避孕微針的制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，特別涉及避孕疫苗的研制技術(shù)，具體為避孕微針的制備方法，具體包括以下步驟：將篩選的人Eppin蛋白優(yōu)勢(shì)抗原表位序列和/或具有自組裝形成納米纖維結(jié)構(gòu)的多肽序列串聯(lián)，得表位肽；將步驟A所得的表位肽充分溶解于超純水中，并與PBS混合，得自組裝系統(tǒng)工作液；將微針浸泡至自組裝系統(tǒng)工作液中不少于5分鐘，取出后，晾干，得避孕微針。避孕疫苗經(jīng)皮微針給藥與皮下注射相比能提高疫苗保護(hù)效率和生物利用度，E-Q11自組裝納米疫苗具有良好的安全性和有效性。
【專(zhuān)利說(shuō)明】避孕微針的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，特別涉及避孕疫苗的研制技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]世界人口的持續(xù)增長(zhǎng)和非意愿性妊娠的高發(fā)生率是困擾人類(lèi)生存健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)，發(fā)展的嚴(yán)峻問(wèn)題。免疫性避孕被廣大研究者認(rèn)為能夠滿足上述新一代避孕措施的需求，因而成為生殖與避孕領(lǐng)域研究的焦點(diǎn)和極具研究前景的避孕途徑。避孕疫苗(contraceptive vaccine, CV)起源于免疫性不孕患者體內(nèi)存在生育抑制相關(guān)的特異性抗體，免疫性避孕的作用原理是選擇與生殖過(guò)程密切相關(guān)關(guān)鍵抗原成分制成疫苗，誘導(dǎo)受者產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，通過(guò)高效、特異地抑制精或卵子發(fā)生、影響精子活力、頂體反應(yīng)或獲能、干擾精卵相互作用、結(jié)合或融合，及阻斷胚胎種植或發(fā)育的一個(gè)或多個(gè)環(huán)節(jié)，從而達(dá)到控制生育的目的。目前，避疫苗的研究主要集中在靶抗原的篩選，而在疫苗設(shè)計(jì)和免疫策略的研究方面落后于他治療性和預(yù)防性疫苗。截至目前，已有數(shù)量眾多的免疫避孕靶抗原被篩選出來(lái)，是僅有人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)嵌合肽疫苗進(jìn)入臨試驗(yàn)，因而，有必要在現(xiàn)有免疫避孕靶抗原的基礎(chǔ)上，結(jié)合在其他治療性和預(yù)性疫苗中成功應(yīng)用的疫苗設(shè)計(jì)和免疫策略，深入挖掘現(xiàn)有免疫避孕靶抗原的潛力，使得更多的避孕疫苗有望進(jìn)入臨床。
[0003]近年來(lái)，基于Eppin的避孕疫苗研究取得了一定的進(jìn)展，但仍存在以下問(wèn)題:(1)采用Eppin優(yōu)勢(shì)表位疫苗進(jìn)行免疫能減少不良反應(yīng)，但免疫原性差；(2)表位交聯(lián)載體蛋白的方法可以增強(qiáng)免疫原性，但所產(chǎn)生的抗體特異性差；(3)基于Eppin的避孕疫苗實(shí)驗(yàn)研究中通常聯(lián)合使用免疫佐劑如弗氏佐劑，其在人體中的應(yīng)用存在安全性問(wèn)題；因此，解決這一問(wèn)題的關(guān)鍵在于構(gòu)建更加安全、有效的避孕疫苗運(yùn)載體系。
[0004]微針透皮給藥是一種集合注射給藥和經(jīng)皮貼劑為一體的新型透皮給藥平臺(tái)技術(shù)。在很小的面積上，以數(shù)百根微針刺穿皮膚角質(zhì)層，使藥物進(jìn)入表皮層而被表皮中朗格漢斯細(xì)胞(LC)直接攝取。既允許藥物通過(guò)角質(zhì)層這個(gè)重要的屏障，又避開(kāi)真皮層的神經(jīng)不會(huì)引起痛覺(jué)?？梢詼p少注射器使用帶來(lái)的副作用，避免口服免疫引起的肝臟首過(guò)效應(yīng)和消化道酶、胃酸對(duì)抗原的破壞，避免滴鼻免疫造成的大部分抗原流入食道的缺點(diǎn)。微針作為疫苗免疫途徑，可誘導(dǎo)系統(tǒng)免疫和黏膜免疫的雙重功效，具有精確、無(wú)痛、安全、高效、便利等優(yōu)點(diǎn)。微針給藥對(duì)藥物的極性、滲透系數(shù)、熔點(diǎn)等都沒(méi)有限制，大大拓寬候選藥物的范圍。而與其他致孔促滲給藥比較，微針顯 示對(duì)皮膚較小的損傷性。目前，微針結(jié)合免疫性避孕的研究還比較少。
[0005]本發(fā)明是針對(duì)上述不足之處提出改進(jìn)的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供避孕微針的制備方法，其操作簡(jiǎn)單，適用于規(guī)模生產(chǎn)。其制備的避孕微針避孕效果明顯。[0007]避孕微針的制備方法，具體包括以下步驟:
[0008]A附睪蛋白酶抑制蛋白的表位肽的合成
[0009]將篩選的人Eppin蛋白的優(yōu)勢(shì)抗原表位的序列(詳見(jiàn)表1)和具有自組裝形成納米
纖維結(jié)構(gòu)的多肽的序列串聯(lián)，得表位肽；
[0010]
【權(quán)利要求】
1.避孕微針的制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟: A附睪蛋白酶抑制蛋白的表位肽的合成 將篩選的人Eppin蛋白的優(yōu)勢(shì)抗原表位的序列和具有自組裝形成納米纖維結(jié)構(gòu)的多肽的序列串聯(lián)，得融合表位肽； B自組裝系統(tǒng)的構(gòu)建 或?qū)⒉襟EA所得的融合表位肽充分溶解于超純水中，并與PBS混合，得自組裝系統(tǒng)工作液； C微針的包被 將微針浸泡至自組裝系統(tǒng)工作液中至抗原充分包被所述微針，得避孕微針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的避孕微針的制備方法，其特征在于:所述人Eppin蛋白的優(yōu)勢(shì)抗原表位序列如SEQ ID NO:1所示，通過(guò)人工合成肽技術(shù)固相合成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的避孕微針的制備方法，其特征在于:所述自組裝形成納米纖維結(jié)構(gòu)的多肽的序列如SEQ ID NO:2所示，通過(guò)人工合成肽技術(shù)固相合成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的避孕微針的制備方法，其特征在于:所述人Eppin蛋白的優(yōu)勢(shì)抗原表位的序列和所述自組裝形成納米纖維結(jié)構(gòu)的多肽的序列組成的所述表位肽的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的避孕微針的制備方法，其特征在于:步驟B中，所述融合表位肽與所述PBS的體積比為1:3~6，所述多肽的濃度為8mM。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的避孕微針的制備方法，其特征在于:步驟C中，所述微針為SkinStamp圖章型微針。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的避孕微針的制備方法，其特征在于:步驟C中，將自組裝系統(tǒng)工作液置于與所述微針匹配的微針池中，每個(gè)微針池內(nèi)加入所述8 L自組裝系統(tǒng)工作液，液面高度約為微針池深度的3/4，再將所述SkinStamp圖章型微針垂直置入匹配的微孔，保持不少于5min后，垂直取出，室溫下靜置使包被液晾干。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的避孕微針的制備方法，其特征在于:步驟C中，所述微針池的制備采用激光蝕刻鉆孔工藝，在厚度為1mm聚四氟乙烯板表面制備與微針陣列相匹配的微針池，微針池的直徑200 u m,深度為400 u m,每個(gè)微針池作為每個(gè)微針浸潰包被時(shí)的單獨(dú)容器。
9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的制備方法所得的避孕微針。
【文檔編號(hào)】C07K19/00GK103566363SQ201310436497
【公開(kāi)日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月23日
【發(fā)明者】梁志清, 唐帥, 何畏, 王延洲, 孫黎黎, 徐萍萍 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院