一種固環(huán)合成去氨加壓素的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種固相環(huán)化合成去氨加壓素的方法，解決了現(xiàn)有空氣液相氧化帶來大量廢液，生產(chǎn)落后，效能不高以及碘作為氧化劑氧化的副產(chǎn)物多的技術(shù)問題，其合成工藝步驟如下：首先在RinkAmideAM樹脂上依次偶聯(lián)9個(gè)氨基酸，偶聯(lián)的氨基酸順序?yàn)椋篎moc-Gly-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Mpa(Trt)-OH，然后使用1%TFA/DCM去除Cys(Trt)和Mpa(Trt)上的保護(hù)基Trt，再用氧化試劑固環(huán)得到環(huán)肽樹脂，最后裂解得到去氨加壓素。本發(fā)明提供了一種反應(yīng)操作簡單、成本低、收率較高，適合規(guī)?；a(chǎn)的去氨加壓素的合成工藝。
【專利說明】一種固環(huán)合成去氨加壓素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種多肽藥物的制備方法，特別涉及一種去氨加壓素的固相合成方法。
【背景技術(shù)】
[0002]去氨加壓素，英文名稱為:Desmopressin，為天然精氨鹽加壓素的結(jié)構(gòu)類似物，系對天然激素的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行兩處改動(dòng)而得，即L-半胱氨酸脫去氨基和以8-D-精氨酸取代8-L-精氨酸。醋酸去氨加壓素具有良好止血效果且不會(huì)產(chǎn)生深靜脈血栓的特點(diǎn)。主要用來治療血友病、尿崩癥及治療性控制出血和手術(shù)前預(yù)防出血。效果好且副作用小，是一種市場前景較好的多肽藥物。其肽序列結(jié)構(gòu)如下:
Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-NH2 (Sulfide bond between Mpa and Cys)
W02011011342公開了一種分別在MBHA、Sieber和CTC樹脂上合成醋酸去氨加壓素的方法，該方法采用碘/ 二氯甲烷進(jìn)行固相環(huán)化，其中CTC樹脂固相環(huán)化、裂解得到碳端為羧基的去氨加壓素前體，再進(jìn)行氨化得到醋酸去氨加壓素，通過三種樹脂和不同方法合成所得產(chǎn)品的純度都低于90%。US5726287公開了一種分別采用Boc法(MBHA樹脂)和Fmoc法(AM樹脂)合成醋酸去氨加壓素的方法，具體步驟為:先合成醋酸去氨加壓素線性肽，然后在水相體系和碘氧化條件下進(jìn)行環(huán)化生成二硫鍵，最后分別采用離子交換填料和反相HPLC進(jìn)行了純化，產(chǎn)品純度都低于95%<ΧΝ101372505公開了一種采用Sieber Amide樹脂固相合成醋酸去氨加壓素的方法，其通過逐步偶聯(lián)法合成去氨加壓素線性肽樹脂后，在乙腈/水體系中用雙氧水對線性肽進(jìn)行氧化生成去氨加壓素肽樹脂，再經(jīng)過裂解、純化得到醋酸去氨加壓素，其收率為55%，產(chǎn)品純度未見報(bào)道。但Sieber Amide樹脂是一種非常特殊的樹月旨，供應(yīng)商很少，不易采購，且售價(jià)高昂。專利CN102863513以Rink Amide AM樹脂為起始樹脂進(jìn)行了去氨加壓素的Fmoc法合成，合成線性肽肽樹脂并裂解后，再通過線性肽的液相雙氧水氧化生成二硫鍵，未報(bào)到收率和產(chǎn)品純度。專利CN103102395采用Sieber Amide樹脂合成去氨加壓素線性肽，裂解得到線性肽粗肽并經(jīng)過純化后，再于水相中進(jìn)行氧化反應(yīng)生成去氨加壓素，最后經(jīng)轉(zhuǎn)鹽得到醋酸去氨加壓素，純度99.5%以上，收率可達(dá)52%。同樣存中其原料Sieber Amide樹脂價(jià)格昂貴和供應(yīng)商少的缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種固環(huán)合成去氨加壓素的工藝方法。本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是:(I)選擇一種固環(huán)合成方法，解決液相氧化帶來的大量廢液，固相合成收率低的問題，(2)選擇一種氧化劑替代碘，解決碘作為氧化劑氧化的副產(chǎn)物多，收率不高的問題。
[0004]本發(fā)明的制備方法如圖1所示，首先在AM樹脂上依次偶聯(lián)上圖1中所示的9個(gè)氨基酸，偶聯(lián)氨基酸順序?yàn)?偶聯(lián)的氨基酸順序?yàn)?Fmoc-Gly-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys (Trt) -OH> Fmoc-Asn (Trt) -OH> Fmoc-Gln (Trt) -OH> Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr (tBu) -OH、Mpa (Trt) -OH,然后使用含 1%TFA 的 DCM 溶液去除 Cys (Trt)和Mpa(Trt)上的保護(hù)基Trt，接著加氧化試劑固環(huán)得到環(huán)肽樹脂，最后經(jīng)裂解得到去氨加壓素。
[0005]本發(fā)明中一些常用的縮寫具有以下含義；
Fmoc:荷甲氧羰基
Fmoc-AA-OH:荷甲氧羰基保護(hù)的氨基酸 tBu:叔丁基 Trt:三苯甲基
Pbf:2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；?br> Cl-HOBt:6_氯-1-羥基苯駢三氮唑
DIC:N，f - 二異丙基碳化二亞胺
Gly:甘氨酸
D-Arg:D-型精 氨酸
Pro:脯氨酸
Cys:半胱氨酸
Asn:天門冬酰胺
Gln:谷氨酰胺
Phe:苯丙氨酸
Tyr:酪氨酸
Mpa:3_巰基丙酸
DMF:N，N' - 二甲基甲酰胺
Piperidine:六氫吡唳
Fmoc-Rink Amide Am resin:用 Fmoc 保護(hù)的 Rink 氨甲基樹脂
TFA:三氟醋酸
PhSMe:苯甲硫醚
PhOMe:苯甲醚
MeOH:甲醇
DCM:二氯甲烷
Kaiser檢測試劑為:5%茚三酮乙醇溶液；吡啶；80%苯酚乙醇溶液 氧化劑為:過氧化尿素(溶劑:DMS0)
為此，本發(fā)明提供一種固環(huán)合成去氨加壓素的方法，所述方法步驟如下:
步驟1，固相合成線性去氨加壓素樹脂；
步驟2,將Cys (Trt)、Mpa (Trt)上的保護(hù)基Trt脫保護(hù)；
步驟3，用氧化劑固環(huán)得到環(huán)肽樹脂；
步驟4，裂解去除樹脂及保護(hù)基團(tuán)得到去氨加壓素。
[0006]其中，步驟I所述線性去氨加壓素樹脂，結(jié)構(gòu)如下:
Mpa (Trt) -Tyr (tBu) -Phe-Gln (Trt) -Asn (Trt) -Cys (Trt) -Pro-D-Arg (pbf) -Gly-NH-Re
sin其合成方法可以采用現(xiàn)有常規(guī)的固相合成技術(shù)。
[0007]其中，步驟2所述脫保護(hù)是使用試劑A與步驟I合成所得線性去氨加壓素樹脂進(jìn)行混合進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為15min，反應(yīng)溫度為25°C，重復(fù)反應(yīng)4遍。其中試劑A的配制方法如下:將ImLTFA加入到IOOmL DCM中。其中，TFA為三氟乙酸，DCM為二氯甲烷。
[0008]其中，步驟3所述氧化使用的氧化劑B選自:過氧化尿素溶液,其使用量為IOOmL,反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)，反應(yīng)溫度為25°C。氧化劑B的配制方法為:將3.SOg的過氧化尿素加入到IOOmL的DMSO (二甲基亞砜)溶液中溶解。
[0009]其中，步驟4所述裂解使用的裂解劑C選自:苯甲硫醚和三氟乙酸，其使用量為350mL,反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)，反應(yīng)溫度為25°C。裂解劑C的配制方法為:將35mL的PhSMe(苯甲硫醚)加入665mL的三氟乙酸中。
[0010]本發(fā)明通過使用經(jīng)過篩選的特定的脫保護(hù)試劑，氧化試劑，裂解試劑，找到一種高收率的方法，得到一種高純度的去氨加壓素。
[0011]以下通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說明本發(fā)明的有益效果:
脫保護(hù)試劑的篩選(體積比):
TFA:DCM =0.5:100 ；TFA:DCM =1:100 ；TFA:DCM =2:100 ；TFA:DCM =4:100
使用上述條件制備目的肽，分別得到不同收率和純度的去氨加壓素，結(jié)果數(shù)據(jù)如下:
【權(quán)利要求】
1. 一種固環(huán)合成去氨加壓素的方法，所述方法步驟如下: 步驟1，固相合成去氨加壓素線性肽樹脂； 步驟2,將Cys (Trt)和Mpa (Trt)上的保護(hù)基Trt脫保護(hù)； 步驟3，用氧化劑固環(huán)得到環(huán)肽樹脂； 步驟4，裂解去除樹脂及保護(hù)基團(tuán)得到去氨加壓素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是: 其中，步驟I所述線性去氨加壓素樹脂，結(jié)構(gòu)如下:
Mpa (Trt) -Tyr (tBu) -Phe-Gln (Trt) -Asn (Trt) -Cys (Trt) -Pro-D-Arg (pbf) -Gly-NH-Resin 其中，步驟2所述脫保護(hù)是使用試劑A與步驟I合成的線性去氨加壓素樹脂進(jìn)行混合反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)，反應(yīng)溫度為25°C ;其中試劑A的配制方法如下:將ImL TFA加入到IOOmL DCM中；其中，TFA為三氟乙酸，DCM為二氯甲烷； 其中，步驟3所述氧化使用的氧化劑B選自:過氧化尿素溶液,其使用量為IOOmL,反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)，反應(yīng)溫度為25°C ;氧化劑B的配制方法為:將3.80g的過氧化尿素加入到IOOmL的DMSO (二甲基亞砜)溶液中溶解； 其中，步驟4所述裂解使用的裂解劑C選自:苯甲硫醚和三氟乙酸，其使用量為350mL，反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)，反應(yīng)溫度為25°C ;裂解劑C的配制方法為:將35mL的PhSMe (苯甲硫醚)加入665mL的三氟乙酸中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是:氧化劑B為:過氧化尿素與DMSO的溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是:固相氧化降低了因液相氧化帶來的大量廢液，同時(shí)加快了反應(yīng)時(shí)間，屬工藝綠色化改造，提高了總收率。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是:使用過氧化尿素作為氧化劑氧化的副產(chǎn)物少，純度高于97%和收率高于65%。
【文檔編號(hào)】C07K1/04GK103992389SQ201310412013
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2013年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月10日
【發(fā)明者】楊東暉, 路楊, 陳曉航 申請人:杭州諾泰制藥技術(shù)有限公司