tea ctc gag cctgac ctt agt tea tgc ac_3'作為菌落PCR篩選陽性表達(dá)菌株的PCR反應(yīng)引物,挑去固體LB培養(yǎng)基表面的白色菌落作`為模板，進(jìn)行菌落PCR反應(yīng)，程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，53°C退火45s，72°C延伸30s，循環(huán)35圈，后延伸5min，根據(jù)PCR結(jié)果，將篩選得到的陽性表達(dá)菌株利用液體LB培養(yǎng)基3mL-5mL進(jìn)行搖瓶震蕩培養(yǎng)，得到表達(dá)菌株培養(yǎng)液； 5)SffD蛋白酶抑制劑分子的誘導(dǎo)表達(dá):將步驟(4)中搖瓶培養(yǎng)的表達(dá)菌株培養(yǎng)液在無菌條件下吸取lmL，轉(zhuǎn)接在新鮮的IOOmL液體LB培養(yǎng)基中，添加卡那霉素最終的質(zhì)量體積濃度為100 ii g/mL，培養(yǎng)溫度為37°C，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm-200rpm，培養(yǎng)時間為3h_4h，之后加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，IPTG的最終物質(zhì)的量濃度為0.1mmoI/L-1.0mmoI/L,其他條件不變的情況下誘導(dǎo)表達(dá)4h-5h之后,5000rpm-6000rpm條件下低速離心收集菌體,菌體沉淀利用IOmL的IXPBS緩沖液重新懸起之后，冰浴上進(jìn)行超聲波破碎，破碎后的液體經(jīng)過10000rpm-12000rpm條件下高速離心收集獲得上清液； 6)SWD蛋白酶抑制劑分子的親和純化:取步驟(5)中的上清液5mL利用His-tag鎳柱進(jìn)行親和純化，純化結(jié)果利用質(zhì)量體積比為15%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，最終根據(jù)電泳結(jié)果合并目的重組蛋白質(zhì)所在位置對應(yīng)的IXelute洗脫液，得到目的SWD重組蛋白質(zhì)I X elute洗脫合并液； 7)SWD蛋白酶抑制劑分子的蛋白酶抑制劑活性的檢測:將步驟(6)的目的重組蛋白質(zhì)I X elute洗脫合并液，利用截留孔徑為3500Da的透析袋對I XPBS緩沖液透析24h，12h期間更換一次I XPBS緩沖液，之后將透析后的淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑分子的蛋白透析液進(jìn)行蛋白酶抑制劑活性的檢測試驗(yàn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑的制備方法，其特征在于，淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑表達(dá)片段擴(kuò)增方法，以表達(dá)引物SWD-F:5' -tac tea gaattc cag cgc aca cac tat gct~3/ 與SWD-R:5' -tac tea ctc gag cct gac ctt agt teatgc ac-3/作為擴(kuò)增SWD表達(dá)片段的前后引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性3min，94°C變性 30s，53。。退火 45s，72。。延伸 30s，循環(huán) 35 圈，后延伸 5min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑的制備方法，其特征在于:淡水小龍蝦SWD蛋白酶抑制劑活性的檢測方法，首選選擇在生長繁殖過程中能夠分泌蛋白酶的細(xì)菌，分別選擇革蘭氏陽性細(xì)菌——枯草芽孢桿菌和革蘭氏陰性細(xì)菌——綠膿桿菌，在不加抗生素的LB固體培養(yǎng)基上劃線37°C過夜培養(yǎng)，然后用經(jīng)過滅菌的牙簽挑去細(xì)菌的單克隆，在同一個固體脫脂奶粉培養(yǎng)基上按照十字對角的方式分別接種四個單菌落，在上面覆蓋一個經(jīng)過滅菌的直徑為8mm-10mm的濾紙小圓片，然后，預(yù)留一個小圓片作為空白對照，在其他3個小圓片上分別滴加經(jīng)過濾膜過濾除菌的SWD重組蛋白透析液、過濾除菌的I X PBS緩沖液、過濾除菌的與SWD重組蛋白透析液的蛋白質(zhì)濃度相同的BSA蛋白溶液，28 °C條件下過夜培養(yǎng)10h-12h，觀察透明`圈出現(xiàn)的情況。
【文檔編號】C07K1/22GK103667330SQ201310403117
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年9月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月6日
【發(fā)明者】杜志強(qiáng), 王金星, 趙小凡, 張雪峰, 王建英 申請人:內(nèi)蒙古科技大學(xué)